Μελέτη των αλληλεπιδράσεων υποουλικής χλωρίδας και προφλεγμονωδών κυτοκινών ( IL-1β, IL-6, TNF-α ) πριν και μετά την περιοδοντική θεραπεία.

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μελέτη των αλληλεπιδράσεων υποουλικής χλωρίδας και προφλεγμονωδών κυτοκινών ( IL-1β, IL-6, TNF-α ) πριν και μετά την περιοδοντική θεραπεία. Ιωαννίδης Ιωάννης Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Οδοντιατρική Σχολή Εργαστήριο Προληπτικής Οδοντιατρικής Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων Θεσσαλονίκη 2006

Επιβλέπουσα διπλωματικής διατριβής Σακελλάρη Δήμητρα Επίκουρος Καθηγήτρια ΑΠΘ Οδοντιατρική Σχολή Εργαστήριο Προληπτικής Οδοντιατρικής Περιοδοντολογίας και Βιολογίας Εμφυτευμάτων

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη σελ. 3 Εισαγωγή..σελ. 4 Υλικά και μέθοδοι. σελ. 9 Αποτελέσματα. σελ. 16 Συζήτηση... σελ. 19 Βιβλιογραφία..σελ. 25 Ευχαριστίες.σελ. 32 Παράρτημα Ι (Πίνακες) σελ. 33 Παράρτημα ΙΙ (Εικόνες) σελ. 51 1

Περίληψη Εισαγωγή : Οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα βακτήρια και τους αμυντικούς μηχανισμούς του οργανισμού καθορίζουν την εμφάνιση και εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου. Σκοπός : Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των συσχετίσεων ανάμεσα στα κύρια περιοπαθογόνα βακτήρια, τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1β, TNF-α, IL-6) και τους περιοδοντικούς κλινικούς δείκτες πριν και μετά την συντηρητική θεραπεία. Υλικά και μέθοδοι : Στην έρευνα συμμετείχαν 20 περιοδοντικοί ασθενείς, στους οποίους εφαρμόστηκε συντηρητική περιοδοντική θεραπεία. Στην αρχική εξέταση και 6 εβδομάδες μετά τη λήξη της θεραπείας πραγματοποιήθηκε καταγραφή των κλινικών παραμέτρων, λήψη υποουλικών δειγμάτων μικροβιακής πλάκας και λήψη υγρού της ουλοδοντικής σχισμής (ΥΟΣ), από 9 θέσεις προεπιλεγμένες με βάση τη βαρύτητα της βλάβης. Τα μικροβιολογικά δείγματα αναλύθηκαν με την τεχνική Checkerboard DNA-DNA hybridization για τα επίπεδα των P. gingivalis, T. forsythia και T. denticola. Η ανοσοαποτυπωτική τεχνική Checkerboard Immunoblotting χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των IL-1β, IL-6 και TNF-α στο ΥΟΣ. Αποτελέσματα : Η περιοδοντική θεραπεία βελτίωσε τους κλινικούς δείκτες και περιόρισε στατιστικώς σημαντικά τα επίπεδα των βακτηρίων και των κυτοκινών με εξαίρεση την IL-1β, οι τιμές της οποίας παρέμειναν σταθερές, τουλάχιστον για το χρόνο παρατήρησης που επιλέχθηκε. Οι σταθερότερες ανοσολογικές συσχετίσεις αφορούσαν την IL-6, τόσο με τον TNF-α, όσο και με βακτηριακά στελέχη. Συμπέρασμα : Από τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες που εξετάσθηκαν στο ΥΟΣ, κυρίως η IL-6 παρουσίασε σταθερή συσχέτιση με τις μεταβολές των κλινικών και μικροβιολογικών δεικτών μετά την περιοδοντική θεραπεία. 2

