Curs : Microbiologie generala

Curs : Microbiologie generala Conceptul modern de microorganism Microorganismele reprezintă un grup foarte heterogen de organisme care au în comun câteva particularităţi generale definitorii: 1) dimensiuni foarte mici, microscopice, care fac ca aceste organisme să nu poată fi vizibile ca indivizi izolaţi decât la microscop, astfel că de obicei sunt studiate ca populaţii omogene sau culturi pure; în natură, pot fi observate uneori ca pelicule sau biofilme dezvoltate pe diverse suprafeţe; dimensiunile sunt apreciate după sistemul metric actual, în μm, iar substructurile în nm sau Å; 2) organizare celulară; teoria celulară (Schleiden şi Schwan, 1838), a reprezentat o importantă generalizare pe care s-a fundamentat biologia modernă, postulând că toate organismele sunt alcătuite din celule; deci microorganismele au o organizare celulară, de tip procariot sau eucariot; 3) sunt sisteme biologice, deci prezinta particularităţile viului; sistemele biologice cele mai rudimentare sunt bacteriile, care însumează trăsăturile minime ce caracterizează viaţa, reunind atributele de: organizare celulara, autonomie (metabolism propriu), invarianţă (informatie genetica ce codifica toate proprietatile acestor celule si transmisa descendentilor, ceea ce asigura mentinerea speciilor); 4) raport mare între suprafaţă şi volumul celular, deoarece o celulă reprezintă chiar un organism; această particularitate favorizează strategia de supravieţuire a microorganismelor în natură, pentru că acest raport influenţează capacitatea de interacţiune cu mediul, respectiv viteza schimburilor de substanţe dintre organism şi mediu, care stă la baza intensităţii mari a metabolismului, ca şi a vitezei mari de multiplicare. Tot ce poate fi definit prin aceste patru particularităţi este considerat la ora actuală microorganism; rezultă că această noţiune este un concept integrator, fără valoare taxonomică. Principalele grupe de microorganisme, având ca reper organizarea celulară, sunt: PROKARYOTES = MONERA EUBACTERIA diferenţiate în două mari grupe: bacterii Gram pozitive şi negative CYANOBACTERIA ARCHAEA (grupeaza microorganisme cu organizare celulara de tip procariot, anterior incadrate intre bacterii; în prezent sunt încadrate în Domeniul ARCHAEA organisme care la nivel molecular sunt mai asemanatoare cu eucariotele decat cu bacteriile). - EUKARYA MICROFUNGI: unicelulari - Levuri (= Drojdii) şi filamentoşi = Mucegaiuri MICROALGE PROTOZOARE Archaeele au fost descoperite de Woese în 1980 în apa hipersalină a lacurilor din peninsula Sinai. Aceste microorganisme cu organizare celulară de tip procariot, sunt considerate ca fiind adevarate fosile vii, reprezentând formele actuale ale unor organisme apărute în condiţiile primordiale ale vieţii pe pământ. Pe baza unor criterii de biologie moleculară (de ex., prin secvenţierea moleculelor de ARNr 16S), în prezent sunt considerate mai asemănătoare cu eucariotele, decât cu procariotele, reprezentând o direcţie de evoluţie aparte, dintr-un strămoş comun, ceea ce explică reîncadrarea lor taxonomică. Moleculele ARNr (16S pentru domeniile Bacteria si Archaea si 18S pentru domeniul Eukarya) sunt inalt conservate, fiind considerate adevarate cronometre moleculare, astfel ca datele obtinute prin secventierea lor sunt utile pentru stabilirea distantelor filogenetice si respectiv a gradului de inrudire dintre specii. 1

Microorganismele archaeene prezintă o afinitate pentru nişe ecologice speciale, fiind considerate microorganisme extremofile, cu particularitati structurale şi activităţi metabolice neobişnuite; sunt clasificate în trei grupe fiziologice:metanogene, termoacidofile, halofile Poziţia microorganismelor în sistemele de clasificare a lumii vii. Sistemul de clasificare propus de Whittaker (1969), acceptat si in prezent, împarte lumea vie în 5 regnuri: 1) Monera = Bacteria (Prokaryotes) 2) Pro(toc)tista 3) Fungi 4) Plantae 5) Animalia Acest sistem de clasificare demonstrează caracterul de grup heterogen al microorganismelor, care se regăsesc în primele 3 regnuri şi caracterul integrator al noţiunii de microorganism. Cel mai nou sistem de clasificare este cel pe domenii, bazat pe date de analiza filogenetica la nivel molecular, date ce au permis stabilirea cadrului conceptual necesar elaborarii sistemului de clasificare filogenetica a lumii vii in 3 domenii (Carl Woese, 1997): Domeniul Bacteria Domeniul Archaea, Domeniul Eukarya. Cum microorganismele sunt esentiale pentru pentru derularea multor cicluri biogeochimice si pentru continua functionare a biosferei, acest sistem de clasificare al lui K. Woese a clarificat aspecte privind evolutia si diversitatea microorganismelor, cu un impact puternic asupra viziunii specialistilor in ecologie generala si microbiana. Pentru taxonomia procariotelor s-au utilizat diferite sisteme si scheme de clasificare. Cu toate acestea, nu exista o clasificare a procariotelor unanim acceptata. Totusi in nici un sistem de clasificare nu sunt luate în considerare virusurile, deoarece sunt entităţi infecţioase, având relaţii cu lumea vie (pentru toate cele 5 regnuri există virusuri specifice), dar cu o organizare acelulară şi fiind particule complet inerte în mediul extern (nu cresc, nu se divid). La nivel molecular sunt mai înrudite cu celula-gazdă pe care o parazitează, decât între ele; sunt ataşate doar convenţional microorganismelor, cu care au în comun doar dimensiunile mici şi existenţa unei informaţii genetice. In lumea medicală consideră că şi capacitatea de a genera boli specifice, unele destul de asemănătoare ca simptomatologie cu cele de etiologie microbiană ar fi un caracter de asemănare. Domeniul PROKARYOTES Bacteriile au fost definite de Fr. Jacob ca fiind un,,minimum vital,, sau organismele cele mai simple, dotate cu atributele viului: organizare, autonomie, invarianţă. Reprezintă o categorie aparte de organisme unicelulare cu o morfologie caracteristică, destul de limitată, dimensiuni mici şi caractere de colorabilitate uşor de stabilit prin observaţii microscopice. Odată cu observarea unor particularităţi foarte diferite, a devenit necesară stabilirea unor caractere diferenţiale, care să permită stabilirea cu certitudine a apartenenţei unui microorganism la grupul bacteriilor. Stanier (1971) a definit bacteriile sau procariotele prin antiteză cu eucariotele, utilizând caractere discriminatorii, care stabilesc diferenţe nete între celulele procariote şi eucariote; ulterior, K. Woese a adus completari esentiale (tabel nr.1). 2

Tabel nr. 1. Conceptul de bacterie, definit prin antiteza dintre caracteristicile celulelor procariote si eucariote (adaptat dupa Stanier, 1971; Woese, 1997). Caracteristica PK EK 1. Peretele celular (P.C.) şi markeri - prezent în mod constant mureina(pg) - absent - la celula animală biochimici ai acestuia - DAP - prezent: -D-aminoacizi - la cel. vegetală- celuloza - acizii teichoici - la cel. fungică- chitina (exc. Gr. Mycoplasmelor şi G. Halobacterium); - la Archaee pseudomureina/m.neconventionala 2. Membrana plasmatică omniprezentă şi structurată la fel la toate organismele, potrivit modelului mozaicului fluid al membranei - comp.ch.: steroli absenţi - constant prezenţi (exc. Mycoplasma) -f. selectivă: permeabila pt. apa, unii ioni, - plasticitate mare la ac.graşi şi s. liposolubile, fragm.de ADN celula animală (capabilă (molecule cu Ø 0,8nm) de endocitoză), redusă la cel.veg şi fungică (cu P.C.) 3. Citoplasma - stare permanentă de gel - tranziţie permanentă curenţi citoplasmatici absenţi gel sol + curenţi citopl. - citoschelet absent - prezent 4. Ribozomii - de tip 70S (mol. de ARNr 16S - de tip 80S = semantida; struct. inalt conservata) - de tip 70 S (în organite) 5. Organite membranare - absente -prezente(mitocondrii,reticul endopl., cloroplaste, ap. Golgi) 6. Sinergonul respirator şi fotosintetic - localizate la nivelul membranei plasm., - autonome, localizate la interconectate structural şi funcţional nivelul organitelor specifice - marker: bacterioclorofila (mitocondrii şi cloroplaste) 7. Sediul şi organizarea - în citoplasmă - inf. genetică esenţială - în nucleu distinct (+ nucleol) materialului genetic - nucleoid - fără mb. nucleară delimitat de membrana nucleară 1 moleculă de ADN d.c.c.c.î. -cromozomi număr caract. = 1 cromozom bacterian (nucleosom) fiecarei specii = ADN + histone - inf. genetică accesorie - plasmide molecule de ADN d.c.c.c.î. -la niv. mitocondriilor şi = minicromozomi cloroplastelor- ADN d.c.c.c.î (conferă avantaje adaptative) - colinearitatea genelor - se succed -informatie discontinua: continuu, fara secv. non-informationale Exoni+ Introni - grd. de ploidie - haploid (1cromosom) - celule somatice diploide - celule sexuale haploide - funcţionarea materialului genetic - replicarea materialului genetic - simplu, de tip semiconservativ - prin mitoză în nucleu - de tip semiconservativ în mitocondrii şi cloroplaste - sediul traducerii informaţiei genetice: - în citoplasmă la niv. (riboz. 70S - în citoplasmă la niv riboz.80s _ (transcrierea si traducerea - cuplate) - în organite la niv. riboz. 70S 8. Multiplicarea - prin diviziune directă (binară) - prin mitoză (diviziune (rar prin înmugurire; prin fragmentare indirectă) - în cel.somatice şi sporulare - la bacteriile filamentoase) - prin meioză (reducţională) - în celulele reproducătoare - echipartiţia materialului genetic: _ - asigurată de mezosom - asigurata de aparatul mitotic 3

