Elucigene CF-EU2v1 Οδηγός λογισμικού ανάλυσης

Elucigene CF-EU2v1 Οδηγός λογισμικού ανάλυσης Κατασκευάζεται από την: Gen-Probe Life Sciences Ltd. Heron House Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: T: +49 (0) 6122 7076451 F: +49 (0) 6122 7076155 E: eucustomerservice@hologic.com E: eutechnicalsupport@hologic.com CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 1 από 40

Ανάλυση GeneMapper Εισαγωγή Η παρακάτω ενότητα περιγράφει τις διαδικασίες ανάλυσης δειγμάτων των αποτελεσμάτων Elucigene CF-EU2v1 με χρήση των πακέτων λογισμικού GeneMapper της Applied Biosystems (έκδοση 3.7 ή νεότερη). Διαδικασία ανάλυσης Η διαδικασία ανάλυσης δειγμάτων συνοψίζεται στο διάγραμμα ροής που εμφανίζεται παρακάτω. Ανάλυση ενισχυμένων δειγμάτων στον γενετικό αναλυτή Άνοιγμα λογισμικού GeneMapper Προσθήκη αρχείων fsa δειγμάτων στο σχέδιο Ορισμός μεθόδου ανάλυσης και προτύπου μεγέθους στο CF-EU2v1 Επιλογή κατάλληλων ομάδων μιγμάτων Εκτέλεση ανάλυσης δείγματος Αποθήκευση σχεδίου Επιλογή δείγματος και άνοιγμα παραθύρου γραφημάτων Ανασκόπηση δεδομένων ίχνους και γονότυπου Βαθμολόγηση γονοτύπων δειγμάτων Εκτύπωση ιχνών δείγματος Elucigene CF-EU2v1 CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 2 από 40

GeneMapper Ανοίξτε το αρχείο του προγράμματος GeneMapper καιεισάγετε τα απαιτούμενα αρχεία fsa κάνοντας κλικ στο κουμπί «add samples to project» (προσθήκη δειγμάτων στο σχέδιο) ( ). Μεταβείτε στον επιθυμητό φάκελο εκτέλεσης ανάλυσης χρησιμοποιώντας το δέντρο φακέλων που βρίσκεται στην αριστερή μεριά του παραθύρου. Επιλέξτε τον φάκελο και κάντε κλικ στο κουμπί «Add to List >>» (Προσθήκη στη λίστα >>). Ο φάκελος εκτέλεσης θα εμφανίσει πλέον το παράθυρο «samples to add» (δείγματα για προσθήκη). Εάν κάνετε διπλό κλικ στο εικονίδιο φακέλου εκτέλεσης ανάλυσης σε αυτό το παράθυρο θα εμφανιστούν όλα τα αρχεία FSA που θα εισαχθούν (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Τα δείγματα έχουν προστεθεί στη λίστα και είναι έτοιμα να προστεθούν στο σχέδιο. Στη συνέχεια, επιλέγονται τα δείγματα κάνοντας κλικ στο κουμπί «Add» ( ) (Προσθήκη). Εισαγωγή ρυθμίσεων ανάλυσης του CF-EU2v1 GeneMapper στο GeneMapper Manager Είναι απαραίτητη η εισαγωγή των ρυθμίσεων CF-EU2v1 για την εφαρμογή GeneMapper. Αυτή η διαδικασία ελέγχεται διαμέσου την επιφάνειας εργασίας του προγράμματος «GeneMapper Manager». Οι ρυθμίσεις του προγράμματος CF-EU2v1 GeneMapper διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com. Αυτές πρέπει να ληφθούν μέσα στον κατάλληλο φάκελο στο σύστημα του χρήστη. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 3 από 40

1. Ανοίξτε το πρόγραμμα GeneMapper Manager κάνοντας κλικ στο εικονίδιο (Εικόνες 2 και 3). Εικόνα 2: Άνοιγμα προγράμματος GeneMapper Manager. Εικόνα 3: Επιφάνεια εργασίας του προγράμματος GeneMapper Manager. 2. Επιλέξτε την καρτέλα «Analysis Methods» (Μέθοδοι ανάλυσης) και κατόπιν κάντε κλικ στο κουμπί εισαγωγής. 3. Περιηγηθείτε και εισάγετε το απαιτούμενο αρχείο (ή τα αρχεία) ρυθμίσεων ανάλυσης CFEU2: 3130 ή 3500 (Εικόνα 4). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 4 από 40

Εικόνα 4: Εισαγωγή μεθόδων ανάλυσης. 4. Επαναλάβετε τη διαδικασία, επιλέγοντας την κατάλληλη καρτέλα και εισάγοντας τα αντίστοιχα αρχεία για: Table Settings (Ρυθμίσεις πινάκων) Plot Settings (Ρυθμίσεις γραφημάτων) Size Standards (Πρότυπα μεγέθους) Σημείωση: Οι καρτέλες Cluster Plot Settings (Ρυθμίσεις γραφημάτων σε ομάδες), Matrices (Πλέγματα), SNP Sets (Σετ SNP) και Report Settings (Ρυθμίσεις αναφορών) δεν απαιτούν εισαγωγές αρχείων. Εισαγωγή ρυθμίσεων ομάδων εξετάσεων CF-EU2v1 στο Panel Manager (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων) Είναι απαραίτητη η εισαγωγή των ρυθμίσεων των ομάδων CF-EU2v1 για το πρόγραμμα GeneMapper. Αυτή η διαδικασία ελέγχεται διαμέσου την επιφάνειας εργασίας του προγράμματος «Panel Manager» (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων). 1. Ανοίξτε το πρόγραμμα GeneMapper Panel Manager (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων GeneMapper) κάνοντας κλικ στο εικονίδιο. 2. Κάντε κλικ στην επιλογή «Panel Manager» (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων) στο αριστερό παράθυρο περιήγησης. Το πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων θα εμφανίζεται πλέον επισημασμένο με μπλε χρώμα. 3. Επιλέξτε «File/Import Panels» (Αρχειοθέτηση/εισαγωγή ομάδων). Περιηγηθείτε και εισάγετε το αρχείο ομάδων CFEU2 «GeneMapper Panels».txt (Εικόνα 5). 4. Κάντε κλικ στην επιλογή «CFEU2 panel» (Ομάδα CFEU2) στο αριστερό παράθυρο περιήγησης. Η ομάδα CF-EU2v1 θα εμφανίζεται πλέον επισημασμένη με μπλε χρώμα. 5. Επιλέξτε «File/Import Bin Set» (Αρχειοθέτηση/εισαγωγή σετ «bin»). Περιηγηθείτε και εισάγετε το αρχείο «bin» CFEU2 «GeneMapper Bins».txt (Εικόνα 6). 6. Κάντε κλικ στην επιλογή «Apply» (Εφαρμογή) και στη συνέχεια κάντε κλικ στο «OK». CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 5 από 40

