ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Pseudomonas aeruginosa ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Pseudomonas aeruginosa ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Επιβλέπουσα ΔΙΖΑ- ΜΑΤΑΥΤΣΗ ΕΥΔΟΞΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μέλη Τριμελούς Επιτροπής ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ- ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΞΗΝΤΑΡΗ ΜΑΡΙΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΙΟΥΝΙΟΣ 2010 1

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 PSEUDOMONAS AERUGINOSA 6 Ονοματολόγια 6 Δομικά χαρακτηριστικά και βιοχημικές ιδιότητες 6 Λοιμογόνοι παράγοντες 8 Λοιμώξεις από P. aeruginosa 8 Αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία και αντοχή της P. aeruginosa 9 Βιολογικό Υμένιο και Quorum Sensing System 10 Ανάπτυξη πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa 10 β-λακταμεσ 12 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ β-λακταμων 12 ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 15 ΙΜΙΠΕΝΕΜΗ 15 ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ 16 ΕΡΤΑΠΕΝΕΜΗ 17 ΔΟΡΙΠΕΝΕΜΗ 17 ΑΝΤΟΧΗ ΤΗΣ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 19 ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ 19 Μειωμένη έκφραση ή απώλεια της πορίνης ΟprD 19 Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής 19 ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ 20 Καρμπαπενεμάσες τάξης Α κατά Ambler 21 Καρμπαπενεμάσες τάξης B κατά Ambler (MBLs) 22 Διασπορά των MBLs 23 Μηχανισμός δράσης των MBLs 23 β-λακταμάσες τάξης C κατά Ambler (Κεφαλοσπορινάσες) 24 Καρμπαπενεμάσες τάξης D κατά Ambler 24 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ β-λακταμασων 25 ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ 25 EDTA TEST 25 DOUBLE-DISC SYNERGY TEST 27 ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ 29 ΔΕΙΓΜΑ 31 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 31 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 31 ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 31 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΡΓΑΛΕΙΑ- ΜΕΘΟΔΟΣ 35 3

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 37 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 41 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 42 4

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Pseudomonas aeruginosa είναι ένας ευκαιριακά παθογόνος για τον άνθρωπο μικροοργανισμός, ο οποίος αποτελεί τα τελευταία χρόνια ένα από τα σημαντικότερα αίτια νοσοκομειακών λοιμώξεων. Ο μικροοργανισμός αυτός διαθέτει μηχανισμούς ενδογενούς αντοχής στα αντιβιοτικά ενώ παράλληλα έχει την ικανότητα να αποκτά νέους μηχανισμούς αντοχής μέσω μεταφερόμενων γενετικών στοιχείων. Από τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, οι καρμπαπενέμες με σημαντική αντιψευδομοναδική δράση είναι πολύτιμες για την εμπειρική αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία των λοιμώξεων από P. aeruginosa. Η ανάπτυξη αντοχής στελεχών P. aeruginosa στις καρμπαπενέμες πραγματοποιείται μέσω συνδυασμού μηχανισμών, όπως η ελαττωμένη έκφραση πορινών, η υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής, η υπερπαραγωγή β-λακταμασών τύπου AmpC και η παραγωγή καρμπαπενεμασών η οποία συνήθως οφείλεται στην πρόσληψη πλασμιδίων ή ιντεγκρονίων. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο τον προσδιορισμό της πιθανής παραγωγής καρμπαπενεμασών σε πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa που απομονώθηκαν στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης Ιπποκράτειο. Η επιδημιολογική μελέτη των καρμπαπενεμασών χρησιμεύει στον έλεγχο της εξάπλωσής τους και στη λήψη ορθών θεραπευτικών αποφάσεων σε κλινικό επίπεδο. Με το πέρας της πραγματοποίησης της, νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσά μου κ. Δίζα- Ματαυτσή Ευδοξία για την εμπιστοσύνη προς το πρόσωπό μου και την αμέριστη και διαρκή συμπαράστασή της. Ευχαριστώ επίσης τα μέλη της τριμελούς επιτροπής και το σύνολο των καθηγητών του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» για τη μεταλαμπάδευση ανεκτίμητων γνώσεων στον τομέα της ιατρικής έρευνας, τη σύζυγο και τους γονείς μου καθώς και τους εξαίρετους συναδέλφους Τζαμπάζ Εγκίν, Σιάνου Ευφροσύνη, Πρωτονοταρίου Έφη και Ζαγοριανού Αλεξία για τη συμβολή τους στην ερευνητική διαδικασία. Τέλος οφείλω να ευχαριστήσω τη μεγάλη μου δασκάλα της Μικροβιολογίας, το πρότυπο επαγγελματισμού και διευθύντρια μου στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης κ. Δανάη Σοφιανού για την απόλυτη στήριξή της στην συγκεκριμένη εργασία και σε κάθε ερευνητική μου προσπάθεια. 5

PSEUDOMONAS AERUGINOSA Η P. aeruginosa είναι ένα πανταχού παρόν βακτηρίδιο. Λόγω της ικανότητάς του να χρησιμοποιεί πολλές οργανικές ουσίες ως πηγές C και N και να επιζεί σε ευρύ φάσμα θερμοκρασιών (4-42 o C) αναπτύσσεται στο έδαφος, τις οργανικές ύλες, τα φυτά και το νερό. Στους χώρους του νοσοκομείου δύναται να ανεβρεθεί σε περιοχές με υγρασία όπως νεροχύτες, τουαλέτες, επιφάνειες εργασίας, μηχανήματα αναπνευστικής υποστήριξης, άνθη και τρόφιμα. Είναι επίσης πιθανό να αποικίσει κατακεκλιμένους ή περιπατητικούς ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς καθώς και ένα μικρό ποσοστό φυσιολογικών ατόμων. Ονοματολόγια Η ονομασία Pseudomonas aeruginosa (Ψευδομονάς η πυοκυανική) αντικατοπτρίζει ορισμένα χαρακτηριστικά του μικροοργανισμού. Η λέξη Pseudomonas αποτελείται από τις Pseudo και monas και σημαίνει ψευδής μονάδα. Aeruginosa (ae και rugine) σημαίνουν παλαιά σκουριά και αναφέρονται στην πρασινίζουσα σκουριά του χαλκού με την οποία προσομοιάζεται το πράσινο χρώμα των αποικιών του μικροοργανισμού. Ο χρωματισμός αυτός των αποικιών οφείλεται στη συνδυασμένη παραγωγή των χρωστικών πυοκυανίνη (pyocyanine) και πυοβερδίνη (pyoverdine). Αν και η λατινική λέξη verdine αναφέρεται στο πράσινο, επί απουσίας της πυοκυανίνης, η πυοβερδίνη έχει κίτρινο χρώμα. Επιπλέον, το πύο που παράγεται σε λοίμωξη από P. aeruginosa έχει υποκυανίζουσα χροιά και για το λόγο αυτό ονομάστηκε «βακτήριο του κυανού πύου». Δομικά χαρακτηριστικά και βιοχημικές ιδιότητες Η P. aeruginosa είναι ένα μικρών διαστάσεων (1,5-3 μm μήκος και 0,5 μm πλάτος περίπου) Gram αρνητικό αερόβιο βακτηρίδιο. Το σώμα του είναι ευθύ ή ελαφρώς κεκαμένο, διατάσσεται κατά μόνας ή κατά ζεύγη και κινείται με μία ή περισσότερες πολικές βλεφαρίδες. Ορισμένα στελέχη, συνήθως σε ασθενείς με κυστική ίνωση, διαθέτουν άφθονο πολυσακχαριδικό έλυτρο. Στην επιφάνεια φέρει φίμπριες οι οποίες διευκολύνουν την προσκόλλησή της στα επιθηλιακά κύτταρα του ξενιστή. Η P. aeruginosa είναι αζυμωτικό βακτηρίδιο, δε διασπά δηλαδή κανένα σάκχαρο αναεροβίως. Αεροβίως διασπά τη γλυκόζη όχι όμως και τη γαλακτόζη. Είναι οξειδάση θετικό, καταλάση θετικό, ινδόλη αρνητικό, Methyl Red αρνητικό. Στον Πίνακα 1 αναγράφονται οι ιδιότητες της P. aeruginosa όπως προέκυψαν από τη μελέτη 201 νοσοκομειακών στελεχών 1. 6

Πίνακας 1. Iδιότητες της P. aeruginosa σε δείγμα νοσοκομειακών στελεχών (n=201). Δοκιμασία % of P. aeruginosa strains Οξειδάση 99 Ανάπτυξη σε MacConkey 100 Cetrimide 94 6% NaCl 65 42 o C 100 Αναγωγή νιτρικών 98 Αέριο από νιτρικά 93 Παραγωγή πυοβερδίνης 65 Arginine dihydrolase 100 Lysine decarboxylase 0 Ornithine decarboxylase 0 Υδρόλυση Ουρία 57 Ζελατίνη 82 Ακετυλαμίδιο 100 Εσκουλίνη 0 Starch 0 Παραγωγή οξέως από διάσπαση Γλυκόζης 97 Ξυλόζης 90 Λακτόζης 0 Σουκρόζης 0 Μαλτόζης 0 Μαννιτόλης 70 Simmons citrate 95 7