Εισαγωγή Οι περιοδοντικοί νόσοι αποτελούν σύνθετες, πολυπαραγοντικές λοιμώξεις και χαρακτηρίζονται από φλεγμονώδεις εξεργασίες με καταστροφικές συνέπειες για τους στηρικτικούς ιστούς του δοντιού. Η εμφάνισή τους απαιτεί την παρουσία συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών και συμπλεγμάτων στο περιβάλλον της ουλοδοντικής σχισμής (Haffajee & Socransky, 1994). Τα μέλη του ερυθρού συμπλέγματος κατά Socransky (Socransky και συν., 1998) δηλαδή ο Porphyromonas gingivalis, η Tannerella forsythia και η σπειροχαίτη Treponema denticola, ανήκουν στα Gram-αρνητικά, αναερόβια βακτήρια και η παρουσία τους έχει συσχετιστεί ισχυρά με τους κλινικούς δείκτες της περιοδοντικής φλεγμονής, όπως το βάθος του θυλάκου και την αιμορραγία κατά την ανίχνευση (Socransky και συν. 1998, Kasuga και συν. 2000). Διακρίνονται για την έντονα λοιμογόνο δράση που ασκούν μέσω της έκκρισης πλήθους πρωτεολυτικών ενζύμων και λιποπολυσακχαριτών (ενδοτοξίνες) και η οποία επιπλέον τους επιτρέπει να αποικούν το υποουλικό περιβάλλον, να ανθίστανται στους αμυντικούς μηχανισμούς του ξενιστή και να προκαλούν τελικά ιστική καταστροφή (Lamont & Jenkinson 1998, Sela 2001, O Brien-Simpson και συν. 2004). Ακόμη, υπάρχουν ενδείξεις για την ικανότητα των βακτηρίων αυτών να διεισδύουν εντός των επιθηλιακών κυττάρων και να τροποποιούν τη γονιδιακή τους έκφραση, με τρόπο που να τους εξασφαλίζει ευνοϊκότερες συνθήκες επιβίωσης (Κωνσταντινίδης, 2003). Οι σύνθετες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα βακτήρια και τα αμυντικά κύτταρα του ξενιστή καθορίζουν σε σημαντικό βαθμό την εξέλιξη της νόσου. Η αρχική ανοσολογική απόκριση του ξενιστή περιλαμβάνει μεταξύ άλλων την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων και των μακροφάγων, τα οποία διαθέτουν την ιδιότητα να απελευθερώνουν μεσολαβητές της φλεγμονής, κυτοκίνες και μεταλλοπρωτεïνάσες της εξωκυττάριας ουσίας. Οι κυτοκίνες αποτελούν απλά πολυπεπτίδια ή γλυκοπρωτεΐνες μικρού μοριακού βάρους με πλειοτροπική, ρυθμιστική δράση σε πλήθος κυτταρικών τύπων που συμμετέχουν στην άμυνα του οργανισμού και τις επουλωτικές διεργασίες (Thomson, 1998). Έτσι, η παρουσία τους αποτελεί αναπόσπαστο στοιχείο της φυσιολογικής ανοσολογικής απόκρισης του ξενιστή και της διατήρησης της ομοιοστασίας του. Η δράση τους ρυθμίζεται προσεκτικά με κατάλληλους αναστολείς και ανταγωνιστές των κυτοκινών, έτσι ώστε να διατηρούνται σε 3

συγκεκριμένα επίπεδα στον ορό και τους ιστούς (Dinarello, 2000). Ωστόσο, σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι και η περιοδοντική νόσος, η ισορροπία αυτή διαταράσσεται με αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή και την υπερέκφραση των κυτοκινών, που με τη σειρά τους εντείνουν τις φλεγμονώδεις εξεργασίες. Στην περιοδοντική νόσο οι κυτοκίνες προέρχονται κυρίως από τα μακροφάγα και τα Τ-λεμφοκύτταρα (Berglundh και συν., 2002), αλλά και από τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, τις ινοβλάστες, τις οστεοβλάστες, τα ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα. Οι κυτοκίνες δρουν αυτοκρινικά ή παρακρινικά μέσω ειδικών, ευαίσθητων υποδοχέων της επιφάνειας των κυττάρων-στόχων. Η ιντερλευκίνη-1β (IL-1β), η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α) ανήκουν στην κατηγορία των προφλεγμονωδών κυτοκινών και κατέχουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της περιοδοντικής νόσου. Η IL-1β αναγνωρίζεται ως ο σημαντικότερος μεσολαβητής της καταστροφής των περιοδοντικών ιστών και της οστικής απορρόφησης (Tatakis 1993, Delima και συν., 2002), καθώς προάγει την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων προσταγλανδίνης Ε 2 (PGΕ 2 ) και μεταλλοπρωτεïνασών (MMPs) από τις ινοβλάστες και τα μονοκύτταρα (Brikedal-Hansen 1993, Czuszak και συν. 1996), αλλά και διεγείρει άμεσα τον σχηματισμό και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Παράλληλα, διαθέτει την ικανότητα να επάγει την απόπτωση, δηλαδή τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, των ινοβλαστών και των οστεοβλαστών, περιορίζοντας με τον τρόπο αυτό τις επανορθωτικές δυνατότητες των περιοδοντικών ιστών (Hock και συν. 2001, Graves & Cochran 2003). Η επίδρασή της ΙL-1β στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων και της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης, γεγονός που επάγει την εξαγγείωση των λευκοκυττάρων. Επιπλέον, έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τα Τ- και τα Β-λεμφοκύτταρα, για τα οποία αναλαμβάνει και χημειοτακτικό ρόλο, όπως κάνει τόσο για τα ουδετερόφιλα, όσο και για τα μακροφάγα. Χαρακτηριστική είναι η ιδιότητά της να προάγει την παραγωγή της ίδιας από τα κύτταρα-στόχους (Dinarello, 1987). Ο TNF-α είναι κυτοκίνη που αναγνωρίστηκε αρχικά από τις κυτταροτοξικές του ιδιότητες και τη δυνατότητά του να εμποδίζει την ανάπτυξη των όγκων. Εμφανίζει παρόμοια, αλλά ασθενέστερη δράση με την IL-1β (Stashenko και συν., 1987), με την οποία δρα συνεργικά σε ό,τι αφορά την οστική απορρόφηση και την 4

