Ενδοκρινικό Σύστημα Μέτρηση Ορμονών - Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ε. Μπότουλα Γ.Ν.Α ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ

Transcript

1 Ενδοκρινικό Σύστημα Μέτρηση Ορμονών - Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Ε. Μπότουλα Γ.Ν.Α ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ 1

2 Κύτταρο

3

4

5 Ενδοκρινής Κυκλοφορία Ιστοί-στόχοι αδένας (κύτταρο) Πυρήνας

6 Πεπτιδικές Στεροειδείς Αμίνες Figure 3c-1. Pathways of thyroid hormone metabolism.

7 Ενδοκρινικό κύτταρο Παρακείμενο κύτταρο ΠΑΡΑΚΡΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΑΥΤΟΚΡΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Περιφερικά κύτταραι

8 Ενδοκρινής Κυκλοφορία Ιστοί-στόχοι αδένας (κύτταρο) Πυρήνας

9 Ειδικές Πρωτείνη που μεταφέρει τις θυρεοειδικές ορμόνες (TBG) Πρωτείνη που μεταφέρει τις ορμόνες του φύλου (SHBG) Πρωτείνη που μεταφέρει την κορτιζόλη (CBG) Πρωτείνη που μεταφέρει την βιταμίνη D Μη ειδικές Λευκωματίνη Προλευκωματίνη

10

11 Ορμόνες του υποθαλάμου Εκλυτική των γοναδοτροφινών ορμόνη (GnRH) Εκλυτική της αυξητικής ορμόνης (GhRH) Εκλυτική της θυρεοειδοτρόπου (TRH) Εκλυτική ττης κορτικοτροφίνης (CRH) Σωματοστατίνη Ντοπαμίνη

12 Ορμόνες της υπόφυσης ΑΔΕΝΟ-ΥΠΟΦΥΣΗ 1. Αυξητική (GH) 2. Θυρεοειδοτρόπος (TSH) 3. Φλοιοεπινεφριδιοτρόπος (ACTH) 4. Γοναδοτρόποι (FSH, LH) 5. Προλακτίνη (Prol) ΝΕΥΡΟ-ΥΠΟΦΥΣΗ 1. Αντιδιουρητική (ADH) 2. Ωκυτοκίνη

13 Υπογλυκαιμ Θυροξίνη Σωματοστατίνη Κορτιζόλη Αργινίνη (+) Ασκηση Υποθάλαμος (-) GnRH Αδενουπόφυση GH

14 Θυρεοειδής αδένας Τ3, Τ4 TG Παραθυρεοδείς αδένες PTH Επινεφρίδια Κορτιζόλη Αλδοστερόνη Γονάδες Οιστραδιόλη Τεστοστερόνη 14

15

16 (-) Υποθάλαμος (+) (-) Νευροϋπόφυση Αδενοϋπόφυση (+) Υποφυσιακή ορμόνη Περιφερικός Ενδοκρινής Αδένας ΟΡΜΟΝΗ

17 Υποθάλαμος ΤRH Αδενοϋπόφυση (+) TSH (-) Θυρεοειδής (περιφερικός αδένας) T3 + T4

18 TSH T4 ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ

19 α) την αύξηση και ανάπτυξη, β) τη διατήρηση της ισορροπίας του εσωτερικού περιβάλλοντος, γ) την παραγωγή, χρήση και αποθήκευση της ενέργειας δ) την αναπαραγωγή.

20 Υπερπαραγωγή Ανεπαρκής παραγωγή Αντίσταση των ιστών στη δράση της ορμόνη

21 H έρευνα της ενδοκρινολογίας προϋποθέτει τη καλή γνώση των βασικών αξόνων τουενδοκρινικού συστήματος Υποθάλαμος-Υπόφυση-Γονάδες Υποθάλαμος-Υπόφυση-Επινεφρίδια Υποθάλαμος-Υπόφυση-θυρεοειδής Ο λειτουργία ή δυσλειτουργία των αξόνων ελέγχεται με τους εργαστηριακούς προσδιορισμούς των βασικών ορμονών Ένα αξιόπιστο εργαστήριο μπορεί να συμβάλει σημαντικάστη αντιμετώπιση των ενδοκρινικών διαταραχών 21

22 Επίσκεψη στον γιατρό Παραγγελία εργ. εξέτασης Ερμηνεία αποτελέσματος ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Λήψη δείγματος Αποτέλεσμα εξέτασης Εκτέλεση εξέτασης (ανάλυση) 22