Λοιμογόνοι παράγοντες Η παθογόνος δράση της P. aeruginosa είναι πολυπαραγοντική καθώς εμπλέκονται σε αυτή δομικά στοιχεία του βακτηρίου, τοξίνες και ένζυμα. Με τις προσκολλητίνες των τριχιδίων επιτυγχάνεται η πρόσδεσή της στα κύτταρα του ξενιστή ενώ το πολυσακχαριδικό έλυτρο, εκτός από τη συμβολή του στην πρόσδεση στα επιθηλιακά κύτταρα και την τραχειοβρογχική βλεννίνη, προστατεύει τον μικροοργανισμό από τη φαγοκυττάρωση και τη δράση των αντιβιοτικών. Ο λιποπολυσακχαριτης (LPS) της εξωτερικής μεμβράνης προκαλεί έντονη ανοσιακή απάντηση στον ξενιστή. Ο LPS αποτελείται από έναν ολιγοσακχαριδικό πυρήνα συνδεδεμένο με επαναλαμβανόμενα σάκχαρα που αποτελούν το αντιγόνο-ο και με το λιπίδιο Α το οποίο έχει ιδιότητες ενδοτοξίνης. Όταν απελευθερωθεί στην κυκλοφορία μετά από λύση του βακτηρίου μπορεί να προκαλέσει πυρετό, διάρροια ακόμη και σηπτική καταπληξία. Ένας από τους σημαντικότερους λοιμογόνους παράγοντες της P. aeruginosa είναι η εξωτοξίνη Α η οποία δρα όπως η διφθεριδική τοξίνη του Corynebacterium diphtheriae, αν και διαφέρει από αυτή δομικά και ανοσολογικά. Η εξωτοξίνη Α αναστέλλει την επιμήκυνση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων στα ευκαρυωτικά κύτταρα διακόπτοντας τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Προκαλεί με το μηχανισμό αυτό βλάβες στους μολυσμένους ιστούς όπως τη νέκρωση των εγκαυμάτων, τις χρόνιες πνευμονικές λοιμώξεις και τη βλάβη του κερατοειδή επί οφθαλμικών λοιμώξεων. Οι εξωτοξίνες S και T που δρουν ως ριβοσυλοτρανσφεράσες του ADP προκαλούν αναδιάταξη της ακτίνης και διευκολύνουν την εισβολή και εξάπλωση του βακτηρίου στους ιστούς. Οι ελαστάσες Las A (πρωτεάση σερίνης) και Las B (μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου) δρουν συνεργητικά επιτυγχάνοντας τη διάσπαση των ιστών που περιέχουν ελαστίνη καθώς και των συστατικών του συμπληρώματος. Επιπλέον, από την παραγωγή αντισωμάτων κατά των Las A και Las B προκαλείται δημιουργία και εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων. Η P. aeruginosa παράγει ακόμη αιμολυσίνες (φωσφολιπάση C, Ραμνολιπίδιο), αλκαλική πρωτεάση, εντεροτοξίνη, εστεράση, DNAση και κοαγκουλάση. Λοιμώξεις από P. aeruginosa Συχνές είναι οι πνευμονικές λοιμώξεις. Η μόλυνση του πνεύμονα από P. aeruginosa δύναται να επιφέρει από απλό αποικισμό ή καλοήθη τραχειοβρογχίτιδα έως βαριά νεκρωτική βρογχοπνευμονία. Ιδιαίτερη κατηγορία συνιστούν οι ασθενείς με κυστική ίνωση στους οποίους η εκρίζωση της P. aeruginosa είναι εξαιρετικά δύσκολη. Άλλοι παράγοντες που ευνοούν την εγκατάσταση της P. aeruginosa στους πνεύμονες νοσηλευόμενων ασθενών είναι η εκτεταμένη χορήγηση αντιβιοτικών και η χρήση μηχανημάτων υποστήριξης της αναπνοής. 8

Συνηθισμένη επίσης θεωρείται η θυλακίτιδα του δέρματος και οι λοιμώξεις των νυχιών μετά από εμβάπτιση σε μολυσμένο νερό. Οι μολύνσεις των εγκαυμάτων από P. aeruginosa παρουσιάζουν μεγάλη επικινδυνότητα καθώς μπορεί να οδηγήσουν μέχρι και σε σήψη. Από τις ωτικές λοιμώξεις, συχνότερη είναι η έξω ωτίτιδα (αυτί του κολυμβητή) παρατηρούνται όμως και η κακοήθης έξω ωτίτιδα σε διαβητικούς ασθενείς καθώς και η χρόνια μέση ωτίτιδα από P. aeruginosa. Οι οφθαλμικές λοιμώξεις αποτελούν συνέπεια τραυματισμού του κερατοειδή και έκθεσης σε μολυσμένο νερό. Τα κερατοειδικά έλκη που προκαλούνται θέτουν σε κίνδυνο την όραση. Για το λόγο αυτό, η θεραπεία η οποία συχνά έχει απογοητευτικά αποτελέσματα, απαιτείται να είναι άμεση και κυρίως αποτελεσματική. Ουρολοιμώξεις από P. aeruginosa εγκαθίστανται κυρίως σε νοσηλευόμενους ασθενείς με χρόνια αντιμικροβιακή αγωγή και σε αυτούς που φέρουν μόνιμους ουροκαθετήρες. Η μικροβιαιμία από P. aeruginosa είναι αδύνατο να διακριθεί κλινικά από αυτές που προκαλούνται από άλλα Gram αρνητικά βακτηρίδια, εμφανίζει όμως υψηλότερη θνητότητα. Το γεγονός αυτό οφείλεται αφενός στην αυξημένη εγγενή λοιμογονικότητα της P. aeruginosa και αφετέρου στην τάση της να προσβάλλει κυρίως τους ήδη ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Άλλες λοιμώξεις που αφορούν την P. aeruginosa είναι οι λοιμώξεις του γαστρεντερικού σωλήνα, του κεντρικού νευρικού συστήματος και η ενδοκαρδίτιδα της τριγλώχινος βαλβίδας σε χρήστες ενδοφλέβιων ναρκωτικών. Αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία και αντοχή της P. aeruginosa Η P. aeruginosa διαθέτει δύο βασικούς μηχανισμούς ενδογενούς αντοχής στα αντιβιοτικά. Εκφράζει μία χρωμοσωμιακή επαγώγιμη AmpC β-λακταμάση η οποία παρέχει αντοχή στην αμπικιλλίνη, την αμοξικιλλίνη, την αμοξικιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ, τις κεφαλοσπορίνες και την κεφτριαξόνη 2. Διαθέτει επίσης αρκετά και σημαντικά συστήματα ενεργητικής εκροής 3. Παρόλα αυτά, αρκετά αντιβιοτικά υπερνικούν τους συγκεκριμένους μηχανισμούς ενδογενούς αντοχής της P. aeruginosa. Σε αυτά ανήκουν οι ευρέως φάσματος πενικιλλίνες (πιπερακιλλίνη και τικαρκιλλίνη), ορισμένες εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες (κεφταζιδίμη και κεφεπίμη), οι καρμπαπενέμες, οι μονομπακτάμες (αζτρεονάμη), οι φθοριοκινολόνες (σιπροφλοξασίνη, λεβοφλοξασίνη), οι αμινογλυκοσίδες (γενταμυκίνη, τομπραμυκίνη, αμικασίνη) και η κολιστίνη. Η ανάπτυξη αντοχής στις συγκεκριμένες κατηγορίες αντιβιοτικών είναι συνέπεια μεταλλάξεων στο γονιδίωμα της P. aeruginosa ή πρόσληψης εξωγενούς γενετικού υλικού με μεταφερόμενα γενετικά στοιχεία, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των μεταφερόμενων β-λακταμασών. Μεταλλάξεις στις τοποϊσομεράσες ΙΙ και IV παρέχουν αντοχή στις κινολόνες 4. Μείωση της διαπερατότητας του κυτταρικού τοιχώματος που οφείλεται σε μεταλλάξεις οδηγεί σε ελαττωμένη είσοδο στο βακτηριακό κύτταρο των καρμπαπενεμών και των αμινογλυκοσιδών. Η μειωμένη διαπερατότητα είναι ένας από τους βασικούς 9

