Ανάλυση μεταβολικού ελέγχου

Ανάλυση μεταβολικού ελέγχου Αναπλ. Καθηγητής Δημοσθένης Σαρηγιάννης 1

Εισαγωγή Βασικός στόχος της Μεταβολικής Μηχανικής θεωρείται η διευκρίνιση των παραμέτρων που είναι υπεύθυνοι για τον έλεγχο των ροών. Στα προηγούμενα κεφάλαια είδαμε ότι με την Ανάλυση Μεταβολικών Ροών μπορούμε να προσδιορίσουμε τις σχέσεις και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφορετικών μεταβολικών μονοπατιών και να ποσοτικοποιηθούν οι ροές γύρω από τα σημεία διακλάδωσης. Στη συνέχεια θα δούμε με ποιες μεθόδους είναι εφικτός ο προσδιορισμός των παραμέτρων αυτών που ασκούν έλεγχο στη ροή των μεταβολικών μονοπατιών. Αυτό επιτυγχάνεται με την μεθοδολογία γνωστή ως Ανάλυση του Μεταβολικού Ελέγχου ΑΜΕ (metabolic control analysis). Με την Ανάλυση του Μεταβολικού Ελέγχου προσδιορίζεται ο έλεγχος που ασκεί κάθε αντίδραση, δηλαδή κάθε ένζυμο, στο μεταβολικό δίκτυο. Μπορούμε να πούμε ότι ΑΜΕ είναι μια ανάλυση της ευαισθησίας των μεταβολικών συστημάτων, όπου. μελετούμε το σχετικό έλεγχο που εξασκείται από κάθε βήμα της μεταβολικής οδού στις διάφορες μεταβλητές του συστήματος (ροές, συγκεντρώσεις μεταβολιτών 2

Η ΑΜΕ εκκινεί από τη σημαντική παραδοχή, πως οι αντιδράσεις ενός δικτύου τείνουν να διατηρούνται σε ισορροπία, ακόμη και όταν οι εξωκυτταρικές συνθήκες μεταβάλλονται, έτσι ώστε να μην υπάρξει καταστροφική διαφοροποίηση των ενδοκυττάριων συγκεντρώσεων των μεταβολιτών. Η κατανόηση του ελέγχου των ροών αποτελεί κρίσιμο σημείο για τον ορθολογικό σχεδιασμό των μεταβολικών ροών, το οποίο αποτελεί κεντρικό στόχο της Μεταβολικής Μηχανικής. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι με τον όρο έλεγχο εννοούμε: α) την εύρεση του ελέγχοντος σταδίου σε ένα δίκτυο ενζυμικών αντιδράσεων, β) την εύρεση των επιδράσεων της ενζυμικής δραστικότητας στις ενδοκυττάριες συγκεντρώσεις των μεταβολιτών, και γ) τη σύζευξη της τοπικής ενζυμικής κινητικής με την μεταβολική συμπεριφορά του συστήματος. 3

ΘΕΜΕΛΙΩΔΕΙΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Η ΑΜΕ εφαρμόζεται αποκλειστικά σε συστήματα που βρίσκονται σε σταθερή κατάσταση (δυναμική ισορροπία) ξεκινώντας από τη βασική υπόθεση ότι μια σταθερή δυναμική ισορροπία ορίζεται από τις δραστικότητες όλων των ενζύμων που καταλύουν τα επιμέρους στάδια μιας μεταβολικής οδού. Οι ενζυμικές δραστικότητες μαζί με τις συγκεντρώσεις του υποστρώματος για την πρώτη αντίδραση και του προϊόντος της τελευταίας αντίδρασης θεωρούνται ως παράμετροι του συστήματος. Οι δύο αυτές συγκεντρώσεις μπορούν να διατηρηθούν σταθερές είτε ελέγχοντας τις περιβαλλοντικές συνθήκες (π.χ σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας), είτε με μηχανισμούς ενδοκυτταρικής ρύθμισης. Κατά κανόνα οι παράμετροι του συστήματος μπορούν να τροποποιηθούν και έτσι να καθορίζουν απόλυτα το σύστημα. Οι ιδιότητες του συστήματος, που καθορίζονται από τις τιμές των παραμέτρων, όπως είναι για παράδειγμα η ροή της μεταβολικής οδού ή οι ενδιάμεσες συγκεντρώσεις των μεταβολιτών, θεωρούνται ως μεταβλητές του συστήματος. 4

