10 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νόσου Alzheimer και Συγγενών Διαταραχών και 2 ο Μεσογειακό Συνέδριο Νευροεκφυλιστικών Νοσημάτων Παρασκευή, 3/2/2017 Ανίχνευση της όξινης ινώδους πρωτεΐνης της γλοίων (GFAP)και φλεγμονωδών μαρτύρων σε βιολογικά υγρά ασθενών με Νόσο Alzheimer Γεώργιος Κ. Κατσίπης 1, Χημικός-Βιοχημικός (MSc)/ Υποψήφιος Διδάκτωρ 1 Μαγδαληνή Ν. Τσολάκη 2, Αναστασία Α. Πανταζάκη 1 1 Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 2 Τρίτη Νευρολογική Κλινική, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης «Γ. Παπανικολάου»
Όξινη Ινώδης Πρωτεΐνη των Γλοίων (GFAP) Κύριο μέλος των IF στα ώριμα αστροκύτταρα Εντοπίζεται σε ινίδια (ομο- ή έτερο-πολυμερή) μαζί με βιμεντίνη και νεστίνη Biswas et al. (2011) Ειδικός βιοδείκτης αστρογλοίων Dr Louise Cole (Core Facilities Manager, Advanced Microscopy Facility) from the University of Sydney and Charean Adams (Chief Operating Officer) of the Bosch Institute Τροποποιήσεις: φωσφορυλίωση, γλυκοζυλίωση, ακετυλίωση, κιτρουλινίωση, ουβικιτινυλίωση Πρωτεολύσεις: κασπάσες, καλπαΐνες Tang D. (2008)
Αστρογλοίωση Οφείλεται στην παρουσία οχλήσεων στο ΚΝΣ (τραυματισμός, λοίμωξη, εκφυλισμός) Συνοδεύεται από υπερέκφραση της GFAP, υπερπλασία αστροκυττάρων Επάγεται κυρίως από προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες (TNFα, IL-1, IFNγ κ.α.) Σκοπός η διαφύλαξη (νευρογλοιακή ουλή) και επούλωση Pekny and Pekna (2014) Sofroniew (2014)
GFAP στην AD Αυξημένη έκφραση λόγω αστρογλοίωσης (Αβ πλάκες και στάδιο Braak) Σε διαγονιδιακά ποντίκια μοντέλα AD, η υπερέκφραση GFAP βαίνει παράλληλα με την εμφάνιση των πλακών Μικρογλοία και δραστικά αστροκύτταρα περικυκλώνουν τις πλάκες και τα NFTs Διάτρητος ΒΒΒ στην AD (Θρομβίνη, αλβουμίνη - ΚΝΣ GFAP, NSE και s100β ορό) Θραύσματα, αυτο-αντισώματα έπειτα από τραυματισμό ΚΝΣ και εγκεφαλικά επεισόδια στον ορό! Heneka et al. 2009 Οι παραφυάδες των αστροκυττάρων διεισδύουν στο εσωτερικό των πλακών Krohn et al. 2015
Σκοπός Dot blot GFAP επίπεδα Western blot Διαμορφώσεις Caseinograph Πρωτεόλυση Όξινη αποδιάταξη Αυτοαντισώματα Στατιστική ανάλυση Dot blot Επίπεδα Στατιστική ανάλυση
Ανίχνευση GFAP στο σίελο Εμφάνιση της GFAP σε δείγματα σιέλου από νευρολογικά υγιείς (Ν1-5), ασθενείς με MCI (M1, Μ3-6) και ασθενείς με AD (Α3, Α4, Α6, Α8, Α14) με χρήση της τεχνικής Dot Blot OD των κηλίδων από πρότυπα δείγματα GFAP (0,2-10 ng) μετά από εμφάνισής τους με τη μέθοδο Dot Blot, συναρτήσει της ποσότητας της GFAP σε ng. Εικονίζονται δύο σειρές δειγμάτων: μία παρουσία 2 mg/ml BSA και μία δίχως.