μηχανισμούς ανάπτυξης αντοχής στις αμινογλυκοσίδες 5 μαζί με τη λειτουργία των αντλιών ενεργητικής εκροής 6 και την απενεργοποίηση του φαρμάκου από ένζυμα χρωμοσωμιακής ή πλασμιδιακής προέλευσης 7. Η αντοχή στην κολιστίνη οφείλεται πιθανότατα σε μεταβολές στη δομή της κυτταρικής μεμβράνης. Αν και η αντοχή στο αντιβιοτικό αυτό είναι σπάνια, παρουσιάζει ωστόσο αυξητικές τάσεις τα τελευταία χρόνια ιδίως σε ασθενείς με κυστική ίνωση που λαμβάνουν κολιστίνη σε εισπνεόμενη μορφή 8. Βιολογικό Υμένιο και Quorum Sensing System Η ικανότητα δημιουργίας βιολογικού υμενίου προστατεύει ορισμένα στελέχη P. aeruginosa από τη δράση των ανοσιακών μηχανισμών και των αντιβιοτικών 9. Λοιμώξεις από στελέχη που σχηματίζουν βιολογικό υμένιο είναι εξαιρετικά δύσκολο να εκριζωθούν ειδικά σε ανοσοκατεσταλμένους και ηλικιωμένους ασθενείς καθώς συχνά δεν απαντούν στη θεραπεία με αντιβιοτικά. Διάφοροι μηχανισμοί έχουν προταθεί για το σχηματισμό του βιολογικού υμενίου στην P. aeruginosa. Σημαντικό ρόλο για τη μετάπτωση από την πλαγκτονική μορφή στην έκφραση του φαινοτύπου παραγωγής βιολογικού υμενίου φαίνεται πως παίζει το σύστημα Quorum Sensing 10 το οποίο ελέγχει την έκφραση ορισμένων γονιδίων μέσω διακυτταρικής επικοινωνίας που επιτυγχάνεται με την παραγωγή και έκκριση μορίων μικρού μεγέθους. Εκτός από τη δημιουργία του βιολογικού υμενίου, το Quorum Sensing System ελέγχει την έκφραση και πλήθους άλλων παραγόντων λοιμογονικότητας. Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει στην P. aeruginosa να προσαρμόζεται στις περιβαλλοντικές προκλήσεις καθώς το σύστημα Quorum Sensing αλληλεπιδρά με σήματα του περιβάλλοντος όπως για παράδειγμα την αλλαγή από αερόβιες σε αναερόβιες συνθήκες. Ανάπτυξη πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa Η απομόνωση πολυανθεκτικών (ανθεκτικών σε τρεις ή περισσότερες κατηγορίες αντιβιοτικών) στελεχών P. aeruginosa αποτελεί ένα παγκόσμιο φαινόμενο ανησυχητικών διαστάσεων. Το 2003 αναφέρθηκε σημαντική διαφορά στα ποσοστά εμφάνισης πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa (από 3% έως 50%) μεταξύ των Ευρωπαϊκών χωρών 11. Το 2005 τονίστηκε η ταχεία αύξηση της απομόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών (35%) στη Λατινική Αμερική 12. Η αύξηση του αντίστοιχου ποσοστού στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής ήταν από 4% σε 14% μεταξύ 1993 και 2002. Τα 10

αντιβιοτικά στα οποία παρουσιάστηκαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής την περίοδο εκείνη ήταν η σιπροφλοξασίνη, η ιμιπενέμη, η τομπραμυκίνη και η αζτρεονάμη 13. Θεμελιώδη ρόλο στην ανάπτυξη της πολυανθεκτικότητας φαίνεται πως παίζουν τα συστήματα ενεργητικής εκροής 14 όπως το MexAB-OprM το οποίο εκφράζεται διαρκώς στην P. aeruginosa. Μετάλλαξη του κατασταλτικού γονιδίου mexr οδηγεί σε υπερέκφραση των αντλιών ενεργητικής εκροής με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση των MICs πολλών αντιβιοτικών 15. Τέτοιου είδους μεταλλάξεις συμβαίνουν συχνότερα σε καταστάσεις στις οποίες ευνοείται η ύπαρξη υψηλών βακτηριακών συγκεντρώσεων όπως το εμπύημα, το διαβητικό πόδι και η χρόνια πνευμονική λοίμωξη. Σε μελέτη ασθενών με κυστική ίνωση που είχαν λάβει σιπροφλοξασίνη βρέθηκε ότι το 80% των απομονωθέντων στελεχών παρουσίαζε υπερέκφραση των αντλιών ενεργητικής εκροής 16. Υπερέκφραση των αντλιών αυτών παρατηρήθηκε και με τη χρήση αντισηπτικών 17, ενώ εξαιρετικά ανησυχητική θεωρείται η ανεύρεση μεταφερόμενου πλασμιδίου που φέρει γονίδια ανάπτυξης αντοχής μέσω του ίδιου μηχανισμού σε στελέχη του περιβάλλοντος 18. 11

β-λακταμεσ Τα β-λακταμικά αντιβιοτικά χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός τετραμελούς β-λακταμικού δακτυλίου που περιέχει άζωτο και έχουν την ικανότητα να δρουν στο κυτταρικό τοίχωμα των μικροβίων αναστέλλοντας το σχηματισμό του. Η ιδιότητά αυτή καθώς και η δομή του μορίου τους τα διαχωρίζει από τις άλλες ομάδες αντιμικροβιακών φαρμάκων. Είναι κυρίως βακτηριοκτόνα με χρονοεξαρτώμενη δράση ενώ τα περισσότερα αποβάλλονται αναλλοίωτα στα ούρα και για το λόγο αυτό είναι κατάλληλα για τη θεραπεία εκτός των άλλων και των ουρολοιμώξεων. Οι β-λακτάμες εμφανίζουν υψηλό θεραπευτικό δείκτη. Οι κύριες ανεπιθύμητες ενέργειες τους οφείλονται σε αλλεργικές αντιδράσεις, η πιο συχνή από τις οποίες είναι το ερυθηματώδες κηλιδοβλατιδώδες εξάνθημα με κνησμό. Τα αντιβιοτικά αυτά σπανίως προκαλούν αναφυλαξία ενώ θεωρούνται ασφαλή για χρήση και στην εγκυμοσύνη. ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ β-λακταμων Οι β-λακτάμες περιλαμβάνουν τέσσερις υποκατηγορίες: τις πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες, τις καρμπαπενέμες και τις μονομπακτάμες. Οι πενικιλλίνες αποτελούνται από ένα β-λακταμικό δακτύλιο μαζί με ένα πενταμελή θειαζολιδικό δακτύλιο. 12

Με τροποποίηση της πλευρικής αλυσίδας στη θέση 6 του β-λακταμικού δακτυλίου προκύπτουν διαφορετικές πενικιλλίνες οι οποίες εμφανίζουν ποικίλες αντιβακτηριακές και φαρμακολογικές ιδιότητες. Υπάρχουν τέσσερις κατηγορίες πενικιλινών: οι φυσικές πενικιλλίνες (βένζιλοπενικιλλίνη, η πενικιλλίνη G και φαινόξυμεθυλοπενικιλλινη ή πενικιλλίνη V), οι αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες, οι αμινοπενικιλλίνες και οι αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες (τικαρκιλλίνη, πιπερακιλλίνη). Οι κεφαλοσπορίνες αποτελούνται από ένα β-λακταμικό δακτύλιο και ένα εξαμελή διυδροθειαζονικό δακτύλιο. Οι διαφορετικές κεφαλοσπορίνες προκύπτουν από υποκαταστάσεις πλευρικών αλυσίδων στη θέση 7 του β-λακταμικού δακτυλίου και στη θέση 3 του διυδροθειαζονικού δακτυλίου. Οι κεφαλοσπορίνες διαιρούνται σε πρώτης, δεύτερης, τρίτης και τέταρτης γενεάς με βάση το αντιμικροβιακό τους φάσμα, ενώ πρόσφατα αναπτύχθηκε η κεφτοβιμπρόλη 19 η οποία χαρακτηρίζεται ως κεφαλοσπορίνη πέμπτης γενεάς. Οι μονομπακτάμες αποτελούνται από ένα β-λακταμικό δακτύλιο ενωμένο με μια σουλφονική ομάδα. Ο κύριος εκπρόσωπος της κατηγορίας αυτής είναι η αζτρεονάμη. Αζτρεονάμη 13

Οι καρμπαπενέμες αποτελούνται από ένα β-λακταμικό δακτύλιο και ένα πενεμικό δακτύλιο. 14

ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ Οι καρμπαπενέμες αποτελούν σημαντικούς αντιμικροβιακούς παράγοντες με δράση έναντι πολλών μικροβίων συμπεριλαμβανομένης και της P. aeruginosa. Όπως όλα τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, οι καρμπαπενέμες είναι εκλεκτικοί αναστολείς της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος, οι οποίοι δρουν μέσω της δέσμευσης ειδικών πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης, των πενικιλλοδεσμευτικών πρωτεϊνών (Penicillin Binding Proteins-PBPs). Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες στην κλινική πράξη είναι η ιμιπενέμη, η μεροπενέμη, και πιο πρόσφατα στην Ευρώπη και τη Β. Αμερική, η ερταπενέμη, ενώ από το 2008 εγκρίθηκε από τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων και η δοριπενέμη. Τα αντιβιοτικά αυτά εμφανίζουν αξιοσημείωτη σταθερότητα ενάντια στη δράση των β-λακταμασών, και γενικά έχουν μεγαλύτερο εύρος δράσης συγκριτικά με άλλα β-λακταμικά. ΙΜΙΠΕΝΕΜΗ Η ιμιπενέμη είναι ένα δικυκλικό β-λακταμικό και διακρίνεται από τα άλλα β- λακταμικά για το ευρύ της αντιμικροβιακό φάσμα. Η ιμιπενέμη καταστρέφεται από τη διυδροπεπτιδάση Ι της ψηκτροειδούς παρυφής του σπειράματος των νεφρών, και για το λόγο αυτό χορηγείται σε συνδυασμό με την σιλαστατίνη, που είναι αναστολέας της νεφρικής δευδροπεπτιδάσης Ι και έχει συμβατές φαρμακοκινητικές ιδιότητες με την ιμιπενέμη. Η ιμιπενέμη συνδέεται εκλεκτικά με τις PBPs και το αντιμικροβιακό της φάσμα περιλαμβάνει όλα σχεδόν τα συνήθη Gram θετικά και Gram αρνητικά παθογόνα βακτήρια. Δεν απορροφάται όταν χορηγείται από το στόμα και γι αυτό δίδεται μόνο ενδοφλεβίως ή ενδομυϊκά. Iμιπενέμη Η απορρόφησή της μετά από ΙΜ χορήγηση είναι 60-75% ενώ αυτή της σιλαστατίνης φτάνει το 95-100%. Η ιμιπενέμη συνδέεται με τα λευκώματα σε ποσοστό 20% και η σιλαστατίνη σε ποσοστό 40% 20. Ο χρόνος ημίσειας ζωής και για τις δύο ανέρχεται σε 1 ώρα όταν χορηγείται ενδοφλεβίως και 2-3 ώρες όταν δίδεται ΙΜ. Λόγω του σχετικά βραχέως χρόνου ημίσειας ζωής το φάρμακο πρέπει να χορηγείται ανά 8ωρο ή 6ωρο. Η διάχυση της ιμιπενέμης σε ιστούς και τα βιολογικά υγρά όπως η σίελος, τα πτύελα, το πλευριτικό υγρό, το αρθρικό υγρό και τα οστά είναι ικανοποιητική. Δεν εμφανίζει υψηλά επίπεδα στη χολή, και δεν παρουσιάζει εντερο-ηπατικό κύκλο, γεγονός 15