Ας θεωρήσουμε μια αντίδραση δύο σταδίων όπου το υπόστρωμα S μετατρέπεται σε προϊόν Ρ μέσω του ενδιάμεσου Χ: Η ροή που χαρακτηρίζει τη μετατροπή του S σε Ρ συμβολίζεται με.j. Είναι σαφές ότι η σταθερή κατάσταση καθορίζεται από τις παραμέτρους του συστήματος, δηλαδή, τη δραστικότητα των ενζύμων Ε ι και Ε 2 και τις συγκεντρώσεις του υποστρώματος S και του προϊόντος Ρ. Ο καθορισμός της σταθερής κατάστασης συνεπάγεται τον προσδιορισμό των μεταβλητών όπως της συγκέντρωσης του ενδιάμεσου μεταβολίτη C x της ροής J κ.ά. Αν οι τιμές των παραμέτρων αλλάξουν τότε το σύστημα θα μετακινηθεί σε μια νέα σταθερή κατάσταση η οποία βέβαια θα χαρακτηρίζεται από άλλες τιμές των μεταβλητών (C x, J). Θεωρείται δε ότι οι μεταβολές των συγκεντρώσεων των ενδιάμεσων μεταβολιτών κατανέμονται με ομογενή τρόπο στα ένζυμα που δρουν στους μεταβολίτες αυτούς. Η ροή που χαρακτηρίζει τη μετατροπή του S σε Ρ συμβολίζεται με.j. 5

Ο έλεγχος των μεταβολικών ροών μετράται δια της εφαρμογής μιας διαταραχής στο υπό εξέταση βήμα μιας μεταβολικής οδού και στη συνέχεια προσδιορίζεται το αποτέλεσμα επί της μεταβλητής που μας ενδιαφέρει αφού το σύστημα έχει καταλήξει σε μια νέα σταθερή κατάσταση. Μετά τον συσχετισμό των παραμέτρων με τις μεταβλητές, έπεται ο προσδιορισμός της επίδρασης των παραμέτρων στις μεταβλητές. Για παράδειγμα, η επίδραση της ενζυμικής ενεργότητας στη ροή ενός μονοπατιού δηλώνει τον έλεγχο, δηλαδή την επίδραση, που ασκεί το συγκεκριμένο ένζυμο στο αντίστοιχο μονοπάτι. Αυτές οι επιδράσεις εκφράζονται με συντελεστές διαφορών τους λεγόμενους Συντελεστές Ελέγχου, 6

Ο ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΡΟΗΣ Bασικό στόχο της ΑΜΕ αποτελεί η συσχέτιση των μεταβλητών ενός μεταβολικού συστήματος (π.χ. τη ροή) με τις παραμέτρους του συστήματος αυτού (π.χ ενζυμική δραστικότητα). Η συσχέτιση αυτή περιγράφεται με την βοήθεια των συντελεστών ελέγχου (Control coefficients) οι οποίοι αποτελούν ένα σχετικό μέτρο του ύψους της διαταραχής σε μια παράμετρο που επηρεάζει μια μεταβλητή του συστήματος (ροές ή συγκεντρώσεις). Οι συντελεστές αυτοί ορίζονται μόνο σε συνθήκες μόνιμης κατάστασης, όπου το σύστημα καταλήγει σε δυναμική ισορροπία. Ο σημαντικότερος από τους συντελεστές ελέγχου είναι ο ονομαζόμενος συντελεστής ελέγχου ροής (Flux control coefficients) C J, ο οποίος ορίζεται από τη σχετική μεταβολή της ροής στη σταθερή κατάσταση η οποία είναι αποτέλεσμα πολύ μικρής μεταβολής στη δραστικότητα ενός ενζύμου Ε ως προς τη σχετική μεταβολή της ενζυμικής δραστικότητας: όπου J η ροή στη σταθερή κατάσταση σε μια αντίδραση του μονοπατιού και Ε η ενεργότητα του ενζύμου 7

Σε ένα διάγραμμα που περιγράφει την εξάρτηση της ροής της σταθερής κατάστασης συναρτήσει της ενζυμικής δραστικότητας (όπως είναι αυτό του παρακάτω σχήματος Σχήμα. Εξάρτηση της ροής σε ένα σημείο μιας μεταβολικής οδού από τη δραστικότητα του ενζύμου. Η κλίση της εφαπτομένης στο διπλό λογαριθμικό διάγραμμα (β) αντιστοιχεί στο συντελεστή ελέγχου ροής C j στο σημείο e,j 8