TPR Αξιολόγηση ως διαγνωστικός δείκτης Είδος Ελάχιστο/ Μεταβολή Αριθμός OD κηλίδας Τυπική σε σχέση πληθυσμο δειγμάτων Dot Blot μέγιστο απόκλιση με control ύ Ανοσοσήμα (%) Control 11 0,198 (±0,072) 0,450/0,405 0,107-1 0,9 0,8 0,7 0,6 Kαμπύλη ROC για GFAP σιέλου MCI 12 0,163 (±0,058) 0/0,335 0,091-17,68 0,5 0,4 0,3 Normal/AD MCI/AD 0,2 AD 11 0,081 (±0,054) 0/0,205 0,081-59,09 0,1 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 FPR Μείωση 17,68% (p=0,4063) στην MCI Μείωση 59,09% (p=0,0090) στην AD Καλός διαγνωστικός δείκτης για διαχωρισμό AD-Υγιών (ROC AUC = 0,81) Καμπύλη ROC για μελέτη της ευαισθησίας και ειδικότητας της διάγνωσης που βασίζεται στη GFAP σιέλου, όπως αυτή προσδιορίζεται από τη μεθοδολογία Dot Blot. Δίνονται τα ποσοστά αληθώς θετικών δειγμάτων (TPR) έναντι των ψευδώς θετικών δειγμάτων (FPR), για δεδομένες τιμές διάκρισης (cut-off values). Η καμπύλη υποδεικνύει καλή διαγνωστική ικανότητα της GFAP σιέλου για τη διάκριση νευρολογικά υγιών ηλικιωμένων από ασθενείς με AD (AUC=0,81) και μέτρια ικανότητα για τη διάκριση ασθενών με MCI από ασθενείς με AD (AUC=0,73).
Ανίχνευση GFAP στον ορό Μεταβολή Ελάχιστο/ Είδος Αριθμός OD κηλίδας Τυπική σε σχέση μέγιστο πληθυσμού δειγμάτων Dot Blot απόκλιση με control Ανοσοσήμα (%) Control 17 0,088 (±0,004) 0,47/0,117 0,018 - AD 15 0,103 (±0,006) 0,06/0,145 0,023 +17,05 Εμφάνιση της GFAP σε δείγματα ορού από νευρολογικά υγιείς (Ν1-8) και ασθενείς με AD (Α1-8), με χρήση της τεχνικής Dot Blot ΑUC = 0,70
Πρωτεολυτική δράση καλπαΐνης σε δείγματα σιέλου 1 2 3 4 5 6 7 8 Καζεϊνογράφημα για τον εντοπισμό πρωτεολυτικής δράσης καλπαΐνης σε δείγματα σιέλου υγιών (σειρές 1-3), ασθενών με MCI (σειρές 4-6) και ασθενών με AD (σειρές 7 και 8 Shintani-Ishida and Yoshida (2015)
Ανίχνευση αυτο-αντισωμάτων N1 N2 N3 N4 N5 M1 M2 M3 M4 M5 A1 A2 A3 A4 A5 Control Diss. Control Diss. Control Diss. Εμφάνιση της GFAP σε δείγματα σιέλου από νευρολογικά υγιείς (Ν1-5), ασθενείς με MCI (M1, Μ3-6) και ασθενείς με AD (Α3, Α4, Α6, Α8, Α14) με χρήση της τεχνικής Dot Blot, έπειτα από όξινη αποδιάταξη (Diss). Είδος πληθυσμού Αριθμός δειγμάτων Μεταβολή ανοσοσήματος (%) Control 11 12,15 (±7,84) MCI 12 18,08 (±7,99) AD 11 13,54 (±5,75) Ελάχιστη/μέγιστη Μεταβολή Τυπική μεταβολή σε σχέση με απόκλιση ανοσοσήματος (%) control (%) 0/34,06 11,67-2,99/42,55 12,58 +48,80 1,61/29,78 8,56 +11,44