23 Προ-αναλυτικό - Παραλαβή ή συλλογή και επεξεργασία δείγματος Αναλυτικό Μεθοδολογίες προσδιορισμού-τεχνικές Έλεγχος ποιότητας Μετα-αναλυτικό Επικύρωση μετρήσεων Εκτύπωση ή αποστολή αποτελεσμάτων 23

24 Μεθοδολογίες προσδιορισμού ορμονών- Τεχνικές Κριτήρια αξιολόγησης μεθόδων Έλεγχος ποιότητας 24

25 Βιολογικές μέθοδοι Χημικές μέθοδοι Χρωματογραφικές μέθοδοι Ανοσοχημικές μέθοδοι ή ανοσοπροσδιορισμοί (Immunoassay techniques) HPLC (High performance liquid chromatography) GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) Multiple assay 25

26 Οι ανοσοχημικές μέθοδοι αποτελούν ειδική κατηγορία αναλυτικών τεχνικών στις οποίες χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρια αντισώματα με σκοπό τον ειδικό ποιοτικό ή ποσοτικό προσδιορισμό συγκεκριμένων ουσιών σε βιολογικά ή άλλα δείγματα. Χαρακτηριστικά ανοσοχημικών μεθόδων: Εξειδίκευση Ευαισθησία Ακρίβεια Επαναληψιμότητα Απλότητα εκτέλεσης 26

27 1959: Ανάπτυξη ραδιοανοσοχημικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της ινσουλίνης από τους R.S. Yalow και S.A. Berson και ραδιοδεσμευτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της θυροξίνης από R.P. Ekins. 1967: Εισαγωγή των τεχνικών στερεάς φάσης για των διαχωρισμό των ελεύθερων από τα δεσμευμένα ανοσοαντιδραστήρια. 1968: Ανάπτυξη των πρώτων μη ανταγωνιστκών ανοσοχημικών μεθόδων. 1971: Αναπτύσονται οι πρώτοι ενζυμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί. 1973: Εφαρμόζεται για πρώτη φορά η τεχνική του πολωμένου φθορισμού για την ανάπτυξη ομογενών ανοσοχημικών μεθόδων. 1975: Οι Kohler και Milstein αναπτύσουν τη μέθοδο παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων. 1977: Εισαγωγή των χημειοφωταυγών ιχνηθετών για την αύξηση της ευαισθησίας των προσδιορισμών. 1979: Η R.S. Yalow λαμβάνει το βραβείο Nobel Φυσιολογίας και Ιατρικής. 1979: Ανάπτυξη του πρώτου ανοσοχημικού ηλεκτροχημικού αισθητήρα. 1981: Η τεχνική του χρονικά διαχωριζόμενου φθορισμού οδηγεί στην ανάπτυξη υπερευαίσθητων ανοσοχημικών μεθόδων. 1984: Ανάπτυξη του πρώτου οπτικού ανοσοχημικού αισθητήρα. 1989: Ανάπτυξη των πρώτων συστοιχιών αντισωμάτων για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών αναλυτών στο ίδιο δείγμα. 27

28 Ag* Ag + Ab Ag*Ab + AgAb Προσδιορισμός κατανομής ιχνηθέτη μετά από τον διαχωρισμό των δεσμευμένων από τις ελεύθερες μορφές ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Προσδιορισμός κατανομής ιχνηθέτη χωρίς διαχωρισμό των δεσμευμένων από τις ελεύθερες μορφές ΟΜΟΓΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 28

29 Αντίσωμα (Ab) Υψηλής εξειδίκευσης ως προς το Ag Μονοκλωνικά αντισώματα Επισημασμένο Ag ή Ab (conjugate) Σταθερός δεσμός με ιχνηθέτη Να διατηρεί τις (ανοσολογικές) ιδιότητες του Ag ή Ab Ιχνηθέτης Ραδιοϊσότοπο (κυρίως I125) RIA-IRMA Ένζυμα (Αλκ. Φωσφατάση, Υπεροξειδάση) EIA-ELISA Φθορίζον μόριο (φλοουρεσκείνη) FIA Χημειοφωταυγής αντίδραση CLIA 29

30 Ανάμειξη δείγματος με θερμή ορμόνη και αντίσωμα Επώαση Διαχωρισμός ελεύθερης από συνδεδεμένη ορμόνη Μέτρηση Κατασκευή καμπύλης αναφοράς 30