Για μια γραμμική μεταβολική οδό η τιμή του συντελεστή (C j κυμαίνεται μεταξύ 0 και 1 (Η τιμή 1 αντιστοιχεί στο τμήμα της γραμμικής εξάρτησης της μεταβολικής ροής από τη δραστικότητα του ενζύμου). Για παράδειγμα αν 10% αύξηση της συγκέντρωσης ενός ενζύμου οδηγεί σε αύξηση της ροής κατά 7.5% ο συντελεστής ελέγχου ροής θα είναι ίσος με 0.075/0.10=0.75. Σε διακλαδιζόμενους μεταβολικούς δρόμους η τιμή αυτή μπορεί να είναι και αρνητική, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση όπου μια αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας στον έναν κλάδο επιφέρει αύξηση της ροής στον κλάδο αυτό, γεγονός όμως που έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ροής στον άλλο κλάδο. Είναι προφανές ότι το ένζυμο με τη μεγαλύτερη τιμή του συντελεστής ελέγχου ροής ασκεί και τον ισχυρότερο έλεγχο στη ροή υπό τη συγκεκριμένη σταθερή κατάσταση. Με αντίστοιχο τρόπο, μπορεί να περιγραφεί η επίδραση που έχει μια μεταβολή της ενζυμικής δραστικότητας Ε στην συγκέντρωση c ενός ενδιάμεσου μεταβολίτη. Η επίδραση αυτή εκφράζεται από τον συντελεστή ελέγχου συγκέντρωσης C x ο οποίος δίνεται από τη σχέση: 9

ΤΟ ΑΘΡΟΙΣΤΙΚΟ ΘΕΩΡΗΜΑ (ή Θεώρημα Άθροισης Συντελεστών Ελέγχου Ροής) Η ΑΜΕ αποκάλυψε ότι αν όλα τα ένζυμα τα οποία επιδρούν σε μια συγκεκριμένη μεταβολική ροή σε ένα κύτταρο ή σε ένα σύστημα ληφθούν υπόψη, τότε το άθροισμα των συντελεστών ελέγχου ροής κάθε επιμέρους ενζύμου ισούται με 1: Η σχέση αυτή είναι γνωστή ως αθροιστικό θεώρημα για τους συντελεστές ελέγχου ροής του οποίου η μαθηματική έκφραση δίνεται από την παρακάτω σχέση: Σύμφωνα με τις παραπάνω εξισώσεις η αύξηση κάποιων συντελεστών ροής συνοδεύεται από μείωση άλλων συντελεστών ώστε το συνολικό άθροισμα να διατηρείται σταθερό και ίσο με 1. Συνέπεια του θεωρήματος είναι το συμπέρασμα ότι οι συντελεστές ελέγχου είναι καθολικές ιδιότητες και πως στα μεταβολικά συστήματα ο έλεγχος αποτελεί ιδιότητα του συστήματος που μοιράζεται σε όλα τα επιμέρους βήματα. Με άλλα λόγια, το αθροιστικό θεώρημα δείχνει ότι όλα τα ένζυμα σε ένα μεταβολικό δρόμο μοιράζονται τον έλεγχο της ροής. 10

Παλαιότερα πολλοί ερευνητές ανέφεραν την παρουσία ορισμένων ενζύμων γνωστών ως ρυθμοκαθοριστικά ένζυμα. Τα ένζυμα αυτά εντοπιζόταν μετά από ένα σημείο διακλάδωσης και κατέλυαν αντιδράσεις οι οποίες θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως μη αντιστρεπτές (με πολύ μεγάλη τιμή σταθεράς ισορροπίας). Με βάση τη θεώρηση αυτή αν λοιπόν κανείς ήθελε να αυξήσει την απόδοση ενός μεταβολικού δρόμου θα αρκούσε απλώς να αυξήσει την ποσότητα του ρυθμοκαθοριστικού ενζύμου. Εφαρμόζοντας τις αρχές της ΑΜΕ θα έπρεπε τα λεγόμενα ρυθμοκαθοριστικά ένζυμα να έχουν συντελεστή ελέγχου ροής ίσο με 1 και κατά συνέπεια τα άλλα ένζυμα του μεταβολικού αυτού δρόμου θα έπρεπε να έχουν συντελεστές ελέγχου ροής ίσους με 0. Καθώς αυτό θεωρητικά δεν είναι δυνατό, είναι ελάχιστα πιθανό ότι η αύξηση της ποσότητας ενός ρυθμοκαθοριστικού ενζύμου (π.χ μέσω της υπερέκφρασης του γονιδίου) θα συνοδευθεί από αύξηση της ροής του μεταβολικού μονοπατιού (γεγονός που πολλές πειραματικές μελέτες το επιβεβαιώνουν). 11