αποδόμηση του κολλαγόνου (Bertolini και συν., 1986). Σε μελέτη των Meikle και συν. αποδείχθηκε in vitro πως οι ινοβλάστες των ούλων είναι ικανοί να αποδομούν το κολλαγόνο παρουσία του TNF-α (Meikle και συν., 1989). O TNF-α προέρχεται κυρίως από τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα, στα οποία δρα αυτοκρινικά, επάγοντας μεταξύ άλλων την σύνθεση της ΙL-1β και της PGΕ 2 (Okada & Murakami, 1998). Η παραγωγή του επάγεται σημαντικά από την παρουσία λιποπολυσακχαριτών (Beutler και συν., 1986). Ο TNF-α διεγείρει την έκφραση των επιφανειακών αντιγόνων ICAM 1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ευνοώντας την προσκόλληση των φλεγμονωδών κυττάρων (Gample και συν. 1985, Pober και συν. 1986). Σε αντίθεση με την IL-1β δεν παρουσιάζει άμεση επίδραση στα λεμφοκύτταρα (Dinarello, 1987). Ενώ η IL-1β και ο TNF-α παράγονται έπειτα από ενεργοποίηση των Τ1 βοηθητικών κυττάρων (Th1) κατά την παρουσίαση των αντιγόνων στην περιοδοντίτιδα, η IL-6 προέρχεται από τον δεύτερο τύπο βοηθητικών κυττάρων (Th2), που σχετίζεται με την χυμική ανοσία (Berglundh και συν., 2002). Οι κυριότερες πηγές της είναι τα διεγερμένα μονοκύτταρα, οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η σπουδαιότερη δράση της συνίσταται στην επαγωγή της τελικής ωρίμανσης των Β-λεμφοκυττάρων σε πλασματοκύτταρα ικανά να εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνες. Διεγείρει την παραγωγή ανοσοσφαιρινών σε τέτοιο βαθμό, ώστε τα επίπεδα της IgG1 στον ορό να μπορούν να αυξηθούν κατά 120-400 φορές (Okada & Murakami, 1998). Επιπλέον, δρώντας αυτοκρινικά προωθεί τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των μονοκύτταρων/μακροφάγων (Shaw & Clark, 1989). Τέλος, όπως και οι άλλες κυτοκίνες, συμμετέχει στη διαδικασία απορρόφησης του οστού, προάγοντας τον σχηματισμό και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών (Ohasaki και συν., 1992). Η μελέτη της παρουσίας των κυτοκινών και του συσχετισμού τους με κλινικές ή μικροβιολογικές παραμέτρους της περιοδοντίτιδας διευκολύνθηκε χάρη στην ανεύρεσή τους στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής. Το υγρό της ουλοδοντικής σχισμής προέρχεται από τον ορό και το διάμεσο μεσεγχυματικό υγρό. Σε περιπτώσεις φλεγμονής, η αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών αιμοφόρων αγγείων έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του όγκου του, γεγονός που έχει διαπιστωθεί κλινικά και ιστολογικά (Hancock και συν. 1979, Loe & Holm- Pedersen 1965). Έτσι, η μέτρηση του όγκου του ουλικού υγρού θεωρείται ένας ικανοποιητικός και αξιόπιστος δείκτης για τον καθορισμό της παρουσίας και της 5