Continuare 9. Procese de sexualitate - excepţ., fenomene de parasexualitate - sexualitate propriu-zisă, = transfer unidirecţional, cu formare de datorită fuziunii gameţilor merozogoţi, parţial şi temporar diploizi (= zigot), prin participarea _ egală a partenerilor sexuali 10. Mecanisme de transfer de material genetic - transformare genetica, conjugare, -fuziune de gameţi, urmată transducţie genetică de fuziune nucleară, cu posibilitatea de recombinare genetică şi variabilitate 11. Mobilitatea - flageli de tip PK (facultativ) - cili şi flageli de tip EK (facult.) (cu structura 2x9+2 microtubuli) 12. Infectarea cu virusuri - prin perforarea P.C. şi injectarea - la cel. anim. prin genomului prin mec.de microseringă endocitarea virionului -la cel.veg., fungi-după lezarea P.C. 13. Sensibilitatea la antibiotice Ex: peniciline, cefalosporine, bacitracina -cicloheximide =subst.inhibitorii subst. inhibitorii ale creşterii celulare - inhibă sinteza mureinei din P.C. ale proteosintezei la EK Antibiotice = subst. cu acţiune selectivă ţinte al bacteriilor în curs de creştere; - ţinta rib.80s-efect citostatic; (structuri celulare/ reacţii de biosinteză); - inactive pe celulele eucariote; folosite în terapia infecţiilor bacteriene; -vinblastina,colchicina inhibă - streptomicina, tetracicline, cloramfenicol asamblarea microtubulilor - ţinta riboz. 70S - efect de blocare a şi diviziunea - efect citostatic; proteosintezei şi implicit a proceselor de creştere şi multiplicare; - antibiotice polienice - acţiune * nu au efect asupra celulelor EK (rib. 80S, antifungică (antimicotice), si nici asupra ribozomilor 70 S din organite active asupra sterolilor din _ (mb. mitoc.- imperm.la aceste antibiotice); plasmalema celulelor fungice. 14. Capacitatea de a forma organisme multicelulare - la PK o celulă = un organism; - la EK - -incapabile de a forma organisme pluricelulare - capacitatea de a forma organisme multicelulare este - în habitatele naturale: definitorie, celula fiind - bacterii solitare (izolate); unitatea de bază a organismului - agregate coloniale, asociaţii de celule multicelular ca întreg identice sau diferite, fiecare celulă păstrându-şi individualitatea; = biofilme microbiene - celulele beneficiază de protecţie, de un,,sistem circulator,, primitiv, de o,,homeostazie,, primitivă; - celulele disociate viabile, capabile de viata _ independenta si de colonizare de noi spaţii; 15. Capacitatea de diferenţiere celulară - la PK - rudimentară, limitată, - la EK - se extinde pe o gamă reprezentată de: largă, de la forme rudimentare, - endosporul bacterian formă de rezistenţă la celule înalt specializate, la condiţii nefavorabile de mediu, considerată culminând cu cele strict specializate: în prezent o formă primitivă de diferenţiere, - neuronul,} prezenta la bact. sporogene; -limfocitul } vertebratelor. -marker biochimic (endospor/pk) acid dipicolinic - heterochistul cianobacteriilor filamentoase celulă diferenţiată specializata in fixarea N 2 atm.; - biofilmele bacteriene -,,ţesuturi,, primitive; între celulele biofilmului se pot stabili relaţii sinergice de tip nutriţional, cu activităţi metabolice mai diverse şi mai eficiente comparativ cu celulele libere sau planctonice. 4

Anatomie bacteriană - Structuri esentiale Peretele celular. Este o structura bacteriană definitorie, prin compoziţie chimică, structura primară, secundară şi terţiară şi în general, un marker biochimic pentru procariote. Este o structură bine definită, rigidă, cu o grosime medie de 15 35 nm, care înconjoară celula bacteriană, acoperă membrana plasmatică şi poate fi străbătută de flageli, la bacteriile mobile. Evidenţiere la microscopul optic: - pe preparate proaspete, datorită refringenţei; - pe frotiuri colorate cu metode selective pentru perete celular; - la microscopul electronic cu transmisie (MET), pe sectiuni ultrafine; - prin lezarea peretelui prin metode mecanice (agitare), US, chimice, şoc osmotic, are loc eliminarea conţinutului celular şi evidenţierea peretelui celular ca un sac golit de conţinut. Desi sistemul actual de clasificare filogenetica a bacteriilor se bazeaza pe criterii oferite de biologia moleculara (Bergey s Manual of Determinative Bacteriology ultima editie fiind publicata intre 2001-2012), o schema generală de clasificare fenotipica a bacteriilor, inca foarte utila din punct de vedere practic, utilizează drept criteriu structura peretelui celular; mai exact, în funcţie de prezenţa, structura, şi gradul de dezvoltare al peretelui celular, bacteriile se împart în 4 diviziuni: 1. Diviz. FIRMICUTES (lat. firmus = tare, cutes = înveliş) = bacteriile Gram pozitive; Cls. 1. Firmibacteria bacterii cu perete celular gros, rigid, prin conţinutul mare în mureină Cls. 2. Thallobacteria bacterii filamentoase = Actinobacteria (den. veche Actinomycetes) 2. Diviz. GRACILICUTES (lat. gracilis = fragil) = bacteriile Gram negative; Cls. 1. Scotobacteria (gr. scotos= intuneric)= bacterii care se pot dezvolta in absenta luminii; Cls. 2. Photobacteria: Subcls. Oxyphotobacteria, respectiv Cyanobacteria; - Subcls. Anoxyphotobacteria bacteriile sulfuroase roşii ( Chromatiaceae); -,,,, verzi (Chlorobacteriaceae); -,, nesulfuroase roşii (Rhodospirillaceae). 3. Diviz. TENERICUTES (lat. teneri = moale) = bacteriile fără perete celular = micoplasme. Cls. Mollicutes (lat. molli = moale, pliabil), genul reprezentativ fiind Mycoplasma; sunt cele mai mici bacterii cunoscute capabile de creştere pe medii acelulare; membrana plasmatică a micoplasmelor are un caracter unic printre bacterii, in sensul ca aceasta conţine steroli care protejează celula de şocul osmotic si ii confera un polimorfism accentuat. 4. Diviz. MENDOSICUTES (lat. mendosus = fals, greşit) = care grupeaza in prezent microorganismele incadrate in Domeniul Archaea, respectiv microorganisme cu organizare celulară de tip procariot, dar care la nivel molecular sunt sunt mai asemanatoare cu eucariotele decât cu procariotele, reprezentând o directie de evolutie aparte. Astfel archaeele prezinta un perete celular fals, în compoziţia căruia intră pseudomureina sau o mureină neconvenţională (lipsită de acidul N- acetilmuramic = NAM), lipidele membranare sunt diferite, glicerolul fiind înlocuit cu acidul N acetil-talosaminuronic; alte deosebiri: structura particulară a moleculelor de ARNt, a ARNr 16S, sensibilitatea diferita la antibiotice. Archaeele sunt foarte raspândite in natura, nu doar in medii cu conditii extreme, ci si in sol, mediul marin si oceanic; au fost identificate si specii comensale, prezente in microbiota intestinala normala a omului si animalelor, participând la procesul de digestie (specii metanogene); nu au potential patogen direct. Diferenţele cele mai nete sunt însa între bacteriile Gram pozitive şi Gram negative, fiind nu doar de tinctorialitate, ci şi din punct de vedere biochimic, comportamental, antigenic şi de patogenitate. Aceasta coloratie diferentiala a fost inventata in 1884 de H.Ch. Gram, fiind o metoda ce permitea si permite in continuare diferentierea celor doua grupe mari de bacterii pe baza afinitatii lor pentru coloranti; dupa elucidarea structurii peretelui celular bacterian, au fost intelese mecanismul acestei coloratii, ca si toate implicatiile privind biologia bacteriilor. 5

Structura peretelui celular la bacteriile Gram pozitive. Bacteriile incluse in acest grup au un perete celular gros, relativ omogen, din mai multe straturi suprapuse, cu un conţinut de: - mureină in proportie de 80-90% din masa uscata, substanta care din punct de vedere chimic este un peptidoglican, numit şi mucopeptid sau mucocomplex, substanta considerata ca fiind un marker biochimic pentru procariote; - polizaharide; - proteine. Specia tip pentru aceast grup de bacterii este Staphylococcus aureus. Mureina este un heteropolimer, alcatuit din două componente, respectiv o parte peptidică şi una glicanică. Partea peptidică este constituită din tetrapeptide si punti interpeptidice; tetrapeptidele au urmatoarea secventa de aminoacizi: L-Ala - D-Glu - LR3 - D- Ala, unde natura restului R3 variaza de la o specie la alta, putând fi un aminoacid neutru- L- alanina sau L- homoserina, un aminoacid dicarboxilic acidul L-glutamic sau un aminoacid diaminat L-lizina sau un derivat al acesteia, respectiv acidul diaminopimelic DAP, derivat din lizină, cu o grupare COOH adiţională. Unităţile tetrapeptidice aparţinând lanţurilor glicanice adiacente sunt legate la rândul lor prin punţi interpeptidice formate din ~ 5 resturi de aminoaczi, astfel încât mureina are în ansamblu o structură tridimensională în reţea, în jurul celulei bacteriene. Partea glicanică are structura unor lanţuri liniare paralele, alcătuite din resturi alternante de N acetil-hexozamine: N-acetiul glucozamina - NAG şi acidul N-acetil muramic NAM, legate prin legături β 1-4. Grupările COOH ale acidului NAM furnizează puncte de legare pentru lanţurile interpeptidice, care fac legătura cu gruparea NH 2 a restului LR3. Această structură de bază a peptidoglicanului poate suferi modificări discrete care nu alterează însă arhitectura generală a moleculei (sunt descrise 8 tipuri de peptidoglican). La bacteriile cilindrice moleculele de mureină sunt formate din lanţuri de glicani aşezate în spirală faţă de axul longitudinal al celulei. Această structură este potrivită pentru creşterea peretelui celular si diviziunea celulelor, procese care se realizează printr-o continua remodelare a peretelui celular, respectiv prin sinteza de molecule de mureină sub acţiunea murein-sintetazei, moleculele nou sintetizate fiind introduse acolo unde acţionează murein-hidrolazele, desfăcând legaturile. Activitatea acestor enzime este perfect coordonată în timp şi spaţiu, creşterea peretelui celular având loc în zona centrală unde sunt localizate enzimele. Prin mecanisme de acţiune asemănătoare acestor enzime acţionează şi lizozimul (muramidaza), o proteină enzimatică, prezentă în umorile organismului (serul sanguin, secreţii), cu rol în apărarea antibacteriană nespecifică sau aşa-numita rezistenţă naturală a organismului animal şi uman. De asemenea, penicilinele sunt antibiotice care au ca ţintă de acţiune peretele celular bacterian, inhibând sinteza peptidoglicanului şi implicit procesele de creştere şi diviziune. Penicilina (si alte antibiotice β- lactamice) actioneaza prin inhibarea proteinelor care leaga penicilina (= PBP), proteine care catalizeaza in mod normal formarea legaturilor incrucisate din peretele celular bacterian. Inelul β-lactam (grupul functional) al penicilinei se leaga de enzima DD-transpeptidaza care participa la legarea moleculelor noi de peptidoglican in peretele celular in curs de crestere. Enzimele care hidrolizeaza legaturile incrucisate din peptidoglican continua sa functioneze, ceea ce conduce la slabirea peretelui celular, mergând pâna la citoliza sau moartea celulei bacteriene datorita lizei osmotice. In plus, formarea de precursori ai peptidoglicanului atrage dupa sine activarea hidrolazelor si autolizinelor din peretele celular, care vor digera mai departe peptidoglicanul existent. Acest dezechilibru intre sinteza si degradarea mureinei este responsabil de actiunea bactericida rapida a acestei clase de antibiotice, chiar in absenta procesului de diviziune celulara. Mai mult, dimensiunea relativ mica a moleculelor de penicilina permite patrunderea lor in profunzimea peretelui celular, afectându-l in totalitate, spre deosebire de alte clase de antibiotice care inhiba sinteza peretelui celular, cum ar fi glicopeptidele (vancomicina) ale caror molecule sunt de dimensiuni mai mari. Penicilina prezinta un efect sinergic cu aminoglicozide (streptomicina, gentamicina, kanamicina, neomicina etc.), deoarece inhibarea sintezei de peptidoglican permite aminoglicozidelor sa patrunda prin peretele celular mai usor, permitând actiunea lor specifica, respectiv inhibarea proteosintezei din celule. 6