Ανίχνευση κυτταροκινών σε σίελο και ορό TNFα Μεταβολή Δείγμα Είδος πληθυσμού Αριθμός δειγμάτων OD κηλίδας Dot Blot Ελάχιστο/μέγιστο Ανοσοσήμα Τυπική απόκλιση σε σχέση με control (%) Σίελος Ορός Control 11 0,298 (±0,093) 0,048/0,482 0,138 - MCI 12 0,289 (±0,110) 0,006/0,614 0,174-3,02 AD 11 0,103 (±0,006) 0,06/0,145 0,023-65,44 Control 17 0,203 (±0,047) 0,093/0,419 0,092 - AD 15 0,214 (±0,045) 0,120/0,366 0,081 5,14 Εμφάνιση του TNFα σε δείγματα σιέλου (αριστερά ) και ορού (δεξιά) από νευρολογικά υγιείς (Ν), ασθενείς με MCI (M) και ασθενείς με AD (Α), με χρήση της τεχνικής Dot Blot. IL-6 Δείγμα Σίελος Ορός Είδος πληθυσμού Αριθμός δειγμάτων OD κηλίδας Dot Blot Ελάχιστο/μέγιστο Ανοσοσήμα Τυπική απόκλιση Μεταβολή σε σχέση με control (%) Control 11 0,144 (±0,051) 0,008/0,288 0,075 - MCI 12 0,126 (±0,041) 0,005/0,192 0,064-12,50 AD 11 0,116 (±0,062) 0,010/0,264 0,092-19,44 Control 17 0,082 (±0,009) 0,057/0,118 0,017 - AD 15 0,104 (±0,020) 0,044/0,172 0,037 26,83 P=0,00398 Εμφάνιση της IL-6 σε δείγματα σιέλου (δεξιά) και ορού (αριστερά) από νευρολογικά υγιείς (Ν), ασθενείς με MCI (M) και ασθενείς με AD (Α), με χρήση της τεχνικής
Συσχέτιση επιπέδων κυτταροκινών με GFAP Κυτταροκίνη TNFα IL-6 Δείγμα Σίελος Ορός Σίελος Ορός Ομάδα Control MCI AD Control AD Control MCI AD Control AD R (GFAP) 0,70 0,80 0,72 0,43 0,34 0,77 0,90 0,53 0,41 0,33 F (GFAP) 0,02 0,002 0,01 0,08 0,20 0,006 10-5 0,09 0,10 0,23 Σίελος Σίελος Σίελος Control: R=0,88 F=0,0004 AD: R=0,83 και F=0,002
Συμπεράσματα Η GFAP εντοπίζεται μειωμένη στο σίελο ασθενών με MCI (-17,68%, p=0,4063) και στους ασθενείς με AD (-59,09%, p=0,0090) H GFAP εντοπίζεται αυξημένη στον ορό ασθενών με AD (+17,05%, p= 0,0475) και ROC AUC=0,70 (Mayer et al. 2013) H GFAP σιέλου αξίζει να μελετηθεί ως πιθανός διαγνωστικός δείκτης (ROC AUC = 0,81) Στο σίελο εντοπίζεται έντονη δραστικότητα ενός είδους καλπαΐνης (πιθανότατα της m) Στο σίελο εντοπίζεται υψηλό ποσοστό αυτο-αντισωμάτων κυρίως στους MCI ασθενείς αλλά και στους AD Ο TNFα εντοπίζεται μειωμένος στο σίελο ασθενών με MCI (-3,02%) και ασθενών με AD (-65,44%) και αυξημένος στον ορό ασθενών με AD (+ 5,14%) H IL-6 εντοπίζεται μειωμένη στο σίελο ασθενών με MCI (-12,50%) και ασθενών με AD (-19,44%) και στατιστικά σημαντικά αυξημένη στον ορό ασθενών με AD (+26,33%) Στατιστικά σημαντική συσχέτιση των κυτταροκινών με τα επίπεδα GFAP και μεταξύ τους εντοπίζεται μόνο στο σίελο
Σας ευχαριστώ πολύ για την προσοχή σας! Ευχαριστίες ακόμα Αν. Καθηγήτρια (Βιοχημείας) Αναστασία Πανταζάκη (Επιβλέπουσα) Καθηγήτρια (Νευρολογίας) Μαγδαληνή Τσολάκη (Παραχώρηση βιολογικών δειγμάτων) Οικογένεια, φίλοι, συνάδελφοι για την υποστήριξη