Επιπροσθέτως σύμφωνα με αυτή τη θεωρία θα έπρεπε η αύξηση της ποσότητας ενός υποτιθέμενου ρυθμοκαθοριστικού ενζύμου να οδηγεί σε συνεχή μείωση του συντελεστή ελέγχου ροής του μεταβολικού μονοπατιού έως ότου τελικά σχεδόν μηδενιστεί. Προφανώς αυτό που ισχύει είναι ότι ο έλεγχος σε ένα μεταβολικό δρόμο μοιράζεται με διαφορετική αναλογία μεταξύ όλων των ενζύμων. Το αθροιστικό θεώρημα στην περίπτωση του συντελεστή ελέγχου συγκέντρωσης εκφράζεται από την ακόλουθη σχέση: Η εξίσωση δείχνει ότι για κάθε μεταβολίτη τουλάχιστον ένα ένζυμο πρέπει να ασκεί αρνητικό έλεγχο, δηλαδή όταν το επίπεδο του ενζύμου αυτού αυξάνει η συγκέντρωση του μεταβολίτη να μειώνεται. 12

ΕΛΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΕΣ ΕΛΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Στην ανάλυση μεταβολικού ελέγχου, οι ιδιότητες του κάθε μεμονωμένου ενζύμου προσδιορίζονται με τρόπο παρόμοιο με αυτόν που χρησιμοποιείται για την ανάλυση του ελέγχου ροής, στην περίπτωση αυτή όμως προσδιορίζοντας ένα συντελεστή ευαισθησίας γνωστό ως συντελεστή ελαστικότητας (elasticity coefficient). Με τον όρο ελαστικότητα (elasticity) αναφερόμαστε σε μια τοπική ιδιότητα ενός ενζύμου που περιγράφει με ποιο τρόπο η ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης μεταβάλλεται σε σχέση με τη συγκέντρωση οποιουδήποτε μεταβολίτη (υπόστρωμα, προϊόν ή άλλος μεταβολίτης) που μπορεί να επιδράσει στην ταχύτητα αυτή. Έτσι, ελαστικότητα με τιμή 0.5 σε σχέση με ένα υπόστρωμα σημαίνει ότι 2% αύξηση στη συγκέντρωση του υποστρώματος μπορεί να επιφέρει αύξηση στην ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης κατά 1%, δηλαδή 0.5χ 2%. (Ο ορισμός αυτός αφορά πολύ μικρές μεταβολές αλλά μπορεί να εφαρμοστεί με σχετική ακρίβεια για μεταβολές που προσεγγίζουν το 10-20%). 13

Η τιμή της ελαστικότητας είναι θετική για το υπόστρωμα (εκτός από τις συνθήκες όπου το υπόστρωμα δρα σαν αναστολέας του ενζύμου) και αρνητική για το προϊόν (εκτός από την σπανιότατη περίπτωση όπου το προϊόν δρα σαν ενεργοποιητής). Πρέπει να τονισθεί ότι, σε αντίθεση με τους συντελεστές ελέγχου που είδαμε προηγουμένως, η ελαστικότητα είναι ιδιότητα ενός μεμονωμένου ενζύμου και όχι του μεταβολικού συστήματος. Μπορεί με απλά μαθηματικά να αποδειχτεί ότι για ένα ένζυμο που ακολουθεί κινητική Michaelis Menten (κάτω από αντιστρεπτές συνθήκες) η ελαστικότητα του ενζύμου για το υπόστρωμα μπορεί να λάβει τιμές που κυμαίνονται από 1 όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι πολύ μικρή, έως 0 σε συνθήκες κορεσμού του ενζύμου (μεγάλη συγκέντρωση υποστρώματος). Η ελαστικότητα ενός ενζύμου ως προς κάποιον μεταβολίτη σχετίζεται με την κλίση της εφαπτόμενης στην καμπύλης που χαρακτηρίζει την εξάρτηση της δραστικότητας του ενζύμου ως προς τη συγκέντρωση του μεταβολίτη η οποία λαμβάνεται για τη συγκέντρωση αυτή του μεταβολίτη με την οποία συμμετέχει στο μεταβολικό δρόμο μελετάται όπως φαίνεται στο σχήμα Εξάρτηση της ταχύτητας μιας ενζυμικής αντίδρασης σε ένα σημείο μιας μεταβολικής οδού από τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Η κλίση της εφαπτομένης στο διπλό λογαριθμικό διάγραμμα (β) αντιστοιχεί στο συντελεστή ελαστικότητας ε s στο σημείο v,s 14

