May 2014 Watermicro-eclass 2610969874 Τεύχος 2 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ ΕΞ ΑΠΟΣΤΑΣΕΩΣ Lab-on-a-chip: οι τεχνικές του μέλλοντος στην ανίχνευση μικροοργανισμών Στον τομέα της μικροβιολογικής διάγνωσης υπάρχει συνεχής ανάγκη για τεχνικές που δίνουν αποτελέσματα στον μικρότερο δυνατό χρόνο. Σε σχέση με τις συμβατικές τεχνικές καλλιέργειας μικροοργανισμών οι μοριακές δοκιμές και οι ανοσολογικές δοκιμασίες προσφέρουν ταχύτερα αποτελέσματα. Όμως ο χρόνος ανίχνευσης εξακολουθεί να είναι σημαντικός, απαιτείται καλά οργανωμένο, εξειδικευμένο εργαστήριο και προσωπικό και συνήθως είναι σχεδιασμένες για την αναγνώριση συγκεκριμένων παθογόνων. Στα τέλη της δεκαετίας του 80 άρχισε η σοβαρή ανάπτυξη της τεχνολογίας Lab-on-a-chip στην Ευρώπη, με μικροαντλίες και ανιχνευτές ροής για αναλυτικά συστήματα. Εξέλιξη αυτού υπήρξε η ανάπτυξη πρωτόκολλων πλήρους ανάλυσης χημικής και βιολογικής. Το ενδιαφέρον για διαστημικές και στρατιωτικές εφαρμογές οδήγησε σε ανάπτυξη του κλάδου. Το ηλεκτρονικό τσιπ, σχεδιασμένο με την μορφή βιοαισθητήρα (biosensor) έχει προσφέρει την δυνατότητα ταυτόχρονης ανάλυσης για τον ταυτόχρονο εντοπισμό πολλών παθογόνων ή για παράλληλες δοκιμασίες παρουσίας ειδικών αλληλόμορφων αντοχής σε αντιβιοτικά. Τέτοιο πολλαπλό σύστημα αναγνώρισης, σε συνδυασμό με εξαρτήματα μορφής τσιπ, έχει διευκολύνει την ανάπτυξη φορητών συσκευών μεγέθους παλάμης χεριού ή ακόμα και τηλεφωνικής κάρτας, για διάγνωση παρουσίας παθογόνων σε κλινικά δείγματα ή στο περιβάλλον. Υπάρχουν πλατφόρμες που ανιχνεύουν 10 12 παθογόνα σε ένα τεστ. Τα τσιπ και η μοριακή τεχνολογία ενώνονται στην μορφή μικρο-συστοιχιών. Χιλιάδες μονάδες νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών μπορεί να αποτεθούν επί στερεάς επιφάνειας (το τσιπ) μικρότερης από αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου. Στην περίπτωση των συστοιχιών DNA χημικοί δεσμοί ανάμεσα στον ανιχνευτή αναφοράς (reference probe) και της συμπληρωματικής αλληλουχίας στον μικροοργανισμό-στόχο του δείγματος δίνει πληροφορία για τις αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων του δείγματος. Για τις πρωτεΐνες οι ανάλογες αντιδράσεις συμβαίνουν μεταξύ αντιγόνων και αντισωμάτων. Περιεχόμενα Lab-on-a-chip: οι τεχνικές του μέλλοντος στην ανίχνευση μικροοργανισμών. 1 Τυποποίηση περιβαλλοντικών στελεχών Pseudomonas aeruginosa απομονωμένα από υδάτινα περιβάλλοντα του Ελλαδικού χώρου. 2 Τα νέα μας 4 Εναλλακτικές Τεχνολογίες Απολύμανσης. 2 Κολυμπώντας με το Κρυπτοσπορίδιο-Ένα αναδυόμενο παθογόνο. 3
2 Εναλλακτικές Τεχνολογίες Ανιχνεύονται ένζυμα που δημιουργούνται από μικροβιακά μεταβολικά μονοπάτια. Για παράδειγμα υπάρχει στην αγορά μικροανιχνευτής παρουσίας E.coli που ανιχνεύει την παρουσία β-γαλακτοσιδάσης, ενζύμου που εμπλέκεται στη ζύμωση λακτόζης. Η αρχή της ELISA επίσης έχει αξιοποιηθεί σε μικροκλίμακα. Το ίδιο και η PCR. Χαρακτηριστικό των μικροσυσκευών είναι το μικρό τους μέγεθος (εύκολα μεταφερόμε- νες και ελαφρές), καθώς και η ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων (συχνά λίγα λεπτά). Προσφέρουν υψηλή επαναληψιμότητα, χρησιμοποιούν μικρούς όγκους υγρών. Έχουν ευκολία στη χρήση, δεν απαιτείται εξειδικευμένο προσωπικό. Μεγάλο χρόνο ζωής και αντοχή σε αντίξοες συνθήκες, άρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε υποανάπτυκτες