Rigiditatea sacului de mureină este determinată de legăturile încrucişate foarte numeroase, de alternanţa aminoacizilor dextro- şi levogiri din tetrapeptide în care legăturile sunt mai compacte decât între orice tip de monomeri, de legăturile β-1,4 din lanţurile glicanice care fac aceste molecule să fie foarte compacte, asemănătoare celor din constituţia chitinei. În plus, acestor legături li se adaugă şi punţile de hidrogen. Rigiditatea sacului de murină este relativă totuşi, astfel că poate suferi flexiuni, cum ar fi de ex. la spirochete. De asemenea, legăturile încrucişate confera o oarecare flexibilitate, ceea ce permite mărirea şi micşorarea volumui celular în condiţiile modificării presiunii osmotice. Bacteriile patogene au numeroase legături încrucişate şi sunt mai rezistente la acţiunea lizozimului. În compoziţia peretelui celular intră şi polizaharide caracteristice pentru procariote, respectiv acizi teichoici (gr. teichos = zid), care se prezintă sub forma unor molecule lungi, flexibile formate din 1,5 poliribitol-fosfat şi 1,3 poliglicerol-fosfat (legaturi fosfodiesterice) şi diferiţi substituenţi care le imprimă specificitate (zaharuri, colină, D-Ala). Aceste molecule sunt ancorate cu o extremitate de straturile interne de peptidoglican (acizi teichoici de perete prezenţi la anumite specii) sau de membrana plasmatică (acizi lipoteichoici prezenţi la toate bacteriile), cealaltă extremitate fiind liberă, expusă la exterior. Acizii teichoici pot fi şi excretaţi, ca molecule solubile. Acizii teichoici intervin în transportul unor ioni, în procesul de diviziune normală, ca receptori de fagi, iar la bacteriile patogene constituie un factor de virulenţă, făcând parte din categoria adezinelor, respectiv a structurilor de suprafaţă cu rol în aderenţa bacteriilor la substratul celular sensibil prima etapă a unui proces infecţios; au şi un rol antifagocitar, opunându-se fagocitozei, proces realizat de către celulele fagocitare ale gazdei, care fac parte din prima linie de apărare, nespecifică a organismului. Datorită compoziţiei lor specifice, permit caracterizarea şi diferenţierea bacteriilor Gram pozitive prin metode imunologice, cu ajutorul unor antiseruri specifice faţă de diferite tipuri de acizi teichoici şi prin evidenţierea reacţiilor Ag-Ac. Proteinele se constituie în aşa-numitul strat S, reprezentat de două straturi proteice paracristaline. Acest strat face parte dintre cele mai primitive structuri parietale, fiind prezent la toate eubacteriile şi la majoritatea archaeelor. Semnificaţie biologică. Cu excepţia bacteriilor care au dezvoltat strategii pentru a trăi în condiţii foarte specializate, adesea extreme, care fac posibilă prezenţa monoculturilor, majoritatea lor trebuie să supravieţuiască în comunităţi multispecifice şi deci în habitate înalt competitive. Se consideră că stratul S are rol de protecţie, de sită moleculară, de capcană pentru molecule şi ioni. De asemenea, se consideră că stratul S este implicat în adeziunea celulară şi recunoaştere şi constituie regiunea-cadru care determină şi menţine forma celulelor la acele archaee la care stratul S este unicul component al peretelui celular. Bacteriile Gram pozitive au capacitatea de a sintetiza şi elibera în mediu metaboliţi, respectiv exoenzime şi exotoxine (gr. exo = în afară). Deci degradarea nutrienţilor are loc sub acţiunea exoenzimelor în mediul extracelular, moleculele cu g.m. mai mică fiind apoi preluate în celule. Sunt favorizate bacteriile Gram pozitive din mediile naturale bogate în nutrienţi şi cu mare densitate populaţională, pentru că moleculele rezultate prin biodegradare sunt folosite de populaţia respectivă. Toxinele sunt otrăvuri microbiene care afectează profund iniţierea şi evoluţia unei infecţii, deoarece o singură toxină poate face ca un microorganism să fie patogen şi foarte virulent. Nu numai bacteriile parazite produc toxine, ci şi bacteriile saprotrofe (Clostridium botulinum). Exotoxinele bacteriene sunt produse în cea mai mare parte de către bacteriile patogene Gram pozitive (deşi şi unele bacterii Gram negative au această capacitate). Sunt toxine puternice, care odată eliberate în mediu, se dizolvă în sânge şi circulă în organism, ajungând la situsul lor de acţiune (manifestă cito/histotropism) şi determinând apariţia manifestărilor caracteristice unor boli specifice, cum ar fi: botulismul alimentar, tetanosul, difteria etc. Sinteza şi eliberarea din celulele producătoare are loc în faza de multiplicare activă a celulelor, iar concentraţia lor în mediu este maximă când creşterea bacteriană a atins punctul maxim. Toxinele purificate au o toxicitate mult mai mare, comparativ cu cea a filtratelor culturilor bacteriene apartinând unor specii toxigene. Deoarece exotoxinele sunt proteine, moleculele lor sunt sensibile la caldură (termolabile) şi la substanţe chimice care reacţionează în mod normal cu proteinele. De exemplu, toxinele supuse acţiunii formaldehidei îşi pierd toxicitatea, transformându-se în anatoxine sau toxoizi care îşi 7

păstrează însă capacitatea de a declanşa un răspuns imun dacă sunt introduse intr-un organism imunocompetent. Exploatarea acestor proprietăţi conduce la obţinerea anatoxinelor difterică şi tetanică utilizate în imunizarea activă antidifterică şi respectiv antitetanică. Fiind de natură proteică, multe exotoxine pot fi inactivate sau chiar distruse de enzimele proteolitice intestinale. Face excepţie toxina botulinică, a cărei toxicitate se intensifică după o proteoliză limitată, prin expunerea unor grupări de toxicitate anterior mascate. Multe dintre toxinele bacteriene au utilizari medicale (terapie, imunoprofilaxie), ca si in cercetare. Peretele celular la bacteriile Gram negative (Gracilicutes) Specie tip Escherichia coli (din Fam. Enterobacteriaceae). Peretele celular al acestor bacterii are o structură specifică: conţine doar 8-10% mureină, lipsesc acizii teichoici; de asemenea, apare o structură suplimentară numită membrana externă, o copie a membranei plasmatice. Peretele celular este alcătuit din 2 componente majore: - complexul peptidoglican - lipoproteină (G = 1,2 5 nm); PG-LP; - membrana externă (G = 5-20 nm); conţine: lipide 35%, proteine 15% şi LPS 50%; o dublu strat fosfolipidic în care sunt inclavate LPS şi diferite categorii de proteine, dintre care semnificative sunt porinele, organizate sub formă de trimeri legaţi necovalent de PG, în care se continuă; aceşti trimeri formează un canal central cu Ø de 1nm, prin care pot trece molecule mici; au şi rol de receptori de fagi. Spaţiul dintre cele 2 membrane este numit spaţiu periplasmic; la acest nivel se află complexul PG - LP, format din lanţuri scurte de PG, de care sunt ataşate prin porţiunea proteică LP, care menţin membrana externă ataşată de PG. La nivelul membranei externe se află LPS şi proteine. LPS sau endotoxinele sunt alcătuite din lipidul A care este toxic, inserat în membrana externă şi lanţuri de polizaharide care formează aşa-numitul Antigen O, care are variabilitate antigenică (maximă în cazul genului Salmonella). În spaţiul periplasmic există şi proteine de legare cu rol de transport, molecule de oligozaharide implicate în procesele de osmoreglare (determină presiunea optimă, pentru a face faţă presiunii interne care împinge membrana internă spre exterior) si enzime: RN-aze, DN-aze, penicilinază, hidrolaze. Fragilitatea bacteriilor Gram negative este dată de cantitatea mică de mureină, de prezenţa spaţiului periplasmic, ca şi a membranei externe. Membrana externă este mai puţin fluidă şi mai puţin permeabilă la molecule hidrofobe (antibiotice), mai rezistentă şi la atacul sărurilor biliare, ceea ce explică existenţa bacteriilor Gram negative în număr mare în intestin (atât a celor ce fac parte din microbiota intestinală normală, cât şi a unor bacterii alohtone). Semnificaţia biologică a peretelui celular este o structură de rezistenţă mecanică, ce menţine întreaga structură a celulei, conferă formă celulei bacteriene, rigiditate, +/- elasticitate. - asigură protecţie faţă de şocul osmotic (se opun presiunii osmotice a mediului intracelular, asigurand integritatea celulelor bacteriene); - participă la procesele de creştere şi de diviziune, mai exact la formarea septului transversal de diviziune; conţine enzime active în procesul de sporogeneză (la bacteriile Gram pozitive sporogene); - are rol în procesele de schimb între celula bacteriană şi mediu (transportul nutrientilor, ca si al produsilor de metabolism); - la nivelul peretelui celular sunt localizaţi receptori pentru bacteriofagi, ca şi suprafeţe de recunoaştere şi legare a altor bacterii, cu rol în formarea cuplurilor de conjugare; - anumite componente structurale ale peretelui celular bacterian fac parte din categoria generica a adezinelor, care mediaza legarea sau aderenta bacteriilor la diverse suprafeţe, inerte din mediul natural sau celulare, la nivelul unor receptori specifici (de pe suprafata plantelor, ca si de pe tegumente si mucoasele organismelor animale). La bacteriile Gram negative, prezenţa unor structuri suplimentare conferă noi funcţii peretelui celular; astfel: 8

