Σύγχρονη διερεύνηση γενετικών νοσημάτων

Σύγχρονη διερεύνηση γενετικών νοσημάτων

Κυτταρογενετική ανάλυση Ανάλυση χρωμοσωμάτων με ζώνες(εναλασσόμενες σκούρες και ανοικτόχρωμες ζώνες) Στόχος: διάκριση φυσιολογικών και παθολογικών καρυοτύπων (αριθμητικές και δομικές ανωμαλίες). Θα πρέπει να αναγνωριστεί η ανωμαλία και να ταυτοποιηθούν τα χρωμοσώματα που συμμετέχουν για να υπάρξει διάγνωση, έλεγχος φορέων και προγεννητικός έλεγχος.

Καρυότυπος(συμβατικός ή κλασσικός) Έλεγχος ολόκληρου του γονιδιώματος Διακριτική ικανότητα: μικρή(>5-10mb)*

-Περιφερικό αίμα (Τλεμφοκύτταρα)+ ηπαρίνη - Mιτογόνο (Φυτοαιμαγλουτινίνη): φυτική πρωτεΐνη που διεγείρει τα λεμφοκύτταρα προς διαίρεση -72h 37oC -Κολχικίνη* -υπότονο διάλυμα-> διόγκωση και λύση των κυττάρων -μονιμοποίηση *Προσδένεται ισχυρά στην ελεύθερη τουμπουλίνη και εμποδίζει τον πολυμερισμό της σε μικροσωληνίσκους Εξαφανίζεται γρήγορα η μιτωτική άτρακτος, σταματά το κύτταρο στη μετάφαση

Μικροσωληνίσκοι Υπομονάδες τουμπουλίνης η καθεμιά από τις οποίες είναι διμερές που αποτελείται από 2 παρόμοιες σφαιρικές πρωτεΐνες: α, β Ζωντανό κύτταρο: μείγμα από μικροσωληνίσκους + ελεύθερες μονάδες τουμπουλίνης

Δυνατότητα Α:αριθμητικές ανωμαλίες.

Δυνατότητα Β. Δομικές ανωμαλίες. -Χρωμοσωμικές ανακατατάξεις (μεταθέσεις, ελλείμματα, διπλασιασμοί)μεγέθους >5-10Mb. -Αδυναμία αναγνώρισης μικρότερου μεγέθους ανακατατάξεων και ανωμαλιών -Αδυναμία αναγνώρισης όλων των χρωμοσωμάτων που συμμετέχουν σε σύνθετες ανακατατάξεις

Σύνθετες ανακατατάξεις Σπάνιες δομικές ανωμαλίες που χαρακτηρίζονται από > 3 σημεία θραύσης σε δύο, τρία ή περισσότερα χρωμοσώματα. Μεταθέσεις, αναστροφές, ελλείμματα, διπλασιασμούς ή/και ενθέσεις.

Διερεύνηση-Μοριακή κυτταρογενετική FluorescentInSituHybridisation

Ανιχνευτές (probes)

FISH WholeChromosomeProbe2 Criduchat probe

Δυνατότητες FISH Μικροελλείμματα- < 5Mb (Φυσιολογικός καρυότυπος) Έλεγχος γνωστής περιοχής (100 800 kb) Μεσοφασικοί πυρήνες Μεταθέσεις- σύνθετες ανακατατάξεις? Σημεία θραύσης

QF-PCR- ταχεία ανίχνευση ανευπλοειδιών Στοχευμένη ανάλυσησυγκεκριμένες περιοχές Αριθμητικές ανωμαλίες (χρ.13, 18, 21, Χ, Υ) Αδυναμίες:δομική χρωμοσωμική ανωμαλία (1-2%), χαμηλό ποσοστό μωσαϊκισμού. Συνήθως σε συνδυασμό με καρυότυπο.