Η μαθηματική έκφραση του παραπάνω ορισμού είναι παρόμοια με αυτή που παρουσιάστηκε για του συντελεστές ελέγχου ροής. Έτσι, με αντίστοιχο τρόπο, ο συντελεστής ελαστικότητας για την επίδραση του μεταβολίτη S στην ταχύτητα ν μιας ενζυμικής αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο Ε σε μια μεταβολική οδό, σε συνθήκες τέτοιες ώστε όλοι οι υπόλοιποι παράγοντες που επιδρούν στο ένζυμο Ε να παραμένουν σταθεροί έχοντας τιμές αυτές με τις οποίες συμμετέχουν στη μεταβολική οδό, δίνεται από τη σχέση:. ή στη γενικότερη μορφή όπου Ρ η παράμετρος (υπόστρωμα, προϊόν ή άλλος μεταβολίτης) που προκαλεί τη διαταραχή της ταχύτητας της αντίδρασης. Κάθε ένζυμο έχει τόσους συντελεστές ελαστικότητας όσος είναι ο αριθμός των παραμέτρων που το επηρεάζουν. 15

Σε αντίθεση με τους συντελεστές ελέγχου, οι συντελεστές ελαστικότητας δεν αποτελούν ιδιότητα του συστήματος αλλά μέτρο της ευαισθησίας των ενζύμων σε μεταβολές των παραμέτρων του συστήματος. Όπως και οι συντελεστές ελέγχου, οι συντελεστές ελαστικότητας δεν έχουν σταθερή τιμή καθώς αυτή εξαρτάται από την τιμή της σχετικής παραμέτρου και έτσι είναι διαφορετικές για κάθε σταθερή κατάσταση. Οι συντελεστές ελαστικότητας λαμβάνουν θετικές τιμές, όταν οι μεταβολίτες επιταχύνουν την αντίδραση, όπως στην περίπτωση κάποιου υποστρώματος ή κάποιου ενεργοποιητή, ενώ είναι αρνητικοί για τους μεταβολίτες-επιβραδυντές, όπως κάποιο προϊόν ή κάποιος αναστολέας. Ας υποθέσουμε ότι αναζητούμε την ελαστικότητα ως προς το υπόστρωμα ενός ενζύμου το οποίο ακολουθεί κινητική κατά Michaelis-Menten Αν η συγκέντρωση του υποστρώματος στην οποία η ελαστικότητα ζητείται είναι 0.5 mm και ισχύει ότι K m 0.75 και V max =100 μmol min -1 μπορεί να υπολογιστεί η ταχύτητα σε συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο 95%, 97.5%, 100%, 102.5,% και 105% της συγκέντρωσης του υποστρώματος 16

Σχηματίζοντας το διάγραμμα που εκφράζει την εξάρτηση του λογαρίθμου των ταχυτήτων συναρτήσει του λογαρίθμου των συγκεντρώσεων, τότε μπορούμε να υπολογίσουμε την ελαστικότητα από την κλίση της ευθείας του γραφήματος στο σημείο που αντιστοιχεί στο 100% της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Γραφικός προσδιορισμός της ελαστικότητας ενζύμου (Κ m = 0.75 και V max =100 μmol min -1 ). Η ελαστικότητα (κλίση στην εφαπτομένη στην καμπύλη) για συγκέντρωση του υποστρώματος ίση με 0.5 mm είναι 0.6. Στο διάγραμμα η καμπύλη δεν παρουσιάζεται καθώς η καμπυλότητα της είναι πάρα πολύ μικρή και ελάχιστα διαφέρει από την εφαπτομένη. 17

Οι συντελεστές ελαστικότητας μπορούν να υπολογιστούν από τις κινητικές εξισώσεις με μερική παραγώγιση. Για παράδειγμα ο συντελεστής ελαστικότητας για ένζυμο που ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten δίνεται από τη σχέση: η λύση της οποίας είναι: Με βάση την παραπάνω εξίσωση μπορεί να υπολογιστεί ότι ο συντελεστής ελαστικότητας στο παράδειγμα του προηγούμενου σχήματος λαμβάνει τιμή ίση με 0.6 η οποία είναι ίδια με αυτή που προέκυψε από τον γραφικό προσδιορισμό. 18