31 Δύο είναι οι σπουδαιότεροι τύποι ανοσοχημικών μεθόδων : Ανταγωνιστικού τύπου Επισήμανση του Ag Το επισημασμένο Ag ανταγωνίζεται με το Ag του δείγματος για τις θέσεις σύνδεσης του Ab Για μικρού ΜΒ ουσίες (απτένια) πχ στεροειδή, θυροειδικές ορμόνες κλπ Μεγάλη ευαισθησία Μη ανταγωνιστικού τύπου (ή sandwich) Επισήμανση του Ab Για πεπτίδια ή πρωτεΐνες πχ TSH, PTH κλπ Πολύ μεγάλη ευαισθησία 31

32 Σήμα Σήμα A + A B B + Συγκέντρωση αναλύτη Συγκέ Ιχνηθέτης Ορμόνη Ακινητοποιημένος αναλύτης 32

33 Σήμα Σήμα A B + Συγκέντρωση αναλύτη Συγκέντρωση αναλύτη Αντίσωμα σύλληψης Ορμόνη Αντίσωμα ανίχνευσης 33

34 Αντίσωμα Επισημασμένο αντιγόνο -αντίσωμα Ιχνηθέτης Πρότυπα διαλύματα Σύστημα διαχωρισμού/διάκρισης φάσεων Συστημα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων 34

35 Κριτήρια επιλογής αντισώματος ανάλυσης Σταθερά σύνδεσης Εξειδίκευση Η εξειδίκευση ενός αντισώματος εκφράζει την ικανότητα του να αναγνωρίζει αποκλειστικά την προς προσδιορισμό ουσία. Μετρό της εξειδίκευσης ενός αντισώματος είναι η διασταυρούμενη δραστικότητα (cross-reactivity) με ουσίες παρεμφερούς δομής προς αυτή του αναλύτη. 35

36 Πολυκλωνικά αντισώματα Μονοκλωνικά αντισώματα 36

37 Διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης της προς προσδιορισμό ουσίας. Χρησιμοποιείται πρώτη ύλη υψηλής καθαρότητας όμοιας δομής με την ουσία που θα προσδιοριστεί στα δείγματα των ασθενών. Το μέσο παρασκευής τους επιλέγεται ώστε να μην παρατηρούνται διαφοροποιήσεις ανάμεσα στα πρότυπα διαλύματα και τα άγνωστα δείγματα. Η βαθμονόμηση τους γίνεται ώς προς Διεθνή Πρότυπα τα όποια διαθέτει ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ή η Ευρωπαϊκή Ένωση. 37

38 Εξειδίκευση Προσδιορισμός διασταυρούμενης δραστικότητας Ευαισθησία Κλίση καμπύλης βαθμονόμησης Προσδιορισμός ορίου ανίχνευσης Ακρίβεια Ανάκτηση εξωγενώς προστιθέμενης ουσίας Γραμμικότητα αραίωσης δειγμάτων Επαναληψιμότητα Προσδιορισμός διακύμανσης των τιμών των δειγμάτων εντός του ιδίου και μεταξύ προσδιορισμών 38

39 39

40 Πλεονεκτήματα αυτόματων αναλυτών Μπορούν να εκτελούν πολλούς διαφορετικούς προσδιορισμούς σε σειρά Μπορούν να εκτελούν αναλύσεις σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων σε πολύ μικρότερο χρόνο Επεξεργάζονται τα αποτελέσματα Έχουν ενσωματωμένα προγράμματα ελέγχου ποιότητας μέσω ορών ελέγχου Η αξιοπιστία της ανάλυσης δεν εξαρτάται από τον χειριστή 40

41 Μειονεκτήματα αυτόματων αναλυτών Υψηλό κόστος αγοράς και λειτουργίας Κλειστά συστήματα που χρησιμοποιούν συγκεκριμένα αντιδραστήρια Μπορεί να εμφανίσουν προβλήματα αξιοπιστίας Η αξιοπιστία της ανάλυσης δεν εξαρτάται από τον χειριστή 41

42 Τεχνική διαχωρισμού υψηλής ευαισθησίας Χρησιμοποιείται και ως 1ο στάδιο «καθαρισμού» του δείγματος πριν από μια ανοσοχημική μέθοδο. Μελέτη προϊόντων μεταβολισμού Κυρίως χρησιμοποιείται για ερευνητικούς σκοπούς Για πολλές ορμόνες (πχ στεροειδή) η HPLC αποτελεί μέθοδο αναφοράς 42