Membrana externă - funcţionează ca o barieră suplimentară de permeabilitate, ca o sită moleculară ce opreşte pătrunderea unor molecule ce depăşesc o anumită masă, - conţine proteine de transport: porine şi sisteme active de transport, specifice (permeaze); - are acţiune antifagocitară, având efect chimiotactic negativ asupra fagocitelor sau opunându-se contactului cu membrana acestora şi contribuind astfel, indirect, la virulenţa bacteriilor patogene; - prezintă proteine receptori cu funcţii specifice de înglobare a anumitor substanţe - vitamina B 12, maltoză, maltodextrine, fier (proteine specifice de chelare si transport al fierului in celule, numite generic siderofori); - prin LPS, mai exact prin Antigenul O, bacteriile capătă personalitate biochimică şi imunologică, care permite identificarea serogrupurilor bacteriene (de ex., la Salmonella sp, au fost identificate peste 65 de serogrupuri); - Lipidul A are acţiune toxică fiind numit si endotoxină, care este termostabilă si determină, în cazul eliberării masive în circulaţie în infecţiile sistemice sau generalizate asa-numitul şoc endotoxic caracterizat prin: febră mare, colaps circulator, coagulare intravasculară diseminată (C.I.D.), ceea ce determina o conduita terapeutica diferentiata in cazul infectiilor sistemice cu bacterii Gram negative. Lipidul A având o structură înalt conservată, aceste fenomene patologice sunt aceleaşi indiferent de specia bacteriană implicată. Spre deosebire de exotoxine, endotoxinele sunt termostabile, proprietate care are implicatii de ordin practic. Spatiul periplasmic este considerat un compartiment pericelular adaptativ, in care are loc degradarea enzimatica a nutrientilor cu g.m. mare la molecule mai mici, care aflându-se in vecinatatea membranei, sunt transportate integral (prin mecanisme de transport pasiv sau activ) si utilizate in celula bacteriana in metabolismul energetic sau de biosinteza al acesteia. Prezenta acestui spatiu confera bacteriilor Gram negative o eficienta mai mare a procesului de nutritie, cresterea acestor bacterii fiind favorizata in mediile sarace in nutrienti sau oligotrofe, cum sunt mediile acvatice, in general. Bacteriile incadrate in Cls. Mollicutes, cu genul reprezentativ Mycoplasma sunt bacterii lipsite de perete celular (in mod natural). Sunt cele mai mici bacterii cunoscute capabile de creştere pe medii acelulare; membrana plasmatică a micoplasmelor are un caracter unic printre bacterii, in sensul ca aceasta conţine steroli care protejează celula de şocul osmotic si ii confera un polimorfism accentuat; datorită dimensiunilor mici şi lipsei peretelui celular celulele traversează majoritatea filtrelor bacteriologice. Exista specii de micoplasme saprotrofe, comensale si parazite la om si animale (implicit patogene) - de o maniera unica, respectiv micoplasmele sunt paraziti de suprafata ai celulelor gazdei, fiind tolerate la acest nivel datorita asemanarii structurale a membranelor celulelor animale si micoplasmelor. Indepartarea peretelui celular bacterian. S-a demonstrat în condiţii de laborator că după îndepărtarea peretelui celular cu ajutorul lizozimului se obţin protoplaşti în cazul bacteriilor Gram pozitive şi sferoplaşti în cazul bacteriilor Gram negative, acestea prezentând inca resturi de perete celular. Protoplaştii bacterieni sunt sensibili la variaţiile presiunii osmotice, păstrând însă o serie de proprietăţi ale celulelor bacteriene, cum ar fi: capacitatea de sinteză proteică şi a acizilor nucleici şi de reactii ale metabolismului energetic, iar viabilitatea lor se poate menţine, fiind posibil chiar procesul de diviziune, iar in anumite condiţii poate avea loc procesul de regenerare a peretelui celular şi trecerea la forma vegetativă normală; protoplastii pot realiza chiar replicarea unui bacteriofag daca celula bacteriană a fost infectata in prealabil. Forme de protoplaşti există şi în mediul natural, mai ales în organismul animal, dar şi la periferia coloniilor bătrâne şi în anumite medii acvatice. Aplicatii practice. Intre metodele circumscrise tehnologiei ADN-recombinant este inclusa si tehnica fuziunii de protoplasti, o tehnica prin care se obtin in vitro celule hibride (bacteriene, ca si celule hibride fungice sau vegetale); protoplasti apartinând la doua specii diferite sunt expusi actiunii unor substanţe fuziogene, de tipul PEG si in prezenta ionilor de Ca++; in aceste condiţii celulele se apropie, stabilesc interacţiuni de tipul proteină-proteină, iar fosfolipidele membranare se asociază prin fenomenul de 9

coalescenţă. Fuziunea de protoplasti s-a realizat mai ales la bacteriile Gram pozitive, dar şi la unele bacterii Gram negative. Fuziunea de protoplaşti este un fenomen de sexualitate artificială pentru că are loc cu fuziunea în întregime a genomurilor bacteriene şi poate avea loc între specii foarte îndepărtate taxonomic, care nu prezintă mecanisme de transfer genetic realizate in mod spontan, facând astfel posibilă recombinarea genetică cu depăşirea barierelor de specie şi chiar de gen. Între celulele aparţinand unor specii înrudite, procentul de recombinanţi este mare. Scopul şi avantajele acestei tehnici sunt: tehnica fuziunii de protoplaşti permite obţinerea de celule ce conţin tranzitoriu informaţia genetică de la doua celule în întregime, iar în final, prin recombinare genetică se obţin celule cu o informaţie genetică provenită de la celulele de origine, într-o măsură mai mică sau mai mare; tehnica se practica cu scopul obţinerii bacteriilor cu proprietăţi super-utile pentru biotehnologii de obţinere a unor produşi de interes sau pentru obţinerea unor celule cu calităţi ce avantajează anumite procese biotehnologice. Structura şi funcţiile componentelor intraparietale Membrana plasmatică. Este o formaţiune structurală permanentă, care delimitează ansamblul constituenţilor celulari, cu diametrul de 7,5 8 nm, alcătuită dintr-un dublu strat fosfolipidic (la arhee lipsesc gruparile fosfat), în care sunt inclavate proteine situate pe faţa externă, internă sau transmembranar. La unele specii de arhee membrana este unistratificata. Din, din punct de vedere funcţional, membrana plasmatică a bacteriilor prezintă o asimetrie, fiind frontiera între mediul extern şi intern. De menţionat în ceea ce priveşte compoziţia chimică, este faptul că lipsesc sterolii (cu exceptia micoplasmelor si a unor specii de arhee hipertermofile care contin molecule sterol-like, cu structura pentaciclica, numite opanoizi). Membrana plasmatică a bacteriilor prezintă toate proprietăţile plasmalemei celulelor eucariote, ceea ce a determinat adoptarea şi pentru bacterii a modelului,,mozaicului fluid al membranei,, (Singer & Nicholson, 1972). Datorită fluidităţii moleculelor dublului strat fosfolipidic, acestea îşi schimbă permanent poziţia, pe acelaşi strat cu viteză mare prin mişcări de difuzie laterală şi de pe un strat pe celălalt, prin mişcări flip-flop. Funcţiile proteinelor membranare: - proteinele enzimatice participă la biosinteza învelişurilor celulare, ce asigură creşterea celulelor, ca şi turnover-ul componentelor (hidrolaze); - proteinele de transport preiau substanţe nutritive din mediu şi le introduc în celule; - proteinele ce formează sistemele transportoare de electroni, cu rol în respiraţia celulară (ex., citocromi); - ATP-aza cu rol în metabolismul energetic. Funcţiile membranei plasmatice: - înveliş celular; - barieră osmotică, impermeabilă pentru unele molecule şi permeabilă pentru altele: molecule liposolubile, filiforme, glucoză, ioni; - sediul sinergonului respirator şi fotosintetic (la nivelul membranei si invaginarilor sale); - suportul chemotaxiei prin prezenţa chemoreceptorilor ce leagă molecule atractante sau repelente, cu rol în semnalizare şi deplasarea orientată a bacteriilor= chemotaxie; - sediul unor procese metabolice, cum ar fi sinteza exoenzimelor şi exotoxinelor, sintetizate de ribosomii legaţi de faţa internă; se consideră că procesele de formare a structurii secundare şi terţiare a acestor proteine de tip special au loc la nivelul membranei sau pe faţa sa externă. Citoplasma bacteriilor Citoplasma celulelor bacteriene este un sistem coloidal complex cu conţinut variabil si compus din proteine (mai ales enzime), glucide, lipide, săruri minerale şi apă (în proporţie de 70-80%), care determina si presiunea osmotica a mediului intern. Citoplasma se afla într-o stare permanentă de gel pentru a putea 10

menţine materialul nuclear lipsit de membrană nucleară într-o stare compactă si are o structură granulară datorită prezenţei ribosomilor cu conţinut crescut în ARNr, ceea ce explică bazofilia intensă a citoplasmei. Alte caracteristici ale citoplasmei bacteriilor: este lipsita de curenţi intracitoplasmatici (proprietate corelata cu starea permanenta de gel) şi de un citoschelet, desi, mai nou, se consideră că şi la bacterii ar fi prezentă o formă rudimentară de citoschelet, format dintr-o proteină contractilă similară actinei. Citoplasma mai poate contine si structuri neesentiale, cum ar fi vacuole si incluziuni (granulatii). Când celulele bacteriene sunt supuse unui stres osmotic sunt afectate reactiile metabolice si implicit procesele de crestere si multiplicare. NUCLEOIDUL Informatia genetica a celulelor bacteriene este localizata in nucleoid sau nucleosom - de tip PK, respectiv fara membrana nucleara si localizat într-o zona a citoplasmei numita nucleoplasmă; este o structură esentiala, ce nu poate fi observată prin microscopie optica, prin colorarea cu metode simple sau diferenţiale, datorită colorării omogene a celulelor cu coloranţi bazici, bazofilia intensă datorându-se conţinutului bogat in ARN al citoplasmei. La microscopul optic nucleoidul poate fi evidenţiat prin digestie enzimatică; de ex., in celulele bacteriene supuse acţiunii RN-azei sau hidrolizei acide, se observă o zonă centrală opacă, ce corespunde ADN-lui nedigerat şi o zonă periferică clară. La microscopul cu contrast de fază, celulele apar cu o zonă centrală mai clară cu filamente subţiri, paralele, ondulate, aceasta fiind macromolecula de ADN. În raport cu celula de tip eucariot, celula procariota prezinta un contrast invers, datorită numărului mare de ribosomi şi cantităţii mari de ARN din citoplasma. La microscopul electronic de transmisie (MET) pe sectiuni ultrafine se evidentiaza o regiune electronotransparenta ce corespunde nucleoidului fibrile de ADN impachetate si o regiune electronodensa ce corespunde citoplasmei, bogata in particule ribosomale si lipsita de organite membranare. Cu ajutorul unor tehnici speciale, din corpusculul central s-a extras materialul nuclear şi s-a demonstrat existenţa unui singur cromosom, la celule aflate în stare de repaus. In prezent, se cunosc şi excepţii de la această regulă, unele specii prezentând 2 cromosomi (de ex., ag.patogen al holerei - Vibrio cholerae (2 crs.), ca si specia fitopatogena - Agrobacterium tumefaciens (1 crs. circular şi 1 linear). Cromosomul bacterian este format dintr-o moleculă de ADN dublu catenara, circulara, covalent inchisa (d.c.c.c.î.). Circularitatea moleculei este obligatorie, pentru că astfel este protejată de acţiunea endonucleazelor, este reglat procesul de replicare şi se creează constrângeri topologice care determină o anumită tensiune în molecula de ADN, favorizând acţiunea topoizomerazelor ce modifică topologia moleculei. În ultimul deceniu, au fost evidenţiaţi şi cromosomi (Borrelia burgdorferi şi Streptomyces sp.), ca şi plasmide lineare. Aceste elemente genetice lineare prezinta secvenţe repetate invers la capetele lor şi proteine (secvente denumite invertroni) la capetele 5 care protejează moleculele de acţiunea enzimelor specifice. La E. coli, molecula de ADN are L = 1360 μm, în timp ce lungimea celulei este de 3 μm. Genomul ocupă un spaţiu de 1μm 3, conţine aprox. 4000 gene, g.m.= 2,5 x 10 9 Da; diametrul moleculei de ADN este de 2,5 nm. Datorită constrângerilor topologice, molecula circulară suferă procese de pliere, supraspiralizare şi suprapunere, pentru ca în final molecula să fie compactă si totusi funcţionala. În structura fizică a moleculei intervin topoizomerazele şi anume, giraza determină suprarăsucirea moleculei, iar alte enzime sunt implicate in derularea moleculei compacte, mai precis a acelor secvenţe de ADN necesare a fi transcrise şi traduse, în funcţie de condiţiile in care se afla celula la un moment dat. Din punct de vedere chimic, cromosomul poate fi disociat în următoarele componente: ADN 60-80 %; ARN ARNm (in curs de sinteza), ARNt; proteine ARN-polimeraza, topoizomeraze, proteine asociate nucleoidului (diferite de histone). S-a demonstrat că moleculele de ARN şi proteine nu sunt asociate doar funcţional cromosomului, ci au rol şi în împachetarea acestuia. Modelul de împachetare (Stonington şi Pettijohn, 1971) demonstrează că prin închiderea moleculei, aceasta îşi reduce diametrul la 350μm, apoi sub acţiunea topoizomerazelor molecula suferă o pliere (engl. folding) în ~ 50 domenii sau bucle, diametrul reducându-se la 30-35μm, prin 11