Εικόνα 5: Εισαγωγή αρχείου ομάδας CFEU2 Εικόνα 6: Εισαγωγή αρχείου σετ «bin» CFEU2 Τροποποίηση του αρχείου παραμέτρων ανάλυσης Μπορεί να είναι απαραίτητη η τροποποίηση των προεπιλογών «Analysis Ranges» (Εύρη ανάλυσης) στις ρυθμίσεις ανάλυσης CF-EU2v1 προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι συνθήκες που αφορούν τη σειρά αναλύσεων. Το ελάχιστο εύρος ανάλυσης θα εξαρτηθεί από το τριχοειδές και το πολυμερές που χρησιμοποιήθηκε κατά τη συλλογή δεδομένων. Για να δείτε τις τρέχουσες ρυθμίσεις ανάλυσης: 1. Ανοίξτε το πρόγραμμα «GeneMapper Manager». 2. Επιλέξτε την καρτέλα «Analysis Methods» (Μέθοδοι ανάλυσης). Το αρχείο CF- EU2v1 που εισάγεται θα παρατίθεται ως «CFEU2 Analysis Method» (Μέθοδος ανάλυσης CFEU2). 3. Κάντε κλικ στην επιλογή «CFEU2 Analysis Method» (Μέθοδος ανάλυσης CFEU2). Η γραμμή θα εμφανίζεται πλέον επισημασμένη. 4. Κάντε κλικ στο κουμπί «Open» (Άνοιγμα) και επιλέξτε την καρτέλα «Peak Detector» (Ανιχνευτής αιχμής) (Εικόνα 7). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 6 από 40

Ως προεπιλογή, τα εύρη ανάλυσης έχουν ρυθμιστεί να ξεκινούν από το 1600 και να σταματούν στο 8000. Εικόνα 7: Εύρη ανάλυσης (επισημασμένο) Για να βρείτε το σωστό εύρος ανάλυσης για το εργαστήριό σας: 1. Από το κύριο παράθυρο του GeneMapper, κάντε διπλό κλικ στον φάκελο εκτέλεσης ανάλυσης που έχει εισαχθεί για να δείτε τη λίστα των αρχείων fsa που περιέχει. 2. Επιλέξτε ένα αρχείο fsa. 3. Εάν κάνετε κλικ στην καρτέλα «Raw data» (Μη επεξεργασμένα δεδομένα) θα εμφανιστεί το ηλεκτροφόρημα των μη επεξεργασμένων δεδομένων. 4. Χρησιμοποιώντας την αιχμή 100 bp GS600v2 LIZ (Πορτοκαλί) ως οδηγό, αποφασίστε για ένα σημείο δεδομένων περίπου 100 σημείων δεδομένων μικρότερο (Εικόνα 8). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 7 από 40

Εικόνα 8: Εύρεση ελάχιστου εύρους χρησιμοποιώντας τα μη επεξεργασμένα δεδομένα του δείγματος 5. Βεβαιωθείτε ότι το μέγιστο εύρος ανάλυσης αφήνει περίπου 100 σημεία δεδομένων μετά από την αιχμή 600 bp GS600v2 LIZ. 6. Εισάγετε τις νέες τιμές στο αρχείο ανάλυσης CF-EU2v1 (προσπελάστε την όπως περιγράφεται παραπάνω). Μπορεί να είναι επίσης απαραίτητη η τροποποίηση των «Peak Amplitude Thresholds» (Ουδοί πλάτους αιχμής) ανάλογα με τη συγκέντρωση των δειγμάτων. Τα πολύ ισχυρά δείγματα θα έχουν υψηλό επίπεδο υποβάθρου, το οποίο μπορεί να παρεμβληθεί στην ανάλυση. Για να αποτρέψετε αυτό το γεγονός, μπορεί να αυξηθεί ο ουδός πλάτους αιχμής. Για παράδειγμα, η πράσινη χρωστική μπορεί να ρυθμιστεί στο 100 αντί για το 50. Και πάλι αυτό γίνεται στην καρτέλα «Peak Detector» (Ανιχνευτής αιχμής) στην επιλογή «CFEU2 Analysis method» (Μέθοδος ανάλυσης CFEU2) (Εικόνα 7). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 8 από 40

Ανάλυση και προσδιορισμός γονοτύπου στα αρχεία CF-EU2v1 που έχουν εισαχθεί 1. Στο κύριο παράθυρο του GeneMapper επιλέξτε «CFEU2 Table Settings» (Ρυθμίσεις πινάκων CFEU2) (Εικόνα 9). Εικόνα 9: Χρησιμοποιήστε το αναπτυσσόμενο μενού για να επιλέξετε τις ρυθμίσεις πινάκων CFEU2 2. Στο κύριο παράθυρο του GeneMapper επιλέξτε το πρώτο κελί στη στήλη «Analysis Method» (Μέθοδος ανάλυσης) και επιλέξετε την κατάλληλη μέθοδο ανάλυσης από το αναπτυσσόμενο μενού: είτε CFEU2_3130 είτε CFEU2_3500. Επαναλάβετε τη διαδικασία για τη στήλη Size Standard (Πρότυπο μεγέθους), επιλέγοντας «CFEU2 size standard» (Πρότυπο μεγέθους CFEU2) από το αναπτυσσόμενο μενού. 3. Επιλέξτε την ομάδα «CFEU2» για κάθε δείγμα (Εικόνα 10). Για το μίγμα A επιλέξτε την υπο-ομάδα που περιέχει το μίγμα A και για το μίγμα B επιλέξτε την υπο-ομάδα που περιέχει το μίγμα B. 4. Κάντε κλικ στο για να ξεκινήσετε την ανάλυση δειγμάτων. Εικόνα 10: Επιλογή των ρυθμίσεων της ομάδας CFEU2 Ανασκόπηση δεδομένων ίχνους CF-EU2v1 και γονότυπου 1. Επιλέξτε «Edit/Sort» (Επεξεργασία/ταξινόμηση). Ταξινομήστε τα δείγματα με την επιλογή «Sample Name» (Ονομασία δείγματος) και κάντε κλικ στο «OK». 2. Κάντε κλικ στο για «Display Plots» (Εμφάνιση γραφημάτων). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 9 από 40

3. Χρησιμοποιήστε το αναπτυσσόμενο μενού για να επιλέξετε τις κατάλληλες ρυθμίσεις γραφήματος CF-EU2v1: Για να δείτε το μίγμα A με δεδομένα ανάλυσης για πολυθυμιδίνες επιλέξτε: «CFEU2 Plot PT-on» (Γράφημα CFEU2 με ενεργοποιημένη ανάλυση για πολυθυμιδίνες) Για να δείτε το μίγμα A χωρίς δεδομένα για πολυθυμιδίνες επιλέξτε: «CFEU2 Plot PT-off» (Γράφημα CFEU2 με απενεργοποιημένη ανάλυση για πολυθυμιδίνες) Εικόνα 11: Χρησιμοποιήστε το αναπτυσσόμενο μενού για να επιλέξετε τις ρυθμίσεις γραφημάτων CFEU2 4. Το παράθυρο του γραφήματος θα εμφανίσει τα δεδομένα ίχνους δείγματος (Εικόνα 12). 5. Συνιστάται η ενεργοποίηση της επιλογής «Single click editing» (Επεξεργασία με ένα κλικ) στο παράθυρο γραφήματος. Για να το κάνετε αυτό επιλέξτε «Alleles/set click editing» (Αλληλόμορφα/ορισμός κλικ για επεξεργασία) και διασφαλίστε ότι έχει γίνει αυτή η επιλογή. Εικόνα 12: Το παράθυρο του γραφήματος δείγματος θα εμφανίσει τα επισημανθέντα δεδομένα ίχνους Μίγμα A Elucigene CF-EU2v1 Μίγμα Β Elucigene CF-EU2v1 CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 10 από 40