Μultiplex Ligation Probe Amplification Συγκεκριμένες περιοχές γονιδιώματος και συγκεκριμένες ανωμαλίες (π.χ. ελλείμματα/διπλασιασμούς) Tεχνολογία DNA Ταυτόχρονος έλεγχος 21 περιοχών του γονιδιώματος (συνήθως ) που συνδέονται με γνωστά σύνδρομα (DiGeorge, Williams, Smith-Magenis, Prader-Willi, Angelman, κ.λ.π.).

ΣΧΑ Πολυχρωματικές μέθοδοι-mcb- multicolor banding and spectral karyotyping

Πολυχρωματικές μέθοδοι.m-fish (multicolor FISH)/SpectralKarYotyping Mίγμα ανιχνευτών όλων των χρωμοσωμάτων με 24 χρώματα (ηλεκτρονική επεξεργασίαψευδοχρωματικά) Μικροσκόπιο εξοπλισμένο με ειδικά φίλτρα Ειδικό λογισμικό Μέθοδος ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώματος

M-FISH

SKY/ MFISH

Δυνατότητες Χρωμοσωμική προέλευση μεταθέσεων (ολική σάρωσηάγνωστα χρωμοσώματα),μικρών χρωμοσωμάτων-δεικτών Σύνθετες ανακατατάξεις Δεν μπορούν να προσδιοριστούν τα σημεία θραύσης, χαμηλή ευαισθησία (ενδοχρωμοσωμικά ελείμματα, διπλασιασμοί, αναστροφές)

Μοριακή κυτταρογενετική-πολυχρωματικές ζώνες(multicolor banding FISH (mband FISH)

Μοριακή κυτταρογενετική-πολυχρωματικές ζώνες(multicolor banding FISH (mband FISH) Χρησιμοποιεί ειδικά για κάθε χρ. Περιοχή μίγματα μοριακών χρώσεων (paints) προερχόμενα από μικροανατομία (microdissection) που αλληλεπικαλύπτονται μερικά και έχουν σημανθεί με διαφορετικά φθοριοχρώματα ή συνδυασμούς φθοριοχρωμάτων. Κάθε ειδική για την περιοχή βιβλιοθήκη δημιουργείται από 8-10 χρωμοσωμικά θραύσματα. Διαφορετικοί αριθμοί βιβλιοθηκών δημιουργούνται ανάλογα με το μέγεθος του χρωμοσώματος ( π.χ.2 για τα χρ. 21, 22, Υ και 8 για το 1) ). Η ακριβής χρωμοσωμική θέσηείναι γνωστή και έχει ελεγχθεί διότι οι ανιχνευτές αυτοί DNA σημαίνονται με φθοριοχρώματα και υβριδοποιούνται (FISH)με φυσιολογικές μεταφάσεις.

Μικροανατομία (microdissection)

Πολυχρωματικές ζώνες-δυνατότητες Ανωμαλίες ενός ή περισσότερων χρωμοσωμάτων Αναγνώριση σημείων θραύσης και ανάλυση ενδο- χρωμοσωμικών ανακατατάξεων (μεταθέσεις, ελλείμματα, αναστροφές)

Fig. 1. (A) A composite karyotype showing all chromosomes displayed in mband. (B F) Chromosomes 16 of the case described. In all chromosome pairs and in the schemes in E the normal chromosome is shown on the left side, and the aberrant chromosome on the right side. (B) GTG-banded chromosomes 16; (C) mbanded chromosomes 16 at high resolution level (850 bands); (D) mbanded chromosomes 16 at reduced resolution ( 200 bands); (E) ISCN ideogram and mband ideogram. Square brackets indicate breakpoints on the normal chromosome. The resulting fragments are sequentially numbered next to the normal ideogram (left) and rearranged according to the observation made by the mband analysis resulting in an aberrant ideogram (right). Inv indicates an inversion of the respective fragment as compared to its original orientation. (F) Signal pattern of the BAC-probes (localization shown below) of the two probe sets hybridized to chromosome 16.