που εξηγεί γιατί παρά το ευρύ της φάσμα επηρεάζει ελάχιστα την εντερική χλωρίδα. Η δίοδος της στο ΕΝΥ επηρεάζεται κυρίως από την ύπαρξη ή όχι φλεγμονής των μηνίγγων. Αποβάλλεται με σπειραματική διήθηση ενώ ο βαθμός σωληναριακής απέκκρισης είναι πολύ μικρός. ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ Η μεροπενέμη έχει παρόμοιο μηχανισμό δράσεως με την ιμιπενέμη ( σύνδεση με τις PBPs, και κυρίως με τις PBP2), διαφέρει όμως στο ότι είναι ανθεκτική στη διυδροπεπτιδάση Ι του νεφρικού σπειράματος και δε χρειάζεται συγχορήγηση με τη σιλαστατίνη. Επιπλέον εμφανίζει μεγαλύτερη διεισδυτικότητα στο μικροβιακό κύτταρο της P. aeruginosa από την ιμιπενέμη, διότι διέρχεται ταχύτερα μέσω της πορίνης OprD. Η μεροπενέμη είναι πιο δραστική έναντι των Gram αρνητικών μικροοργανισμών συγκριτικά με την ιμιπενέμη, υπολείπεται όμως ως προς τη δραστικότητα έναντι των Gram θετικών κόκκων. Όπως και η ιμιπενέμη, χορηγείται μόνο παρεντερικά, καθώς δεν απορροφάται από το γαστρεντερικό βλεννογόνο. Mεροπενέμη Ο όγκος κατανομής (Vd) σε ενήλικες είναι 0,3 L/Kg και στα παιδιά 0,4-0,5 L/Kg 21. Συνδέεται με πρωτεΐνες του ορού σε ποσοστό 2% και μεταβολίζεται στο ήπαρ σε ανενεργείς μορφές. Ο χρόνος ημίσειας ζωής της μεροπενέμης σε υγιείς ενήλικες είναι 1-1,5 ώρες ενώ χρειάζεται προσαρμογή της δόσεως επί νεφρικής ανεπάρκειας. Με τιμές κάθαρσης κρεατινίνης 30-80 ο χρόνος ημίσειας ζωής είναι 1,9-3,3 ώρες και με τιμές 2-30 φτάνει τις 3,8-5,7 ώρες. Η αποβολή της δεν επηρεάζεται από την ηπατική ανεπάρκεια και δε χρειάζεται προσαρμογή της δόσης σε κιρρωτικούς ασθενεις. Κατά την αιμοκάθαρση αποβάλλεται με επακόλουθο να χρειάζεται χορήγηση μιας δόσεως μετά το πέρας της. Παρουσιάζει καλή διαπερατότητα σε ιστούς και σωματικά υγρά όπως τα οστά, το αρθρικό υγρό, τη χολή το σίελο ενώ διαπερνά τις μήνιγγες και είναι δυνατόν να επιτευχθούν στο ΕΝΥ επίπεδα 1-5 μg/ml. 16

ΕΡΤΑΠΕΝΕΜΗ Η ετραπενέμη είναι μια νεότερη καρβαπενέμη που χαρακτηρίζεται από παρατεταμένο χρόνο ημίσειας ζωής (3,6-4 ώρες) και εξελίχθηκε με σκοπό την εφάπαξ ημερησία χορήγησή της για τη θεραπεία των λοιμώξεων της κοινότητας. Είναι και αυτή ανθεκτική στη δράση της διυδροπεπτιδάσης Ι και μπορεί να χορηγηθεί ενδοφλεβίως ή ενδομυϊκά 22. Είναι πιο αποτελεσματική επί των εντεροβακτηριακών από την ιμιπενέμη και τη μεροπενέμη, όμως δεν είναι ή είναι ελάχιστα δραστική έναντι στελεχών P. aeruginosa και Acinetobacter spp., ευαίσθητων στις άλλες καρμπαπενέμες. Eτραπενέμη Έχει Vd 0,2 L/Kg σε παιδιά 3 μηνών-12 ετών, 0,16 L/Kg σε παιδιά 13-17 ετών και 0,12 L/Kg σε ενήλικες. Συνδέεται με αλβουμίνη σε ποσοστό 85-95%. Αποβάλλεται κατά 80% στα ούρα, κυρίως με σπειραματική διήθηση και κατά 10% στα κόπρανα. Το υπόλοιπο ποσοστό υδρολύεται σε ανενεργούς μεταβολίτες. ΔΟΡΙΠΕΝΕΜΗ Η δοριπενέμη είναι μία ευρέως φάσματος καρμπαπενέμη που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της νοσοκομειακής πνευμονίας, των επιπλεγμένων ενδοκοιλιακών λοιμώξεων και των επιπλεγμένων ουρολοιμώξεων 23. Όπως όλες οι καρμπαπενέμες, είναι και αυτή ενέσιμη και δραστική έναντι πολλών αερόβιων και αναερόβιων Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων, ενώ σε πρόσφατη μελέτη φαίνεται να είναι πιο ισχυρή in vitro έναντι της P. aeruginosa από τις άλλες καρμπαπενέμες 24. Δοριπενέμη 17

Έχει Vd 16,8 L και συνδέεται με τις πρωτεΐνες του ορού σε ποσοστό 8-9%. Ο χρόνος ημίσειας ζωής της είναι 1 ώρα. Απεκκρίνεται 70% αναλλοίωτη στα ούρα και 15% ως δοριπενέμη Μ1 (ανενεργός μεταβολίτης που προκύπτει από τη δράση της διυδροπεπτιδάσης Ι). Στα κόπρανα εμφανίζεται σε ποσοστό <1%. 18

ΑΝΤΟΧΗ ΤΗΣ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ Η ευρεία χρήση των καρμπαπενεμών έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη ανθεκτικών στα αντιβιοτικά αυτά στελεχών P. aeruginosa ανά τον κόσμο. Η αντοχή της P. aeruginosa στις καρμπαπενέμες οφείλεται σε μη ενζυμικούς και σε ενζυμικούς μηχανισμούς. ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Μειωμένη έκφραση ή απώλεια της πορίνης ΟprD Η πορίνη OprD είναι μια πρωτεΐνη της εξωτερικής μεμβράνης (outer membrane protein- OMP), μοριακής μάζας 54 kda, γνωστή και ως D2 πορίνη. Η απώλεια της, που πιθανόν οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου OprD που την κωδικοποιεί, προκαλεί αντοχή στην ιμιπενέμη. Στελέχη με απώλεια της πορίνης OprD παρουσιάζουν μειωμένη επιδεκτικότητα και στη μεροπενέμη, ενώ τα άλλα β-λακταμικά δεν επηρεάζονται. Η μείωση της έκφρασης ή η απώλεια της πορίνης OprD συμβαίνει συχνά κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ιμιπενέμη 25. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής Τα συστήματα αντλιών ενεργητικής εκροής (multidrug efflux systems-mex) αποτελούν έναν εξαιρετικά σημαντικό μηχανισμό ανάπτυξης αντοχής κατά των αντιβιοτικών για την P. aeruginosa. Τα συστήματα MexAB-OprM και MexXY- OprM σε συνδυασμό με τη μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης (ΕΜ) προσφέρουν ενδογενή αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά. Η υπερέκφραση των δυο προαναφερθέντων συστημάτων ως συνέπεια μεταλλάξεων καθώς και η έκφραση τεσσάρων ακόμη, των MexCD-OprJ, MexEF- OprN, MexJK-OprM και MexVW-OprM, παρέχουν επιπλέον επίκτητη αντοχή στην P. aeruginosa. Εκτός από τα αντιβιοτικά, οι αντλίες ενεργητικής εκροής αποβάλλουν από το βακτηριακό κύτταρο χρωστικές, αναστολείς του μεταβολισμού, οργανικούς διαλύτες και μόρια που εμπλέκονται στην επικοινωνία μεταξύ των κυτταρων. Η εκροή αντιβιοτικών αφορά τις κινολόνες, τις αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες, τις αμινογλυκοσίδες και τη μεροπενέμη ενώ η ιμιπενέμη και η κεφταζιδίμη δεν επηρεάζονται. Όταν όμως η υπερέκφραση αντλιών συνυπάρχει με μειωμένη διαπερατότητα της ΕΜ, τότε παρατηρείται αντοχή και στις δύο τελευταίες καρβαπενέμες. Οι αντλίες ενεργητικής εκροής κατατάσσονται σε πέντε κατηγορίες από τις οποίες οι RND (Resistance-nodulation-division) έχουν κλινική σημασία και έχουν περιγραφεί καλύτερα για την P. aeruginosa 26. Τα συστήματα αυτά καταλύουν την εκροή των αντιβιοτικών χρησιμοποιώντας ενέργεια που προέρχεται από την ταυτόχρονη μεταφορά πρωτονίων. Αν και η ακριβής δομή των αντλιών RND δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, εντούτοις θεωρείται ότι αποτελούνται από έναν μεταφορέα πρωτονίων της κυτταρικής μεμβράνης, μια περιπλασματική πρωτεΐνη (Membrane fusion protein-mfp) 19