Βαθμολόγηση διαγνωστικών αιχμών Ένα άτομο έχει δύο αντίγραφα του γονιδίου CFTR. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν την ίδια αλληλουχία για ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο, το άτομο περιγράφεται ως ομόζυγο για αυτή τη θέση. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν διαφορετική αλληλουχία για ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο, το άτομο περιγράφεται ως ετερόζυγο (Εικόνα 13). Το μίγμα A (με τη μετάλλαξη) καθορίζει εάν ένα άτομο φέρει μετάλλαξη και εμφανίζεται με την παρουσία μπλε αιχμής. Το μίγμα με τη μετάλλαξη περιέχει επίσης εκκινητές για το φυσιολογικό αλληλόμορφο F508del, συνεπώς αυτό το μίγμα μπορεί να καθορίσει εάν το άτομο είναι φυσιολογικό για το αλληλόμορφο F508del (μόνον πράσινη αιχμή), ομόζυγο για το αλληλόμορφο F508del (μόνο μπλε αιχμή) ή ετερόζυγο για το αλληλόμορφο F508del (μπλε και πράσινη αιχμή). Εάν παρατηρηθεί οποιαδήποτε άλλη μετάλλαξη, το δείγμα μπορεί να ενισχυθεί με το μίγμα B (WT) για να προσδιοριστεί η ομοζυγωτία ή η ετεροζυγωτία. Η παρουσία πράσινης αιχμής για το συγκεκριμένο αλληλόμορφο στο μίγμα WT υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ετερόζυγο, ενώ η απουσία πράσινης αιχμής υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ομόζυγο για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη. Εικόνα 13: Παραδείγματα ατόμων α) φυσιολογικών, β) ετερόζυγων και γ) ομόζυγων για το αλληλόμορφο 711+1G>T A B C Ένα άτομο που φέρει δύο διαφορετικές μεταλλάξεις αναφέρεται ως σύνθετος ετεροζυγώτης (Εικόνα 14). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 11 από 40

A Εικόνα 14: Παραδείγματα δειγμάτων σύνθετων ετερόζυγων. A) G85E/D1152H B) F508del/E60X B Δύο υπερμεταβλητοί δείκτες STR (κόκκινοι) περιλαμβάνονται και στα δύο μίγματα. Αυτό επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα με τη μετάλλαξη και του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα WT για να μειωθεί το ενδεχόμενο μπερδέματος των δειγμάτων (Εικόνα 15). Η παρουσία αυτών των δεκτών STR υποδεικνύουν αποτυχημένο δείγμα. Η παρουσία δεικτών STR σε πολύ χαμηλές σχετικές μονάδες φθορισμού (rfu) υποδεικνύει ασθενές δείγμα, το οποίο θα πρέπει να αναλύεται με προσοχή. Εικόνα 15: Γραφήματα του μίγματος A και του μίγματος B που δείχνουν τους δύο δείκτες STR για ένα άτομο CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 12 από 40

Οι υπερμεταβλητοί δείκτες STR μπορούν να αποκρυφτούν με την απενεργοποίηση των δεδομένων της κόκκινης χρωστικής στο παράθυρο του γραφήματος. Η απενεργοποίηση των δεδομένων της μπλε και πράσινης χρωστικής επιτρέπει την ευκολότερη απεικόνιση των δεικτών STR. Ορισμός δεικτών στο πρόγραμμα GeneMapper Κατά την προβολή αναλυμένων δεδομένων ίχνους στο πρόγραμμα GeneMapper, οι διαγνωστικές αιχμές στο μίγμα A θα επισημαίνεται με το όνομα και τον αριθμό του δείκτη. Οι διαγνωστικές αιχμές στο μίγμα B θα επισημαίνονται μόνο με τον αριθμό του δείκτη. Τα δεδομένα αιχμής για έναν επισημασμένο δείκτη που έχει ανιχνευθεί είναι δυνατόν να εξεταστούν εξονυχιστικά με τη μετακίνηση του δρομέα του ποντικιού επάνω από την ετικέτα του δείκτη-ενδιαφέροντος, οπότε και θα εμφανιστούν το όνομα του δείκτη, το μέγεθος της αιχμής και το ύψος της αιχμής στο κάτω μέρος του παραθύρου γραφημάτων δειγμάτων. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 13 από 40

Η συσχέτιση μεταξύ των αριθμών των δεικτών και των δεικτών εμφανίζεται παρακάτω. Δείκτες που ανιχνεύονται Αρ. δείκτη Δείκτης Εύρος μεγέθους ζευγών βάσεων (bp) για το προϊόν (δεδομένα 3130/POP7) 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 14 από 40

* Μεγέθη αλληλόμορφων 5T Μέγεθος bp για το Δείκτης προϊόν Εύρος POP7/3130 5T (9) 117,25 118,75 5T (10) 119,25 120,75 5T (11) 121,25 122,75 5T (12) 123,25 124,75 5T (13) 125,25 126,75 Σημείωση: Τα εύρη μεγέθους για κάθε δείκτη μπορεί να διαφέρει λόγω του οργάνου και του πολυμερούς που χρησιμοποιούνται. Δείκτης CF-EU2v1 di507del Λόγω της θέσης της έλλειψης I507 στο γονίδιο CFTR είναι δυνατός ο εντοπισμός της παρουσίας αυτού του δείκτη μέσω μιας μεταβολής κατά 3 bp στο μέγεθος της αιχμής F508del, καθώς επίσης και της παρουσίας μιας αιχμής που είναι ειδική για τη μετάλλαξη I507del. Όταν υπάρχει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο I507del, η αιχμή μετάλλαξης I507del θα παρατηρηθεί ως μπλε αιχμή στα 159 bp περίπου. Θα παρατηρηθεί η παρουσία μίας αιχμής φυσικού τύπου (WT) για τη μετάλλαξη F508del, αλλά με το μισό περίπου ύψους της αιχμής που σχετίζεται φυσιολογικά με ομόζυγο γονότυπο φυσικού τύπου. Αυτό παρατηρείται ως μία πράσινη αιχμή στα 167 bp περίπου. Θα υπάρξει επίσης μία πρόσθετη πράσινη αιχμή που παρατηρείται στα 164 bp περίπου (Εικόνα 16). Εικόνα 16: Ετερόζυγο δείγμα I507del Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/F508del θα αποδώσει μια μεταβληθείσα πράσινη αιχμή F508del WT στα 164 bp περίπου (3 bp λιγότερα από το φυσιολογικό), μια μπλε αιχμή μετάλλαξης F508del στα 166 bp και μία μπλε αιχμή μετάλλαξης I507del στα 159 bp περίπου. Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/I507del θα αποδώσει μία μπλε αιχμή περίπου στα 159 bp και μία μεμονωμένη πράσινη αιχμή στα 164 bp περίπου (3 bp λιγότερα από τη φυσιολογικά παρατηρούμενη αιχμή F508del όταν δεν υπάρχει μετάλλαξη I507del). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η παρουσία μίας μετάλλαξης F508del παρεμποδίζει τη λειτουργία του εκκινητή I507 WT. Συνεπώς, ένα άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη F508del δεν θα έχει καμία αιχμή I507 WT στο μίγμα WT και ένα άτομο που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη F508del θα έχει μειωμένο ύψος αιχμής I507 WT στο μίγμα WT. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 15 από 40