suprarăsucirea (supercoiling) domeniilor diametrul se reduce la 3 μm, iar prin suprapunerea acestora la 1μm. Spiralizarea moleculei se realizeaza cu ajutorul topoizomerazelor. Compactizarea moleculei se face astfel încât asigură totuşi transcrierea genelor vitale. S-a demonstrat că acest corpuscul este o structură dinamică, existând şi porţiuni laxe (bucle în citoplasmă), care reprezintă secvenţe de ADN funcţional, gene în curs de transcriere, pentru biosinteza proteinelor. La bacterii procesele de transcriere şi traducere sunt cuplate, având loc în citoplasmă. Din punctul de vedere al gradului de ploidie celula bacteriană este haploidă, caracter contestat de unii cercetători care au observat 2, 3, 4 mase nucleare (cromosomi), aparenţă datorată faptului că cele 2 mase nucleare nu sunt independente, ci legate prin punţi de ADN foarte fine. Structura genetică a bacteriilor trebuie raportată la condiţia normală, fiziologică a celulei bacteriene, care are de regulă 1 cromosom şi este haploidă. Condiţia normală este cea în care diviziunea celulei bacteriene este perfect reglată, existând o corelaţie perfectă între ritmul de replicare al cromosomului şi procesul de diviziune celulară. În condiţii speciale (medii bogate în nutrienţi) apare un decalaj între ritmul de replicare al cromosomului şi cel de creştere şi diviziune (viteză mare de replicare). Celula încearcă să compenseze această situaţie prin iniţierea unor cicluri suplimentare de replicare a ADN, apărând mai multe bifurcaţii de replicare. În celulă nu există 2 sau 4 cromosomi replicaţi, ci un cromosom cu n furci de replicare, expresia unui fenomen de amplificare genică pentru determinanţii din apropierea originii replicării. Structura genetică a cromosomului bacterian. Din punct de vedere molecular, cromosomul bacterian este numit şi genofor sau lineom, denumiri care se referă la fenomenul de colinearitate a genelor, informaţia genetică fiind continuă, astfel că şi biosinteza proteinelor va fi diferită faţă de cea din celulele eucariote, datorită faptului că din molecula de ADN bacterian lipsesc secvenţele non-informaţionale sau intronii. Sunt consemnate excepţii şi de la această regulă (de ex. in Dom. Archaea genele pentru ARNt de la halofile şi hipertermofile, de asemenea unele cianobacterii). Există situsuri de ataşare la membrana plasmatică, regiuni corespunzătoare originii replicării cromosomului şi punctului terminus al replicării. Unitatea genetică de structură şi funcţie este reprezentată de operon. De ex., la E. coli cromosomul este compus din ~ 4000 de gene, din care 90% sunt gene structurale, care codifică structura primară a proteinelor (succesiunea aminoacizilor). Nu toate aceste gene sunt funcţionale în acelaşi timp, fiind supuse proceselor de reglare prin inducţie şi represie enzimatică. În organizarea cromosomului bacterian există regiuni corespunzătoare genelor reglatoare, de tipul promotorilor şi operatorilor. Diferite gene structurale sunt dispuse în ordinea ce corespunde ordinii în care produsele lor intră în acţiune într-o cale metabolică. La eucariote, astfel de gene pot fi situate pe cromosomi diferiţi, fiind coordonată exprimarea lor de secvenţe genice care alcătuiesc un reglon. Reglarea sintezei enzimelor la bacterii prin inducţie şi represie enzimatică a fost explicată pe modelul operon, elaborat de Jacob şi Monod (distinşi cu premiul Nobel pentru Medicină în 1965). În general genele structurale care codifică enzimele care intervin într-o cale metabolică sunt supuse controlului unei regiuni de reglare împreună cu care alcătuiesc un operon: - genele de reglare codifică substanţe de tipul represorilor şi funcţionarea lor determină stoparea activităţii genelor din regiunea operator a cromosomului; - regiunea operator funcţionează ca receptor de semnale, sesizând prezenţa în mediu a represorilor şi inductorilor (funcţionează similar unui comutator tip on/off); - regiunea promotor adiacentă regiunii operator, corespunde zonei în care are loc iniţierea transcrierii informaţiei genetice realizată de ARN-polimeraza, care se leagă de această regiune. Represia este un mecanism care diminuează sinteza enzimelor, care se manifestă când celulele sunt expuse unui produs final al unei căi metabolice, condiţii în care are loc o scădere a ratei de sinteză a enzimelor implicate în sinteza unui produs final. De ex., celulele de E. coli cultivate pe un mediu lipsit de aminoacizi, sintetizează enzime necesare căilor de sinteză a aminoacizilor necesari sintezei proteinelor specifice. Introducerea unui aminoacid în mediu, va scădea sinteza enzimelor necesare producerii aminoacidului respectiv. Enzimele a căror sinteză este redusă în prezenţa produsului final se numesc enzime represibile, iar substanţa care determină represia este numită corepresor (= produs final). 12

Inductia este mecanismul invers prin care se sintetizeaza enzimele necesare metabolizarii unui substrat prezent in mediu. Exemple de mecanisme inductibile: genele pentru sinteza enzimelor necesare pentru metabolizarea lactozei, organizate în operonul,,lac,,. Dacă bacteriile sunt cultivate pe un mediu cu lactoză, prin inducţie vor produce o cantitate mare de β-galactozidază, o enzimă inductibilă, sintetizată în prezenţa lactozei, acest substrat nutritiv acţionând ca un inductor al genei structurale. Similar, se produce sinteza penicilinazei (β-lactamaza) la bacteriile rezistente la penicilină. Există modalităţi de reglare a exprimării genelor, care reglează şi metabolismul celulei, prin transcrierea şi traducerea genelor ce codifica enzime metabolice; se realizează astfel direcţionarea sintezei proteice. Prin mecanisme de control (inducţie şi represie) este reglată sinteza şi nu activitatea enzimelor dintr-o cale metabolică. Represia prin produs final nu acţionează asupra unor enzime preexistente, ci produsul final inhibă sinteza de noi molecule de enzime, deci controlul se realizează la nivel genetic, aceasta fiind deosebirea de inhibiţia tip feed-back, cu care se aseamănă parţial. Inducţia şi represia reprezintă mecanisme adaptative, cu rol în supravieţuirea celulei care nu consumă energie pentru sinteza unor enzime care nu sunt necesare în momentul respectiv, astfel că reglarea exprimării genelor este esenţială pentru economia energetică a celulei, fiind o cale de conservare a energiei. Există gene care nu sunt supuse represiei, acestea fiind răspunzătoare de sinteza enzimelor necesare indiferent de cantitatea de nutrienţi din mediu. Aceste gene şi enzimele a căror sinteză o codifică se numesc constitutive enzimele respective fiind necesare celulelor în cantităţi constante pentru desfăşurarea proceselor vitale (de ex., respiratie celulara). Funcţiile materialului nuclear : 1) Conţine informaţia genetică esenţială existenţei bacteriilor în mediul natural (pentru arhitectura celulei, metabolism, sinteza enzimelor ce intervin în reacţiile de biositeză şi în metabolismul energetic); 2) Codifică structura mecanismelor de reglare prin structuri operaţionale de tip operon; 3) Conţine informaţia necesară pentru replicare şi ereditate, cu asigurarea potenţialului de creştere şi diviziune celulară; 4) Asigură potenţialul de variabilitate şi evoluţie prin căi complexe: capacitatea de mutageneză, de reparare a erorilor, prin mecanisme de transfer de material genetic si de integrare a plasmidelor (prin conjugare), a genelor fagice (prin transductie), a fragmentelor de ADN cromozomal /plasmidial (transformare) si a elementelor genetice transpozabile (secvente de insertie si transpozoni). Plasmidele sunt structuri intracitoplasmatice, invizibile la microscopul optic, care pot fi evidenţiate la M.E.T. Conţin informaţie genetică extracromosomală, accesorie, de confort sau de lux, imbunatatind conditiile de viata ale bacteriilor si adaptarea la mediu; reprezinta 1-5 % din cromosom, fiind numite şi minicromosomi. Sunt structuri moleculare fizic independente de cromosom, constituite din molecule de ADN d.c.c.c.î., cu dimensiuni mai mici, cu excepţia plasmidelor lineare ale unor specii de actinobacterii. Semnificaţia biologică generală a plasmidelor Plasmidele (F, R, col, de patogenitate si virulenta, metabolice) conferă proprietăţi noi celulelor bacteriene şi posibilitatea adaptării rapide la mediu. În acelaşi timp reprezintă o sursă de variabilitate genetică, cu implicaţii în evoluţia bacteriilor, deoarece plasmidele integrate în cromosom sunt transmise prin diviziune descendenţilor, împreună cu genele cromosomale. O semnificaţie deosebită au plasmidele cu caracter de conjugon, care pot fi transferate interspecific şi intergeneric. Datorită acestor plasmide conjugative există un flux genetic, prin care se pierd şi se câştigă continuu noi proprietăţi, proces controlat cromosomal şi cu implicaţii în variabilitatea genetică şi evoluţia bacteriilor. Adaptarea genetică la un mediu variabil poate fi interpretată ca ca o strategie de supravieţuire mediată de plasmide. Bacteriile împrumută gene sub presiunea selectivă a mediului. Se poate vorbi deci de o evoluţie pe orizontală, responsabilă de marea variabilitate genetică şi plasticitate metabolică a bacteriilor. 13