ΤΟ ΘΕΩΡΗΜΑ ΣΥΝΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Ένα ιδιαίτερα χρήσιμο και σημαντικό χαρακτηριστικό της ΑΜΕ είναι ότι μπορεί να συσχετίσει τις κινητικές ιδιότητες των μεμονωμένων αντιδράσεων, με καθολικές ιδιότητες του μεταβολικού συστήματος που εμπεριέχει τις μεμονωμένες αυτές αντιδράσεις. Αυτό δικαιολογείται από το θεώρημα συνεκτικότητας (connectivity theorem) το οποίο συσχετίζει τους συντελεστές ελέγχου και τους συντελεστές ελαστικότητας των βημάτων με κοινούς ενδιάμεσους μεταβολίτες. Ας θεωρηθεί ότι επιλέγεται ένας ενδιάμεσος μεταβολίτης S ενός μεταβολικού δρόμου και προσδιορίζουμε όλα τα ένζυμα του μεταβολικού συστήματος. Ας υποθέσουμε ότι τα ένζυμα αυτά είναι τρία και συγκεκριμένα τα i, j και k. Σύμφωνα με το θεώρημα συνεκτικότητας, ισχύει ότι αν αθροίσουμε το γινόμενο του συντελεστή ελέγχου ροής για μια συγκεκριμένη ροή J με τον συντελεστή ελαστικότητας ως προς το S που προκύπτει για κάθε ένζυμο, τότε το αποτέλεσμα του αθροίσματος είναι ίσο με μηδέν: 19

Σύμφωνα δηλαδή με το θεώρημα συνεκτικότητας για τους συντελεστές ελέγχου ροής φαίνεται ότι για ένα κοινό μεταβολίτη S το άθροισμα των γινομένων των συντελεστών ελέγχου ροής όλων των επιμέρους βημάτων i που επηρεάζονται από το S με τους συντελεστές ελαστικότητας που σχετίζονται με το δ είναι μηδέν, και στη γενική μορφή δίνεται από τη σχέση: Το θεώρημα συνεκτικότητας αποτελεί τη βάση της κατανόησης του πώς η κινητική ενός ενζύμου σε ένα σημείο του μεταβολικού δρόμου επιδρά στον έλεγχο της ροής. Σύμφωνα με το θεώρημα συνεκτικότητας για μια αντίδραση δύο σταδίων όπου το υπόστρωμα S μετατρέπεται σε προϊόν Ρ μέσω του ενδιάμεσου Χ 20

Ισχύει ότι: Ή Από την οποία εξάγεται το συμπέρασμα ότι μεγάλες τιμές ελαστικότητας συνδέονται με μικρές τιμές συντελεστών ελέγχου ροής και αντίστροφα. Οι αντιδράσεις που βρίσκονται κοντά στην θερμοδυναμική τους ισορροπία είναι πιο ευαίσθητες στις μεταβολές της συγκέντρωσης των μεταβολιτών, δηλαδή, η ελαστικότητα για τις αντιδράσεις αυτές είναι μεγάλη, το οποίο με τη σειρά του σημαίνει ότι ο έλεγχος των ροών των αντιδράσεων αυτών είναι μικρός. Το θεώρημα συνεκτικότητας για τους συντελεστές ελέγχου συγκέντρωσης C x στην περίπτωση που οι συντελεστές ελαστικότητας και ελέγχου συγκέντρωσης αφορούν διαφορετικούς μεταβολίτες (Χ και S) εκφράζεται από τη σχέση: ενώ στην περίπτωση όπου οι δύο συντελεστές αφορούν στον ίδιο μεταβολίτη (Χ) τότε ισχύει: Το θεώρημα συνεκτικότητας επιτρέπει την περιγραφή του τρόπου με τον οποίο οι διαταραχές σε μεταβολίτες ενός μεταβολικού δρόμου, διαδίδονται μέσω των ενζύμων του δρόμου αυτού. Οι τοπικές κινητικές ιδιότητες κάθε ενζύμου διαδίδουν αποτελεσματικά τη διαταραχή προς και από τους άμεσους γειτονικούς παράγοντες. 21