Δείκτες πολυθυμιδινών Το Elucigene CF-EU2v1 περιέχει φθορίζοντες εκκινητές ARMS που έχουν σημανθεί με NED (κίτρινο) για τον εντοπισμό παραλλαγών IVS8-5T, IVS8-7T και IVS8-9T. Οι πληροφορίες σχετικά με τις πολυθυμιδίνες για ένα δείγμα είναι δυνατόν να προσδιοριστούν από την ενεργοποίηση της απεικόνισης των δεδομένων της κίτρινης χρωστικής εντός των ρυθμίσεων GeneMapper CF-EU2v1. Ο χειριστής μπορεί, συνεπώς, να επιλέξει να προβάλλει αυτά τα δεδομένα όπως κριθεί απαραίτητο εντός της διαδικασίας εξέτασης του εργαστηρίου. Σημείωση: Δεν υπάρχουν εκκινητές πολυθυμιδινών στο μίγμα B, συνεπώς, τα προϊόντα θα απεικονιστούν μόνο σε δείγματα μίγματος A. Ανάλυση πολυθυμιδινών Τα παρακάτω παραδείγματα του προγράμματος GeneMapper εμφανίζουν μορφολογίες αιχμής που είναι χαρακτηριστικές των περιοχών παραλλαγών IVS8 που εξετάζονται. Παράδειγμα 1: Δείγμα IVS8-5T / IVS8-9T Το παρακάτω παράδειγμα παρουσιάζει το αποτέλεσμα του μίγματος A, όπως παρατηρείται με χρήση των ρυθμίσεων γραφήματος «CFEU2 Plot PT-on» (Γράφημα CFEU2 με ενεργοποίηση ανάλυσης PT). Η αφαίρεση των πληροφοριών σε πράσινο και μπλε χρώμα στις ρυθμίσεις του γραφήματος για το ίδιο δείγμα εμφανίζει σαφώς τον δείκτη πολυθυμιδινών, όπως φαίνεται παρακάτω. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 16 από 40

Παράδειγμα 2: Δείγμα IVS8-7T / IVS8-7T Παράδειγμα 3: Δείγμα IVS8-7T / IVS8-7T (ποικιλότητα επαναλήψεων TG) Οι δύο αιχμές οφείλονται στην ετεροζυγωτία της περιοχής επαναλήψεων TG, η οποία βρίσκεται μέσα στο αμπλικόνιό μας. Αυτή η επίδραση μπορεί επίσης να παρατηρηθεί με ομόζυγα δείγματα 5T και 9T. Είναι συνεπώς πιθανόν να καθοριστεί ο αριθμός των επαναλήψεων TG εντός κάθε παραλλαγής πολυθυμιδινών IVS8. Παράδειγμα 4: Δείγμα IVS8-9T / IVS8-9T Σημαντική σημείωση Υπό ορισμένες συνθήκες του προσδιορισμού είναι δυνατόν να παρεμβληθούν παρατηρούμενα τεχνήματα χρωστικών με την ανάλυση ρουτίνας. Είναι σημαντικό να γνωρίζει ο χρήστης την πιθανότητα παρεμβολής για να διασφαλιστεί η σωστή ανάλυση των δεδομένων. Μπορούν να παρατηρηθούν τεχνήματα λόγω χρωστικών σήμανσης ως μικρές μπλε ή πράσινες αιχμές. Αυτά τα τεχνήματα λόγω χρωστικών είναι γενικά μικρότερα από 100 bp σε μέγεθος και δεν παρεμβάλλονται φυσιολογικά με την ανάλυση δεδομένων. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, αυτές οι αιχμές των τεχνημάτων είναι ασήμαντες σε σχέση με τις πραγματικές αιχμές των αμπλικονίων και δεν προκαλούν οποιαδήποτε προβλήματα με την ανάλυση. Ωστόσο, όταν το ποσό του αμπλικονίου που φορτώνεται είναι μικρό, πιθανόν λόγω περιορισμένου γενωμικού DNA, οι αιχμές των τεχνημάτων λόγω χρωστικών φαίνονται σχετικά μεγαλύτερες με ενδεχόμενο να αναλυθούν ως αληθείς αιχμές αμπλικονίου. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 17 από 40

Ανάλυση GeneMarker Εισαγωγή Η παρακάτω ενότητα περιγράφει τις διαδικασίες ανάλυσης δειγμάτων των αποτελεσμάτωνelucigene CF-EU2v1, χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SoftGenetics GeneMarker, έκδοσης V1.95. Διαδικασία ανάλυσης Η διαδικασία ανάλυσης δειγμάτων συνοψίζεται στο διάγραμμα ροής που εμφανίζεται παρακάτω. Ανάλυση ενισχυμένων δειγμάτων στον γενετικό αναλυτή Άνοιγμα λογισμικού GeneMarker Προσθήκη αρχείων fsa δειγμάτων στο σχέδιο Επιλέξτε την κατάλληλη ομάδα και τις κατάλληλες ρυθμίσεις ανάλυσης CF-EU2v1 Εκτέλεση ανάλυσης δείγματος Επιλέξτε την εφαρμογή: ARMS/Comparative Analysis (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) Επιλέξτε «Mutant + Wild-type» (Μεταλλαγμένα + φυσικού τύπου) ή «Mutant Only» (Μόνο μεταλλαγμένα) Επιλέξτε Print (Εκτύπωση) Επιλέξτε Preview (Προεπισκόπηση) CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 18 από 40

Προσθήκη αρχείων δειγμάτων στο πρόγραμμα GeneMarker Ανοίξτε το αρχείο του προγράμματος GeneMarker και όταν σας ζητηθεί επιλέξτε «Open Data» (Άνοιγμα δεδομένων). Θα εμφανιστεί το πλαίσιο Open Data Files (Άνοιγμα αρχείου δεδομένων). Κάντε κλικ στο κουμπί «Add» (Προσθήκη). Θα εμφανιστεί το πλαίσιο διαλόγου ανοίγματος. Μεταβείτε στον κατάλογο που περιέχει τα αρχεία μη επεξεργασμένων δεδομένων Επιλέξτε όλα τα αρχεία πατώντας CTRL+A ή χρησιμοποιήστε τα πλήκτρα CTRL ή/και SHIFT για να επιλέξετε μεμονωμένα δείγματα Κάντε κλικ στο κουμπί Open (Άνοιγμα) στο πλαίσιο διαλόγου ανοίγματος Τα αρχεία που επιλέγονται θα εμφανιστούν στο πεδίο Data File List (Λίστα αρχείου δεδομένων) (Εικόνα 1). Κάντε κλικ στο κουμπί OK, στο πλαίσιο διαλόγου Open Data Files (Άνοιγμα αρχείων δεδομένων) και τα δείγματα θα αποσταλούν στο GeneMarker. Στη συνέχεια, το λογισμικό θα ανοίξει αυτόματα το παράθυρο Raw Data Analysis (Ανάλυση μη επεξεργασμένων δεδομένων) (Εικόνα 2). Εικόνα 1: Δείγματα που έχουν προστεθεί στη λίστα Data File (Αρχείο δεδομένων). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 19 από 40

