Πράσινη ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ (6η Άσκηση) Καθ. Κυριάκοσ Κοτζαμπάςησ 2011-2012 6 ε Άζθεζε Βηνηερλνινγία κηθξνθπθώλ ΙΙΙ: Βέιηηζηεο ζπλζήθεο ζύλζεζεο ιηπαξώλ από κηθξνθύθε Παξαζθεπή βηνληίδει. (Κ. Κοτζαμπάσης) Τμήμα Βιολογίασ Πανεπιςτήμιο Κρήτησ
6ε Άζθεζε Βηνηερλνινγία κηθξνθπθώλ ΙΙΙ: Βέιηηζηεο ζπλζήθεο ζύλζεζεο ιηπαξώλ από κηθξνθύθε Παξαζθεπή βηνληίδει. (Κ. Κοτζαμπάσης) Η εν λόγω εργαζηηριακή άζκηζη θα ζηηριτθεί ζηο MSc ηης κας Αμαλίας Καραμαλάκη 2 Τν βηνληίδει είλαη ελαιιαθηηθό ηνπ «ζπκβαηηθνύ» ληίδει θαύζηκν, πνπ κπνξεί λα παξαρζεί από αλαλεώζηκεο βηνινγηθέο πεγέο, όπσο νη θπηηθέο θαη δσηθέο ιηπαξέο νπζίεο. Γεληθά ππάξρνπλ αξθεηά νθέιε από ηε ρξήζε ηνπ, θπξίσο γηα ην πεξηβάιινλ, γηαηί πξόθεηηαη γηα θαύζηκν κε ρακειό πνζνζηό εθπνκπώλ επηβιαβώλ αεξίσλ, είλαη βηνδηαζπώκελν θαη θπξίσο κε ηνμηθό. Τν κεγάιν πξόβιεκα ηεο ππεξζέξκαλζεο ηνπ πιαλήηε από ην θαηλόκελν ηνπ ζεξκνθεπίνπ, πνπ επεξεάδεη δηάθνξεο πηπρέο ηεο αλζξώπηλεο δσήο, ζε ζπλδπαζκό κε ηε κείσζε ησλ απνζεκάησλ ηνπ αξγνύ πεηξειαίνπ θαη γεληθόηεξα ηηο δπζθνιίεο ζηελ εμόξπμε θαη ηελ επεμεξγαζία ηνπ, πνπ ζα νδεγήζνπλ ζηε δξακαηηθή αύμεζε ηνπ θόζηνπο ηνπ, θαζηζηνύλ ηε ρξήζε ηνπ βηνληίδει σο επηηαθηηθή αλάγθε. Γηα λα απνθεπρζνύλ ινηπόλ κεγάια πξνβιήκαηα ζε πνιινύο ηνκείο ηεο θαζεκεξηλόηεηαο θαη ηδηαίηεξα ζηνλ ηνκέα ησλ κεηαθνξώλ, όπνπ κέρξη θαη ζήκεξα ππάξρνπλ θάπνηεο πξνζσξηλέο ιύζεηο γηα ηα νξπθηά θαύζηκα θαη γηα ηελ αληηθαηάζηαζήο ηνπο είλαη αλαγθαίν λα βξεζνύλ θαζαξέο θαη αλαλεώζηκεο πεγέο ελέξγεηαο, ώζηε λα αληηκεησπηζηεί έλα από ηα πιένλ δπζθνιόηεξα πξνβιήκαηα πνπ αληηκεησπίδεη ε αλζξσπόηεηα ζε κηα κεζνπξόζεζκε έσο καθξνπξόζεζκε πξαγκαηηθόηεηα. Τν βηνληίδει παξάγεηαη από θπηηθά έιαηα (εδώδηκα θαη κε) ή δσηθά ιίπε. Δπεηδή ηα θπηηθά έιαηα κπνξνύλ επίζεο λα ρξεζηκνπνηεζνύλ γηα αλζξώπηλε θαηαλάισζε, κπνξεί λα νδεγήζεη ζε αύμεζε ησλ ηηκώλ ησλ ηξνθίκσλ αλάινγα κε ηελ πνηόηεηα ηνπ ιαδηνύ, κε απνηέιεζκα αύμεζε ηνπ