ΣΧΑ Τεχνικές βασισμένες σε μικροσυστοιχίες

CGH Συγκριτική υβριδοποίηση γονιδιωμάτων (ComparativeGenomicHybridisation) Array-CGH +Tαυτοποίηση άγνωστης προέλευσης γενετικού υλικού π.χ. μη ισοζυγισμένες, σύνθετες ανακατατάξεις, μικρά χρωμοσώματα δείκτες. -Απαιτούνται μεταφάσεις -Δεν μπορεί να αναγνωρίσει ισοζυγισμένες ανακατατάξεις. www.array-cgh.de Comparison of conventional CGH and array-cgh +Ανευπλοειδίες, ελλείμματα, διπλασιασμοί - Δεν απαιτούνται μεταφάσεις -ισοζυγισμένες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις (μεταθέσεις, αναστροφές), πολυπλοειδίες, αιτία του κλινικού προβλήματος (ή φυσιολογικές πολυμορφικές

The chromosomal locations of 1,447 CNVRs are indicated by lines to either side of the ideograms. Green lines =CNVRs associated with segmental duplications; blue lines = CNVRs not associated with segmental duplications. The length of right-hand side lines = the size of each CNVR. The length of left-hand side lines= the frequency with which a CNVR is detected (minor call frequency among 270 HapMap samples). When both platforms identify a CNVR, the maximum call frequency of the two is shown. For clarity, the dynamic range of length and frequency are log transformed (see scale bars). Copyright 2006 Nature Publishing Group, Redon, R., et. al., Global variation in copy number in the human genome, Nature 444, 444-454

CGH - array 46,ΧΥ,del(18)(q21.2)

Δυνατότητες-αδυναμίες acgh μέθοδος μεγάλης ευαισθησίας (>100 φορές από την ανάλυση στο μικροσκόπιο) (αντικειμενική και ποσοτική ανίχνευση ελλειμμάτων και διπλασιασμών που συνδέονται με το κλινικό πρόβλημα. Δεν μπορεί να ανιχνεύσει ισοζυγισμένες ανακατατάξεις ( μεταθέσεις ή ενθέσεις), χαμηλό μωσαϊκισμό και πολυπλοειδία. acgh μπορεί να αναγνωρίσει αλλαγές του αριθμού αντιγράφων, πολυμορφικά (και μη παθολογικά) ελλείμματα και διπλασιασμούς του γονιδιώματος Copy Number Variation (CNVs).

ΣΧΑ Next generation paired-end sequencing (PES), MPSmate-pair sequencing : χαρτογράφηση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου

Αλληλούχιση (Sequencing): Τμήμα DNA(δίκλωνο, συγκεκριμένη κατεύθυνση, 5 και 3 άκρο). Όταν συντίθεται DNA οι δύο αλυσίδες διαχωρίζονται και νέες βάσεις προστίθενται στο 3 (κατεύθυνση σύνθεσης 5-3 ). Για να ξεκινήσει η σύνθεση DNA απαιτείται ένα μικρό τμήμα DNA, (εκκινητής- primer). Οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε να μπορούν να συνδεθούν με DNAστόχο και να ξεκινήσει η σύνθεση DNA. Αλληλούχιση DNA (sequencing - Fredrick Sanger method. Βραβείο Nobel 1980.