Δέντρο δειγμάτων Εικόνα 2: Παράθυρο ανάλυσης μη επεξεργασμένων δεδομένων Συνθετική εικόνα γέλης Ίχνος μη επεξεργασμένων δεδομένων Επεξεργασία δεδομένων Μετά από την αποστολή των αρχείων μη επεξεργασμένων δεδομένων στο GeneMarker, είναι έτοιμα να υποστούν επεξεργασία. Το βήμα επεξεργασίας περιλαμβάνει εφαρμογή του προτύπου προσδιορισμού μεγέθους, φιλτράρισμα των αιχμών λόγω θορύβου και σύγκριση με γνωστή ομάδα αλληλόμορφων, εάν είναι επιθυμητό. Το πρόγραμμα GeneMarker συνδυάζει όλα αυτά τα βήματα σε ένα απλό εργαλείο που ονομάζεται Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) (Εικόνα 3). Για πρόσβαση στο βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης κάντε απλά κλικ στο εικονίδιο εκτέλεσης ανάλυσης του σχεδίου στην κύρια γραμμή εργαλείων. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 20 από 40

Εικόνα 3: Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης παράθυρο επιλογής μήτρας Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης παράθυρο επιλογής μήτρας Δημιουργήστε μία μήτρα CF-EU2v1 και επιλέξτε τις κατάλληλες ρυθμίσεις Size Standard (Πρότυπο μεγέθους), Standard Colour (Χρώμα προτύπου) και Analysis type (Τύπος ανάλυσης) (όπως φαίνεται στην εικόνα 3). Επιλέξτε την κατάλληλη ομάδα ανάλογα με την πλατφόρμα που χρησιμοποιείται, π.χ. CF- EU2v1_POP7. Αυτά διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com. Αυτές πρέπει να ληφθούν μέσα στον κατάλληλο φάκελο στο σύστημα του χρήστη. Κάντε κλικ στην επιλογή «Next» (Επόμενο) για να συνεχίσετε Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης Επεξεργασία δεδομένων Το παράθυρο Data Process (Επεξεργασία δεδομένων) του Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) επιτρέπει στον χρήστη να επιλέξει τις παραμέτρους φιλτραρίσματος αιχμών. Φροντίστε να επιλέξετε τις ρυθμίσεις, όπως φαίνεται στην εικόνα 4 παρακάτω. Κάντε κλικ στην επιλογή «Next» (Επόμενο) για να συνεχίσετε CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 21 από 40

Εικόνα 4: Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης παράθυρο επεξεργασίας δεδομένων ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για 3500 δεδομένα αυξήστε την επιλογή Min Intensity (Ελάχιστη ένταση) σε 300. Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης Πρόσθετες ρυθμίσεις Δεν υπάρχουν πρόσθετες ρυθμίσεις που απαιτούνται κατά την εκτέλεση ανάλυσης CF-EU2v1. Κάντε κλικ στην επιλογή «ΟΚ» για να συνεχίσετε CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 22 από 40

Εικόνα 5: Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης Πρόσθετες ρυθμίσεις Πλαίσιο επεξεργασίας δεδομένων Αφού κάνετε κλικ στην επιλογή OK, στο πλαίσιο Run Wizard Additional Settings (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης-πρόσθετες ρυθμίσεις), εμφανίζεται το πλαίσιο Data Processing (Επεξεργασία δεδομένων) (Εικόνα 6). Τα μη επεξεργασμένα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία και μετράται το μέγεθός τους, κατόπιν εφαρμόζονται οι παράμετροι φιλτραρίσματος και εφαρμόζεται η επιλεγμένη ομάδα CF-EU2v1. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK» στο πλαίσιο Data Processing (Επεξεργασία δεδομένων) όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση. Εικόνα 6: Πλαίσιο επεξεργασίας δεδομένων CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 23 από 40

Παράθυρο κύριας ανάλυσης Το παράθυρο κύριας ανάλυσης (Εικόνα 7) του προγράμματος GeneMarker έχει μία εύχρηστη διάταξη. Αυτή η διάταξη περιλαμβάνει: Τη λίστα αρχείων δειγμάτων εμφανίζεται στην αριστερή πλευρά του παραθύρου. Εικόνα συνθετικής γέλης εμφανίζεται στο επάνω μέρος του παραθύρου. Ηλεκτροφορήματα δεδομένων κάτω από την εικόνα γέλης. Ένας πίνακας αναφορών εμφανίζεται στη δεξιά πλευρά του παραθύρου. Σε αυτό το παράθυρο είναι σημαντικό να ελέγξετε ότι όλες οι αντίστοιχες αιχμές σε κάθε προφίλ έχουν ονομαστεί σωστά. Κάντε διπλό κλικ σε κάθε δείγμα διαδοχικά στο δέντρο αρχείων δειγμάτων στην αριστερή πλευρά της οθόνης. Κάντε δεξί κλικ σε οποιαδήποτε από τις εν λόγω αιχμές και κάντε τις επιλογές στο πλαίσιο διαλόγου, π.χ. επεξεργασία ή διαγραφή αλληλόμορφου, επιβεβαίωση ή αναίρεση επιβεβαίωσης, όπως είναι απαραίτητο. Όπου δεν έχει δοθεί κανένα όνομα σε μία αιχμή, επειδή είναι χαμηλότερη από τον ουδό, μπορεί να αντιστοιχιστεί μη αυτόματα ένα αλληλόμορφο. Επιλέξτε τον κατάλληλο «Marker» (Δείκτη) από το αναπτυσσόμενο πλαίσιο, κρατώντας πατημένο το πλήκτρο shift στην εν λόγω αιχμή, κάντε κλικ στην επιλογή «Insert Allele» (Εισαγωγή αλληλόμορφου) και, κατόπιν, κάντε κλικ στην επιλογή «OK». Κατά την ταυτόχρονη ανάλυση των δεδομένων του μίγματος A και B είναι σημαντικό να διασφαλιστεί ότι όλες οι αιχμές STR έχουν ονοματιστεί. Μόλις ολοκληρωθεί αυτή η διαδικασία για όλα τα δείγματα, μπορεί να εκτελεστεί το επόμενο στάδιο της ανάλυσης. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 24 από 40

Εικόνα 7: Παράθυρο κύριας ανάλυσης Δέντρο αρχείων δειγμάτων Συνθετική εικόνα γέλης Ηλεκτροφόρημα Πίνακας αναφορών Ανάλυση μεταλλαγμένων μόνο (μίγμα A) Από το παράθυρο κύριας ανάλυσης, επιλέξτε το αναπτυσσόμενο μενού «Applications» (Εφαρμογές) από το επάνω μέρος της οθόνης. Επιλέξτε «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), ακολουθούμενη από την επιλογή «Mutant Only» (Μόνο μεταλλαγμένα). Στο πλαίσιο διαλόγου «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) επιλέξτε «Poly-T Analysis» (Ανάλυση πολυθυμιδινών), εάν επιθυμείτε αυτή την ανάλυση (Εικόνα 8). Κάντε κλικ στην επιλογή «Preview» (Προεπισκόπηση), στο πλαίσιο διαλόγου «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) για να δείτε την αναφορά Elucigene CF-EU2v1 (Μίγμα A) μόνο για μεταλλαγμένα (Εικόνα 11). Από αυτό το παράθυρο, ο χειριστής μπορεί να εξετάσει και να εκτυπώσει κάθε αναφορά δειγμάτων. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK», στο πλαίσιο διαλόγου «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) για να εκτυπώσετε την αναφορά Elucigene CF-EU2v1 (Μίγμα A) μόνο για μεταλλαγμένα (Εικόνα 11), χωρίς προεπισκόπηση. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 25 από 40