Ribozomii Sunt structuri esenţiale, invizibile la microscopul optic, vizibile doar la microscopul electronic cu transmisie (MET), fiind uniform dispersate în citoplasma care are un aspect granular şi prezentându-se ca formaţiuni sferic-ovalare cu Ø = 20 25nm, aspect care s-a dovedit a nu corespunde formei reale. Ribozomii bacterieni au constanta de sedimentare 70 S. Din punct de vedere chimic, ribozomii sunt structuri ribonucleoproteice, alcătuite din 2 subunităţi: subunitatea mică de 30S şi subunitatea mare de 50S, cea mică având forma unui receptor de telefon aşezat pe subunitatea mare (structura chimică şi morfologia au fost determinate prin tehnici de mare fineţe biochimice, imunologice, cristalografie in raze X). Cele două subunităţi pot fi asociate, stare în care ribosomii sunt funcţionali (în prezenţa ionilor de Mg 2+ ) sau disociate, fiind dispersate în citoplasmă (la scăderea concentraţiei de Mg 2+ ). Subunităţile ribosomale conţin: Subunitatea mică: 1 moleculă ARNr 16S*; 21 molecule de proteine S** (S 1 -S 21 ; S, de la engl. Small = mic). Subunitatea mare: 2 molecule ARNr: 23S şi 5S; 34 molecule de proteine L (L 1 -L 34 ; L, de la engl. Large = mare). * Molecula de ARNr 16S, datorită originii sale vechi şi structurii înalt conservate, este considerată o moleculă semantoforetică sau semantidă (gr. semantikos = înţeles, semnificaţie), deci purtătoare de sens/ semnificaţie. ** Cele 55 de molecule de proteine au rol structural şi funcţional unic; de ex., S1 - participă la legarea ribozomilor de molecula de ARNm; S6 la legarea N-f-Met-ARNt; S2, S3, S14 la legarea aminoacil ARNt. În formarea arhitecturii subunităţilor, moleculele ARNr au rol cheie rol de matriţă în primele faze ale asamblării, de ele ataşându-se în poziţii fixe proteinele ribosomale între care există interacţiuni proteină - proteină, astfel încât cele 2 subunităţi au o conformaţie sterică bine conturată şi prezintă zone complementare care facilitează asocierea lor, ca şi situsuri pentru ataşarea moleculelor de ARN mesager şi de transport. Aranjarea fixă a moleculelor constitutive, conform unor scheme de la care nu există abateri, explică asamblarea rapidă a ribozomilor, în funcţie de necesităţile de moment ale celulei. Astfel, o celulă metabolic activă poate sintetiza până la 500 de ribosomi/minut, în timp ce numărul total de ribozomi variază între 15.000 100.000/celulă. Funcţia ribozomilor: funcţia lor esenţială este cea de traducere a informaţiei genetice transcrisă în ARNm, ribosomii fiind consideraţi adevărate fabrici de proteine şi puncte de întâlnire a diferiţilor constituenţi implicaţi în proteosinteză. Ambele procese, transcrierea şi traducerea informaţiei genetice, la bacterii au loc în citoplasmă şi sunt cuplate (datorită lipsei membranei nucleare). Biosinteza proteinelor este un proces complex în cursul căruia informaţia conţinută în ADN, transmisă la ribosomi prin intermediul ARNm, este tradusă într-o secvenţă polipeptidică prin asamblarea aminoacizilor într-o ordine specifică, înscrisă în mesajul genetic (diataxie celulară). Procesul de proteosinteză decurge cu o mare fidelitate. Fiecare ribosom are două situsuri de legare: situsul A (aminoacyl attachement) şi situsul P (peptidil). Moleculele de ARNt aduc aminoacizii aşezându-i în poziţiile corespunzătoare (situsul A), între aminoacizi se formează legăturile peptidice rezultând molecule polipeptidice în curs de sinteză, translocate la situsul P. În ansamblu, ribosomii sunt structuri dinamice ce au rolul de a menţine matriţa de ARNm, cât şi aminoacil-arnt într-o orientare corespunzătoare pentru a asigura citirea corectă a informaţiei genetice (pe baza complementarităţii codonanticodon) şi formarea legăturilor peptidice, sub influenţa enzimei peptidil-transferaza. Procesul are loc cu consum de energie, rezultată din hidroliza GTP. In celulele cu metabolism intens, care la un moment dat necesită de ex. cantităţi mari ale aceleiaşi enzime sau alte tipuri de proteine, se formează poliribosomi, care sunt asociaţii de 5 50 ribosomi, la nivelul cărora are loc sinteza concomitentă a mai multor lanţuri polipeptidice. Există ribosomi liberi în citoplasmă la nivelul cărora se sintetizează proteine intracelulare, ca şi ribosomi asociaţi cu faţa internă a membranei plasmatice, la nivelul cărora se sintetizate proteinele de export (de ex., exoenzime şi exotoxine). Semnificatie practica. Secvenţierea şi compararea secvenţelor moleculelor de ARNr 16 S provenite de la specii bacteriene diferite sunt la ora actuală tehnici utilizate în studiile taxonomie bacteriană şi filogenie la nivel molecular. 14

Endosporul bacterian. Endosporul (= spor de origine endogenă) a fost considerat o formă tipică şi unică de spor la bacterii. Reprezintă o structură de rezistenţă şi adaptare a bacteriilor la condiţii nefavorabile de mediu, asigurând astfel supravieţuirea speciei si fără rol în multiplicare. În prezent, se cunosc şi alte tipuri de spori bacterieni, dar cu particularităţi şi funcţii diferite de cele ale endosporului (de ex., la actinobacterii se formeaza spori de propagare/diseminare, cu rol in multiplicarea bacteriilor). Endosporul este considerat o formă primitivă de citodiferenţiere la procarite, o celulă diferenţiată în interiorul unei celule vegetative, o structură cu capacităţi speciale de rezistenţă la factori de mediu nocivi, datorită unor particularităţi structurale şi chimice. Sporogeneza (capacitatea de a forma endospori) este un proces foarte diferit de ciclul de viaţă vegetativ al celulei bacteriene, controlat genetic, prezent la anumite bacterii Gram pozitive, deoarece formarea sporului este asociată cu producerea unui înveliş gros, bogat în mureină (peptidoglican). Procesul de sporogeneză este limitat la o serie de eubacterii numite sporogene din grupul bacililor, proces obligatoriu prezent la speciile genului Clostridium (bacterii anaerobe), frecvent la speciile aparţinând genurilor Bacillus (bacterii aerobe), Sporolactobacillus, Desulfotomaculum (bacili incurbaţi, anaerobi, din grupul fiziologic al bacteriilor sulfatreducătoare) şi foarte rar întâlnit la coci (ex. Sporosarcina). Bacteriile sporogene sunt prezente mai ales în sol (practic, orice probă de sol conţine spori) si sedimentele acvatice. Endosporul este foarte diferit de celula vegetativă, numita si sporange, în care se formează, fiind rezultatul unor modificari structurale, chimice, biochimice şi biologice ce caracterizează sporogeneza sau formarea sporului; celula vegetativă este considerata celula activă metabolic, pe când sporul este o formă inertă, inactiva din punct de vedere metabolic (stare de criptobioza). Evidenţierea microscopică a sporului se poate face ocazional pe preparate proaspete datorită refringenţei foarte mari, pe frotiuri colorate (prin metoda coloratiei simple sau prin metoda coloratiei diferentiale Gram) ca zone incolore (învelişurile sporale fiind impermeabile pentru coloranţi şi alte substanţe chimice în condiţii obişnuite) sau pe frotiuri colorate prin metode selective care permit colorarea sporului. Se pot observa şi spori liberi, după liza resturilor celulelor vegetative. Sporii sunt structuri sferic-ovalare (cu dimensiuni cuprinse între: 0,5 0,9 x 1-1,5µm). Dimensiunile, forma şi poziţia sporului sunt caracteristici de specie şi au un rol important in identificare. Particularităţile structurale şi de compoziţie chimică explică rezistenţa lor la temperaturi ridicate, substanţe chimice, radiaţii. Din punct de vedere structural, endosporul conţine următoarele structuri: 1. protoplastul sporal sau citoplasma sporului, diferentiata in nucleoplasma (zona in care se afla materialul genetic - ADN) şi sporoplasma; 2. cortexul sporal un înveliş sporal gros, alcătuit din peptidoglican modificat în timpul procesului de sporogeneză (echivalentul peretelui celular), ce contribuie in mare masura la marea rezistenţă a sporului; 3. învelişuri sporale externe (intina şi exina) multistratificate, în funcţie de tipul de spor; sunt de natură proteică, cu un conţinut bogat în aminoacizi cu sulf ce formează punţi disulfidice şi o structură keratin-like, foarte rezistentă la factorii chimici; 4. exospor de natură lipoproteica; prezintă filamente suspensoare care ancorează miezul sporului de învelişul extern, provenit din celula vegetativă; 5. apendice sporale - prezent la unele tipuri de spori, cu rol în diseminarea acestora şi în preluarea nutrienţilor în perioada germinării. Din punct de vedere biochimic, sporul se caracterizează prin: - absenţa unor enzime cu importanţă fundamentală într-o celulă activă metabolic (enzimele ciclului Krebs şi lanţului transportor de electroni); - prezenta unui numar redus de enzime ce pot fi (1) sintetizate de novo (formate în timpul sporularii) sau (2) provenite din celula vegetativă, caz în care derivă prin clivarea partilor laterale, cu pastrarea situsului catalitic; - continut mare de aminoacizi cu sulf; 15

