FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Podoplanin Clone D2-40 Ready-to-Use (Link) Κωδικός IR072 Προοριζόµενη χρήση Περίληψη και επεξήγηση Αντιδραστήριο που παρέχεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το αντίσωµα FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Podoplanin, Clone D2-40, Ready-to-Use (Link), προορίζεται για ανοσοϊστοχηµική χρήση σε συνδυασµό µε τα όργανα Autostainer Link. Το αντίσωµα αυτό επισηµαίνει το δείκτη του λεµφικού ενδοθηλίου ποδοπλανίνη σε φυσιολογικούς και νεοπλαστικούς ιστούς. Το αντίσωµα µπορεί να είναι χρήσιµο στην αναγνώριση της λεµφικής διήθησης µιας σειράς καρκίνων (1, 2). Η κλινική ερµηνεία της χρώσης ή της απουσίας χρώσης πρέπει να συµπληρώνεται µε µορφολογικές µελέτες που χρησιµοποιούν κατάλληλους µάρτυρες και πρέπει να αξιολογούνται στο πλαίσιο του κλινικού ιστορικού του ασθενούς και άλλων διαγνωστικών εξετάσεων από ειδικό παθολόγο. Η ποδοπλανίνη είναι µια διαµεµβρανική σιελογλυκοπρωτεΐνη ~38 kda µε δεσµούς O η οποία εκφράζεται στο ενδοθήλιο των λεµφικών τριχοειδών αλλά όχι και στο σύστηµα αιµατικών αγγείων (3). Εκτός από την έκφραση στο λεµφικό ενδοθήλιο, η ποδοπλανίνη βρίσκεται επίσης σε ποικιλία άλλων ιστών, µεταξύ των οποίων µεσοθηλιακά κύτταρα, δικτυωτά κύτταρα, θυλακιώδη δενδριτικά κύτταρα, βλαστικά κύτταρα των ωοθηκών και των όρχεων (4). Το αντίσωµα ποδοπλανίνης έχει επίσης διαπιστωθεί ότι αντιδρά µε λεµφικό ενδοθήλιο και δεν αντιδρά µε αγγειακό ενδοθήλιο (1, 2). Σε νεοπλαστικούς ιστούς, η ανοσόχρωση λεµφικού ενδοθηλίου από το αντίσωµα ποδοπλανίνης έχει καταδειχθεί χρήσιµη στην αναγνώριση λεµφικής επέκτασης πρωτογενών όγκων (1, 2). Η συνδυασµένη χρήση δεικτών καλρετινίνης και ποδοπλανίνης έχει αποδειχτεί ότι βελτιώνει τη διαφοροποίηση του µεσοθηλιώµατος έναντι του µεταστατικού αδενοκαρκινώµατος (5). Έχει επίσης αποδειχτεί ότι η ποδοπλανίνη είναι χρήσιµος δείκτης για τη διαφορική αναγνώριση των σεµινωµάτων και των όγκων θυλακιωδών δενδριτικών κυττάρων (6). Ανατρέξτε στις Γενικές οδηγίες για την ανοσοϊστοχηµική χρώση της Dako ή στις οδηγίες του συστήµατος ανίχνευσης των διαδικασιών IHC για: 1) την Αρχή της διαδικασίας, 2) τα Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται, 3) την Αποθήκευση, 4) την Προετοιµασία δειγµάτων, 5) τη ιαδικασία χρώσης, 6) τον Ποιοτικό έλεγχο, 7) την Αντιµετώπιση προβληµάτων, 8) την Ερµηνεία της χρώσης, 9) τους Γενικούς περιορισµούς. Έτοιµο προς χρήση µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού που παρέχεται σε υγρή µορφή σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. Κλώνος: D2-40 (7). Ισότυπος: IgG1, κ. Ανοσογόνο Ιστός από δυσβλάστωµα (7). Ειδικότητα Το αντίσωµα ποδοπλανίνης, Clone D2-40 εξετάστηκε µε στύπωµα Western κυτταρολύµατος από ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών. Το αντίσωµα εντόπισε µια ζώνη ~40 kda στα ανοσοστυπώµατα των κυττάρων επιθηλιακού καρκινώµατος των ωοθηκών HEY και µία άλλη µορφή µε ελαφρώς µεγαλύτερο µοριακό βάρος σε στυπώµατα