Εικόνα 8: Πλαίσιο «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης), μόνο για μεταλλαγμένα Προεπισκόπηση της αναφοράς Elucigene CF-EU2v1 Αναφορά μεταλλαγμένων μόνο (μίγμα A) Κάντε κλικ στην επιλογή «Preview» (Προεπισκόπηση), στο πλαίσιο διαλόγου «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) για να δείτε την αναφορά μίγματος Α Elucigene CF-EU2v1 (Εικόνα 11). Από αυτό το παράθυρο, ο χειριστής μπορεί να εξετάσει και να εκτυπώσει κάθε αναφορά δειγμάτων. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 26 από 40

Εικόνα 11: Παράθυρο αναφοράς CF-EU2v1 μόνο για μεταλλαγμένα (μίγμα A) Η αναφορά Elucigene CF-EU2v1 περιλαμβάνει τα παρακάτω χαρακτηριστικά: Επικεφαλίδα αναφοράς: Περιέχει πληροφορίες σχετικά με την ανάλυση, το σχέδιο, το δείγμα και τις παραμέτρους. Πλαίσιο υπογραφών: Ημερομηνία και αρχικό διάστημα για ελεγκτές της αναφοράς. Ηλεκτροφόρημα: Σύμφωνα με το παράθυρο «ARMS/Comparative analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), εμφανίζει όλες τις χρωστικές του ίχνους του δείγματος. Πίνακας αναφορών: Ο κύριος πίνακας εμφανίζει όλες τις μεταλλάξεις που εξετάζονται για αυτό το κιτ. Η παρουσία ή απουσία μίας μετάλλαξης υποδεικνύεται με το 1 ή το 0. Σημειώστε ότι η πλήρης κατάσταση ζυγωτίας μπορεί να αναφερθεί μόνον για τον τόπο F508, μόνον κατά την ανάλυση μίγματος A. Ο δεύτερος πίνακας εμφανίζει την κατάσταση πολυθυμιδινών του δείγματος, εάν έχει επιλεγεί αυτή η λειτουργία. Ανάλυση μίγματος μεταλλαγμένων + φυσικού τύπου (A και Β) Από το παράθυρο κύριας ανάλυσης επιλέξτε το αναπτυσσόμενο μενού «Tools» (Εργαλεία) από το επάνω μέρος της οθόνης, ακολουθούμενο από την επιλογή «File Name Group Tool» (Εργαλείο ομαδοποίησης βάσει ονόματος αρχείου). Αυτή η επιλογή θα ανοίξει την οθόνη «File Name Group Editor» (Πρόγραμμα επεξεργασίας ομαδοποίησης βάσει ονόματος αρχείου). Στο πλαίσιο «Compare by Section» (Σύγκριση ανά τομέα), πληκτρολογήστε τον αριθμό της στήλης στην οποία εμφανίζεται το όνομα του CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 27 από 40

δείγματος. Στο πλαίσιο «Match to Identifier by Section» (Αντιστοίχηση με αναγνωριστικό ανά τομέα), πληκτρολογήστε τον αριθμό της στήλης στην οποία εμφανίζεται ο τύπος του μίγματος, δηλαδή Α ή Β. Στο πλαίσιο «Control Identifier» (Αναγνωριστικό μάρτυρα), πληκτρολογήστε «A». Κάντε κλικ στο κουμπί «Match» (Αντιστοίχιση) και θα εμφανιστούν τα αντιστοιχισμένα δείγματα στη δεξιά πλευρά του πλαισίου διαλόγου (Εικόνα 9). Εικόνα 9: Οθόνη προγράμματος επεξεργασίας ομαδοποίησης βάσει ονόματος αρχείου Αποθηκεύστε την αντιστοιχισμένη ομάδα σε κατάλληλο φάκελο, κάνοντας κλικ στο εικονίδιο που βρίσκεται στο επάνω μέρος του τομέα «Matched Groups» (Αντιστοιχισμένες ομάδες). Από το παράθυρο κύριας ανάλυσης, επιλέξτε το αναπτυσσόμενο μενού «Applications» (Εφαρμογές) από το επάνω μέρος της οθόνης. Επιλέξτε «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), ακολουθούμενη από την επιλογή «Mutant + Wildtype» (Μεταλλαγμένα + φυσικού τύπου). Στο πλαίσιο «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), αρχικά επιλέξτε το αντίστοιχο «Group File» (Αρχείο ομάδας) και στη συνέχεια επιλέξτε «Poly-T Analysis» (Ανάλυση πολυθυμιδινών), εάν επιθυμείτε αυτή την ανάλυση ή/και «STR Check» (Έλεγχος STR) (Εικόνα 10α). Στη συνέχεια, κάντε κλικ στην επιλογή «OK» για να δείτε το παράθυρο «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) (Εικόνα 10β). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 28 από 40

Εικόνα 10α: Πλαίσιο ρυθμίσεων ARMS/Comparative Analysis (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) Εικόνα 10β: Παράθυρο ARMS/Comparative Analysis (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) Αρχεία που έχουν ομαδοποιηθεί Ηλεκτροφορήματα Ιστόγραμμα διαφορών Πίνακας αναφορών Προεπισκόπηση της αναφοράς Elucigene CF-EU2v1 Αναφορά μεταλλαγμένων + φυσικού τύπου (μίγμα A + Β) Στο παράθυρο «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), κάντε κλικ στο εικονίδιο εκτύπωσης. Επιλέξτε «Poly-T Analysis» (Ανάλυση πολυθυμιδινών), εάν επιθυμείτε αυτή την ανάλυση ή/και «STR Check» (Έλεγχος STR) CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 29 από 40

(Εικόνα 12α). Κάντε κλικ στην επιλογή «Preview» (Προεπισκόπηση) για να δείτε την αναφορά A + B Elucigene CF-EU2v1 (Εικόνα 12β). Από αυτό το παράθυρο, ο χειριστής μπορεί να εξετάσει και να εκτυπώσει κάθε αναφορά δειγμάτων. Εικόνα 12a: Πλαίσιο ARMS/Comparative Print Settings (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) Εικόνα 12b: Παράθυρο αναφοράς CF-EU2v1 για μεταλλαγμένα + φυσικού τύπου (μίγμα A + Β) CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 30 από 40