και μια πρωτεΐνη-δίαυλο της εξωτερικής μεμβράνης, έτσι ώστε να είναι δυνατή η μεταφορά του αντιβιοτικού από το κυτταρόπλασμα στο εξωτερικό του κυττάρου. ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Οι β-λακταμάσες είναι ένζυμα που υδρολύουν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά και αποτελούν τον κυριότερο μηχανισμό ανάπτυξης αντοχής των Gram αρνητικών βακτηρίων. Τα ένζυμα αυτά, κατατάσσονται βάσει δύο χαρακτηριστικών: της μοριακής τους δομής και της λειτουργίας τους. Η κατάταξη με βάση τη μοριακή δομή (κατά Ambler) κατηγοριοποιεί τις β-λακταμάσες στις τάξεις A, C και D, οι οποίες φέρουν σερίνη στο ενεργό τους κέντρο και στις β-λακταμάσες τάξης B οι οποίες έχουν Zn 2+ στο ενεργό τους κέντρο και είναι γνωστές ως μεταλλο-β-λακταμάσες (MBLs). Η λειτουργία των β-λακταμασών καθορίζεται από τα επίπεδα υδρόλυσης που επιτυγχάνουν σε ένα ευρύ φάσμα β-λακταμικών υποστρωμάτων, καθώς και από την επιδεκτικότητα τους στη δράση των αναστολέων των β-λακταμασών. Η λειτουργική κατάταξη (κατά Bush) διαχωρίζει τις β-λακταμάσες σε τέσσερις κατηγορίες (1 έως 4) 27. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι κεφαλοσπορινάσες, των οποίων η δράση δεν αναστέλλεται πλήρως από το κλαβουλανικό οξύ, και στη δεύτερη οι πενικιλλινάσες, οι κεφαλοσπορινάσες και οι ευρέως φάσματος β-λακταμάσες, των οποίων η δράση αναστέλλεται από τους αναστολείς των β-λακταμασών. Τα μεταλλο-ένζυμα αποτελούν την τρίτη κατηγορία της κατάταξης κατά Bush, και υδρολύουν τις πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες και τις καρβαπενέμες και δεν αναστέλλονται παρά ελάχιστα από τους αναστολείς των β-λακταμασών. Στην τέταρτη κατηγορία τέλος, κατατάσσονται κάποιες σπάνιες πενικιλλινάσες οι οποίες δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Αν και όλες οι MBLs υδρολύουν τις καρμπαπενέμες, εν τούτοις ο βαθμός της υδρόλυσης αυτής ποικίλει. Έτσι, η λειτουργική ταξινόμηση επεκτείνεται περεταίρω με βάση την υδρόλυση που επιτυγχάνει το κάθε ένζυμο στις καρμπαπενέμες και σε άλλα β- λακταμικά υποστρώματα. Στην ομάδα 3α ανήκουν οι MBLs με ευρύ φάσμα δράσεως. Στην 3b κατατάσσονται τα ένζυμα που εμφανίζουν δράση κυρίως καρμπαπενεμάσης και στην 3c τα ένζυμα εκείνα που υδρολύουν τις καρμπαπενέμες σε μικρό βαθμό συγκριτικά με τα άλλα β-λακταμικά. Σε μοριακό επίπεδο, διακρίνονται τρεις ακόμη υποκατηγορίες ενζύμων της τάξης Β κατά Ambler. Στην υποτάξη Β1 (ευρύ φάσμα δράσης), η θέση 1 της σύνδεσης Zn 2+ αποτελείται από τρεις ιστιδίνες (His-116, His-118, His-196) και η θέση 2 από His-263, Cys-221 και Asp-120. Οι MBLs που πληρούν αυτά τα κριτήρια είναι οι IMP, VIM, GIM, SPM-1 και SIM-1. Στην υποτάξη Β2 η θέση 2 παραμένει ίδια ενώ στη θέση 1 η His-116 έχει αντικατασταθεί από Asp. Τα ένζυμα αυτά υδρολύουν μόνο τις καρβαπενέμες και δρουν με ένα μόριο Zn 2+. Η σύνδεση και δεύτερου μορίου Zn 2+ έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή δράσης τους. Χαρακτηριστικό ένζυμο της κατηγορίας αυτής είναι το SFH-1 της Serratia fonticola. Στην υποτάξη Β3, η θέση σύνδεσης Zn 2+ 1 είναι όμοια με αυτήν της Β1, ενώ η Cys-221 της θέσης 2 έχει αντικατασταθεί από His. Τα ένζυμα τάξης Β3 υδρολύουν κυρίως κεφαλοσπορίνες και καρβαπενέμες. Το μοναδικό ένζυμο της κατηγορίας είναι το L1 της S. maltophilia. Όπως και οι υπόλοιπες β-λακταμάσες, έτσι και οι MBLs μπορούν να διαχωριστούν σε χρωμοσωμικές και σε πλασμιδιακές. Οι χρωμοσωμικές βρίσκονται 20

συνήθως σε στελέχη του περιβάλλοντος και εικάζεται ότι η αιτία της ύπαρξης τους είναι ότι επιτελούν πιθανότατα κάποια άγνωστη ακόμη φυσιολογική κυτταρική λειτουργία. Οι πρώτες που ανακαλύφθηκαν είναι η BC II του Bacillus cereus 28 και η L1 της S. maltophilia 29. Οι πλασμιδιακές MBLs είναι κλινικά οι πιο σημαντικές και έχουν τη δυνατότητα να μετακινούνται μέσω μεταθετών γενετικών στοιχείων. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους τύπους IMP, VIM και GIM μεταφέρονται με ιντεγκρόνια τάξης 1 ως γονιδιακές κασέτες αν και γονίδια IMP έχουν βρεθεί και σε ιντεγκρόνια τάξης 3. Οι γονιδιακές κασέτες φέρουν και άλλα γονίδια τα οποία παρέχουν αντοχή στις αμινογλυκοσίδες και σε άλλα β-λακταμικά. Για να πραγματοποιηθεί η μεταφορά τους σε έναν άλλο μικροοργανισμό απαιτείται η συνδρομή μεγαλύτερων μεταφερόμενων στοιχείων, όπως τα τρανσποζόνια και τα πλασμίδια. Έτσι, οι περισσότερες MBLs έχουν βρεθεί σε πλασμίδια 120 έως 180 kb. Εξαίρεση σε αυτό φαίνεται να αποτελεί το γονίδιο bla SPM-1, το οποίο μαζί με τα γειτονικά του γονίδια, συνιστούν μία μεταφερόμενη νησίδα παθογονικότητας που βρέθηκε σε ένα πλασμίδιο μεγέθους180 kb περίπου. Οι νησίδες παθογονικότητας αποτελούν διακριτά γενετικά στοιχεία ενός μεγάλου αριθμού παθογόνων, τα οποία κωδικοποιούν λοιμογόνους παράγοντες που απουσιάζουν από τα μη παθογόνα στελέχη του ιδίου ή στενά συγγενικών ειδών και αποκτώνται με οριζόντια γονιδιακή μεταφορά. Καρμπαπενεμάσες τάξης Α κατά Ambler Οι καρμπαπενεμάσες τάξης Α κατά Ambler αναστέλλονται από τους αναστολείς των β-λακταμασών, όπως το κλαβουλανικό οξύ, γεγονός που καθιστά χρήσιμη τη διενέργεια του double-disk synergy test (DDST) κατά την ανίχνευσή τους. GES/IBC (Guiana extended spectrum) / (Integron-borne cefalosporinase) Τα μέλη της οικογένειας β-λακταμασών GES/IBC δεν απαντώνται συχνά. Οι πρώτες αναφορές έγιναν το 2000 για την IBC-1 σε στέλεχος E. cloacae στην Ελλάδα 30 και GES- 1 στη Γαλλική Γουιάνα 31. Για την P. aeruginosa έχουν αναφερθεί η GES-2 στη Νότιο Αφρική και η IBC-2 στην Ελλάδα 32. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα συγκεκριμένα ένζυμα βρίσκονται σε πλασμίδια, ως γονιδιακές κασσέτες σε ιντεγκρόνια τάξης 1. Τα ένζυμα της οικογένειας GES/IBC έχουν πολύ μικρότερη δραστικότητα σε σχέση με τις χρωμοσωμικές β-λακταμάσες τάξης Α. Μπορούν όμως να γίνουν κλινικά σημαντικά σε συνδυασμό με τη μειωμένη διαπερατότητα της ΕΜ και την υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής στην P. aeruginosa. KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) Οι β-λακταμάσες τύπου KPC υδρολύουν σε μεγάλο βαθμό την ιμιπενέμη, και δεν χρειάζονται επιπρόσθετους μηχανισμούς ώστε να προσδώσουν αντοχή στις καρβαπενέμες. Επιπλέον, δεν εμφανίζουν ιδιαίτερη επιρρέπεια στους αναστολείς των β- λακταμασών και είναι μεταφερόμενες μέσω πλασμιδίου. Μέχρι σήμερα έχει γίνει μια μόνο αναφορά στην Κολομβία 33 για την ύπαρξη KPC-2 σε ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη P. aeruginosa, η οποία και αποτελεί τη μοναδική μέχρι σήμερα περίπτωση ανίχνευσης ενός τέτοιου ενζύμου σε αζυμωτικά βακτήρια. 21

Καρμπαπενεμάσες τάξης B κατά Ambler (MBLs). Οι MBLs υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά εκτός από την αζτρεονάμη. Τα γονίδια που τις κωδικοποιούν βρίσκονται στο χρωμόσωμα ή σε πλασμίδια, και μεταφέρονται με ιντεγκρόνια ως γονιδιακές κασέτες. Τα στελέχη που παράγουν MBLs είναι συχνά πολυανθεκτικά, διότι στα ίδια ιντεγκρόνια βρίσκονται γονίδια αντοχής και σε άλλες τάξεις αντιβιοτικών. Οι καρβαπενεμάσες της τάξης Β θεωρούνται κλινικά οι πιο σημαντικές και ταξινομούνται σε πέντε τύπους: IMP, VIM, SPM, GIM και SIM. IMP (active on imipenem) Η IMP-1 ήταν το πρώτο ένζυμο που βρέθηκε να παρέχει επίκτητη αντοχή στις καρμπαπενέμες, και αναφέρθηκε το 1991 στην Ιαπωνία 34. Έκτοτε έχουν βρεθεί και άλλα μέλη της οικογένειας των ενζύμων IMP (IMP-1, -2, -4, -7, -9, -10, -11, -13, -16, -18) που παρέχουν αντοχή στις καρβαπενέμες σε στελέχη P. aeruginosa. Μετά το 2000 παρατηρείται διασπορά IMP αλλά και VIM σε όλες τις ηπείρους 35. VIM (Verona integron-encoded metallo-β-lactamase) Η VIM-1 απομονώθηκε για πρώτη φορά στη Βερόνα της Ιταλίας το 1997 σε στελέχη P. aeruginosa 36. Η οικογένεια των ενζύμων VIM περιλαμβάνει 22 μέλη, εκ των οποίων η VIM-2 φαίνεται να είναι η πιο συχνή παγκοσμίως. Στην Ελλάδα ενδημούν οι VIM-1, -2, -4 και -17 37. SPM-1 (Sao Paolo metallo-β-lactamase) Απομονώθηκε για πρώτη φορά το 2002 στο Σάο Πάολο της Βραζιλίας 38 σε στελέχη P. aeruginosa και έκτοτε προκάλεσε νοσοκομειακές λοιμώξεις με υψηλή θνητότητα στη χώρα αυτή. Μέχρι σήμερα, η SPM-1 δεν έχει βρεθεί σε άλλη γεωγραφική περιοχή εκτός της Βραζιλίας. GIM-1 (German imipenemase) Απομονώθηκε στη Γερμανία 39 το 2002 σε στελέχη P. aeruginosa και εμφανίζει 30% ομολογία με τις VIM, 43% ομολογία με τις IMP και 29% ομολογία με την SPM. Μετά το 2002 δεν υπήρξε άλλη αναφορά παγκοσμίως. SIM-1 (Seoul imipenemase) Πρόκειται για τη νεότερη οικογένεια MBLs, η οποία βρέθηκε στην Κορέα 40 το 2005. Η αναφορά αυτή δεν αφορούσε στελέχη P. aeruginosa, αλλά 7 στελέχη Acinetobacter spp. που παρήγαγαν την SIM-1. 22

Διασπορά των MBLs Μετά το 2000 παρατηρείται διασπορά IMP αλλά και VIM σε όλες τις ηπείρους 41 ενώ η παρουσία της SPM-1 σε στελέχη P. aeruginosa ανθεκτικά στις καρβαπενέμες σε νοσοκομεία της Βραζιλίας άγγιζε το 20%. Η αρχική εξάπλωση των MBLs έγινε πιθανότατα μεταξύ στελεχών P. aeruginosa και επεκτάθηκε αργότερα στα εντεροβακτηριακά. IMP έχουν βρεθεί επιπλέον σε στελέχη Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Achromobacter xylosoxidans, Alcaligenes xylosoxidans, Alcaligenes faecalis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Acinetobacter lwoffi και Shigella flexneri. Ένζυμα της οικογένειας VIM έχουν ανιχνευτεί, εκτός από την P. aeruginosa, και σε Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas stutzeri, Citrobacter freundii και Pseudomonas fluorescens. Μηχανισμός δράσης των MBLs Οι β-λακταμάσες υδρολύουν τον αμιδικό δεσμό C-N του β-λακταμικού δακτυλίου των β-λακταμικών αντιβιοτικών 42. Οι MBLs ειδικότερα, επιτυγχάνουν την υδρόλυση αυτή μέσω του μορίου Zn 2+ που βρίσκεται στο ενεργό τους κέντρο. Ο Zn 2+ προκαλεί πόλωση του αμιδικού δεσμού 43 ο οποίος στη συνέχεια διασπάται με τη βοήθεια ενός ΟΗ που φέρεται συνδεδεμένο με το μόριο του Zn 2+. Το γεγονός ότι ο Zn 2+ είναι απαραίτητος για την ενζυμική τους λειτουργία καθιστά τις ουσίες που δεσμεύουν το μέταλλο αυτό (EDTA και μερκαπτοπροπιονικό οξύ) ιδιαίτερα χρήσιμες στην ανίχνευση των MBLs. Παρά το γεγονός ότι οι MBLs παρουσιάζουν μεταξύ τους ομολογία αμινοξέων μέχρι και λιγότερο από 25%, εντούτοις έχουν όλες κοινή αββα τριτοταγή δομή και η τρισδιάστατη διαμόρφωση του ενεργού τους κέντρου είναι ίδια. Επιπλέον, η πλαστικότητα του ενεργού αυτού κέντρου επιτρέπει τη χρήση πολλών β-λακταμικών ως 23

υποστρώματων και αποτελεί την εξήγηση της ευρύτητας του φάσματος των β- λακταμασών της τάξης Β. Σε αντίθεση με τις β-λακταμάσες σερίνης, δε σχηματίζουν σταθερά παράγωγα ενζύμου-υποστρώματος και δεν αδρανοποιούνται από τη προσθήκη αναστολέων όπως το κλαβουλανικό οξύ και η σουλμπακτάμη. Έτσι, οι MBLs υδρολύουν όλα τα β λακταμικά αντιβιοτικά εκτός από την αζτρεονάμη. β-λακταμάσες τάξης C κατά Ambler (Κεφαλοσπορινάσες) Ο συνδυασμός υπερέκφρασης AmpC κεφαλοσπορινασών με μειωμένη διαπερατότητα ΕΜ και υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής μπορεί να οδηγήσει σε αντοχή στις καρμπαπενέμες 44. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει ότι αρκετές AmpC κατέχουν ενδογενή, αλλά μικρής ισχύος ικανότητα υδρόλυσης των καρμπαπενεμών. Παρ όλα αυτά, οι AmpC δεν θεωρούνται καρμπαπενεμάσες. Καρμπαπενεμάσες τάξης D κατά Ambler Στην τάξη D κατά Ambler ανήκουν οι οξακιλλινάσες, ορισμένες εκ των οποίων παρέχουν κάποιου βαθμού αντοχή στις καρμπαπενέμες. Τα ένζυμα αυτά συνδράμουν στην ανάπτυξη αντοχής στις καρμπαπενέμες, σε συνδυασμό με άλλους μηχανισμούς (μειωμένη διαπερατότητα και/ή ενεργητική εκροή). Η μόνη ΟΧΑ β-λακταμάση που παράγεται από την P. aeruginosa είναι η ΟΧΑ-40. 24

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ β-λακταμασων Η ανίχνευση των β-λακταμασών αποτελεί σημαντικό βήμα στην πρόληψη της περεταίρω εξάπλωσής τους. Για το σκοπό αυτό εφαρμόζονται φαινοτυπικές δοκιμασίες της κλινικής μικροβιολογίας (EDTA test και DDST) και στη συνέχεια ακολουθεί η διερεύνηση τους με μοριακές τεχνικές (PCR και αλληλούχηση νουκλεοτιδίων). ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ EDTA TEST: Το EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) είναι ένα πολυάμινοκαρβοξυλικό οξύ, άχρωμο και διαλυτό στο νερό του οποίου η χρησιμότητα έγκειται στην ιδιότητά του να δεσμεύει ιόντα μετάλλων. EDTA Χάρη στην ιδιότητα αυτή, το EDTA χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς όπως η βιομηχανία, η γεωργία και η ιατρική. Στη μοριακή βιολογία και τη βιοχημεία βρίσκει εφαρμογή στην απενεργοποίηση μεταλλο-ενζύμων όπως οι MBLs δεσμεύοντας το απαραίτητο για τη λειτουργία τους μέταλλο. 25

Για τη διενέργεια του EDTA test προετοιμάζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού (0.5 McFarland) και απλώνεται σε Mueller-Hinton άγαρ με τη χρήση αποστειρωμένου βαμβακοφόρου στειλεού. Στο τρυβλίο τοποθετούνται ένας δίσκος ιμιπενέμης και ένας δίσκος κεφταζιδίμης. Πάνω και κάτω από τους δίσκους των αντιβιοτικών τοποθετούνται δίσκοι από διηθητικό χαρτί εμβαπτισμένοι σε διάλυμα EDTA. Το τρυβλίο επωάζεται για 24 ώρες σε θερμοκρασία 37 o C οπότε και ακολουθεί η αξιολόγηση του τεστ. Θετικό θεωρείται το τεστ όταν γύρω από τους δίσκους των αντιβιοτικών σχηματιστεί άλως αναστολής δίκην κλειδαρότρυπας εξ αιτίας της απενεργοποίησης της MBL από το EDTA. Στην Εικόνα 1 φαίνεται ένα αρνητικό τεστ EDTA και στις Εικόνες 2, 3 και 4 φαίνονται θετικά τεστ EDTA. Εικόνα 1. EDTA (-) Εικόνα 2. EDTA (+) Εικόνα 3. EDTA (+) Εικόνα 4. EDTA (+) 26

DOUBLE-DISC SYNERGY TEST: Για την φαινοτυπική διερεύνηση της παραγωγής β-λακταμασών των οποίων η δράση αναστέλλεται από το κλαβουλανικό οξύ και κυρίως των ευρέως φάσματος β-λακταμασών (ESBLs- Extended Spectrum Beta Lactamases) χρησιμοποιείται το Double-Disk Synergy Test (DDST). Για τη διενέργεια του DDST προετοιμάζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού (0.5 McFarland) και απλώνεται σε Mueller-Hinton άγαρ με τη χρήση αποστειρωμένου βαμβακοφόρου στειλεού. Στο κέντρο του τριβλίου τοποθετείται ένας δίσκος augmentin (20 μg amoxycillin + 10 μg CLA) και περιφερικά τοποθετούνται δίσκοι κεφταζιδίμης, ιμιπενέμης, κεφτριαξόνης, κεφοταξίμης, αζτρεονάμης και κεφεπίμης. Το τρυβλίο επωάζεται για 24 ώρες σε θερμοκρασία 37 o C πριν από την αξιολόγηση του τεστ. Θετικό θεωρείται το τεστ όταν η άλως αναστολής γύρω από κάποιον από τους δίσκους των αντιβιοτικών εμφανίσει ξεκάθαρη αύξηση προς τον δίσκο του augmentin. Στις Εικόνες 5 και 6 φαίνονται αρνητικά τεστ DDST και στις Εικόνες 7 και 8 φαίνονται θετικά τεστ DDST. Εικόνα 5. DDST (-) Εικόνα 6. DDST (-) 27

Εικόνα 7. DDST (+) Εικόνα 8. DDST (+) 28

ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR), είναι μια σύγχρονη μέθοδος για τη δημιουργία αντιγράφων συγκεκριμένων τμημάτων DNA, σε αριθμό ώστε αυτά να είναι ανιχνεύσιμα. Η PCR είναι μία μοριακή τεχνική σχετικά εύκολη στην εκτέλεσή της η οποία προσφέρει ειδικότητα για κάθε ενζυμική οικογένεια. Επιπλέον, με την PCR είναι δυνατή η επεξεργασία πολλών δειγμάτων ταυτόχρονα. Απαιτεί βέβαια τη γνώση και την κατοχή των κατάλληλων εκκινητών (primers) για κάθε προς ανίχνευση ένζυμο, ενώ δεν είναι σε θέση να διακρίνει επαρκώς τα ξεχωριστά ένζυμα της κάθε οικογένειας, καθώς και τα νέα ένζυμα που ενδεχομένως να υπάρχουν σε κάποιο στέλεχος. Για το λόγο αυτό, συχνά η PCR δεν αρκεί για να ολοκληρωθεί η ανίχνευση και σε ορισμένες περιπτώσεις, χρειάζεται να γίνει επιπλέον και αλληλούχηση νουκλεοτιδίων. Αρχικά γίνεται απομόνωση του γενετικού υλικού από τα βακτηριακά στελέχη και προετοιμάζεται το διάλυμα που περιέχει το υπό εξέταση δείγμα, την Taq πολυμεράση, νουκλεοτίδια, ιόντα μαγνησίου και τους εκκινητές. Στον πίνακα 2 αναγράφονται μερικοί από τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των MBLs 45. Ακολουθεί ενίσχυση του γονιδίου που κωδικοποιεί την προς διερεύνηση MBL σε θερμικό κυκλοποιητή. Η διαδικασία αυτή ακολουθεί τα εξής στάδια: Στο πρώτο στάδιο, ενεργοποιείται η Taq πολυμεράση με αύξηση της θερμοκρασίας στους 94 96 C για 1-9 λεπτά, και αρχίζουν οι κύκλοι της PCR, αρχικά με το πρώτο στάδιο της αποδιάταξης (denaturation) της διπλής έλικας του DNA (94-98 C για 20-40 δευτερόλεπτα). Κατά το δεύτερο στάδιο η θερμοκρασία μειώνεται στους 50 65 C για 20-40 δευτερόλεπτα, και πραγματοποιείται η υβριδοποίηση (annealing) των εκκινητών στις μονές πλέον αλυσίδες του DNA. Η θερμοκρασία υβριδοποίησης (annealing temperature, Ta) είναι κατά 5 C χαμηλότερη από τη θερμοκρασία αποδιάταξης των εκκινητών (melting temperature, Tm) που χρησιμοποιούνται. Κατά το τρίτο στάδιο της επιμήκυνσης (elongation), (70-75 C για 0,5-3 λεπτά), η Taq πολυμεράση συνθέτει συμπληρωματικές αλυσίδες, χρησιμοποιώντας ως μήτρα τις μονές αλύσους του DNA που προέκυψαν κατά το στάδιο της αποδιάταξης, και ξεκινώντας από τους εκκινητές που υβριδίστηκαν στο αμέσως προηγούμενο στάδιο. Τα στάδια της αποδιάταξης, υβριδοποίησης και επιμήκυνσης συνιστούν ένα κύκλο της αντίδρασης. Μετά από ν παρόμοιους κύκλους προκύπτουν 2 ν αντίγραφα του προς ανίχνευση τμήματος του DNA του βακτηρίου. Το τελικό στάδιο πραγματοποιείται στους 70-74 C για 5-15 λεπτά και αποσκοπεί στην πλήρη επιμήκυνση όλων των υπολειπόμενων μονών αλυσίδων. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε γέλη αγαρόζης με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου. Η οπτικοποίηση του αποτελέσματος γίνεται σε θάλαμο ακτινών UV όπου οι ζώνες που προκύπτουν από την ηλεκτροφόρηση, καθίστανται ορατές χάρη στην παρουσία του βρωμιούχου αιθιδίου. 29

Πίνακας 2. Εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των MBLs. Primers Γονίδιο στόχος Αλληλουχία DNA Θέση Accession no. IMP-1F blaimp 5 -CTACCGCAGCAGAGTCTTTG-3 47 66 AB010417 IMP-1R blaimp 5 -AACCAGTTTTGCCTTACCAT-3 633 614 AB010417 IMP-1SQF blaipm-1 5 -ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC-3 49 68 AB010417 IMP-1SQR blaipm-1 5 -ACAACCAGTTTTGCCTTACC-3 635 616 AB010417 IPM-2F blaimp 5 -GTGTATGCTTCCTTTGTAGC-3 23 42 AB182996 IPM-2R blaimp 5 -CAATCAGATAGGCGTCAGTGT-3 196 176 AB182996 IMP-2Fnew blaimp 5 -GTT TTA TGT GTA TGC TTC C-3 16 34 AB182996 IMP-2Rnew blaimp 5 -TTCAAGAGTGATGCGTCCCCA-3 674 654 AB182996 VIM-F blavim 5 -AAAGTTATGCCGCACTCACC-3 1831 1850 AJ586617 VIM-R blavim 5 -TGCAACTTCATGTTATGCCG-3 2695 2676 AJ586617 VIM-F359 blavim 5 -TCGGCGGCGTTGATGTCC-3 339 359 AJ586617 VIM-R660 blavim 5 -GGGCCATTCAGCCAGATCG-3 640 660 AJ586617 VIM-2SQF blavim 5 -ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3 1 21 AJ586617 VIM-2SQR blavim 5 -CTACTCAACGACTGAGCG-3 801 781 AJ586617 VIM-F152 blavim 5 -ATGGTGTTTGGTCGCATATC-3 152 171 AJ586617 VIM-R660 blavim 5 -GGGCCATTCAGCCAGATCG-3 660 642 AJ586617 SPM-1F blaspm 5 -CCTACAATCTAACGGCGACC-3 121 140 AJ492820 SPM-1R blaspm 5 -TCGCCGTGTCCAGGTATAA-3 769 750 AJ492820 SIM-1F blasim 5 -TACAAGGGATTCGGCATCG-3 127 145 EF12010 SIM-1R blasim 5 -TAATGGCCTGTTCCCATGTG-3 697 678 EF12010 GIM-1F blagim-1 5 -ATGGGTTGGTAGTTCTGGATA-3 1192 1212 AJ620678 GIM-1R blagim-1 5 -ACTCATGACTCCTCACGAGG-3 1584 1565 AJ620678 30

ΔΕΙΓΜΑ Το δείγμα αποτέλεσαν 40 στελέχη P. aeruginosa που απομονώθηκαν στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης από 26/04/09 έως 27/11/09. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν ήταν πολυανθεκτικά και ανθεκτικά στις καρμπαπενέμες. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Τα στελέχη απομονώθηκαν από καλλιέργειες διαφόρων υλικών που προέρχονταν από διαφορετικά τμήματα του Νοσοκομείου. Πιο συγκεκριμένα, τα στελέχη του δείγματος προέρχονται από: 14 καλλιέργειες ούρων, 6 αιμοκαλλιέργειες, 5 καλλιέργειες βρογχικών εκκρίσεων, 4 καλλιέργειες υλικού τραύματος, 3 καλλιέργειες πτυέλων εκ των οποίων οι 2 από ασθενείς με κυστική ίνωση, 2 καλλιέργειες βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL), 1 καλλιέργεια υλικού αναρροφήσεως πυώδους συλλογής, 1 καλλιέργεια εγκεφαλονωτιαίου υγρού, 1 καλλιέργεια φαρυγγικού επιχρίσματος, 1 καλλιέργεια κεντρικού φλεβικού καθετήρα, 1 καλλιέργεια υλικού εξελκώσεων και 1 καλλιέργεια οστεοσύνθεσης (Πίνακας 3). ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Ο έλεγχος της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά όπως προέκυψε από το VITEK2 System (biomerieύx France) φαίνεται στον Πίνακα 4. Όλα τα στελέχη του δείγματος ήταν ανθεκτικά στην ιμιπενέμη, τη μεροπενέμη, τη μινοκυκλίνη και το συνδυασμό τριμεθοπίμης-σουλφομεθοξαζόλης. Από το σύνολο των στελεχών 2,5% ήταν ευαίσθητα στην αζτρεονάμη, 5,2% στην τικαρκιλλίνη και το συνδυασμό τικαρκιλλίνης-κλαβουλανικού οξέως, 7,5% στην ισεπαμυκίνη, 7,7% στην πεφλοξακίνη, 10% στη σιπροφλοξασίνη, 12,5% στην κεφταζιδίμη, 12,5% στην κεφεπίμη, 12,5% στην τομπραμυκίνη, 20% στην αμπικιλλίνη, 30% στη γενταμυκίνη, 49,9% στην πιπερακιλλίνη, 68,4% στην πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη και 95% στην κολιστίνη (Πίνακας 5). 31

Πίνακας 3. Καλλιέργειες από τις οποίες απομονώθηκαν τα στελέχη του δείγματος. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΡΙΘΜΟΣ Ούρων 14 Αίματος 6 Βρογχικών εκκρίσεων 5 Υλικού τραύματος 4 Πτυέλων 3 BAL 2 Αναρροφήσεως πυώδους συλλογής 1 ΕΝΥ 1 Φαρυγγικού επιχρίσματος 1 Κεντρικού φλεβικού καθετήρα 1 Εξελκώσεων 1 Οστεοσύνθεσης 1 ΣΥΝΟΛΟ 40 32

Πίνακας 4. Ευαισθησία των στελεχών του δείγματος στα αντιβιοτικά. No ID A M A Z T C E F C E F T C I P C O L G E N I M P 1 D955 R I I I R S I R R R R - - - - - S R 2 A2665 R I I R R S I R R I R R S S R R R R 3 D1070 S R S S I R R R R R R R R S S S R R 4 A2731 R I R R R S S R R R R R R S R R R R 5 D1045 R R R R S S I R R R R R S S R R S R 6 D1123 R I I R R S S R R R R R S S R R R R 7 D1134 R I I R R S I R R R R R R S R R R R 8 D1121 R I R R R S S R R R R R S S R R R R 9 B3643 R I R R R S S R R R R R R S R R R R D1149 10 R I I R R S S R R R R R S S R R R R C1242 11 S I S I R S S R R R R R S S R R R R B3970 12 R R R R R S R R R R R R R S R R R R D1389 13 S R R R R S R I R R R R R S R R R R C1421 14 R I I I R S I R R R R R S S R R R R D1371 15 S R I R R S I R R R R R R R R R S R C1419 16 R R R I R S R R R R R R R R R R R R D1478 17 S R R R R S I R S R R R R R R R I R A3745 18 S R R R R S S R S R R R R R R R I R B4967 19 S R R R R S R I R R R R R S R R R R B5148 20 R I I I R S I R R R R R S S R R R R D1550 21 R I I R R S R R R R R - - - - - S R C2063 22 R I R R S S R R R R R S R R R R R R D1957 23 R - I R R S S R R R R R S S R R R R C2395 24 R I I R R S I R R I R R S S R R R R B6758 25 R I I R R S S R R R R R S S R R R R A5779 26 R I S S S R R I R R R S R R R R R R C2767 27 R I I I R S I R R R R R S S R R R R B8373 28 R R R R R S R R R R R R R R R R R R C3286 29 R I I I R S I R R R R R S S R R R R C3318 30 R R R R R S R I R R R R R R R R R R A7568 31 R I R S R S R R R R R R R R R R R R A7527 32 R I I R R S I R R R R R S S R R R R B11090 33 R I I R R S I R R I R R S S R R R R B11107 34 R R R R R S R R R R R R R R R R R R B11119 35 R I I S R S R R R R R R R R R R R R B10975 36 R I I I R S I R R R R R S S R R R R B11190 37 S S S S S S S R S R R S S S S S S R B11317 38 R R S I R S S R R R R R R R R R R R B12134 39 R I I I R S S R R R R R S S R R R R A10043 40 R I I I R S I R R R R R S S R R R R I S E M E R M I N P E F P I P P I P T Z T I C T I C C L T O B TR IM SU LF 33

Πίνακας 5. Ποσοστά ευαίσθητων στελεχών του δείγματος στα αντιβιοτικά. ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟ ΠΟΣΟΣΤΟ ΕΥΑΙΣΘΗΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Ιμιπενέμη 0% Μεροπενέμη 0% Μινοκυκλίνη 0% Τριμεθοπίμη-Σουλφομεθοξαζόλη 0% Αζτρεονάμη 2,5% Τικαρκιλλίνη 5,2% Τικαρκιλλίνη-Κλαβουλανικό οξύ 5,2% Ισεπαμυκίνη 7,5% Πεφλοξακίνη 7,7% Σιπροφλοξασίνη 10% Κεφταζιδίμη 12,5% Κεφεπίμη 12,5% Τομπραμυκίνη 12,5% Αμπικιλλίνη 20% Γενταμυκίνη 30% Πιπερακιλλίνη 49,9% Πιπερακιλλίνη-Ταζομπακτάμη 68,4% Κολιστίνη 95% 34

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΡΓΑΛΕΙΑ- ΜΕΘΟΔΟΣ Για την καλλιέργεια των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν στερεά θρεπτικά υλικά (McConkey agar και αιματούχο agar). Η τυποποίηση του μικροοργανισμού και ο έλεγχος της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά έγινε με το VITEK2 System (biomerieύx France). Η αντοχή των στελεχών στην ιμιπενέμη επιβεβαιώθηκε και με τη μέθοδο Kirby-Βauer. Στο χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από την απομόνωση του μικροοργανισμού έως τη διενέργεια PCR τα στελέχη συντηρήθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (-70 ο C). Για την φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής μέταλλο-β-λακταμασών πραγματοποιήθηκε σε όλα τα στελέχη το EDTA test. Τα στελέχη με EDTA test (+) θεωρήθηκε ότι πιθανώς παράγουν MBLs και ελέγχθηκαν με PCR αρχικά για το γονίδιο VIM-1 και στη συνέχεια για το VIM-2. Στα στελέχη με EDTA (-) πραγματοποιήθηκε DDST σε Muller Hinton άγαρ με ενσωματωμένη κλοξακιλλίνη (200μg cloxacillin/1ml) ώστε να ανασταλεί η δράση της χρωμοσωμιακής AmpC β-λακταμάσης 46. Οι συνθήκες των PCRs που πραγματοποιήθηκαν ήταν οι εξής: 1. PCR conditions VIM-1 94 o C X 3 min 94 o C X 1 min 55 o C X 1 min 72 o C X 2 min 72 o C X 7 min 35 cycles 2. PCR conditions VIM-2 94 o C X 5 min 94 o C X 40 sec 60 o C X 40 sec 72 o C X 70 sec 72 o C X 5 min 35 cycles 35

3. PCR conditions KPC 95 o C X 5 min 94 o C X 45 sec 53 o C X 45 sec 72 o C X 1 min 72 o C X 10 min 35 cycles Τα προϊόντα της PCR που διενεργήθηκε χρησιμοποιώντας τους primers VIM-2 στάλθηκαν στη Macrogen Inc Κορέας όπου και έγινε αλληλούχιση. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης συγκρίθηκαν με την κατατεθειμένη στη Genebank αλληλουχία του γονιδίου VIM-2. Για τη σύγκριση αυτή χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πακέτο BioEdit. Η κλωνική συγγένεια μεταξύ των στελεχών που έφεραν το γονίδιο VIM-2 ελέγχθηκε με τη διενέργεια ERIC PCR 47,48. 36