κυττάρων MGH-U3. Η ανοσοδραστικότητα παρατηρήθηκε επίσης σε στυπώµατα Western κυττάρων επιθηλιακού καρκινώµατος των ωοθηκών SK-OV-3 και Caov-3, κυττάρων PA-1PA-1 τερατοκαρκινώµατος των ωοθηκών, κυττάρων Tera-1 και Tera-2 τερατοκαρκινώµατος των όρχεων, κυττάρων 833 εµβρυϊκού καρκινώµατος, κυττάρων RT-4 µεταβατικού καρκινώµατος της ουροδόχου κύστης και κυττάρων U-2 OS οστεοσαρκώµατος. εν παρατηρήθηκε δραστικότητα σε στυπώµατα Western των άλλων κυτταρικών σειρών όγκων που προέρχονταν από µια ποικιλία καρκίνων (7). Η επίδραση της ενζυµικής πέψης στην ανοσοδραστικότητα του κλώνου D2-40 εξετάστηκε χρησιµοποιώντας αντιγόνο καθαρισµένο µε συνάφεια από κύτταρα HEY και από άθικτα κύτταρα HEY. Η ανοσοδραστικότητα µε στυπώµατα Western καθαρισµένου αντιγόνου και µε κύτταρα από κυτταροµετρία ροής δεν επηρεάστηκε από την αφαίρεση των καταλοίπων σιαλικού οξέος µε τη βοήθεια κατεργασίας των κυττάρων ή της πρωτεΐνης µε νευραµινιδάση. Η κατεργασία της πρωτεΐνης ή των κυττάρων µε Ο-σιελογλυκοπρωτεάση κατέστρεψε την ανοσοδραστικότητα του κλώνου D2-40 τόσο σε στυπώµατα Western όσο και σε κυτταροµετρία ροής και έδειξε ότι το αντιγόνο που αναγνωρίζεται είναι µια γλυκοπρωτεΐνη µε δεσµούς Ο (7). Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN 3), µια ιδιαίτερα τοξική χηµική ουσία σε καθαρή µορφή. Στις συγκεντρώσεις προϊόντος, παρόλο που δεν έχει ταξινοµηθεί ως επικίνδυνο, το νατραζίδιο ενδέχεται να αντιδράσει µε τις µολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δηµιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικές εναποθέσεις µεταλλικών αζιδίων. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε µε άφθονο νερό για να αποτρέψετε τη συσσώρευση µεταλλικών αζιδίων στις σωληνώσεις. 3. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να εφαρµόζονται οι δέουσες διαδικασίες χειρισµού. 4. Πρέπει να φοράτε τα κατάλληλα µέσα ατοµικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το (118648-002) 307710GR_002 σελ. 1/5
δέρµα. 5. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. Αποθήκευση Προετοιµασία δειγµάτων καθώς και υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται ιαδικασία χρώσης καθώς και υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Ερµηνεία χρώσης Χαρακτηριστικά απόδοσης Αποθηκεύστε στους 2 8 C. Μην χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο φιαλίδιο. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει τις συνθήκες. εν υπάρχουν ορατά σηµάδια που να υποδεικνύουν έλλειψη σταθερότητας του προϊόντος αυτού. Για τον λόγο αυτό, θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση, που δεν µπορεί να εξηγηθεί από τις διακυµάνσεις των εργαστηριακών διαδικασιών και υπάρχουν υποψίες για πρόβληµα στο αντίσωµα, επικοινωνήστε µε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. Το αντίσωµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη σήµανση τοµών ιστού µονιµοποιηµένου µε φορµαλίνη και εγκλεισµένου σε παραφίνη. Τα δείγµατα ιστού πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους περίπου 4 µm. Απαιτείται προκατεργασία µε θερµική ανάκτηση του επιτόπου (HIER). Βέλτιστα αποτελέσµατα λαµβάνονται µε την προκατεργασία ιστών µε χρήση EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (Link) (Κωδικός K8000/K8004). Αποπαραφινωµένες τοµές: Προτείνεται προκατεργασία των αποπαραφινωµένων µονιµοποιηµένων µε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη τοµών ιστών µε τη χρήση Dako PT Link (Κωδικός PT100/PT101). Ανατρέξτε στον Οδηγό Χρήστη του PT Link για λεπτοµέρειες. Ακολουθήστε την διαδικασία προκατεργασίας που περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας του EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (Link) (Κωδικός K8000/K8004). Οι ακόλουθες παράµετροι πρέπει να χρησιµοποιούνται για το PT Link: Θερµοκρασία προθέρµανσης: 65 C, θερµική ανάκτηση επίτοπου και χρόνοι: 97 C για 20 (±1) λεπτά, αφήστε το να κρυώσει στους 65 C. Αφαιρέστε τη σχάρα των αντικειµενοφόρων του Autostainer από το δοχείο PT Link και αµέσως βυθίστε τις αντικειµενοφόρους σε δοχείο (π.χ. PT Link Rinse Station, Κωδικός PT109) που περιέχει αραιωµένο σε θερµοκρασία δωµατίου EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Link) (Κωδικός K8000). Αφήστε τις αντικειµενοφόρους στο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για 1-5 λεπτά. Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη: Ως εναλλακτική µέθοδος προετοιµασίας των δειγµάτων, η αποπαραφίνωση και η ανάκτηση επίτοπου είναι δυνατόν να πραγµατοποιηθούν στο PT Link χρησιµοποιώντας µια τροποποιηµένη διαδικασία. Βλ. Οδηγό Χρήστη του PT Link για οδηγίες. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας χρώσης, οι τοµές πρέπει να αφυδατωθούν, να υποστούν διαύγαση και να επικαλυφθούν χρησιµοποιώντας µέσα µόνιµης επικάλυψης. Οι τοµές ιστού δεν πρέπει να στεγνώνουν κατά τη διάρκεια της κατεργασίας ή κατά τη διάρκεια της παρακάτω ανοσοϊστοχηµικής διαδικασίας χρώσης. Για καλύτερη προσκόλληση των τοµών ιστού στις υάλινες αντικειµενοφόρους πλάκες, συνιστάται η χρήση Dako Silanized Slides (κωδικός S3003). Το συνιστώµενο σύστηµα εµφάνισης είναι το EnVision FLEX, High ph, (Link) (Κωδικός K8000). Τα στάδια της χρώσης και οι χρόνοι επώασης έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του συστήµατος χρώσης Autostainer Link. Για λεπτοµερείς οδηγίες σχετικά µε την τοποθέτηση των αντικειµενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στον κατάλληλο Οδηγό Χρήστη του Autostainer Link. Εάν τα πρωτόκολλα δεν είναι διαθέσιµα στην χρησιµοποιούµενη πλατφόρµα Autostainer, επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία της Dako. Όλα τα βήµατα επώασης πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Οι βέλτιστες συνθήκες ενδέχεται να ποικίλλουν ανάλογα µε το δείγµα και τη µέθοδο προετοιµασίας και πρέπει να καθορίζονται ξεχωριστά από κάθε εργαστήριο. Εάν ο εξετάζων παθολογοανατόµος επιθυµεί διαφορετική ένταση χρώσης, µπορείτε να επικοινωνήσετε µε έναν ειδικό εφαρµογών της Dako / ειδικό της τεχνικής υπηρεσίας για τον επαναπρογραµµατισµό του πρωτοκόλλου. Ελέγξτε ότι η απόδοση του τροποποιηµένου πρωτοκόλλου εξακολουθεί να ισχύει, αξιολογώντας ότι το πρότυπο χρώσης είναι πανοµοιότυπο µε το πρότυπο χρώσης που περιγράφεται στην ενότητα «Χαρακτηριστικά απόδοσης». Η αντίχρωση µε αιµατοξυλίνη συνιστάται µε χρήση EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (Κωδικός K8008). Συνιστάται µη υδατικό µέσο µόνιµης επικάλυψης. Αρνητικοί και θετικοί µάρτυρες πρέπει να αναλύονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών χρησιµοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο. Ο ιστός θετικού µάρτυρα πρέπει να περιλαµβάνει τη σκωληκοειδή απόφυση και την αµυγδαλή, τα δε κύτταρα/δοµές πρέπει να εµφανίζουν τα πρότυπα αντίδρασης που περιγράφονται για αυτούς τους ιστούς στην ενότητα «Χαρακτηριστικά απόδοσης» σε όλα τα θετικά δείγµατα. Το συνιστώµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα είναι το FLEX Negative Control, Mouse (Link) (Κωδικός IR750). Το πρότυπο κυτταρικής χρώσης είναι κυτταροπλασµατικό και µεµβρανικό. Φυσιολογικοί ιστοί: Το αντίσωµα παρέχει έντονη ανοσοχρώση στο λεµφικό ενδοθήλιο, στα γαγγλιοκύτταρα και στα νεύρα πολλών τύπων φυσιολογικού ιστού. Τα κύτταρα αγγειακού ενδοθηλίου ήταν αρνητικά σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς που δοκιµάστηκαν (8). Τύπος ιστού (αρ. εξετάσεων) Στοιχεία ιστών µε θετική χρώση Επινεφρίδιο (3) Σκωληκοειδής απόφυση (11) Μυελός των οστών (3) 0/3 2/3 κυτταρόπλασµα των καψικών ινοβλαστών 1/3 κυτταρόπλασµα των ενδιάµεσων ινοβλαστών 1/3 κυτταρόπλασµα των περικαψικών λεµφοκυττάρων 9/11 κυτταρόπλασµα των ενδοθηλιακών κυττάρων (118648-002) 307710GR_002 σελ. 2/5
Εγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα (3) Εγκέφαλος, κύριο τµήµα (3) Μαστός (3) Τράχηλος της µήτρας (3) Παχύ έντερο (3) 3/3 κυτταρόπλασµα του νευροπιλήµατος 3/3 πυρήνες σπανίων αστροκυττάρων 3/3 κυτταρόπλασµα των µυοεπιθηλιακών κυττάρων 3/3 µεµβράνη ή/και κυτταρόπλασµα των βασικών επιθηλιακών κυττάρων, 3/3 κυτταρόπλασµα των στρωµατικών ινοβλαστών 2/3 λεµφοκύτταρα Οισοφάγος (3) 1/3 κυτταρόπλασµα των γαγγλιοκυττάρων σε µυ 1/3 κυτταρόπλασµα του βασικού επιθηλίου Καρδιά (3) Νεφρός (3) Ήπαρ (3) 0/3 Πνεύµονας (3) Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) Ωοθήκη (3) Πάγκρεας (3) Παραθυρεοειδής(3) 0/3 Περιφερειακό νεύρο (3) Υπόφυση (3) Προστάτης (3) Σιελογόνος αδένας (3) Σκελετικός µυς (3) έρµα (3) Λεπτό έντερο (3) Σπλήνας (3) 0/3 Στόµαχος (3) Όρχεις (3/3) Θύµος (3) Θυρεοειδής (3) 0/3 Αµυγδαλή (3) Μήτρα (3) 2/3 κυτταρόπλασµα των µυοκυττάρων 1/3 κυτταρόπλασµα των περικαψικών ινοβλαστών 2/3 κυτταρόπλασµα των βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων 3/3 κυτταροπλασµατικό όριο των φατνιακών κυττάρων 1/3 κυτταρόπλασµα των µεσοθηλιακών κυττάρων 3/3 κυτταρόπλασµα των στρωµατικών κυττάρων της ωοθήκης 1/3 κυτταρόπλασµα του επιφανειακού επιθηλίου των έγκλειστων κυστών 2/3 κυτταρόπλασµα των περιπορικών ινοβλαστών 1/3 κυτταρόπλασµα