βαρύτητας της φλεγμονής. Η δε σύσταση του καθορίζεται από την αλληλεπίδραση του βακτηριακού βιοϋμενίου που βρίσκεται προσκολλημένο στις οδοντικές επιφάνειες και των κυττάρων των περιοδοντικών ιστών. Η ανάλυση των ειδικών συστατικών του υγρού της ουλοδοντικής σχισμής παρέχει έναν ποσοτικό, βιοχημικό δείκτη που μπορεί να συσχετιστεί με το στάδιο εξέλιξης της περιοδοντικής νόσου (Champagne και συν., 2003). Η χρήση του ως αντικείμενου μελέτης και διαγνωστικού μέσου διευκολύνεται από τις μεθόδους συλλογής του, που συνίστανται σε απλές και μη επεμβατικές διαδικασίες. Συγκεκριμένα, για τις IL-1β, IL-6 και τον TNF-α, υπάρχουν αρκετές μελέτες που επιβεβαιώνουν τη δυνατότητα εντοπισμού τους στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής και τον συσχετισμό τους με την περιοδοντική κατάσταση του ασθενή. Για την IL-1β έχει βρεθεί πως η παρουσία της στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής αυξάνεται στους περιοδοντικούς ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς (Masada και συν. 1990, Tatakis 1993, Figueredo και συν. 1999), ανάλογα μάλιστα με τη βαρύτητα της νόσου (Ishihara και συν., 1997), καθώς και στις περιοχές με ενεργή απώλεια πρόσφυσης συγκριτικά με τις θεραπευμένες ή τις υγιείς (Jandinski και συν. 1991, Stashenko και συν. 1991). Οι παρατηρήσεις αυτές είναι αρκετά σταθερές ώστε να αναφέρεται η αυξημένη παρουσία της IL-1β στο ουλικό υγρό ως χαρακτηριστικό της περιοδοντικής νόσου. Παρόμοια υψηλά επίπεδα σε περιπτώσεις προχωρημένης περιοδοντίτιδας έχουν αναφερθεί για τον TNF-α (Roberts και συν., 1997), αν και οι Rossomando και συν., δεν μπόρεσαν να συσχετίσουν την παρουσία του με τους κλινικούς δείκτες (Rossomando και συν., 1990). Αντίθετα, αυτό συνέβη με την IL-6 (Geivelis και συν. 1993, Dongari- Bagtzoglou & Ebersole 1998), η αύξηση των τιμών της οποίας έχει παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις υποτροπιάζουσας περιοδοντίτιδας (Reinhardt και συν., 1993), καθώς και σε γυναίκες με περιοδοντίτιδα και ανεπάρκεια οιστρογόνων (Reinhardt και συν., 1994). Ενώ, λοιπόν, η εγκατεστημένη φλεγμονή συνοδεύεται από αυξημένες τιμές κυτοκινών στο ουλικό υγρό, η αποδρομή της με τη βοήθεια της περιοδοντικής θεραπείας έχει σημαντικό αντίκρισμα και σε ανοσολογικό επίπεδο. Η συντηρητική περιοδοντική θεραπεία στοχεύει καταρχήν στη μείωση του μικροβιακού φορτίου του θυλάκου και την αποκατάσταση της συμβατής με την υγεία υποουλικής μικροβιακής χλωρίδας. Η εφαρμογή των ριζικών αποξέσεων είναι τεκμηριωμένα αποτελεσματική στη μείωση του αριθμού των κύριων περιοπαθογόνων 6

βακτηρίων (Haffajee και συν. 1997, Sakamoto και συν. 2004, Rhemrev και συν. 2006). Η απομάκρυνση της μικροβιακής πλάκας περιορίζει το αντιγονικό φορτίο στο περιοδόντιο και συνεπώς μπορεί να ρυθμίσει τα επίπεδα των κυτοκινών, επαναφέροντας και διατηρώντας έτσι τον φυσιολογικό τους ρόλο. Πράγματι, η περιοδοντική θεραπεία έχει σημαντική επίδραση, τόσο στη συνολική ποσότητα των κυτοκινών, όσο και στη συγκέντρωσή τους στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής. Συγκεκριμένα, η IL-1β εμφανίζει στατιστικά σημαντική μείωση της συνολικής της ποσότητας μετά από την εφαρμογή συντηρητικής θεραπείας, όπως επιβεβαιώνεται σε πλήθος μελετών (Masada και συν. 1990, Reindhardt και συν. 1993, Gamonal και συν. 2000). Τα αποτελέσματα ωστόσο που αφορούν τον ποσοτικό προσδιορισμό του TNF-α και της IL-6 δεν είναι εξίσου σταθερά και επιπλέον, προέρχονται από περιορισμένο αριθμό μελετών σε σχέση με την IL- 1β. Παρά τη σημαντική ερευνητική δραστηριότητα που έχει αναπτυχθεί εδώ και πολλά έτη στον τομέα της αιτιοπαθογένειας της περιοδοντικής νόσου, το πλήθος των εμπλεκόμενων παραμέτρων που αφορούν τα βακτήρια, τον ξενιστή και το περιβάλλον περιορίζει την ερμηνεία των ευρημάτων και δυσχεραίνει την εξαγωγή ασφαλώς τεκμηριωμένων συμπερασμάτων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των υποουλικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα κύρια περιοπαθογόνα βακτήρια και τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες του ξενιστή πριν και μετά την συντηρητική περιοδοντική θεραπεία, καθώς και ο συσχετισμός τους με κλινικές παραμέτρους της περιοδοντικής νόσου. 7