θόζηνπο ηνπ βηνληίδει, αθόκε θαη αλ έρεη πνιιά πεξηζζόηεξα πιενλεθηήκαηα ζε ζρέζε κε ην «ζπκβαηηθό» ληίδει. Τα πιενλεθηήκαηα από ηε ρξήζε ησλ κηθξνθπθώλ γηα ηελ παξαγσγή ηνπ βηνληίδει ζε ζύγθξηζε κε άιιεο δηαζέζηκεο πξώηεο ύιεο είλαη αξθεηά θαη ζεκαληηθά. Από πξαθηηθή άπνςε ηα κηθξνθύθε είλαη εύθνιν λα θαιιηεξγεζνύλ, κπνξνύλ λα αλαπηπρζνύλ ρξεζηκνπνηώληαο λεξό αθαηάιιειν γηα αλζξώπηλε θαηαλάισζε θαη εύθνια πξνζιακβάλνπλ ηηο ζξεπηηθέο νπζίεο από απηό πνπ ίζσο λα πεξηέρνπλ. Τα κηθξνθύθε γηα λα αλαπαξαρζνύλ ρξεηάδνληαη κνλό ιίγεο κέξεο γηα λα νινθιεξώζνπλ ησλ θύθιν αλάπηπμεο ηνπο ιόγν ηεο θσηνζπλζεηηθήο ηνπο δξαζηεξηόηεηαο. Δπηπιένλ, κπνξνύλ λα αλαπηπρζνύλ ζρεδόλ νπνπδήπνηε, κε ηελ ρξήζε ηεο ειηαθήο αθηηλνβνιίαο θαη κεξηθέο απιέο ζξεπηηθέο νπζίεο, ελώ νη ξπζκνί αλάπηπμεο κπνξνύλ λα επηηαρπλζνύλ κε ηελ πξνζζήθε εηδηθώλ ζξεπηηθώλ νπζηώλ θαη κε ηνλ επαξθή αεξηζκό ηνπο. Έρνπλ πνιύ πςειόηεξνπο ξπζκνύο αλάπηπμεο θαη παξαγσγηθόηεηαο ζε ζύγθξηζε κε ηα άιια θπηηθά είδε ησλ γεσξγηθώλ θαιιηεξγεηώλ, θαζώο θαη άιια πδξόβηα θπηά. Απαηηνύλ πνιύ ιηγόηεξε έθηαζε από όηη άιια θπηηθά είδε γεσξγηθώλ θαιιηεξγεηώλ (49 θαη 132 θνξέο ιηγόηεξε ζε ζρέζε κε ηελ ειαηνθξάκβε θαη ηε ζόγηα αληίζηνηρα), ελώ ε παξαγσγή ιηπαξώλ (θαηάιιεισλ γηα δεκηνπξγία βηνληίδει) πνπ κπνξεί λα πεξηέρεη ε βηνκάδα ησλ κηθξνθπθώλ κπνξεί λα θηάζεη θαη ην 30% (w/w). Ωο εθ ηνύηνπ, κε ηελ εθηεηακέλε ρξήζε κηθξνθπθώλ γηα ηελ παξαγσγή βηνληίδει, ν αληαγσληζκόο γηα ηηο θαιιηέξγεηεο ηνπ εδάθνπο κε άιιεο θαιιηέξγεηεο, ηδίσο γηα αλζξώπηλε θαηαλάισζε, κεηώλεηαη ζεκαληηθά. Σθνπόο ηεο παξνύζαο άζθεζεο είλαη λα εξεπλεζνύλ θαη λα δηαπηζησζνύλ νη θαηαιιειόηεξεο ζπλζήθεο αύμεζεο θαη αλάπηπμεο ηνπ κηθξνθύθνπο Scenedesmus obliquus γηα ηελ βέιηηζηε παξαγσγή ιηπαξώλ, θαηάιιεισλ γηα δεκηνπξγία βηνληίδει. Γηα απηό ηνλ ιόγν ζα γίλεη πξνζπάζεηα «ρεηξαγώγεζεο» ησλ κεηαβνιηθώλ κνλνπαηηώλ ηνπ Scenedesmus obliquus, απνζθνπώληαο ζηελ αύμεζε ηεο θπηηαξηθήο ζπγθέληξσζεο ησλ ιηπαξώλ ηνπο, κε ηελ επηιεθηηθή έιιεηςε αδώηνπ [-Ν], θσζθόξνπ [-P] ή θαη ησλ δύν καδί [-N/P]. Τόζν ην άδσην όζν θαη ν θώζθνξνο είλαη δπν πνιύ ζεκαληηθά ζηνηρεία γηα ηηο θπηηαξηθέο ιεηηνπξγίεο ησλ κηθξνθπθώλ. Δίλαη γλσζηό όηη γηα θάζε θπηηθό νξγαληζκό ην άδσην θαη ν θώζθνξνο είλαη δπν πνιύ ζεκαληηθά ζηνηρεία. Η έιιεηςε αδώηνπ παξεκπνδίδεη ηε βηνζύλζεζε θεληξηθώλ βηνκνξίσλ όπσο ησλ λνπθιετθώλ νμέσλ θαη ησλ ακηλνμέσλ/πξσηετλώλ ελώ ε έιιεηςε θσζθόξνπ παξεκπνδίδεη ηε ζύλζεζε πξσηετλώλ θαη σο εθ ηνύηνπ ε απνπζία ηνπο από ην ζξεπηηθό κέζν νδεγεί ζε πεξηνξηζκό αλάπηπμεο ηεο θαιιηέξγεηαο. Έηζη κπνξεί λα γίλεη θαηαλνεηό όηη έιιεηςε αδώηνπ ή θσζθόξνπ ή θαη ησλ δύν καδί κπνξεί λα κεηαβνιίζεη ηνλ νξγαληθό άλζξαθα (γιπθόδε) ηνπ ζξεπηηθνύ κέζνπ ζε άκπιν ή ιηπαξά ζηα θύηηαξα κε απνηέιεζκα ηελ αύμεζε ηεο πεξηεθηηθόηεηαο ησλ θπηηάξσλ ζε ιηπαξά, πνπ ζηε ζπλέρεηα ζα κπνξνύζαλ λα ρξεζηκνπνηεζνύλ γηα ηελ παξαγσγή βηνληίδει. 3
ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΔΘΟΓΟΙ 1. Οξγαληζκόο Δξγαζηεξηαθό Μάζεκα - Πξάζηλε Βηνηερλνινγία (2ΓΜ) Σηελ παξνύζα άζθεζε ζα ρξεζηκνπνηεζεί ην κνλνθύηηαξν ρισξνθύθνο Scenedesmus obliquus. H θπινγελεηηθή ηνπ ηαμηλόκεζε είλαη ε εμήο: Βαζίιεην : Φπηά Γηαίξεζε : Φισξόθπηα Κιάζε : Φισξνθύθε Σάμε : Chlorococcales Γέλνο : Scenedesmus Δίδνο : Scenedesmus οbliquus Ο νξγαληζκόο απηόο είλαη κνλνθύηηαξνο επθαξπσηηθόο, κε ειιεηςνεηδή θύηηαξα, κήθνπο πεξίπνπ 5-10 κm. Ο θύθινο δσήο ηνπ δηαξθεί γύξσ ζηηο 20 ώξεο. Σηε δηάξθεηα απηή, δηαηξείηαη κία θνξά δίλνληαο 4-8 ζπγαηξηθά θύηηαξα, ηα νπνία κόιηο ζρεκαηηζηνύλ πιήξσο, ζπλήζσο απνθόπηνληαη κεηαμύ ηνπο (δελ ζρεκαηίδνπλ θνηλόβηα). Δμειηθηηθά βξίζθεηαη πνιύ θνληά ζηα άιια δύν γλσζηά ζην εξεπλεηηθό πεδίν θύθε ηε Φιακπδνκνλάδα (Chlamydomonas) θαη ηε Φισξέιια (Chlorella). Πξόθεηηαη γηα θσηνζπλζεηηθό κηθξννξγαληζκό, πνπ παξάγεη νμπγόλν θαηά ηε θσηνζύλζεζή ηνπ. Όζνλ αθνξά ηα ραξαθηεξηζηηθά ηεο θσηνζπλζεηηθήο ηνπ δξαζηεξηόηεηαο κνηάδεη κε ηα γπκλόζπεξκα θπηά. Ο άγξηνο ηύπνο (wt) έρεη ηελ ηθαλόηεηα βηνζύλζεζεο ηεο ρισξνθύιιεο θαη ζην ζθνηάδη, όπσο θαη ζην θσο. Γειαδή, αθόκα θαη ζε εηεξόηξνθεο ζπλζήθεο έρεη δηακνξθσκέλνπο ρισξνπιάζηεο θαη ελεξγά θσηνζπζηήκαηα Ι θαη ΙΙ (εθ όζνλ ηνπ παξέρεηαη θάπνηα πεγή νξγαληθνύ άλζξαθα ζην ζξεπηηθό κέζν). 