των µυοεπιθηλιακών κυττάρων πόρου 2/3 κυτταρόπλασµα του περινευρίου 1/3 κυτταρόπλασµα των περικαψικών ινοβλαστών στη νευροϋπόφυση, 1/3 κυτταρόπλασµα του νευροπιλήµατος στη νευροϋπόφυση 3/3 κυτταρόπλασµα των βασικών κυττάρων των πόρων, 3/3 κυτταρόπλασµα των στρωµατικών ινοβλαστών 3/3 κυτταρόπλασµα των κυψελοειδών µυοεπιθηλιακών κυττάρων των πόρων 3/3 κυτταρόπλασµα του περιµύιου 3/3 κυτταρόπλασµα των µυοεπιθηλιακών κυττάρων των επικουρικών δοµών 3/3 κυτταρόπλασµα του µυεντερικού πλέγµατος 3/3 κυτταρόπλασµα των περιαδενικών ινοβλαστών 1/3 κυτταρόπλασµα του µυεντερικού πλέγµατος 1/3 κυτταρόπλασµα και µεµβράνη των λεµφοκυττάρων βλαστικού κέντρου 3/3 κυτταρόπλασµα των περισωληνοειδών ινοβλαστών 3/3 κυτταρόπλασµα και µεµβράνη των µυελικών λεµφοκυττάρων 3/3 κυτταρόπλασµα και µεµβράνη των βασικών επιθηλιακών κυττάρων και των λεµφοκυττάρων βλαστικού κέντρου 3/3 κυτταρόπλασµα του µυοµήτριου, 1/3 κυτταρόπλασµα των αδένων ενδοµητρίου Παθολογικοί Ιστοί (2, 7): Τύπος ιστού (αρ. εξετάσεων) Σάρκωµα Kaposi (24): Στάδια πλάκας και οζιδίου Λεµφαγγείωµα (10) Ιστός µε θετική χρώση 24/24 Αγγειοσάρκωµα (7) 3/7 Λειοµυοσάρκωµα (10) 3/10 ερµατοϊνοµύωµα (6) 2/6 Κακοήθες ινώδες ιστιοκυττάρωµα (2) 1/2 Αιµαγγείωµα (10) 0/10 Όγκος χοριοειδικού βώλου (3) 0/3 10/10 ενδοθήλιο που καλύπτει τα κολποειδή διαστήµατα (118648-002) 307710GR_002 σελ. 3/5
Αγγειολίπωµα (2) 0/2 Πυογόνο κοκκίωµα (2) 0/2 Αγγειακή δυσµορφία (2) 0/2 Αιµαγγειοπερικύτωµα (1) 0/1 Αιµαγγειοενδοθηλίωµα (1) 0/1 Προεξέχον δερµατοϊνοσάρκωµα (4) 0/4 Νευροϊνώµατα (6) 0/6 Απλοί όγκοι βλαστικών κυττάρων Σπερµογονιώµατα (35) 34/35 Εµβρυϊκά καρκινώµατα (5) 1/5 Ανώριµα και ώριµα τερατώµατα (1) 0/1 Σύνθετοι όγκοι βλαστικών κυττάρων Σπερµογονιώµατα (12) 12/12 Εµβρυϊκά καρκινώµατα (21) 17/21 Ανώριµα και ώριµα τερατώµατα (16) 5/16 Όγκος λεκιθικού σάκου (4) 1/4 Χοριοκαρκίνωµα (2) 0/2 (118648-002) 307710GR_002 σελ. 4/5
Βιβλιογραφία 1. Kahn HJ, Marks A. A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors. Lab Invest 2002;82: 1255-7. 2. Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas. Mod Pathol 2002; 15:434-40. 3. Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowalski H, Horvat R, Amann G, Kriehuber E, et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol 1999; 154:385-94. 4. Kalof AN and Cooper K. D2-40 Immunohistochemistry So Far! Adv Anat Pathol 2009; 16:62-4. 5. Chu AY, Litzky LA, Pasha TL, Acs G, Zhang PJ. Utility of D2-40, a novel mesothelial marker, in the diagnosis of malignant mesothelioma, Mod Pathol 2005, 18:105-110. 6. Yu H, Gibson JA, Pinkus GS, Hornick JL. Podoplanin (D2-40) is a novel marker for follicular dendritic cell tumors. Am J Clin Pathol 2007; 128:776-82. 7. Marks A, Sutherland DR, Bailey D, Iglesias J, Law J, Lei M, et al. Characterization and distribution of an oncofetal antigen (M2A antigen) expressed on testicular germ cell tumours. Br J Cancer 1999; 80:569-78. 8. IHC003 Report On File Έκδοση 07/12 (118648-002) 307710GR_002 σελ. 5/5