- cantitate mare de ioni de Ca 2+ şi Mg 2+ ; -prezenta acidului dipicolinic, sub forma dipicolinatului de Ca 2+, marker biochimic pentru PK; - absenţa sintezei de macromolecule, inclusiv de ARNm (absent sau prezent în cantitate mică); - starea apei conţinutul în apă este similar cu cel al unei celule vegetative, predominând insa apa legată de diferite structuri, in timp ce apa liberă este prezenta în cantitate mică (3-4%); Prin urmare, endosporul este o celula metabolic inactiva si rezistenta la orice factori de stres. Sporogeneza este declanşată in principal de absenţa mutrienţilor din mediul de viaţă, deci în condiţii de înfometare sau starvatie (C, N, P). Celula vegetativă se transformă în sporange în care au loc o succesiune de modificări, in 7-8 etape. Fiecare stadiu de formare a sporului este codificat de alte gene (50 200 de gene sporogene), iar procesul odată amorsat este ireversibil. La revenirea condiţiilor favorabile de mediu, sporii germinează. Germinarea este procesul de reversie a endosporului la starea vegetativă si are loc în 3 stadii: - activarea implică deteriorarea învelişurilor sporale şi se produce spontan - germinarea propriu-zisă necesită apă şi un agent de germinare (aminoacizi, diferiti ioni) - învelişurile sporale se gelifică într-o anumită regiune sub influenţa unei enzime sporolitice care determină hidroliza cortexului, favorizată de un număr mic de legături încrucişate în stratul extern de peptidoglican; se pierd ioni de Ca 2+ şi încetează starea de latenţă şi de rezistenţă a sporului, celula vegetativă iesind din învelişurile sporale; - creşterea revenirea celulei bacteriene la condiţia normală, care într-un mediu nutritiv bogat are loc rapid începe sinteza de ARNm, proteine, de ADN şi celula îşi dublează volumul iniţial; peretele celular se reface pe membrana celulei sporale. Semnificaţia biologică a endosporului bacterian. Sporogeneza reprezintă o strategie adaptativă a bacteriilor, pentru a supravieţui în condiţii nefavorabile de mediu, neavând rol în multiplicare; endosporul este considerat in prezent o forma primitiva de citodiferentiere la procariote. Starea de latenţă metabolica sau criptobioză determină rezistenţa sporilor la temperaturi de peste 100 pâna la 180ºC, uscăciune (desicatie) şi radiaţii UV, la substanţe antimicrobiene (antiseptice, antibiotice). Deci endosporul poate fi considerat o formă de conservare a speciei, dovedita de longevitatea mare a acestor structuri; de ex., în soluri nelucrate, sporii isi mentin viabilitatea timp de zeci şi chiar sute de ani, iar în roci sedimentare chiar mai mult; au rol si în diseminarea bacteriilor în natură, fiind omniprezenti in sol, praf si sedimente acvatice. Importanţa practică. Descoperirea şi descrierea endosporilor au reprezentat momente esenţiale in dezvoltarea microbiologiei experimentale, ceea ce a permis dezvoltarea unor metode adecvate de sterilizare pentru medii de cultură, alimente, produse farmaceutice şi alte produse perisabile (controlul microbiologic fiind obligatoriu în cazul acestor produse); la stabilirea parametrilor fizici mentionati in protocolul acestor metode s-a tinut cont in primul rând de particularitatile endosporului bacterian. Importanţa medicală este ilustrată de faptul că unele bacterii patogene sunt sporogene, cum ar fi: Clostridium botulinum, C. tetani, C. perfringens, aceste bacterii anaerobe prezentând un circuit enteroteluric, în sensul că se multiplică în intestin, fiind apoi eliminate si ajungând in apele uzate si sol, unde supravieţuiesc sub formă de spori. Aceste specii produc toxine puternice, ce determina boli specifice: botulism alimentar (intoxicatie, determinata de ingerarea de toxina preformata in alimente incorect sterilizate), tetanos si respectiv gangrena gazoasa. Importanta industrială mai exact, pentru industria alimentara, deoarece sporii pot fi cauza alterarii alimentelor sterilizate sau păstrate incorect, la care se adaugă şi riscul de intoxicaţii (botulism alimentar) şi T.I.A. (C.perfringens); pentru industria farmaceutică - unele proprietăţi biologice ale bacteriilor sunt asociate cu anumite faze ale sporogenezei, cum ar fi producerea de antibiotice: polimixina, bacitracina, gramicidina (Bacillus sp.), ca şi producerea de proteinaze. In agricultură - bacteriile numite entomocide prezintă importanţă prin capacitatea lor de a sinteza cristale parasporale, de natură proteică, cu calităţi de pretoxină; această formă inactivă poate fi activată la ph-ul alcalin = 10 din tubul digestiv al insectelor, la care determină fenomenul de paralizie, de unde imposibilitatea hrănirii şi moartea consecutivă. Culturi sporulate de B. thuringiensis sunt folosite pentru combaterea 16

biologica a insectelor (larve de lepidoptere defoliatoare, ţânţari), cu scopul înlocuirii insecticidelor chimice, cu remanenta mare in organismul animal/uman, dar si in sol, cu efect poluant. Specia anaeroba sporogena Clostridium pasteurianum este in acelasi timp si fixatoare de azot, cu rol important in fertilitatea /imbogatirea in azot a solurilor profunde sau inundate. In afară de bacteriile sporogene bacterii Gram pozitive, prezente ca spori mai ales în sol (şi la care s-a demonstrat un circuit enteroteluric), celelalte bacterii, nesporogene, beneficiază şi de alte mecanisme de protecţie faţă de uscăciune, radiaţii (capsulă şi glicocalix, pigmenţi accesorii, plasmide R etc.). În general, la schimbarea bruscă a condiţiilor de mediu numărul bacteriilor se reduce drastic, dar supravieţuieşte o parte (în microhabitate, sedimente, biofilme), capabilă apoi la revenirea conditiilor favorabile de mediu, să refacă populaţia. La bacteriile Gram negative acvatice s-a descris un mecanism de protecţie la condiţiile de înfometare, reprezentat de o modificare structurală şi metabolică celulele vegetative intră într-o stare de starvaţie, transformându-se în celule dormante numite ultramicrobacterii, celule sferice cu diametrul de aprox. 0,3 µm, care pot supravieţui ca celule în suspensie timp de luni şi ani de zile. Structurile bacteriene /microbiene extraparietale (capsula, glicocalix, pili, fimbrii) sunt structuri accesorii, cu rol adaptativ, de regula de natura polizaharidica, mai rar polipeptidica, motiv pentru care sunt incadrate in conceptul integrator de E.P.S (extracellular polymeric substances). Aceste structuri intervin in relatiile microorganismelor cu mediul biotic si abiotic, toate fiind incluse in categoria generica a adezinelor, numite astfel pentru ca mediaza aderenta bacteriilor/microorganismelor la diferite suprafete sau substraturi din mediu, vii sau neanimate si dezvoltarea de biofilme, comunitati bacteriene/ microbiene mono- sau polispecifice, cu o semnificatie deosebita din punct de vedere medical, ecologic si industrial / biotehnologic. Biofilm = o comunitate microbiană sesilă compusă din celule care sunt în mod ireversibil ataşate la un substrat, la o interfaţă sau unele de altele, care sunt înglobate într-o matrice de substanţe polimerice extracelulare produse de către aceste celule şi care prezintă un fenotip modificat, în privinţa ratei de creştere şi a transcrierii genelor. Biofilme microbiene = comunitati mono- /multispecifice (consortii) = expresia cea mai de succes si mai competitiva a genomului procariot (celule eficiente metabolic si bine protejate rezistenta la conditii de stres (inclusiv la substantele antimicrobiene); rezistenta celulelor inglobate in biofilme (in matricea acestora, constituita din exopolizaharide microbiene) este comportamentala si numita mai nou toleranta, pentru a o diferentia de cea codificata genetic (gene de rezistenta, plasmidiale sau cromozomale). În cadrul biofilmelor interacţiunile sunt atât celulă - substrat, cât şi celulă celulă. Acestea din urmă permit pe de o parte, o mai mare acumulare de celule, ceea ce este important mai ales pentru bacteriile cu creştere lentă, iar pe de altă parte, distribuţia lor spaţială poate iniţia interacţiuni metabolice şi schimburi de gene între diferitele celule bacteriene, ceea ce determină o adaptare fiziologică rapidă la mediu. Deoarece s-a observat ca celulele imobilizate au randamentul cel mai mare de producere a reactiilor de biosinteza sau de catabolism, in prezent exista metode de stimulare a aderentei microorganismelor (bacterii, levuri) la suprafata unui bioreactor, pentru producerea unor substante de interes cu randament sporit prin metode biotehnologice. Flagelul bacterian. Flagelii bacterieni sunt organite de locomotie filamentoase (lat. flagellum = bici), unice sau multiple, care asigura mobilitatea si chemotaxia procariotelor. Sunt echivalentul cililor si flagelilor de tip eucariot, dar, spre deosebire de acestia (care au o structura sintetizata in formula (2x9+2 tubuli), flagelii bacterieni sunt tubulari, cu lungime variabila (20-70µm) si constituiti dintr-o proteina specifica numita flagelina. Morfogeneza flagelului este un proces complex, controlat de gene numeroase (>40): fla, fli, flg). Prezenta/absenta, numarul si aranjarea flagelilor sunt caracteristici de specie, utile taxonomiei bacteriene; astfel exista bacterii neflagelate sau atriche, bacterii flagelate cu flageli polari (unici mono- si 17