4 2. πλζήθεο Αλάπηπμεο Η αλάπηπμε ηνπ ρισξνθύθνπο ζα γηλεη ζε εηδηθνύο επηκήθεηο γπάιηλνπο ζσιήλεο (δηακέηξνπ 5 cm), κε εηδηθό ζηόκην ζην θάησ κέξνο ηνπ ζσιήλα, πνπ επηηξέπεη ηνλ αεξηζκό ηεο θαιιηέξγεηαο. Οη ελ ιόγσ ζσιήλεο ζα ηνπνζεηεζνύλ ζε ελπδξείν ζηαζεξήο ζεξκνθξαζίαο 30 o C, κπξνζηά από ιάκπεο ιεπθνύ θσηηζκνύ, κε ξπζκηδόκελε έληαζε (βι. Σρήκα). Οη θαιιηέξγεηεο ζα αλαπηπρζνύλ ζε απηέο ηηο ζπλζήθεο γηα 2-3 εκέξεο πεξίπνπ, έπεηηα ζα αλαθαιιηεξγεζνύλ πξνζζέηνληαο λέν κέζν θαιιηέξγεηαο (βι. Πίλαθα) (Bishop and Senger, 1971), ελώ αθνινύζσο, κεηά ην ύστημα προκαλλιέργειας τοσ τλωρουύκοσς Scenedesmus πέξαο 3-4 εκεξώλ, ζα ρξεζηκνπνηεζνύλ σο κεηξηθή θαιιηέξγεηα obliquus γηα ηε δηεμαγσγή ηνπ εθάζηνηε πεηξάκαηνο. Όιεο νη πεηξακαηηθέο πξνζεγγίζεηο ζα γίλνπλ ζε ζξεπηηθό κέζν πνπ εθηόο ησλ αλόξγαλσλ ζπζηαηηθώλ ηνπ (βι. παξαθάησ πίλαθα) ζα έρεη θαη νξγαληθό άλζξαθα ππό ηελ κνξθή γιπθόδεο (5g/L).
πζηαηηθά ηνπ κέζνπ θαιιηέξγεηαο ηνπ Scenedesmus obliquus (Bishop and Senger, 1971) ΤΣΑΣΙΚA ΠΕΡΙΕΚΣΙΚΟΣΗΣΑ (σε g/l) CaCl 2 x 2H 2 O 1,50 KNO 3 80,0 MgSO 4 x7h 2 O 24,6 NaCl 47,0 Na 2 HPO 4 x2h 2 O 17,8 NaH 2 PO 4 x1h 2 O 40,5 FeSO 4 x1h 2 O 0,06 Fe(III)citrate 0,24 H 3 BO 3 2,86 MnCl 2 x4h 2 O 1,81 ZnSO 4 x7h 2 O 0,222 CuSO 4 x5h 2 O 0,079 MoO 3 (85%-99.5%) 0,0177 3. Τπνινγηζκόο Κπηηαξηθήο πγθέληξωζεο Βλέπε Υλικά και Μεθόδοσς ηης 3 ης άζκηζης 4. Δπαγωγηθόο Φζνξηζκόο-Φπζηθνρεκηθέο Αλαιύζεηο ηεο Μνξηαθήο Γνκήο θαη Λεηηνπξγίαο ηνπ Φωηνζπλζεηηθνύ Μεραληζκνύ 5 Βλέπε Υλικά και Μεθόδοσς ηης 3 ης άζκηζης 5. Λπνθηινπνίεζε θπηηάξωλ Η ιπνθηινπνίεζε ησλ θπηηάξσλ γηα ηνλ ππνινγηζκό ηνπ μεξνύ βάξνπο, αιιά θαη γηα ηελ πεξαηηέξσ ρξήζε ηνπο γηα ηελ εθρύιηζε ησλ ιηπαξώλ νπζηώλ, κεηά από θπγνθέληξεζε ησλ θαιιηεξγεηώλ ιακβάλεη ρώξα ζε ιπνθηινπνηεηή (Heto, MAXI dry lyo) γηα 10-12 ώξεο. 6. Μέζνδνο εθρύιηζεο ιηπαξώλ Γηα ηελ εθρύιηζε ιηπαξώλ νη θαιιηέξγεηεο ζα θπγνθεληξεζνύλ (5min ζηα 1500g) θαη ζηελ ζπλέρεηα ζα ιπνθηινπνηεζνύλ γηα πεξίπνπ 10-12 ώξεο. Τν μεξό βάξνο θάζε δείγκαηνο δπγίδεηαη θαη πξνζηίζεληαη νη αλάινγεο πνζόηεηεο ρισξνθόξκηνπ θαη κεζαλόιεο γηα ηελ εθρύιηζε ησλ ιηπαξώλ νπζηώλ. Σε 1g μεξήο βηνκάδαο κηθξνθπθώλ πξνζηίζεληαη 2ml CHCl 3 θαη 1ml CH 3 OH. Τν δείγκα νκνγελνπνηείηαη κε ηελ ρξήζε εηδηθνύ κίμεξ (ULTRA TURRAX T25, IKA LABORTECHINIK) γηα κεξηθά ιεπηά. Τν νκνγελνπνηεκέλν δείγκα αλαδεύεηαη γηα 20sec, κεηά θπγνθεληξείηαη γηα 5min ζηηο 1500g θαη ζπιιέγεηαη ην ππεξθείκελν. Πξνζηίζεηαη μαλά ε ίδηα αλαινγία CHCl 3 θαη CH 3 OH, πνπ είρε ππνινγηζηεί αξρηθά γηα ην θάζε δείγκα. Αθνινύζσο νκνγελνπνηείηαη ζην κίμεξ ιίγα ιεπηά θαη κεηά ηνπνζεηείηαη γηα 20sec ζε ππεξήρνπο γηα θαιύηεξν ζπάζηκν ησλ θπηηάξσλ. Από ηελ θπγνθέληξεζε πνπ αθνινπζεί (5min ζηα 1500g) θξαηείηαη ην ππεξθείκελν. Η παξαπάλσ δηαδηθαζία επαλαιακβάλεηαη γηα αθόκε κηα
θόξα. Μεηά ην ηέινο ηεο δηαδηθαζίαο ηα ιηπαξά πνπ έρνπλ θξαηεζεί (κεηά από θάζε θπγνθέληξηζε) από θάζε δείγκα ηνπνζεηνύληαη ζε κηα δηαρσξηζηηθή ρνάλε θαη κε ηελ πξνζζήθε NaCl 1% (v/v) ζε αλαινγία 2mL αλά g μεξήο βηνκάδαο ηνπ θάζε δείγκαηνο, ππάξρεη δηαρσξηζκόο θάζεσλ. Η θάησ θάζε πνπ είλαη ηα ιηπαξά κε ην ρισξνθόξκην, απνζπάηαη κε κεγάιε πξνζνρή θαη ζα ππνβιεζεί ζηε ζπλέρεηα ζε εμάηκηζε ησλ ππνιεηκκάησλ ηνπ νξγαληθνύ δηαιύηε. 7. Μέηξεζε Ακύινπ Γηα ηηο κεηξήζεηο ακύινπ ζα ρξεζηκνπνηεζεί ε κέζνδνο anthrone (Jermyn 1963). Σε 25κl δείγκαηνο θαη 975κl H 2 O, ζα πξνζηεζνύλ 2ml H 2 SO 4 θαη 0,004g Anthrone (C 14 H 10 O). Σηε ζπλέρεηα αθνύ ην δείγκα αλαδεπηεί ζα κεηξεζεί θσηνκεηξηθά ζηα 630nm. Γηα ηελ πνζνηηθή εθηίκεζε ησλ κεηξήζεσλ εηνηκάζηεθε θακπύιε αλαθνξάο. 8. Μέζνδνο παξαζθεπήο Βηνληίδει Γηα ηελ παξαγσγή ηνπ βηνληίδει θάπνηα πνζόηεηα (4ml) ησλ ιηπαξώλ νπζηώλ πνπ εθρπιίζηεθε από ηηο θαιιηέξγεηεο ησλ κηθξνθπθώλ ζεξκέλεηαη ζηνπο 55 ν C. Δηνηκάδεηαη δηάιπκα 12 ml κεζαλόιεο θαη 125 mg NaOH, αλαδεύεηαη κέρξη λα δηαιπζεί θαιά θαη ζηε ζπλέρεηα πξνζηίζεηαη ην δηάιπκα (Μεζνμείδην) ζηγά ζηγά ζην δεζηό δείγκα ιηπαξώλ θαη αλαδεύεηαη γηα 3h έηζη ώζηε λα γίλεη ε αληίδξαζε ηεο εζηεξνπνίεζεο (Chisti 2007). Σηε ζπλέρεηα αθήλεηαη ην δηάιπκα λα εξεκήζεη θαη ακέζσο αξρίδεη λα δηαθαίλεηαη ν δηαρσξηζκόο ησλ θάζεσλ (νινθιεξώλεηαη κεηά από 10-12 ώξεο), όπνπ ζηελ θάησ θάζε θαηαιήγεη ε γιπθεξίλε, θαη ζην ππεξθείκελν είλαη ην βηνληίδει. Σπιιέγεηαη ην ππεξθείκελν πνπ είλαη ην βηνληίδει κε κεγάιε πξνζνρή θαη πιέλεηαη κε 5% λεξό. Απηή ε δηαδηθαζία επαλαιακβάλεηαη κέρξη ην βηνληίδει γίλεη αξθεηά δηαπγέο. Η δηαύγεηα ηνπ δείγκαηνο απνηειεί έλα από ηα πνηνηηθά ραξαθηεξίζηεθα ηνπ βηνληίδει. Κάπνηα άιια πνηνηηθά ραξαθηεξίζηεθα είλαη ην ph ηνπ πνπ πξέπεη λα είλαη νπδέηεξν (ph 7), ν πιήξεο δηαρσξηζκόο ηνπ από ην λεξό θαη ε κπξσδηά ηνπ (δειαδή λα κελ κπξίδεη αιθνόιε αιιά ζαλ ηελ κπξσδηά θάπνηνπ ζπνξέιαηνπ)(hossain, Salleh et al. 2008). 6
ΠΔΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΓΙΑΓΙΚΑΙΑ Βηνηερλνινγία κηθξνθπθώλ ΙΙΙ: Βέιηηζηεο ζπλζήθεο ζύλζεζεο ιηπαξώλ από κηθξνθύθε Παξαζθεπή βηνληίδει Πεηξακαηηθή ξνή Πεξηγξαθή Τιηθά Βήκα 1: Μεηξηθέο θαιιηέξγεηεο Μεηξηθέο θαιιηέξγεηεο ζε ελπδξείν ζηαζεξήο ζεξκνθξαζίαο (28 ν C πεξίπνπ) θαη έληαζεο θσηόο (150 κmol/m 2 /s) (5 εκέξεο) Απνζηεηξσκέλα «ζαμόθσλα» (7) Απνζηεηξσκέλα ζξεπηηθά (2 L) 2 petri Scenedesmus obliquus 7 Βήκα 2: Αλαθαιιηέξγεηεο θαη πεηξακαηηθνί ρεηξηζκνί Οη πεηξακαηηθνί ρεηξηζκνί ζα γίλνπλ όπσο πεξηγξάθνληαη ζην αθόινπζν νξγαλόγξακκα. Τα πεηξάκαηα ζα πξαγκαηνπνηεζνύλ ζε ζπλζήθεο θσηόο (50 κmol/m 2 /s) θαη ζε ζθνηάδη από δύν επαλαιήςεηο γηα ηνλ θάζε έλα ρεηξηζκό. Θα γίλεη πξνζπάζεηα «ρεηξαγώγεζεο» ησλ κεηαβνιηθώλ κνλνπαηηώλ ηνπ Scenedesmus obliquus, απνζθνπώληαο ζηελ αύμεζε ηεο θπηηαξηθήο ζπγθέληξσζεο ησλ ιηπαξώλ ηνπο, κε ηελ επηιεθηηθή έιιεηςε αδώηνπ [-Ν], θσζθόξνπ [-P] ή θαη ησλ δύν καδί [-N/P] από ην ζξεπηηθό κέζν. Απηό ζεκαίλεη όηη ζπλνιηθά ζα ππάξρνπλ 8 δηαθνξεηηθνί ρεηξηζκνί από δύν επαλαιήςεηο ζηνλ θάζε έλα. κεηξηθή control -N -P -N/P Τα πεηξάκαηα απηά ζα πξαγκαηνπνηεζνύλ ζε θσληθέο θηάιεο ησλ 500 ml θαη ζα αθεζνύλ γηα 5 εκέξεο λα αλαπηπρζνύλ ζε επσαζηήξεο ζηνπο 30 ν C κε αλάδεπζε. Απνζηεηξσκέλεο θσληθέο θηάιεο ησλ 500 ml (16) Απνζηεηξσκέλα εηεξόηξνθα ζξεπηηθά (+ γιπθόδε 5g/L) (1 L control, 1 L ζξεπηηθό απνπζία Ν, 1 L ζξεπηηθό απνπζία P θαη 1 L ζξεπηηθό απνπζία Ν θαη P ηαπηόρξνλα) Απνζηεηξσκέλεο θσληθέο θηάιεο ησλ 2 L (2) Απνζηεηξσκέλνπο νγθνκεηξηθνύο θπιίλδξνπο ησλ 100 ml θαη ησλ 500 ml (1
+ 1 αληίζηνηρα) Βήκα 3: Υπνινγηζκόο θπηηαξηθήο ζπγθέληξσζεο Βήκα 4: Δπαγσγηθόο θζνξηζκόο - Φπζηθνρεκηθέο Αλαιύζεηο ηεο Μνξηαθήο Γνκήο θαη Λεηηνπξγίαο ηνπ Φσηνζπλζεηηθνύ Μεραληζκνύ Βήκα 5: Μέηξεζε ακύινπ Σε όιεο ηηο θαιιηέξγεηεο θξνληίδνπκε λα έρνπκε ηελ ίδηα ζηαζεξή ζπγθέληξσζε θπηηάξσλ (δεο βήκα 3 γηα ηνλ ππνινγηζκό ηεο) θαη ηνλ ίδην ζηαζεξό ηειηθό όγθν (300 ml) ώζηε λα είλαη ζπγθξίζηκα ηα απνηειέζκαηα. Θα γίλεη δεηγκαηνιεςία ζε ζηείξεο ζπλζήθεο ώζηε λα ππνινγηζηεί ε θπηηαξηθή ζπγθέληξσζε ηεο θαιιηέξγεηαο. Γηα ηνλ ππνινγηζκό απαηηνύληαη κόλν 1 ml δείγκαηνο ώζηε λα γίλεη ε θσηνκέηξεζε θαη κεηά ε αλαγσγή ζε κl παθεηαξηζκέλσλ θπηηάξσλ (δεο Υιηθά θαη ζηηο Μεζόδνπο) Θα ρξεζηκνπνηεζεί 1 ml θαιιηέξγεηαο ώζηε λα κεηξεζεί ζην HANDY PEA θαη κε ηε βνήζεηα ηνπ επαγσγηθνύ θζνξηζκνύ λα εθηηκήζνπκε ηηο αιιαγέο ηεο κνξηαθήο δνκήο θαη ιεηηνπξγίαο ηνπ θσηνζπλζεηηθνύ κεραληζκνύ κεηαμύ ησλ δηαθνξεηηθώλ ρεηξηζκώλ. Θα ρξεζηκνπνηεζνύλ 25 κl δείγκαηνο ώζηε κε ηε κέζνδν ηεο anthrone λα πνζνηηθνπνηεζεί ην πεξηερόκελν άκπιν. Απνζηεηξσκέλε γπάιηλε πηπέηα ησλ 20 ml (4) Γπάιηλα ζσιελάθηα αληίδξαζεο (16) Κπςειίδα ηνπ 1 ml (γηαηί κε απηήλ έρεη γίλεη ε ζπζρέηηζε κε ην PCV) Δηδηθά tubes γηα ην JIP-test (2) Anthrone (0,01 g) H 2 SO 4 (40 ml) Απηνληζκέλν λεξό (200 ml) 8 Βήκα 6: Σπιινγή ησλ θπηηάξσλ Μεηά ην πέξαο 5 εκεξώλ από ηελ εθθίλεζε ηνπ πεηξάκαηνο νη παξαπάλσ ρεηξηζκνί ζπιιέγνληαη κε θπγνθέληξηζε (3000 rpm γηα 3 min). Τειηθά θάζε έλαο ρεηξηζκόο ζπιιέγεηαη ζε έλα falcon ησλ 50 ml, νπόηε θαη θαηαιήγνπκε κε 8 δηαθνξεηηθά falcon. 8 falcon ησλ 50 ml light 1 control 2 -N 3 -P 4 -N/P dark 5 control 6 -N 7 -P 8 -N/P Σεκ: πάληα ζηα πεηξάκαηα θξνληίδνπκε λα έρνπκε πεξηζζόηεξεο ηεο κηαο επαλαιήςεηο. Όκσο ε ζπιινγή βηνκάδαο γηα ηελ εθρύιηζε ησλ ιηπαξώλ πνπ ζα αθνινπζήζεη απαηηεί κεγάιεο πνζόηεηεο, πνπ δελ
Βήκα 7: Λπνθηινπνίεζε ησλ θπηηάξσλ είλαη εθηθηό λα ζπιιερζνύλ θάλνληαο θαιιηέξγεηεο ζε θσληθέο θηάιεο ησλ 500 ml ζε εύινγν ρξνληθό δηάζηεκα. Γη απηό θαη ζην ελ ιόγσ πείξακα θαηαιήμακε κε κία επαλάιεςε από θάζε ρεηξηζκό. Τα 8 falcon ζα ηνπνζεηεζνύλ ζην speedvac όπνπ θαη ζα αθεζνύλ overnight ώζηε λα απνκαθξπλζεί θάζε ίρλνο λεξνύ από ηα θύηηαξα. Η μεξή βηνκάδα πνπ ζα πξνθύςεη δπγίδεηαη ώζηε λα γίλεη ε αλαγσγή ησλ ιηπαξώλ πνπ ζα εθρπιηζηνύλ από απηήλ. Βήκα 8: Δθρύιηζε ιηπαξώλ Βήκα 9: Γηαρσξηζκόο θάζεσλ πνιηθώλ θαη κε πνιηθώλ ιηπαξώλ ζε δηαρσξηζηηθή ρνάλε. Σεκ: είλαη πνιύ ζεκαληηθό λα είλαη απόιπηα μεξά ηα δείγκαηά καο, αιιηώο δελ ζα γίλεη ε εθρύιηζε. Με βάζε ην βάξνο ηεο μεξήο βηνκάδαο (dwt) πξνζζέηνπκε ρισξνθόξκην θαη κεζαλόιε ζε αλαινγία 2:1 γηα θάζε κία από ηηο 3 εθρπιίζεηο πνπ ζα αθνινπζήζνπλ. 