χώρες. Ποσοτικά πολλαπλά αποτελέσματα επιτρέπουν την ταχύτερη λήψη αποφάσεων. Απολύμανσης Καθώς οι καταναλωτές αυξάνουν τη ζήτησή τους για ασφαλή, φρέσκα (fresh like) και ποιοτικά υγρά τρόφιμα με μεγαλύτερο χρόνο ζωής, εμφανίζεται μεγαλύτερο ενδιαφέρον για ικανές τεχνολογίες που παράγουν υψηλής ποιότητας προϊόντα. Οι μη θερμικές - πράσινες τεχνολογίες εφαρμόζονται στην επεξεργασία των υδάτων ως σημαντικές εναλλακτικές προτάσεις στη διαδεδομένη χλωρίωση. Μια πολλά υποσχόμενη τεχνολογία απολύμανσης είναι η χρήση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη χρήση UV θανατώνονται όλοι οι επικίνδυνοι μικροοργανισμοί παράγοντας ένα τελικό προϊόν ασφαλές και απαλλαγμένο από μικροοργανισμούς. Η υπεριώδης ακτιvοβολία έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς και για την εξόντωση παρασίτων όπως η Giardia και το Cryptosporidium. Μειονέκτημα είναι το κόστος ανταλλακτικών ανά εξεταζόμενο δείγμα. Επίσης η τεχνολογία δεν είναι πλήρως δοκιμασμένη στο πεδίο. Φυσικά και χημικά φαινόμενα παρουσιάζουν ελαφρώς διαφορετικές συμπεριφορές σε μικροκλίμακα, οφειλόμενες σε τριχοειδείς δυνάμεις και χημικές αλληλεπιδράσεις. Έρευνα γίνεται και βελτιώσεις εισάγονται τα τελευταία χρόνια και προς τις δυο αυτές κατευθύνσεις, καθώς και στην κατεύθυνση της αύξησης της ποικιλίας των παθογόνων που ανιχνεύονται. Εναλλακτικές Τεχνολογίες Απολύμανσης. Οι σύγχρονες αυτές μικροσυσκευές έχουν σημαντικές εφαρμογές για την ταχεία διάγνωση κλινικών δειγμάτων. Η σημασία τους για περιβαλλοντικά δείγματα είναι επίσης πολύ σημαντική. Επιτρέπουν τον έλεγχο της ποιότητας νερού επί τόπου (σε πηγή υδροληψίας, σε μικρά/μεμονωμένα συστήματα υδροδότησης, σε νερό κολύμβησης κλπ) χωρίς την μεσολάβηση διαδικασιών δειγματοληψίας, μεταφοράς δείγματος, επεξεργασίας στο εργαστήριο. Επίσης μηδενίζουν τον χρόνο που απαιτείται για εφαρμογή καλλιεργητικής ή μοριακής τεχνικής στο εργαστήριο. (Μ.Ευστρατίου, επίκουρος καθηγήτρια, Παν.Αιγαιου) Cryptosporidium parvum (Α.Μπίρμπα, Γεωπόνος, MSc)
3 ''Τυποποίηση περιβαλλοντικών στελεχών Pseudomonas aeruginosa απομονωμένα απο υδάτινα περιβάλλοντα του Ελλαδικού χώρου με τρείς τυποποιητικές μεθόδους: Οροτυποποίηση, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) και Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)'' Ο.Παππα, Γ. Μανδηλαρά, Α. Βατόπουλος και Α. Μαυρίδου. Η μελέτη της ποικιλομορφίας σε γονοτυπικό και φαινοτυπικό επίπεδο που παρατηρείται σε στελέχη του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa, που απομονώνονται από υδάτινα περιβάλλοντα, είναι μεγάλης σημασίας υπό το πρίσμα της δημόσιας υγείας, λόγω της πανταχού παρουσίας του, αλλά και της παθογένειάς του. Μοριακές (Random Amplified Polymorphic DNA και Pulsed Field Gel Electrophoresis) και φαινοτυπικές (Οροτυπία) μέθοδοι εφαρμόστηκαν σε στελέχη (70) που απομονώθηκαν από υδάτινα περιβάλλοντα του Ελλαδικού χώρου (δίκτυο ύδρευσης, πισίνες, πηγάδια, γεωτρήσεις, νερό πηγής). Η τυποποιητική και διακριτική ικανότητα των μεθόδων μελετήθηκαν και συγκρίθηκαν σύμφωνα με κριτήρια που προτείνονται από τους Belkum Van et al (2007). Με την Οροτυπία τυποποιήθηκε το 38.6% των στελεχών, το οποίο κατανεμήθηκε σε 10 διαφορετικούς ορότυπους. Ο O:11 ήταν αυτός που επικράτεί. Η διακριτική ικανότητα της μεθόδου ήταν χαμηλή (0.82) εξαιτίας του ότι το 37% των στελεχών που