43 43

44 44

45 Συνδυασμός μιας τεχνικής διαχωρισμού όπως η αέρια χρωματογραφίας (GC), με μια τεχνική ταυτοποίησης (φασματομετρία μάζας MS) Πολύ ισχυρή αναλυτική τεχνική με υψηλή ευαισθησία Εφαρμόζεται σε ουσίες (ορμόνες) με θερμική σταθερότητα και πτητικότητα Χρησιμοποιείται κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς 45

46 Περισσότεροι από ένας προσδιορισμοί (εξετάσεις) ταυτόχρονα (στο ίδιο δείγμα): Evidence the multi-analyte Biochip Array Technology (Randox) Luminex 46

47 47

48 Παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή και την προετοιμασία του Παράγοντες που σχετίζονται με το δείγμα Παράγοντες που σχετίζονται με την ίδια τη φύση των ορμονών αλλά και με ενδογενείς περιορισμούς των ανοσομετρήσεων 48

49 Διαιτητική κατάσταση Φύλο ηλικία Φάρμακα Φυσική κατάσταση του ασθενούς stress Θέση του σώματος 49

50 Τόσο η λήψη, όσο και η αποφυγή λήψης τροφής μπορεί: - Να προκαλέσουν διέγερση ή αναστολή της έκκρισης ορισμένων ορμονών - Να παρέμβουν στον προσδιορισμό των ορμονών in vitro 50

51 Φύλο: Επηρεάζει την παραγωγή ορμονών και των συνδετικών πρωτεϊνών τους Διαφοροποίηση ανάλογα με την ηλικία 51

52 Μπορεί να επηρεάσουν τα επίπεδα των ορμονών με τρείς τρόπους: Να διεγείρουν ή να αναστείλουν την παραγωγή μιας ορμόνης ή της δεσμευτικής της πρωτεΐνης in vivo Να επηρεάσουν τη μεταφορά (μέσω ανταγωνισμού στη σύνδεση με τις πρωτεΐνες-φορείς), τον μεταβολισμό ή την απέκκριση μίας ορμόνης Να παρέμβουν στην αναλυτική διαδικασία 52

53 Φυσική κατάσταση του ασθενούς stress Θέση του σώματος 53

54 Αιμοληψία Αιμόλυση Φιαλίδια συλλογής Αντιπηκτικά Συνθήκες διαχωρισμού του δείγματος Συνθήκες διατήρησης 54

55 1. Βιολογικοί ρυθμοί: Ρυθμός ζωής Εποχιακός ρυθμός Μηνιαίος ρυθμός Νυχθήμερος ή κιρκαδιανός ρυθμός Ρυθμός εκκριτικής αιχμής (secretory peak) ανά λεπτό ή ώρα 2. Συνδετικές πρωτεΐνες 55

56 Μέτρηση της ανοσολογικής δραστικότητας Μη ειδικές παρεμβολές στις ανοσοαναλύσεις Φαινόμενο hook στις υψηλές συγκεντρώσεις 56

57 Αυτές δεν ταυτίζονται πάντα, γιατί μπορεί να κυκλοφορούν περισσότερες της μιάς μορφές της ορμόνης βιολογικά αδρανείς ή λιγότερο δραστικές από την ανέπαφη, όπως: Μεγαλυτέρου Μ.Β. (πρόδρομες ορμόνες, πολυμερείς μορφές) Μικρότερου Μ.Β. κλάσματα Μη φυσιολογικά ανάλογα της φυσικής ορμόνης ή έκτοπη παραγωγή πρόδρομων μορφών 57

58 ΜΟΡΦΗ ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗΣ Απλή (Little) ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ (KD) 23 % ΤΗΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΟΛΑΚΤΙΝΗΣ ΣΤΟΝ ΟΡΟ Μεγάλη (Big) Μεγάλη-Μεγάλη (Big-Big) 150 <10

59 NH COOH Carboxy-terminal fragments COOH 84 N-terminal fragments

60 Παρουσία αντισωμάτων προς την ίδια την ορμόνη Ετερόφιλα αντισώματα Ρευματοειδείς παράγοντες 60