Ο ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ O συντελεστής ελέγχου ροής εκφράζει την επίδραση της μεταβολής της συγκέντρωσης του ενζύμου στη μεταβολική ροή. Με αντίστοιχο τρόπο μπορεί να προσδιοριστεί και η επίδραση άλλων εξωτερικών παραγόντων στη ροή ενός μεταβολικού δρόμου. Η επίδραση αυτή μπορεί να προσδιοριστεί με το λεγόμενο συντελεστή απόκρισης (response coefficient) R. Ο συντελεστής απόκρισης για έναν εξωτερικό παράγοντα Ρ δίνεται από τη σχέση Μπορεί να αποδειχτεί ότι ο συντελεστής απόκρισης σχετίζεται με τους συντελεστές ελέγχου ροής του επηρεαζόμενου ενζύμου Ε (C J Eκαι την ελαστικότητα του ενζύμου αυτού σε σχέση με τον εξωτερικό παράγοντα Ρ E P, σύμφωνα με τη σχέση: Από την παραπάνω εξίσωση προκύπτει ότι η ανταπόκριση ενός μεταβολικού δρόμου σε κάποιον παράγοντα εξαρτάται από: α) την ευαισθησία του μεταβολικού δρόμου στη δραστικότητα του ενζύμου στο οποίο ο παράγοντας Ρ επιδρά (όπως εκφράζεται από τον συντελεστή ελέγχου ροής του ενζύμου) και β) από την ένταση της επίδρασης του παράγοντα Ρ στο ένζυμο (η οποία δίνεται από την ελαστικότητα) 22

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΩΝ ΕΛΕΓΧΟΥ Διάφορες μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν για τον προσδιορισμό των συντελεστών ελέγχου τόσο της ροής όσο και της ελαστικότητας. Οι μέθοδοι αυτοί μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε 3 βασικές κατηγορίες: Στις άμεσες μεθόδους, όπου για παράδειγμα οι συντελεστές ελέγχου ροής προσδιορίζονται άμεσα από μετρήσεις της μεταβολής της ροής μετά από μικρή αλλά μετρήσιμη αλλαγή της ενζυμικής δραστικότητας. Στις έμμεσες μεθόδους όπου πρώτα προσδιορίζονται οι συντελεστές ελαστικότητας και στη συνέχεια οι συντελεστές ελέγχου υπολογίζονται από τα θεωρήματα της ΑΜΕ. Στις μεθόδους όπου οι συντελεστές ελέγχου προσδιορίζονται μέσω μετρήσεων των συγκεντρώσεων των ενδιάμεσων μεταβολιτών. 23

Άμεσες μέθοδοι. Οι μέθοδοι αυτοί βασίζονται στον προσδιορισμό της μεταβολικής ροής μετά από μικρές αλλαγές της ενζυμικής δραστικότητας. Σκοπός είναι η δημιουργία μιας γραφικής παράστασης που θα εκφράζει την εξάρτηση της ροής από την ενζυμική δραστικότητα ώστε από την κλίση της εφαπτομένης στην καμπύλη του διαγράμματος να προκύψει ο συντελεστής ρύθμισης ροής. Οι μέθοδοι που μπορούν να εφαρμοστούν για την τροποποίηση της δραστικότητας ενός ενζύμου που καταλύει κάποιο βήμα σε ένα μεταβολικό δρόμο βασίζονται: στην τροποποίηση σε γενετικό επίπεδο στην τροποποίηση μέσω επαγωγέων ή διαιτητικών και περιβαλλοντικών μέσων, στην τιτλοδότηση με καθαρό (απομονωμένο) ένζυμο και στην τιτλοδότηση του ενζύμου με ειδικούς αναστολείς. 24

Τροποποίηση σε γενετικό επίπεδο Η μέθοδος αυτή αφορά στον έλεγχο της έκφρασης του ενζύμου σε γενετικό επίπεδο μέσω των τεχνικών της μοριακής βιολογίας. Η προσέγγιση αυτή μας επιτρέπει να μελετήσουμε ίη νίνο την επίδραση της αλλαγής της ενζυμικής δραστικότητας. Η τροποποίηση της ενζυμικής δραστικότητας σε γενετικό επίπεδο μπορεί να επιτευχθεί είτε μέσω της αλλαγής της δοσολογίας του γονιδίου του ενζύμου τόσο με τεχνικές της κλασσικής γενετικής όσο και με τεχνικές της μοριακής γενετικής είτε με την εισαγωγή ρυθμιστικών προαγωγών που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων. Η χρήση ρυθμιστικών προαγωγών (π.χ tac προαγωγού σε Ε. Coli (υβριδικό οπερόνιο του lac) επιτρέπει την εισαγωγή αλλαγών διαφορετικού μεγέθους στην ενζυμική δραστικότητα ενώ οι αλλαγές αυτές μπορεί να είναι και προς τις δύο κατευθύνσεις δηλαδή να αυξάνουν ή και να μειώνουν την ενζυμική δραστικότητα. Τροποποίηση μέσω επαγωγέων ή με τροποποίηση διαιτητικών και περιβαλλοντικών μέσων Η απόκριση ενός οργανισμού σε διατροφικές μεταβολές ή γενικότερα περιβαλλοντικές αλλαγές, εκφράζεται με την προσαρμογή του μεταβολισμού του στις νέες συνθήκες και στην περίπτωση που οι αλλαγές αυτές διαρκούν συχνά οδηγούν και σε τροποποίηση της ποσότητας των ενζύμων. Σε ορισμένα μεταβολικά μονοπάτια οι αλλαγές αυτές μπορεί να αφορούν ορισμένα ή ακόμη και όλα τα ένζυμα που συμμετέχουν, σε άλλα όμως μονοπάτια η αλλαγή μπορεί να αφορά λίγα μόνο ένζυμα ή ακόμη και μόνο ένα. Στο παρακάτω βλέπουμε την εξάρτηση της ροής του καταβολισμού της θρυπτοφάνης σε ηπατοκύτταρα ποντικού από τη συγκέντρωση του ενζύμου 2,3-διοξυγονάση της θρυπτοφάνης, μετά από αλλαγές στη διατροφή των ποντικών ή την αγωγή με ορμόνες. 25