Οι 2 αλυσίδες δ.dna iδιαχωρίζονται και ένας εκκινητής σημασμένος συνδέεται με DNA (A); 4 αντιδράσεις για τη σύνθεση νέου DNA, καθεμιά έχει τα 4 dntps και μικρή ποσότητα ddntps (B); Έτσι κατά τη σύνθεση DNA, ενσωματώνεται κάθε φορά στην τελική θέση ένα ddntp (C); DNA και από τις 4 αντιδράσεις διαχωρίζεται σε πηκτή σε τέσσερις στήλες και δίνει ένα πρότυπο (D); Α αλληλουχία διαβάζεται από κάτω προς τα πάνω και είναι η αντίθετη βάση που αναγνωρίζεται.. Οταν γίνεται ενίσχυση DNA προστίθενται νέα dntps στην νέα αλυσίδα. Μέθοδος Sanger: χρησιμοποεί χημικά ανάλογα των 4 νουκλεοτιδίων ( ddα, ddt, ddc, ddt) and τα οποία λείπει το 3 -ΟΗ της δεοξυριβόζης (εκτος από το ΟΗ που λείπει φυσιολογικά στο DNA). Εαν αυτά τα ddntps ενσωματωθούν σε μια αλυσίδα DNA που συντίθεται, εμποδίζουν την πολυμεράση DNA να προσθέσει την επόμενη συμπληρωματική βάση όπως αυτή καθορίζεται από το αρχικό εκμαγείο και τερματίζεται η επιμήκυνση της αλυσίδας. Μετά από πολλούς κύκλους ενίσχυσης έχουμε όλα τα πιθανά μήκη DNA που διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος σε ηλεκτροφόρηση. Kάθε ddntp εκπέμπει διαφορετικού μ.κ. φθοριόχρωμα και μπορεί να αναγνωριστεί. Η αντίδραση εξασφαλίζει ένα φθορίζον ddntp σε κάθε θέση στην αλυσίδα DNA ( υπάρχει αλυσίδα κάθε πιθανού μεγέθους DNA) και κάθε νουκλεοτίδιο της αλυσίδας μπορεί να αναγνωριστεί. Τελικό αποτέλεσμα: μετά απο επεξεργασία των δεδομένων παίρνουμε έγχρωμο γράφημα της αλληλουχίας.

Αλληλούχιση με ραδιενεργεια- με φθορίζουσες κορυφές (peaks)

Αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole genome sequencing)

-85% των μεταλλάξεων που έχουν συσχετισθεί με γενετικές ασθένειες Exome sequencing

NGS-PES(next generation paired-end Πολλοί τύποι ανακατατάξεων μπορούν να μελετηθούν. Δημιουργούνται πρώτα τυχαία θραύσματα και η αλληλούχιση γίνεται σε κάθε άκρο του μορίου DNA. Βασίζεται στη σύγχρονη ανάλυση 2 μικρών αλληλουχιών (mate-pairs) που συγκρίνονται(aligned) με συγκεκριμένο/γνωστό γονιδίωμα Ακολουθεί σύγκριση με αλληλουχία αναφοράς. Εκτός από την πληροφορία της αλληλούχισης το «διάβασμα» και από τις δύο πλευρές δίνει πληροφορίες για τη θέση/περιοχή της ανακατάταξης. Βιοπληροφορικά εργαλεία sequencing )

NGS-PES(next generation paired-end ανάλυση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου συχνά αποδεικνύεται ότι οι CCR είναι πιο περίπλοκες αναγνωρίζονται άμεσα γονίδια που έχουν διακοπεί στα σημεία θραύσης χαρακτηρίζονται δομικές ανακατατάξεις π.χ. μικρά ελλείμματα ή αναστροφές που συχνά δεν ανιχνεύονται με άλλες τεχνικές Βιοπληροφορικά εργαλεία υπολογιστικής και στατιστικής ανάλυσης-τεράστιος όγκος δεδομένων-δύσκολη ερμηνεία των αποτελεσμάτων sequencing ) cancerpreventionresearch.aacrjournals.org

Δυσκολίες Συχνά είναι δύσκολο να αναγνωριστούν (συγκριθούν) -ΣΘ που βρίσκονται σε μη γνωστή περιοχή (gap) -ΣΘ που βρίσκονται σε περιοχή επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και τμηματικών διπλασιασμών Nazaryan L, Tommerup N. Wilhelm Johannsen Centre for Functional Genome Research, Institute of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Health Science, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark