ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ - ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Γενικά Η χρωµατογραφία είναι µια από τις σηµαντικότερες τεχνικές διαχωρισµού και µέθοδος ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης, που βρίσκει εφαρµογές σε πολλούς επιστηµονικούς κλάδους. Στηρίζεται στο διαχωρισµό, µε βάση τις διαφορετικές κατανοµές των συστατικών ενός µίγµατος µεταξύ δυο φάσεων. Η µία παραµένει σταθερή και ονοµάζεται στατική φάση, και η άλλη διέρχεται µέσα ή πάνω από την επιφάνεια της στατικής φάσης, και ονοµάζεται κινητή φάση. Η τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) αποτελεί επέκταση της κλασσικής υγρής χρωµατογραφίας µε βαρυτική ροή. Η κύρια διαφορά τους είναι, ότι η πρώτη χρησιµοποιεί ως πληρωτικό υλικό σωµατίδια µεγέθους µερικών µικροµέτρων µε αποτέλεσµα να είναι απαραίτητη η εφαρµογή µεγάλης πίεσης για να εξασφαλισθεί η επιθυµητή ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Το σηµαντικότερο πλεονέκτηµα είναι ότι οι HPLC στήλες έχουν αισθητά βελτιωµένες αποδόσεις σε σχέση µε αυτές της κλασσικής υγρής χρωµατογραφίας. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 4 η ιαχωρισµός και ποσοτικός προσδιορισµός των δραστικών συστατικών του δισκίου «Excedrin». Προαπαιτούµενες γνώσεις Είδη υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης, χρωµατογραφία κατανοµής, υλικά πλήρωσης στήλης, χρόνος κατακράτησης, παράγοντας κατακράτησης, παράγοντας εκλεκτικότητας, διαχωριστική ικανότητα, µέθοδοι ανίχνευσης, χαρακτηριστικά ιδανικού ανιχνευτή. Στόχος του πειράµατος Εξοικείωση µε το σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης και ποσοτική ανάλυση των συστατικών του φαρµακευτικού σκευάσµατος «Excedrin». 1
Μεθοδολογία Ένα δισκίο Excedrin περιέχει ακετυλοσαλικυλικό οξύ (250mg), παρακεταµόλη (250mg) και καφείνη (65mg) σαν δραστικά συστατικά και έναν αριθµό εκδόχων. Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ και η παρακεταµόλη διαλύονται λίγο στο νερό, διαλύονται όµως ευκολότερα σε οργανικούς διαλύτες όπως η µεθανόλη. Η καφείνη διαλύεται στο νερό ενώ η διαλυτότητα της αυξάνεται παρουσία βενζοικών αλκαλίων. Σχήµα Β-1: οµή του ακετυλοσαλικυλικού οξέος O H 3 C C NH OH Σχήµα Β-2: οµή της παρακεταµόλης Σχήµα Β-3: οµή της καφείνης Μια ποσότητα κονιοποιηµένου δισκίου Excedrin αιωρείται σε µίγµα µεθανόλης και οξικού οξέος µε αναλογία 95:5 ώστε να διαλυθούν τα δραστικά συστατικά και να περάσουν στην υγρή φάση. Μετά τη διήθηση, το διάλυµα ενίεται σε χρωµατογραφική στήλη και τα συστατικά διαχωρίζονται. Τυπικό χρωµατογράφηµα για το σύστηµα ακετυλοσαλικυλικού οξέος - 2
παρακεταµόλης καφείνης φαίνεται στο σχήµα Β-4. Παρασκευάζονται πρότυπα διαλύµατα ακετυλοσαλικυλικού οξέος -παρακεταµόλης-καφείνης στον ίδιο διαλύτη, εκλούονται στην ίδια στήλη µε τις ίδιες παραµέτρους και κατασκευάζονται καµπύλες βαθµονόµησης βάσει των οποίων ποσοτικοποιείται το διάλυµα του σκευάσµατος. Intensity (a.u.) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 4,2 παρακεταµόλη 8,4 καφεϊνη 12,4 ακετυλοσαλικυλικό οξύ 0.1 0.0-0.1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 time(min) Σχήµα Β-4: Χρωµατογραφικός διαχωρισµός µίγµατος ακετυλοσαλικυλικού οξέος - παρακεταµόλης - καφείνης µε στήλη αντιστρόφου φάσης C 18. Η ανίχνευση πραγµατοποιείται µε ανιχνευτή υπεριώδους. Απαιτούµενος Εξοπλισµός Σύστηµα Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης (βλ. προσάρτηµα ΙΙ-1) Προστήλη αντίστροφης φάσης C 18 (20mm, 4mm) Χρωµατογραφική στήλη αντίστροφης φάσης C 18 (250mm, 4mm, 5µm) Σύστηµα διήθησης Millipore µε φίλτρο µεµβράνης 0.45 µm Μαγνητικός αναδευτήρας Σύστηµα απαέρωσης µέσω κενού 3
Αναλυτικός ζυγός Γουδί µε ύπερο Μαγνητικός αναδευτήρας Μαγνητική µπάρα Κωνικές φιάλες, ποτήρια ζέσεως, γυάλινα χωνιά Ογκοµετρικοί κύλινδροι, σπάτουλες, σκαφίδια ζύγισης Φίλτρα διήθησης Υπερκαθαρό νερό ισκία Excedrin Μεθανόλη Οξικό οξύ Καφείνη Παρακεταµόλη Ακετυλοσαλικυλικό οξύ Πειραµατική διαδικασία 1. Κινητή φάση: Παρασκευάστε µίγµα νερού µεθανόλης οξικού οξέος σε αναλογία 69:28:3. ιηθείστε. Μεταφέρετε το µίγµα στην ειδική γυάλινη φιάλη του χρωµατογράφου. Απαερώστε υπό κενό και υπό ανάδευση. Τοποθετείστε το απαερωµένο διάλυµα στο σύστηµα του χρωµατογράφου και εξισορροπείστε τη στήλη. 2. ιαλύτης: Παρασκευάστε µίγµα µεθανόλης οξικού οξέος σε αναλογία 95:5. ιηθείστε. 3. Πρότυπα διαλύµατα παρακαταθήκης (standard stock solutions): ιαλύστε προσεκτικά ζυγισµένες ποσότητες ακετυλοσαλικυλικού οξέος, παρακεταµόλης και καφείνης στον διαλύτη ώστε να παρασκευάσετε τρία διαλύµατα µε συγκεντρώσεις 0.75 mg ml -1 σε ακετυλοσαλικυλικό οξύ, 0.75 mg ml -1 σε παρακεταµόλη και 0.2 mg ml -1 σε καφείνη αντίστοιχα. ιηθείστε. 4. Πρότυπα διαλύµατα εργασίας (standard solutions): Παρασκευάστε, µε κατάλληλες αραιώσεις από τα πρότυπα διαλύµατα παρακαταθήκης, πολυπρότυπα διαλύµατα τα οποία περιλαµβάνουν και τις τρεις αναλυόµενες ουσίες σε περιοχή συγκεντρώσεων 0.1-0.5 mg ml -1 σε ακετυλοσαλικυλικό οξύ, 0.1-0.5 mg ml -1 σε παρακεταµόλη και 0.02-0.15 mg ml -1 σε καφείνη αντίστοιχα. 4
5. είγµα προς µελέτη: Ζυγίστε στον αναλυτικό ζυγό 1 δισκίο «Excedrin» και καταγράψτε το βάρος του. Κονιοποιείστε το στο γουδί. Μεταφέρετε 20 mg από το κονιοποιηµένο δισκίο σε µια ογκοµετρική φιάλη των 20ml που περιέχει περίπου 10ml διαλύτη. Ανακινείστε µέχρι διαλύσεως του στερεού. Προσθέστε διαλύτη µέχρι τη χαραγή και οµογενοποιείστε. ιηθείστε. 6. ιαδικασία: Εγχύστε στο χρωµατογράφο µε τη βοήθεια µικροσύριγγας ίσες ποσότητες (περίπου 60µl) από καθένα από τα πολυπρότυπα καθώς και από το προς ανάλυση δείγµα. Για κάθε έγχυση καταγράψτε το αντίστοιχο χρωµατογράφηµα (βλ. διαδικασία αναλύσεως, προσάρτηµα ΙΙ-2). Επαναλάβετε τη διαδικασία ακόµη µια φορά για κάθε διάλυµα. Σηµείωση: Κάθε εργαστηριακή οµάδα, κατά τη διεξαγωγή της άσκησης, θα πρέπει να έχει µαζί της ένα flash disk για την αποθήκευση των δεδοµένων. Επεξεργασία απoτελεσµάτωv 1. Μετρείστε το ύψος (ή το εµβαδόν) των κορυφών του ακετυλοσαλικού οξέος, της παρακεταµόλης και της καφείνης σε καθένα από τα χρωµατογραφήµατα των πολυπρότυπων διαλυµάτων και κατασκευάστε καµπύλη βαθµονόµησης για κάθε ουσία. 2. Οµοίως µετρείστε το ύψος (ή το εµβαδόν) των κορυφών για τα χρωµατογραφήµατα του σκευάσµατος. Με τη βοήθεια των καµπυλών βαθµονόµησης βρείτε την άγνωστη συγκέντρωση των δύο δραστικών συστατικών. Ανάγετε στο σκεύασµα. 3. Υπολογίστε τη τυπική απόκλιση για τη συγκέντρωση του αγνώστου που υπολογίζεται από την καµπύλη βαθµονόµησης. 4. Συγκρίνετε τη σύσταση του δισκίου που βρήκατε µε την αναγραφόµενη σύσταση στη συσκευασία (σχετικό σφάλµα). 5