Η αναφορά Elucigene CF-EU2v1 περιλαμβάνει τα παρακάτω χαρακτηριστικά: Επικεφαλίδα αναφοράς: Περιέχει πληροφορίες σχετικά με την ανάλυση, το σχέδιο, το δείγμα και τις παραμέτρους. Πλαίσιο υπογραφών: Ημερομηνία και αρχικό διάστημα για ελεγκτές της αναφοράς. Παρέχεται πρόσθετη στήλη ελέγχου για τα αρχικά του ελεγκτή. Ηλεκτροφόρημα: Σύμφωνα με το παράθυρο «ARMS/Comparative analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση), εμφανίζει όλες τις χρωστικές του ίχνους του δείγματος. Πίνακες αναφορών: Ο κύριος πίνακας εμφανίζει όλες τις μεταλλάξεις που εξετάζονται για αυτό το κιτ. Η ομοζυγωτία ή η ετεροζυγωτία υποδεικνύεται από τον αριθμό αλληλόμορφων φυσικού τύπου ή μεταλλαγμένων αλληλόμορφων που αναφέρονται για κάθε θέση. Ο δεύτερος πίνακας εμφανίζει την κατάσταση πολυθυμιδινών του δείγματος, εάν έχει επιλεγεί αυτή η λειτουργία. Ιστόγραμμα σύγκρισης ιχνών: Το πρόγραμμα GeneMarker υπολογίζει τις διαφορές των αλληλόμορφων μεταξύ των ιχνών μίγματος A και B και τις εμφανίζει σε ένα ιστόγραμμα που βρίσκεται κάτω από τα ηλεκτροφορήματα δειγμάτων. Σημάνσεις αιχμών Οι σημάνσεις αιχμών είναι χρωματικά κωδικοποιημένες ανάλογα με την ποιότητα της αντιστοίχισης μεταξύ της ανιχνευμένης αιχμής και των παρατηρούμενων «bin» ομάδων. Στο ηλεκτροφόρημα, οι δείκτες είναι οριζόντιες γκρι γραμμές και το κέντρο των αιχμών επισημαίνεται με μία κάθετη γκρι γραμμή. Οι αιχμές που βρίσκονται εκτός των δεικτών ή των «bin» της ομάδας επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα ως Off Ladder (Εκτός κλίμακας) (OL). Σημείωση: Οι διακυμάνσεις ως προς τον τύπο του πολυμερούς και του προτύπου μεγέθους του μηχανήματος μπορεί να καταστήσει απαραίτητη τη βελτιστοποίηση των «bin» των δεικτών προκειμένου να προσαρμόσετε το λογισμικό στις συνθήκες εκτέλεσης ανάλυσης που χρησιμοποιούνται. Μπορείτε να βρείτε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την τροποποίηση των «bin» των ομάδων στο εγχειρίδιο GeneMarker που παρέχεται μαζί με το λογισμικό. Βαθμολόγηση διαγνωστικών αιχμών Ένα άτομο έχει δύο αντίγραφα του γονιδίου CFTR. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν την ίδια αλληλουχία για ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο, το άτομο περιγράφεται ως ομόζυγο για αυτή τη θέση. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν διαφορετική αλληλουχία για ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο, το άτομο περιγράφεται ως ετερόζυγο (Εικόνα 13). Το μίγμα A (με τη μετάλλαξη) καθορίζει εάν ένα άτομο φέρει μετάλλαξη και εμφανίζεται με την παρουσία μπλε αιχμής. Το μίγμα με τη μετάλλαξη περιέχει επίσης εκκινητές για το φυσιολογικό αλληλόμορφο F508del, συνεπώς αυτό το μίγμα μπορεί να καθορίσει εάν το άτομο είναι φυσιολογικό για το αλληλόμορφο F508del (μόνον πράσινη αιχμή), ομόζυγο για το αλληλόμορφο F508del (μόνο μπλε αιχμή) ή ετερόζυγο για το αλληλόμορφο F508del (μπλε και πράσινη αιχμή). Εάν παρατηρηθεί οποιαδήποτε άλλη μετάλλαξη, το δείγμα μπορεί να ενισχυθεί με το μίγμα B (WT) για να προσδιοριστεί η ομοζυγωτία ή η ετεροζυγωτία. Η παρουσία πράσινης αιχμής για το συγκεκριμένο αλληλόμορφο στο μίγμα WT υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ετερόζυγο, ενώ η απουσία πράσινης αιχμής υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ομόζυγο για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 31 από 40

Εικόνα 13: Παραδείγματα ατόμων α) φυσιολογικών, β) ετερόζυγων και γ) ομόζυγων για το αλληλόμορφο 711+1G>T A B C Ένα άτομο που φέρει δύο διαφορετικές μεταλλάξεις αναφέρεται ως σύνθετος ετεροζυγώτης (Εικόνα 14). CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 32 από 40

A Εικόνα 14: Παραδείγματα δειγμάτων σύνθετων ετερόζυγων. A) W1282X/S1251N B) F508del/R560T B Δύο υπερμεταβλητοί δείκτες STR (κόκκινοι) περιλαμβάνονται και στα δύο μίγματα. Αυτό επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα με τη μετάλλαξη και του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα WT για να μειωθεί το ενδεχόμενο μπερδέματος των δειγμάτων (Εικόνα 15). Η παρουσία αυτών των δεκτών STR υποδεικνύουν αποτυχημένο δείγμα. Η παρουσία δεικτών STR σε πολύ χαμηλές σχετικές CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 33 από 40

μονάδες φθορισμού (rfu) υποδεικνύει ασθενές δείγμα, το οποίο θα πρέπει να αναλύεται με προσοχή. Εικόνα 15: Γραφήματα του μίγματος A και του μίγματος B που δείχνουν τους δύο δείκτες STR για ένα άτομο Οι υπερμεταβλητοί δείκτες STR μπορούν να αποκρυφτούν με την κατάργηση της επιλογής «STR Check» (Έλεγχος STR) στο πλαίσιο «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) εάν αναλύετε μόνον το μίγμα A ή της επιλογής «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) εάν αναλύετε το μίγμα A και B. Η εμφάνιση των δεδομένων μόνον της κόκκινης χρωστικής στο παράθυρο «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) επιτρέπει την ευκολότερη απεικόνιση των δεικτών STR. Ορισμός δεικτών στο πρόγραμμα GeneMarker Κατά την προβολή αναλυμένων δεδομένων ίχνους στο πρόγραμμα GeneMarker, οι διαγνωστικές αιχμές στο μίγμα A θα επισημαίνεται με το όνομα του δείκτη. Οι διαγνωστικές αιχμές στο μίγμα B θα επισημαίνεται μόνο με τον αριθμό του δείκτη, με επίθημα «WT» κατά την προβολή με επιλεγμένη μόνο την πράσινη χρωστική. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 34 από 40

Η συσχέτιση μεταξύ των αριθμών των δεικτών και των δεικτών εμφανίζεται παρακάτω. Δείκτες που ανιχνεύονται Αρ. δείκτη Δείκτης Εύρος μεγέθους ζευγών βάσεων (bp) για το προϊόν (δεδομένα 3130/POP7) 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 35 από 40

* Μεγέθη αλληλόμορφων 5T Μέγεθος bp για το Δείκτης προϊόν Εύρος POP7/3130 5T (9) 117,25 118,75 5T (10) 119,25 120,75 5T (11) 121,25 122,75 5T (12) 123,25 124,75 5T (13) 125,25 126,75 Σημείωση: Τα εύρη μεγέθους για κάθε δείκτη μπορεί να διαφέρει λόγω του οργάνου και του πολυμερούς που χρησιμοποιούνται. Δείκτης CF-EU2v1 di507del Λόγω της θέσης της έλλειψης I507 στο γονίδιο CFTR είναι δυνατός ο εντοπισμός της παρουσίας αυτού του δείκτη μέσω μιας μεταβολής κατά 3 bp στο μέγεθος της αιχμής F508del, καθώς επίσης και της παρουσίας μιας αιχμής που είναι ειδική για τη μετάλλαξη I507del. Όταν υπάρχει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο I507del, η αιχμή μετάλλαξης I507del θα παρατηρηθεί ως μπλε αιχμή στα 159 bp περίπου. Θα παρατηρηθεί η παρουσία μίας αιχμής φυσικού τύπου (WT) για τη μετάλλαξη F508del, αλλά με το μισό περίπου ύψους της αιχμής που σχετίζεται φυσιολογικά με ομόζυγο γονότυπο φυσικού τύπου. Αυτό παρατηρείται ως μία πράσινη αιχμή στα 167 bp περίπου. Θα υπάρξει επίσης μία πρόσθετη πράσινη αιχμή που παρατηρείται στα 164 bp περίπου (Εικόνα 16). Εικόνα 16: Ετερόζυγο δείγμα I507del Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/F508del θα αποδώσει μια μεταβληθείσα πράσινη αιχμή F508del WT στα 164 bp περίπου (3 bp λιγότερα από το φυσιολογικό), μια μπλε αιχμή μετάλλαξης F508del στα 166 bp και μία μπλε αιχμή μετάλλαξης I507del στα 159 bp περίπου. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 36 από 40

Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/I507del θα αποδώσει μία μπλε αιχμή περίπου στα 159 bp και μία μεμονωμένη πράσινη αιχμή στα 164 bp περίπου (3 bp λιγότερα από τη φυσιολογικά παρατηρούμενη αιχμή F508del όταν δεν υπάρχει μετάλλαξη I507del). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η παρουσία μίας μετάλλαξης F508del παρεμποδίζει τη λειτουργία του εκκινητή I507 WT. Συνεπώς, ένα άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη F508del δεν θα έχει καμία αιχμή I507 WT στο μίγμα WT και ένα άτομο που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη F508del θα έχει μειωμένο ύψος αιχμής I507 WT στο μίγμα WT. Δείκτες πολυθυμιδινών Το Elucigene CF-EU2v1 περιέχει φθορίζοντες εκκινητές ARMS που έχουν σημανθεί με NED (κίτρινο) για τον εντοπισμό παραλλαγών IVS8-5T, IVS8-7T και IVS8-9T. Οι πληροφορίες σχετικά με τις πολυθυμιδίνες για ένα δείγμα είναι δυνατόν να προσδιοριστούν από την ενεργοποίηση της απεικόνισης των δεδομένων της κίτρινης χρωστικής εντός του παραθύρου κύριας ανάλυσης του προγράμματος GeneMarker (Εικόνα 7). Οι δείκτες πολυθυμιδινών μπορούν να αποκρυφτούν με την κατάργησης της επιλογής «Poly-T Analysis» (Ανάλυση πολυθυμιδινών) στο πλαίσιο «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) εάν αναλύετε μόνο το μίγμα A ή της επιλογής «ARMS/Comparative Analysis» (Ανάλυση ARMS/συγκριτική ανάλυση) εάν αναλύετε το μίγμα A και B. Ο χειριστής μπορεί, συνεπώς, να επιλέξει να προβάλλει αυτά τα δεδομένα όπως κριθεί απαραίτητο εντός της διαδικασίας εξέτασης του εργαστηρίου. Σημείωση: Δεν υπάρχουν εκκινητές πολυθυμιδινών στο μίγμα B, συνεπώς, τα προϊόντα θα απεικονιστούν μόνο σε δείγματα μίγματος A. Ανάλυση πολυθυμιδινών Τα παρακάτω παραδείγματα του προγράμματος GeneMarker εμφανίζουν μορφολογίες αιχμής που είναι χαρακτηριστικές των περιοχών παραλλαγών IVS8 που εξετάζονται. Τα παρακάτω παραδείγματα εμφανίζουν το αποτέλεσμα για το μίγμα A, όπως παρατηρούνται όταν έχει επιλεγεί «Poly-T Analysis» (Ανάλυση πολυθυμιδινών) στο πλαίσιο διαλόγου «ARMS/Comparative Print Settings» (Ρυθμίσεις εκτύπωσης ανάλυσης ARMS/συγκριτικής ανάλυσης) όταν αναλύετε μόνο το μίγμα A. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 37 από 40

Παράδειγμα 1: Δείγμα IVS8-5T / IVS8-7T Παράδειγμα 2: Δείγμα IVS8-7T / IVS8-7T CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 38 από 40

Παράδειγμα 3: Δείγμα IVS8-7T / IVS8-7T (ποικιλότητα επαναλήψεων TG) Οι δύο αιχμές οφείλονται στην ετεροζυγωτία της περιοχής επαναλήψεων TG, η οποία βρίσκεται μέσα στο αμπλικόνιό μας. Αυτή η επίδραση μπορεί επίσης να παρατηρηθεί με ομόζυγα δείγματα 5T και 9T. Είναι συνεπώς πιθανόν να καθοριστεί ο αριθμός των επαναλήψεων TG εντός κάθε παραλλαγής πολυθυμιδινών IVS8. Παράδειγμα 4: Δείγμα IVS8-9T / IVS8-9T Σημαντική σημείωση Υπό ορισμένες συνθήκες του προσδιορισμού είναι δυνατόν να παρεμβληθούν παρατηρούμενα τεχνήματα χρωστικών με την ανάλυση ρουτίνας. Είναι σημαντικό να γνωρίζει ο χρήστης την πιθανότητα παρεμβολής για να διασφαλιστεί η σωστή ανάλυση των δεδομένων. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 39 από 40

Μπορούν να παρατηρηθούν τεχνήματα λόγω χρωστικών σήμανσης ως μικρές μπλε ή πράσινες αιχμές. Αυτά τα τεχνήματα λόγω χρωστικών είναι γενικά μικρότερα από 100 bp σε μέγεθος και δεν παρεμβάλλονται φυσιολογικά με την ανάλυση δεδομένων. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, αυτές οι αιχμές των τεχνημάτων είναι ασήμαντες σε σχέση με τις πραγματικές αιχμές των αμπλικονίων και δεν προκαλούν οποιαδήποτε προβλήματα με την ανάλυση. Ωστόσο, όταν το ποσό του αμπλικονίου που φορτώνεται είναι μικρό, πιθανόν λόγω περιορισμένου γενωμικού DNA, οι αιχμές των τεχνημάτων λόγω χρωστικών φαίνονται σχετικά μεγαλύτερες με ενδεχόμενο να αναλυθούν ως αληθείς αιχμές αμπλικονίου. Το ELUCIGENE είναι εμπορικό σήμα της Gen-Probe Life Sciences Ltd. Το ARMS είναι εμπορικό σήμα της AstraZeneca UK Ltd. Το QIAAMP είναι εμπορικό σήμα της Qiagen GmbH. Το GENEMARKER είναι εμπορικό σήμα της SoftGenetics Corporation.Τα GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI και PET είναι εμπορικά σήματα της Life Technologies Corporation. ΣΗΜΕΙΩΣΗ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ: ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΗ ΑΔΕΙΑ Τα πολυνουκλεοτίδια που σημαίνονται με χρωστικές VIC, NED και PET ή/και η χρήση τους μπορεί να καλύπτονται από μία ή περισσότερες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Applied Biosystems, LLC. Η τιμή αγοράς αυτού του προϊόντος περιλαμβάνει περιορισμένα, μη μεταβιβάσιμα δικαιώματα βάσει ορισμένων αξιώσεων σε συγκεκριμένες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Applied Biosystems, LLC για χρήση μόνον αυτής της ποσότητας του προϊόντος αποκλειστικά για τις δραστηριότητες του αγοραστή για την ανίχνευση στόχου (ή στόχων) εντός του πεδίου των διαγνωστικών προϊόντων του ανθρώπου. Δεν μεταφέρονται άλλα δικαιώματα. Μπορείτε να λάβετε περισσότερες πληροφορίες για τις άδειες αγοράς που σχετίζονται με τις χρωστικές που αναφέρθηκαν παραπάνω επικοινωνώντας με την Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, HΠA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd. CF2EUGSEL Rev.10/2013 Σελίδα 40 από 40