61 Παράδειγμα: Τα αντιθυρεοσφαιρινικά αυτοαντισώματα (TgAb) παρεμβαίνουν στη μέτρηση της θυρεοσφαιρίνης (Tg) κυρίως με τις ανοσομετρικές μεθόδους δύο θέσεων προκαλώντας ψευδώς χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα αποτελέσματα. Όμως, ούτε οι ανταγωνιστικές RIA είναι ασφαλείς Γι αυτό συνιστάται, μαζί με τη μέτρηση της Tg, να μετρώνται σε κάθε δείγμα και τα TgAb με ευαίσθητη μέθοδο και να μην αξιολογούνται τα αποτελέσματα της όταν αυτά είναι θετικά. 61

62 Αντισώματα που αναπτύσσονται στον ορό ορισμένων ανθρώπων προς τις ανοσοσφαιρίνες ενός ή/και περισσοτέρων ζώων Προέλευση Ιατρογενής: χορήγηση φαρμακευτικών ή διαγνωστικών ουσιών Μη ιατρογενής: συγκατοίκηση και ενασχόληση με ζώα Συχνότερα εμφανιζόμενο: το HAMA ( Human Anti-Mouse Antibody ) 62

63 Παρεμβολή κυρίως σε two site-ima μεθόδους: Συνδέεται και σχηματίζει γέφυρα με το ακινητοποιημένο και το ιχνηθετημένο αντίσωμα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα Συνδέεται με το ένα αντίσωμα παρεμποδίζει την αντίδραση του με την ορμόνη ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα Παρεμβολή σε ανταγωνιστικές μεθόδους: σπάνια, μικρή 63

64 Αποτέλεσμα μη συμβατό με την κλινική εικόνα Ετερόφιλο αντίσωμα; Δοκιμασία αραίωσης Όχι η αναμενόμενη γραμμικότητα; Αυξημένη πιθανότητα 64

65 1. Με απομάκρυνση ή αδρανοποίηση τους π.χ με καταβύθιση με πολυαιθυλενο-γλυκόλη (PEG) πριν από τον προσδιορισμό 2. Με τροποποίηση των αντισωμάτων της μεθόδου (αφαίρεση του τμήματος Fc ) 3. Με προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα της μεθόδου ανοσοσφαιρινών του ζώου 65

66 Χαμηλής συγγένειας ανθρώπινα αυτοαντισώματα (κυρίως IgM) που αναγνωρίζουν επιτόπους στο τμήμα Fc της IgG ασθενών που πάσχουν από ρευματικά νοσήματα Συνδέονται με το τμήμα Fc των επιστρωμένων ή ακινητοποιημένων πολυκλωνικών αντισωμάτων Παρεμποδίζουν τη σύνδεση της ορμόνης στο αντίσωμα 66

67 Επηρεάζει: Δείγματα με πολύ ψηλές τιμές ορμόνης, όπως π.χ. με HCG, TG Τις ανοσομετρικές μεθόδους δύο θέσεων ( two site-ima ) Προκαλεί: Ψευδώς χαμηλές ή μηδενικές τιμές 67

68 Τα δύο αντισώματα της μεθόδου κορέννυνται από την περίσσεια της ορμόνης-αντιγόνου Δεν μπορεί να δημιουργηθεί η γέφυρα αντίσωμα-αντιγόνο-αντίσωμα Ψευδώς πολύ χαμηλή τιμή 68

69 69

70 Αποτέλεσμα μη συμβατό με την κλινική εικόνα και αναμενόμενη τιμή πολύ υψηλή Μέτρηση του δείγματος ως έχει και με αραίωση 1:10 με ορό ελεύθερο ορμόνης Ψηλότερη τιμή στο σωληνάριο με το αραιωμένο δείγμα hook effect 70

71 Με την επιλογή μεθόδου «δύο βημάτων» αντί «ενός βήματος» Με την προτροπή όλα τα ύποπτα δείγματα να αναλύονται και ως έχουν και με αραίωση 1:10. Θα πρέπει η εταιρεία να επικυρώνει τη μέθοδο ως προς την μη ύπαρξη hook effect σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις και να περιλαμβάνει τα στοιχεία αυτά στο πληροφοριακό φυλλάδιο. 71

72 Τεχνικά Σφάλματα Τιμές Αναφοράς Η Απόλυτη τιμή πολλές φορές στερείται διαγνωστικής αξίας 72

73 Μέτρηση Διάγνωση

74 74