Υλικά και μέθοδοι Πληθυσμός μελέτης : Στην έρευνα συμμετείχαν 20 ασθενείς, οι οποίοι προσήλθαν στην μεταπτυχιακή κλινική του Εργαστηρίου Προληπτικής Οδοντιατρικής, Περιοδοντολογίας και Βιολογίας των Εμφυτευμάτων, Οδοντιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Οι ασθενείς έπρεπε να εμφανίζουν Χρόνια Γενικευμένη Περιοδοντίτιδα, διαγνωσμένη με κλινικά και ακτινογραφικά κριτήρια, σύμφωνα με την πιο πρόσφατη ταξινόμηση της American Academy of Periodontology (Armitage, 1999), και να διαθέτουν τουλάχιστον 20 δόντια και 8 σημεία με βάθη θυλάκων >4mm. Το σύνολο του πληθυσμού μελέτης όφειλε να μην έχει λάβει συστηματική χορήγηση αντιβιοτικών το τελευταίο εξάμηνο ή περιοδοντική θεραπεία το τελευταίο έτος. Άλλα κριτήρια αποκλεισμού συνιστούν η εγκυμοσύνη, η γαλουχία και συστηματικά νοσήματα που είναι δυνατόν να θέτουν τον ασθενή σε κατηγορία υψηλού κινδύνου, καθώς και να επηρεάζουν την πορεία της περιοδοντικής νόσου ή της θεραπείας της. Επιπλέον, καταγράφηκε η έξη των ασθενών στο κάπνισμα. Η έρευνα εγκρίθηκε από τη Επιτροπή Δεοντολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης σύμφωνα με τις αρχές του κανονισμού δεοντολογίας της Επιτροπής Ερευνών του Α.Π.Θ, σχετικά με τις τυποποιημένες πρακτικές για Βιολογικές Έρευνες σε ανθρώπους, και οι ασθενείς συμπλήρωσαν έντυπο συναίνεσης για τη συμμετοχή τους στη μελέτη. Κλινικά στάδια : Κατά την πρώτη συνεδρία πραγματοποιήθηκε η λήψη ιατρικού και οδοντιατρικού ιστορικού. Ακολούθησε καταγραφή των κλινικών δεικτών από τον ίδιο εξεταστή σε όλο το φραγμό και πιο συγκεκριμένα το βάθος θυλάκου (PD), η υφίζηση (REC), η απώλεια πρόσφυσης (PAL) και η αιμορραγία κατά την ανίχνευση (BOP). Οι μετρήσεις αφορούσαν 6 θέσεις σε κάθε δόντι (εγγύς παρειακά, παρειακά, άπω παρειακά, εγγύς γλωσσικά, γλωσσικά, άπω γλωσσικά) και πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση περιοδοντικής μήλης CP 11 (Hu-Friedy, USA). Στην ίδια συνεδρία ακολούθησε ακτινογραφικός έλεγχος και τέθηκε η τελική διάγνωση. Η λήψη δειγμάτων υγρού από την ουλοδοντική σχισμή (ΥΟΣ) και υποουλικής πλάκας πραγματοποιήθηκε μετά από διάστημα μιας εβδομάδας. Η δειγματοληψία έγινε από εννιά προεπιλεγμένες θέσεις ανά ασθενή: τρεις με βάθος θυλάκου 1-3 mm, τρεις με βάθος θυλάκου 4-6 mm και τρεις με βάθος 8

θυλάκου 7 mm. Από τη δειγματοληψία έγινε προσπάθεια να εξαιρεθούν οι γομφίοι (ιδιαίτερα οι σωφρονιστήρες). Τα δείγματα του ΥΟΣ αναλύθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό της IL-1β, της IL-6 και του TNF-α. Τα δείγματα υποουλικής πλάκας αναλύθηκαν για τα εξής βακτηριακά στελέχη: Porphyromonas gingivalis (FDC 381), Tannerella forsythia (FDC 338) και Treponema denticola (TD1). Τεχνική δειγματοληψίας; Μετά την απομάκρυνση της υπερουλικής πλάκας, ακολούθησε απομόνωση του πεδίου με τολύπια βάμβακος και στέγνωμα με ριπή αέρος από αεροσύριγγα. Για τη λήψη του υγρού από την ουλοδοντική σχισμή χρησιμοποιήθηκαν οι ειδικές ταινίες χάρτου Periopaper GCF strips, IDE Interstate, Amityville, NY, USA. Οι ταινίες χάρτου τοποθετήθηκαν στις θέσεις αυτές μέχρι να γίνει αισθητή μια ελαφρά αντίσταση και παρέμειναν μέσα στην ουλοδοντική σχισμή για 30 δευτερόλεπτα. Σε περίπτωση αιμορραγίας κατά την τοποθέτηση της ταινίας, ακολουθούσε στέγνωμα με ριπή αέρος ή/και γάζας και η δειγματοληψία επαναλαμβανόταν μετά το πέρας της λήψης ΥΟΣ από τους υπόλοιπους θυλάκους. Για την εκτίμηση του όγκου του υγρού χρησιμοποιήθηκε το Periotron 6000. Η ρύθμιση του Periotron έγινε με βάση ποσότητες από 0 έως 2 μl, οι οποίες τοποθετήθηκαν με σύριγγα ακριβείας Hamiltton στις ειδικές ταινίες χάρτου. Οι τιμές που προέκυψαν από το Periotron (0-2) μετατράπηκαν σε καμπύλη αναφοράς με τη βοήθεια πολυωνυμικής ανάλυσης 4 ης τάξης. Οι μετρήσεις του όγκου του υγρού της ουλοδοντικής σχισμής από τα κλινικά δείγματα των ασθενών έγινε με αναγωγή των τιμών Periotron στην καμπύλη αναφοράς και μετατροπή τους σε μl (Chapple και συν. 1999). Σε περίπτωση στην οποία ο μετρούμενος όγκος ξεπερνούσε την ανώτερη τιμή καταγραφής του Periotron (ένδειξη OFF), η διαδικασία επαναλαμβανόταν τρεις φορές και όταν ακόμη και η τρίτη μέτρηση υπερέβαινε την ανώτερη τιμή καταγραφόταν η ίδια ως η μετρούμενη (2 μl). Στη συνέχεια κάθε ταινία χάρτου τοποθετήθηκε σε αποστειρωμένο φιαλίδιο μικροφυγοκέντρησης, ελεύθερο δεσοξυριβουνοκλεασών και ριβουνοκλεασών, το οποίο περιείχε 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος εκπλύσεως PBST (0,05% Tween 20 σε αλατούχο φωσφορικό διάλυμα). Τα φιαλίδια αποθηκεύονταν στους -80 C μέχρι την επεξεργασία τους. Την λήψη ΥΟΣ ακολούθησε η λήψη δειγμάτων υποουλικής πλάκας από τις ίδιες ακριβώς προεπιλεγμένες θέσεις. Η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε με 9