1 ε εθρύιηζε: εηδηθό «καραίξη» + αλάδεπζε γηα 20 min 2 ε εθρύιηζε: εηδηθό «καραίξη» + bath ππεξήρσλ γηα 20 min 3 ε εθρύιηζε: εηδηθό «καραίξη» + αλάδεπζε γηα 20 min Τα ππεξθείκελα από ηελ θάζε εθρύιηζε ζπιιέγνληαη ζε έλα falcon ησλ 50 ml. Τν πεξηερόκελν από θάζε έλα falcon εηζάγεηαη ζηε δηαρσξηζηηθή ρνάλε θαη πξνζηίζεληαη 5 ml NaCl 1%, αλαδεύεηαη θαη αθήλεηαη λα εξεκήζεη. Ακέζσο παξαηεξνύληαη ζηαγόλεο ιηπαξώλ, νη νπνίεο θαζηδάλνπλ ζην θάησ κέξνο ηεο δηαρσξηζηηθήο ρνάλεο ζηε θάζε κε ην CHCl 3 (όπσο θαίλεηαη αθνινύζσο), ελώ επάλσ κέλεη ε θάζε κε ηε κεζαλόιε ηελ νπνία θαη πεηάκε. CHCl 3 (300 ml) CH 3 OH (100 ml) Falcon ησλ 50 ml (8) NaCl 1% (40 ml) Falcon ησλ 50 ml (8) 9 Βήκα 10: Παξαγσγή βηνληίδει Η θάζε κε ην CHCl 3 ζπιιέγεηαη ζε έλα λέν falcon θαη εμαηκίδεηαη ζηνλ εμαηκηζηήξα, ώζηε λα πνζνηηθνπνηεζνύλ ηα ιηπαξά πνπ πεξηέρεη θαη ηα νπνία αλάγνληαη ζηελ αξρηθά κεηξνύκελε μεξή βηνκάδα. 10 ml ιηπαξώλ (ζε πεξίπησζε πνπ δελ ζα ζπιιέμνπκε ηελ πνζόηεηα απηή από ηα κηθξνθύθε, ζα ρξεζηκνπνηεζεί ειηέιαην) ζα ρξεζηκνπνηεζνύλ γηα ηελ παξαγσγή ηνπ βηνληίδει όπσο πεξηγξάθεηαη ζην αθόινπζν δηάγξακκα θαη εμεγείηαη αλαιπηηθά ζηα πιηθά θαη ζηηο κεζόδνπο. Ηιηέιαην (10 ml) CH 3 OH (30 ml) NaOH (0,31 g) Απηνληζκέλν λεξό
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. http://www.fao.org/uploads/media/0707_wagner_-_biodiesel_from_algae_oil.pdf 2. http://spg.ucsd.edu/algae/pdf/mayfield_ucsd%20biofuels%201-29.pdf 3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20547326 4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19636552 5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16772097 6. http://146.164.33.61/termo/seminarios09/biodiesel%20alga/chance%20for%20korea%20to%2 0advance%20algal-biodiesel%20technology%2009.pdf 7. http://www.buzzle.com/articles/algae-as-biofuel.html 10