bipolari sau in manunchiuri, respectiv bacterii monotriche, amfitriche, lofotriche) si flageli pericelulari (celule peritriche). Datorită diametrului mic (in medie 20 nm), la microscopul optic se evidentiaza doar prin tehnici speciale de colorare, bazate pe îngrosarea filamentului flagelar prin depunere de coloranti, dar la MET flagelul se evidentiaza ca o structura cu arhitectura complexa, fiind alcatuit din: filament, cârlig şi corp bazal. (1) Filamentul este o structura semirigida helicala si tubulara (Ø= 3nm). Unitatea structurala de baza a filamentului este o proteina specifica globulara, respectiv monomerii de flagelina, sintetizati in celula si depusi la extremitatea libera a flagelului, dupa o simetrie helicala, prin autoasamblare. (2) Carligul este tubular, curbat, are rol de articulatie flexibila universala (denumirea sugereaza ca aceasta structura are echivalent in tehnica). Flexibilitatea permite filamentului sa aiba o asezare perpendiculara pe suprafata peretelui celular si rotirea in asociatie a flagelilor multipli. Cârligul face legatura intre filament si corpul bazal al flagelului. Mecanismul articulatiei cârlig - filament permite rotatia cu 360 0 a filamentului, care se mişcă asemenea unei elice, aceasta miscare rotatorie fiind un caz unic in biologie. (3) Corpul bazal consta dintr-un ax conectat la carlig si o serie de discuri care ancoreaza flagelul de peretele celular si membrana plasmatica; are rol determinant in mobilitatea bacteriilor prin inducerea rotatiei filamentului. Corpul bazal are o structura diferita la bacteriile Gram-pozitive (2 discuri suprapuse) si Gram-negative (4 discuri suprapuse). Toate discurile sunt strabatute de piesa centrala cilindrica numită ax, care se continua cu carligul. In jurul discurilor MS-C se ataseaza lateral molecule de proteine Mot, formând un manson in jurul discurilor, care functioneaza generând cuplul motor pentru rotatia flagelului, pus in miscare de forta proton motrice (rezultata din procese chemo-osmotice). Fluxul de H + din membrana plasmatica strabate canalul dintre proteinele Mot si discurile bazale si le incarca electrostatic, proteinele Mot având rol de stator al motorului rotativ si imprimând rotatia corpului bazal. Proteinele Fli actioneaza ca un comutator al motorului care imprima flagelului fie o miscare de rotatie in sensul acelor de ceasornic, fie invers, ca si oprirea rotatiei flagelului si deplasarii celulei bacteriene. Fluxul de ioni dintre stator si rotor este de regula un flux de H +, dar poate fi si un flux de ioni de Na+ la bacteriile care traiesc in medii alcaline. Filamentul se roteste ca o elice, cu pâna la 40.000 rotatii/minut, propulsând celula. Viteza relativa de deplasare a bacteriilor (raportata la lungimea corpului lor) este foarte mare, fiind de 20-80 µm/sec, de 50 ori sau mai mult fata de lungimea corpului, depasind viteza oricarui animal terestru sau acvatic. In functie de semnalele receptionate din mediu (substante atractante si repelente) si prelucrate intracelular, este elaborat un raspuns comportamental, discurile MS-C imprimând rotatia flagelului intr-un sens sau celalalt. Functia flagelului este asociata fenomenului de chemotaxie, de deplasare orientata a bacteriilor in functie de gradientul de concentratie al diferitelor substante din mediu. Nutrientii, O 2 (pentru bacteriile aerobe) reprezinta substante atractante, determinând apropierea bacteriilor, iar substantele potential daunatoare, repelente, determina indepartarea bacteriilor. Chemotaxia la bacterii asigura raspunsuri comportamentale specifice actionate chimic, al caror suport structural este asigurat de prezenta chemoreceptorilor din membrana plasmatica proteine senzoriale metil-acceptoare ce actioneaza ca transductori de semnale (proteine transmembranare). Semnalele ajung la o proteina transductor din membrana plasmatica si apoi la o proteina citoplasmatica reglator a raspunsului, care influenteaza activitatea flagelului. S-a demonstrat ca flagelul este un organit care percepe contactul cu o suprafaţa datorită încetinirii sau opririi rotaţiei sale, mecanismul transmiterii acestui semnal fiind inca necunoscut, dar implicat in semnalizarea intracelulara si reglarea exprimarii genelor. Asa se explica de exemplu, modificarea exprimarii genelor la celulele aderate la un substrat (celular sau inert). Pentru intelegerea acestui mecanism de semnalizare este esenţiala identificarea parametrilor interfeţei solid- lichid care să fie suficient de diferiţi în raport cu mediul lichid, pentru a informa bacteria de contactul cu suprafaţa, cum ar fi osmolaritatea mediului sau ph-ul extracelular, pentru receptionarea carora se utilizează aceleaşi căi. Functiile flagelului: 18

- mobilitatea si chemotaxia sunt supuse reglarii si au valoare adaptativa; flagelul si chemoreceptorii/senzorii au capacitatea de a converti stimulii senzoriali in raspunsuri comportamentale; - fototaxia bacteriilor fotosintetizante poate fi considerata ca un precursor al sistemlor vizuale; - factor de virulenta la bacteriile patogene: - rol antifagocitar (prin evitarea contactului cu membrana fagocitelor si inglobarii de catre acestea); - rol in aderenta la substratul celular sensibil, indirect, prin faptul ca favorizeaza strabaterea stratului de mucus, bacteriile ajungând astfel in contact cu celulele epiteliale ale mucoaselor si aderând la receptorii specifici (de ex., Helicobacter pylori). - rol de Ag in identificarea serologica. Metabolismul microbian Reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice implicate în activităţile biologice ale microorganismelor, prin care acestea preiau din mediu energie şi elemente chimice biogene (ca atare sau sub forma unor combinaţii) şi le utilizează în reacţii de biosinteză, în reacţii de biodegradare şi producere de energie, ca şi pentru creştere şi alte activităţi fiziologice (transport transmembranar, mobilitate, bioluminiscenţă etc.). Substanţele sunt preluate din mediu prin procese de transport pasiv sau activ (cu consum de energie) şi după natura lor, sunt transformate în constituenţi celulari, produşi de metabolism ce pot fi secretaţi), energie. Aceste reacţii metabolice se desfăşoară la microorganisme în general şi la bacterii în special, cu respectarea unui principiu fundamental în biologie, respectiv principiul economiei şi optimalităţii sau al eficienţei maxime, însemnând că reacţiile decurg cu consum minim de energie şi utilizarea sa maximă pentru biosinteze, din care rezultă un număr mare de celule în unitatea de timp. Multiplicarea rapidă şi consecutiv existenţa în număr foarte mare reprezintă condiţia fundamentală pentru supravieţuirea în natură, fiind principalul mecanism de competiţie cu alte organisme asociate, ca şi de rezistenţă faţă de condţiile nefavorabile de mediu. Metabolismul este un proces ciclic autoreglat, datorită unor reacţii chimice speciale de reglare a ritmului de producere a reacţiilor diferitelor căi metabolice, cu rol în menţinerea stabilităţii celulelor. Căile metabolice Sunt secvenţe de reacţii metabolice în mai multe trepte, fiecare treaptă fiind catalizată de o enzimă specifică. In cadrul unei căi metabolice, substratul metabolic este transformat în produşi intermediari şi aceştia în produs final. O cale metabolică individuală se poate manifesta în mai multe moduri: linear, ciclic sau ramificat. Metabolismul microbian se realizează pe 2 căi metabolice principale: reacţii de catabolism = biodegradare, cu eliberarea de energie = reacţii exergonice; reacţii de anabolism = biosinteză, realizate cu consum de energie = reacţii endergonice. Din punct de vedere funcţional, cele 2 tipuri de căi metabolice sunt interconectate, deoarece energia şi o parte din produşii rezultaţi din reacţiile de catabolism sunt folosiţi ca energie şi produşi intermediari în reacţiile de anabolism. Prin urmare, căile metabolice centrale care eliberează energie, pot furniza şi precursori pentru alte căi metabolice, aceste căi fiind numite căi amfibolice (auxiliare). Căile anaplerotice sunt tot căi auxiliare ce apar atunci cand desfăşurarea unei căi metabolice principale este blocată datorită utilizării produşilor intermediari în alte căi metabolice. Căile anaplerotice au o semnificaţie deosebită fiind căi de reaprovizionare cu produşi intermediari, rezultaţi dintr-o alte cale, a unei căi metabolice principale, evitând blocarea acesteia. Funcţionarea şi interacţiunea celor patru tipuri de căi sunt perfect coordonate în celulă, astfel încât aceasta să funcţioneze cu randament optim. I. Căile catabolice = Catabolismul = Metabolismul energetic Căile catabolice = de dezasimilaţie = catabolismul reprezintă o succesiune de reacţii biochimice implicate în degradarea nutrienţilor şi eliberearea de energie necesară pentru funcţionarea celorlalte căi metabolice şi altor activităţi fiziologice ale celulei. 19

Căile catabolice au loc în 3 faze succesive (Kornberg, 1965): Faza 1: macromoleculele sunt descompuse enzimatic în unităţi de bază: proteinele AA, lipidele acizi graşi şi glicerol, glucidele monoglucide; - are loc frecvent la exteriorul celulei bacteriene, fiind realizată de exoenzime. Din aceste reacţii se eliberează ~1% din energia totală a macromoleculei, inaccesibilă celulei, fiind eliberată sub formă de căldură. Faza 2: moleculele rezultate în faza precedentă sunt degradate incomplet, eliberand 1/3 din E totală, cu producrea, în afară de CO 2 + H 2 O, a unui număr mic (12) de produşi de importanţă esenţială în metabolism, numiţi intermediari metabolici ai căilor metabolice centrale. Aceşti compuşi sunt aceiaşi la toate organismele, o dovadă a unităţii metabolice în lumea vie. De ex., aminoacizii sunt utilizaţi pe căi diferite şi catabolismul lor conduce la formarea de acetil-coa sau intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici = ciclul Krebs. Faza 3: se derulează diferit, în funcţie de tipul respirator al microorganismului considerat, astfel: - la microorganismele aerobe, care pot degrada substratul integral până la CO 2 + H 2 O, calea majoră de desfăşurare şi eliberare de energie este ciclul Krebs, cuplat cu fosforilarea oxidativă şi eliberarea unei mari cantităţi de energie, stocata in ATP. - microorganismele anaerobe (sau în lipsa relativă a O 2 molecular), urmează calea fermentaţiei (alcoolică, lactică, butirică, propionică etc.) ai cărei produşi de degradare servesc ca donori sau acceptori de electroni şi H + în reacţii de oxido-reducere cuplate, care eliberează o cantitate mică de energie (ŋ mic). Degradarea se face printr-o serie de reacţii în care o substanţă D cu rol de donor de e - / H + se oxidează şi o altă substanţă A cu rol de acceptor de e - /H + se reduce. Procesul de degradare a nutrienţilor prin reacţii de oxidoreducere biologică se numeşte respiraţie celulară. II. Căile anabolice = Anabolismul = Metabolismul de asimilaţie sau de biosinteză Căile anabolice sunt căi a căror evoluţie este în direcţie inversă celor catabolice. Reprezinta totalitatea reactiilor biochimice prin care microorganismele îşi sintetizează din molecule simple constituenţii celulari proprii. Pot fi utilizaţi şi intermediari ai căilor metabolice centrale. Se sintetizează 2 categorii de macromolecule: de rezervă (depozit) alcătuite din monomeri de acelaşi tip (glicogen, amidon s.a.); macromolecule esenţiale pentru sistemele biologice, specifice, codificate genetic (proteine, acizi nucleici). Sinteza macromoleculelor este foarte eficientă şi se face sub acţiunea informaţiei genetice codificată în ADN. Celula bacteriană sintetizează mai întâi monomeri (AA, baze azotate) pe care îi aranjează ulterior într-o ordine specifică, dictată genetic, care determină structura primară a macromoleculelor respective, prin procesul de diataxie celulara; procesul este realizat cu mare fidelitate. Periodic, apar accidente de tipul mutaţiilor care pot determina formarea de molecule nefuncţionale, dar în momentul diataxiei sunt recunoscute şi se evită legarea lor. Sinteza macromoleculelor din molecule mici, asigură o mare eficienţă a sintezelor. Specificitatea biologică constă în aranjarea diferită a unui număr limitat de monomeri (unităţi de structură: 20 AA, 5 baze azotate) pentru a forma un număr impresionant de macromolecule biologice cu structuri şi funcţii diferite. Particularităţi specifice metabolismului microbian Inainte se considera, pe baza dimensiunilor mici şi a relativei simplităţi structurale, că metabolismul ar fi rudimentar. Cercetările moderne de biochimie au demonstrat caracterul asemănător al cailor metabolice centrale la toate formele de viaţă, microorganismele folosind căi metabolice comune. Majoritatea căilor metabolice principale au fost descoperite întăi la microorganisme şi ulterior au fost extrapolate la organismele superioare. Cu toate acestea, la bacterii se manifestă căi metabolice unice în lumea vie: fixarea biologică a N 2 atmosferic, respiraţia anerobă, sinteza anumitor antibiotice, fotosinteza anoxigenică. 20