αποστειρωμένα κοχλιάρια Gracey (Hu-Friedy, Chicago, Il.) και το υλικό τοποθετήθηκε σε φιαλίδια μικροφυγοκέντρησης που περιείχαν 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (Tris HCL 10mM, EDTA 1mM, ph 7.5). Στα φιαλίδια αυτά προστέθηκαν 200 μl NaOH και ακολούθησε η αποθήκευση τους στους -20 C μέχρι την επεξεργασία τους. Περιοδοντική θεραπεία: Στη δεύτερη συνεδρία ξεκίνησε η εφαρμογή της αρχικής, αιτιολογικής φάσης της περιοδοντικής θεραπείας που περιλάμβανε ενεργοποίηση στις διαδικασίες στοματικής υγιεινής (εκπαίδευση στο βούρτσισμα με τη μέθοδο Bass και στη χρήση μεσοδόντιων μέσων καθαρισμού) και υπερουλική- υπουλική αποτρύγωση με χρήση υπερήχων και εργαλείων χειρός υπό τοπική αναισθησία χωρίς χρονικούς περιορισμούς για κάθε συνεδρία. Η συντηρητική περιοδοντική θεραπεία εφαρμόστηκε ανά τεταρτημόριο και ολοκληρώθηκε σε διάστημα δύο εβδομάδων σε 4 διαδοχικές επισκέψεις. Ο επανέλεγχος ορίστηκε 6 με 8 εβδομάδες μετά το πέρας της θεραπείας. Στη συνεδρία αυτή πραγματοποιήθηκαν εκ νέου λήψη υγρού ουλοδοντικής σχισμής, λήψη υποουλικής πλάκας από τις ίδιες θέσεις και καταγραφή των κλινικών δεικτών με τον ίδιο τρόπο και από τον ίδιο εξεταστή, όπως κατά την αρχική εξέταση. Μικροβιολογική ανάλυση με την τεχνική μοριακής βιολογίας «Checkerboard» DNA-DNA hybridization: Έπειτα από την επαναφορά τους σε θερμοκρασία δωματίου, τα μικροβιακά δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά έτσι ώστε να σπάσουν οι διπλές έλικες του DNA και προστέθηκαν 600 μl οξικού αμμωνίου 5Μ. Από το σύνολο των 1000 μι, μετά από ανάδευση, μεταφέρθηκαν με πιπέτα τα 500 μι στα ανοιχτά παράλληλα κανάλια υβριδισμού της συσκευής Minislot-60 (Immunetics, Cambridge, Mass), στην οποία είχε προηγουμένως τοποθετηθεί η θετικά φορτισμένη νάιλον μεμβράνη δέσμευσης νουκλεïκού οξέος (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN, USA). Το διάλυμα απορροφήθηκε από τη μεμβράνη και το νουκλεïκό οξύ (DNA) δεσμεύτηκε και μονιμοποιήθηκε στη μεμβράνη μετά από την επώασή της σε ξηρό κλίβανο στους 120 ºC για 30 λεπτά. Μετά τη μονιμοποίηση του DNA, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα 20xSSC (1x = 0,15M NaCl, 0,015M Sodium citrate, ph 7,0) για 5 λεπτά. Ο προϋβριδισμός της μεμβράνης έγινε στους 42ºC για 1 ώρα, σε διάλυμα προϋβριδισμού 50mls που 10