οροτυποποιήθηκαν τοποθετήθηκε στον ορότυπο O:11, ενώ υψηλό ήταν και το ποσοστό των Rough στελεχών (17,1%). Σαράντα-εννέα από τα 70 στελέχη (70%) τυποποιήθηκαν με την RAPD-PCR και ομαδοποιήθηκαν σε 18 τύπους. Ενδιαφέρον είναι ότι το 75% των στελεχών που εμφάνισαν τον Rough φαινότυπο κατά την οροτυποποίηση και το 58% αυτών που χαρακτηρίστηκαν ως ατυποποίητα, χαρακτηρίστηκαν επιτυχώς με τη γονοτυπική μέθοδο. Η διακριτική ισχύς της μεθόδου υπολογίζεται ότι είναι 0.95, η οποία θεωρείται ιδανική. Ο συνδυασμός φαινοτυπικών και μοριακών τυποποιητικών μεθόδων είναι απαραίτητη κατά τη διάρκεια μιας επιδημιολογικής μελέτης. Στη παρούσα μελέτη, ο προσδιορισμός του οροτύπου χρησιμοποιείται ως η πρότυπη φαινοτυπική μέθοδος. Όμως, ο συνδυασμός της με την PFGE και την RAPD αύξησε ακόμη περισσότερο την διακριτική ικανότητα (0.97 και 0.95 αντίστοιχα), παράγοντας αξιόπιστα αποτελέσματα. Εμφανίσθηκαν πολλοί και διαφορετικοί κλώνοι που φαίνεται να κυκλοφορούν στα υδάτινα περιβάλλοντα του Ελλαδικού χώρου. Κολυμπώντας με το Κρυπτοσπορίδιο-Ένα αναδυόμενο παθογόνο Το Cryptosporidium συναντάται σε όλο τον κόσμο. Κατά τα 20 τελευταία χρόνια αναγνωρίστηκε στις ΗΠΑ ως μία από τις πιο κοινές αιτίες υδατο-γενούς ανθρώπινης ασθένειας (πόσιμο νερό ή πάρκα ανα-ψυχής). Οι περισσότερες γα-στρεντερίτιδες που εκδηλώ-νονται μετά από χρήση πισίνας, οφείλονται στο παράσιτο αυτό. Το ποσοστό μόλυνσης μπορεί να φτάσει και στο 47% για τακτικούς χρήστες πισίνας που δέχεται πολύ κόσμο και δεν γίνεται τακτική ανανέωση του νερού της. Πολύ λίγοι μικροοργανισμοί είναι αρκετοί να προκαλέσουν συμπτώματα μετά από κατάποση νερού πισίνας (2-10 ωοκύστεις). Τα συμπτώματα γενικά εμφανίζονται 2-10 ημέρες μετά από τη μόλυνση. Συνήθως διαρκούν περίπου 2 εβδομάδες σε άτομα με υγιή ανοσοποιητικά συστήματα, ωστόσο το παράσιτο μπορεί να συνεχίζει να περνά στα κόπρανα για διάστημα μέχρι και 2 μηνών. Παραμένει μολυσματικό για 2-6 μήνες εκτός σώματος. (M.Μπέλου, Βιολόγος)
4 Watermicro-eclass Πανεπιστήμιο Πατρών Ιατρική Σχολή 26504, Πάτρα 2610969874 Fax: 2610969875 info@watermicro-eclass.net Επισκεφθείτε μας στην τοποθεσία Web http://www.watermicroeclass.net Τα νέα μας Το e-class προετοιμάζεται να υποδεχθεί τους σπουδαστές του στο εργαστήριο Υγιεινής του Πανεπιστημίου Πατρών για το τριήμερο πρακτικό σεμινάριο, με σκοπό τη καλύτερη κατάρτιση τους σε εργαστηριακά θέματα. Το σεμινάριο θα διεξαχθεί 26-28 Μαΐου περισσότερες πληροφορίες θα βρείτε στην ιστοσελίδα μας. Οι καθηγητές του προγράμματος συνέγραψαν το βιβλίο «Μικροβιολογία & Επιδημιολογία Νερού: Θεωρία και Τεχνικές», για τις ανάγκες του προγράμματος, που αποτελεί ένα σύγχρονο εργαλείο με νέα δεδομένα των τελευταίων χρόνων στη Μικροβιολογία-Επιδημιολογία του υδάτινου περιβάλλοντος. Καθώς το πρόγραμμα κατάρτισης εξ αποστάσεως ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ φτάνει για ακόμη μια χρονιά στο τέλος του, θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τους σπουδαστές μας για την συμμετοχή τους καθώς και να τους συγχαρούμε για την μεγάλη προσπάθειά τους, που αποδεικνύεται από τις υψηλού επιπέδου εργασίες που παρέδωσαν. Έκδοση της Συντονιστικής Επιτροπής του Προγράμματος Κατάρτισης Μικροβιολογία του Νερού, με το οποίο ενημερώνει τους σπουδαστές του αλλά και κάθε ενδιαφερόμενο με επίκαιρα νέα και θέματα που αφορούν στο χώρο των υδάτων.