Τιτλοδότηση με καθαρό (απομονωμένο) ένζυμο Η τεχνική βασίζεται στην τιτλοδότηση με καθαρό ένζυμο εκχυλισμάτων χωρίς κύτταρα, και στην περίπτωση όπου η δραστικότητα του ενζύμου μπορεί να μετρηθεί, τότε ο συντελεστής ελέγχου ροής μπορεί να προσδιοριστεί απευθείας. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η μεγάλη ευαισθησία σε πειραματικό λάθος. Μια έξυπνη μέθοδος για τον περιορισμό της ευαισθησίας έχει να κάνει με το ότι όλα τα ένζυμα του μεταβολικού δρόμου προσθέτονται σε περίσσεια έτσι ώστε η συμμετοχή τους στον έλεγχο της ροής να ελαχιστοποιηθεί. Στις συνθήκες αυτός ο έλεγχος της ροής κατανέμεται μόνο στα ένζυμα που μας ενδιαφέρουν και η κατανομή του ελέγχου της ροής μεταξύ των ενζύμων αυτών προσδιορίζεται μετά από τιτλοδότηση. Εξάρτηση της ροής του καταβολισμού της θρυπτοφάνης σε ηπατοκύτταρα ποντικού από τη συγκέντρωση του ενζύμου 2,3-διοξυγονάση της θρυπτοφάνης, μετά από αλλαγές στη διατροφή των ποντικών ή την αγωγή με ορμόνες. 26

Τιτλοδότηση του ενζύμου με ειδικούς αναστολείς Η μέθοδος βασίζεται στην ίη νίνο τιτλοδότηση κάποιου ενζύμου που συμμετέχει σε μια μεταβολική οδό με έναν αναστολέα του. Όταν μετρηθεί η προκύπτουσα ροή τότε με βάση την εξίσωση μπορεί να προσδιοριστεί ο συντελεστής απόκρισης που αφορά στον αναστολές. Αν η απόκριση του ενζύμου (δηλαδή η ελαστικότητα) ως προς τον αναστολέα είναι γνωστή τότε από τη σχέση μπορεί να προσδιοριστεί ο συντελεστής ελέγχου ροής. Μπορεί να αποδειχτεί ότι για έναν μη αντιστρεπτό αναστολέα (όπου η ενζυμική δραστικότητα μειώνεται γραμμικά με τη συγκέντρωση του αναστολέα) ότι ο συντελεστής ελέγχου ροής C J υπολογίζεται από τη σχέση: όπου Τ η κλίση της εφαπτομένης στην καμπύλη που περιγράφει την εξάρτηση της ροής από τη συγκέντρωση του αναστολέα, J o η μεταβολική ροή απουσία του αναστολέα, και I max η συγκέντρωση του αναστολέα στην οποία η αναστολή του ενζύμου είναι 100%. 27

Η καμπύλη του παραπάνω σχήματος αφορά στην αναστολή ενζύμου με συντελεστή ελέγχου ροής ίσο με 0.2, από πολύ ισχυρό αναστολέα. Η αρχική κλίση Τ για μηδενική συγκέντρωση αναστολέα συμβολίζεται με τη διακεκομμένη γραμμή. Το γραμμικό τμήμα της καμπύλης στο άλλο άκρο έχει προεκταθεί έως όρου η ροή λάβει τιμή ίση με 0 οπότε προκύπτει η συγκέντρωση του αναστολέα I max στην οποία όλο το ένζυμο είναι συνδεδεμένο με τον αναστολέα. 28

Thank you for your kind attention www.enve-lab.eu A connectivity perspective to environmental health 29