αποτελείται από 50% φορμαμίδη, 25% 20xSSC, 25% αποσταγμένο νερό, 0,5% w/v SDS, 0,1% w/v Lauryl Sulfate, 0,5% w/v καζεΐνη. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε στη συσκευή Miniblotter-45 (Immunnetics, Cambridge, Mass), που έχει κλειστά κάθετα κανάλια υβριδισμού. Ανιχνευτές DNA από ολόκληρο το χρωμόσωμα του βακτηρίου (whole genomic DNA probes), σεσημασμένοι με διγοξιγενίνη, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των μικροβιακών στελεχών. Κάθε ανιχνευτής τοποθετήθηκε σε διάλυμα υβριδισμού (διάλυμα προϋβριδισμού και 10% w/v dextran sulfate) σε αραίωση τέτοια, ώστε να επιτυγχάνεται συγκέντρωση DNA 20 μg/ml και ακολούθησε έγχυση σε συγκεκριμένα κανάλια της συσκευής σε ποσότητα 170 μl. Όλο το σύστημα περιβλήθηκε με διαφανή μεμβράνη και τοποθετήθηκε σε σακούλα (Ziploc ), η οποία ασφαλίζεται, αφού πρώτα εμποτισμένο με λίγες σταγόνες νερού χαρτί χρησιμοποιήθηκε για να αποτραπεί η εξάτμιση από τα κανάλια. Ο υβριδισμός των μεμβρανών έγινε σε κινούμενο υδατόλουτρο στους 60 rpm και στους 42 ºC για περίοδο μιας νύχτας. Ακολούθησαν 4 δεκάλεπτες πλύσεις της μεμβράνης με ταχύτητα 60 rpm στο κινούμενο υδατόλουτρο στους 65ºC με διάλυμα Η 3 ΡΟ 4 (SDS 1%, 1mM EDTA, 20mM Na 2 HPO 4 ) για να απομακρυνθούν οι ανιχνευτές που είναι χαλαρά δεσμευμένοι. Για να αποφευχθεί η μη ειδική σύνδεση, η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα μαλεϊκού οξέος με 1% καζεΐνη (100 mm μαλεϊκό οξύ, 150 mm NaCl, ph 7,5) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανίχνευση του συμπλέγματος βακτηρίου-ανιχνευτή με χημειοφωταύγεια έγινε μετά από επώαση με το παραπάνω διάλυμα μαλεïκού οξέος και αντί-διγοξιγενίνη σεσημασμένη με αλκαλική φωσφατάση σε αραίωση 1:20.000 για 30 λεπτά σε κινούμενο αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη εκπλύθηκε με διάλυμα μαλεϊκού οξέος (100 mm μαλεϊκό οξύ, 150 mm NaCl, ph 7.5) και τοποθετήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (100 mm Tris-HCl, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2, ph 9,5) για 5 λεπτά. Στη συνέχεια επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37ºC σε υπόστρωμα χημειοφωταύγειας CSPD (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN, USA) και εκτέθηκε σε αυτοραδιογραφικό ακτινογραφικό φιλμ. H αξιολόγηση του αριθμού των βακτηρίων στο κλινικό δείγμα έγινε με τη χρήση ειδικού λογισμικού που επιτρέπει μετά από δημιουργία καμπύλης αναφοράς την ποσοτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων και την αναφορά τους σε απόλυτους αριθμούς βακτηρίων (TotalLab 100 v.2005, Nonlinear Dynamics Inc.) 11

Προσδιορισμός ανοσολογικών δεικτών με την τεχνική μοριακής βιολογίας «Checkerboard» Immunoblotting (Βλ. Παράρτημα ΙΙ) Επώαση των μονοκλωνικών αντισωμάτων των αντιγόνων αναφοράς και των δειγμάτων σε μεμβράνες υβριδισμού (PVDF): Οι υδρόφοβες μεμβράνες υβριδισμού από διφθοριοπολυβινυλιδένιο - PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciencences, Arlington Heights, IL) προϋγράνθηκαν σε μεθανόλη, εκπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και αφού εμβαπτίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης (coating buffer, 15mM ανθρακικό νάτριο, 35 mμ διττανθρακικό νάτριο. ph 9,6) για 10 λεπτά τοποθετήθηκαν στη συσκευή Miniblotter-60 (Immunetics, Cambridge, MΑ). Οι μεμβράνες επιστρώθηκαν με μείγμα μονοκλωνικών αντί-ανθρώπειων αντισωμάτων για IL-1β, IL-6 και TNF-α (RnD Systems, Minneapolis, MN). Προκειμένου να δημιουργηθεί μια τυπική καμπύλη αναφοράς - σύγκρισης της έντασης των σημάτων από τα προς μελέτη δείγματα, μίγμα από ανασυνδυασμένες ανθρώπινες IL-1β, IL-6 και TNF-α (RnD Systems, Minneapolis, MN), αραιώθηκε διαδοχικά σε πέντε υποδιπλάσιες αραιώσεις με PBST. Το εύρος των αραιώσεων αντιστοιχεί σε 5-150 pg, 6-200 pg και 6-200 pg για τις IL-1β, IL-6 και TNF-α, αντίστοιχα. Το εύρος αυτό στηρίζεται στα επίπεδα των δοκιμασμένων αντιγόνων του ουλικού υγρού σύμφωνα με τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Τα προς μελέτη δείγματα ΥΟΣ και τα δείγματα αναφοράς τοποθετήθηκαν στη μεμβράνη και επωάσθηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση το σύνολο των δειγμάτων αναρροφήθηκε από τα κανάλια της συσκευής, η οποία απoσυναρμολογήθηκε. Ακολούθως η μεμβράνη αφαιρέθηκε από τη συσκευή και εκπλύθηκε σε τρεις δεκάλεπτες πλύσεις με ΤBST [ 0,1% Τween 20 σε τρις αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα (20mM TRIZMA Base, 137 mm χλωριούχο νάτριο, ph 7,6)], σε επιτραπέζιο αναδευτήρα. Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετήθηκε για μία ώρα σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%, προκειμένου να επιτευχθεί εξουδετέρωση των μικροβιακών υπεροξειδασών. Μη ειδικά σημεία δέσμευσης αποκλείστηκαν κατόπιν δωδεκάωρης επώασης σε θερμοκρασία 40 0 C με 250ml διαλύματος TBS-T με 1% καζεϊνη Hammersten (VWR international Ltd, Poole, UK). Δέσμευση ενδογενούς βιοτίνης: Τα δείγματα περιέχουν βιοτίνη που προέρχεται από τα βακτήρια. Η ενδογενής αυτή βιοτίνη μπορεί να αυξήσει σημαντικά τα μη ειδικά σήματα και για το λόγο αυτό δεσμεύεται με το σύστημα αβιδίνης / βιοτίνης 12

(Vector Laboratories, Burlingame, CA). Η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε 120ml ΤBST με 24 σταγόνες αβιδίνης και αναδεύτηκε για 15 λεπτά. Αφού εκπλύθηκε με τρεις δεκάλεπτες πλύσεις σε 250ml TBST, η δέσμευση ολοκληρώθηκε με ανάδευση για 30 λεπτά σε 120 ml διαλύματος TBST με 24 σταγόνες βιοτίνης. Επώαση των βιοτινυλιωμένων αντισωμάτων: Έπειτα από τρεις νέες δεκάλεπτες πλύσεις σε 250ml TBST η μεμβράνη επανατοποθετήθηκε στην συσκευή Miniblotter-45, αυτή τη φορά κάθετα στην αρχική διεύθυνση. Αντι-ανθρώπινα, αίγειας προέλευσης βιοτινυλιωμένα αντισώματα για τα αντιγόνα που εξετάζονται (IL-1β, IL-6 και TNF-α) αραιωμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (TBS-T με 1% καζεϊνη Hammersten), διοχετεύτηκαν με πιπέτα στα κανάλια του Miniblotter-45 σε τρεις διαφορετικές αραιώσεις για το καθένα. Μετά από 1 ώρα επώασης σε θερμοκρασία δωματίου η μεμβράνη εκπλύθηκε με 500ml TBST στο σύστημα Manifold (Immunetics, Cambridge, MA) και με τρεις διαδοχικές δεκάλεπτες πλύσεις με 250 ml TBST σε επιτραπέζιο αναδευτήρα. Δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με περοξειδάση: Περοξειδάση φυτικής προέλευσης - HRP (RnD, Minneapolis, MA) δεσμευμένη με στρεπταβιδίνη αραιώθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (1:200) και η μεμβράνη επωάσθηκε με 120ml από το αντιδραστήριο σε σφραγισμένη σακούλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στον αναδευτήρα. Η μεμβράνη εκπλύθηκε και πάλι με τρεις διαδοχικές δεκάλεπτες πλύσεις με 250 ml TBST. Ανίχνευση των σημάτων: Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας LumiGLO Reserve (KPL, Gaithersburg, MD) που περιέχει φωταυγές διάλυμα και ένα ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης. Ένα ευαίσθητο αυτοακτινογραφούμενο φιλμ (Hyperfilm, ECL, Amersham, Arlington Heights, IL) χρησιμοποιήθηκε για να αποτυπώσει την εκπομπή φωτός από την μεμβράνη. Το φιλμ εκτέθηκε για 1-3 ώρες (ανάλογα με την ανάπτυξη της τυπικής καμπύλης) και εμφανίστηκε σε σκοτεινό θάλαμο. Υπολογισμός των αντιγόνων: Τα φιλμ σαρώθηκαν σε επίπεδο σαρωτή (Epson 1640, Epson CA). Οι μονάδες οπτικής πυκνότητας θα καθοριστούν στο ίδιο φιλμ, τόσο για το μίγμα των αντιγόνων αναφοράς, όσο και για τα προς μελέτη αντιγόνα. Οι συγκεντρώσεις για τα εξεταζόμενα δείγματα θα εκτιμηθούν με βάση την τυπική καμπύλη, χρησιμοποιώντας λογαριθμική ανάλυση, και εκφράστηκαν σε pg με χρήση του λογισμικού που περιγράφηκε για την ποσοτική εκτίμηση των βακτηρίων. 13

Στατιστική ανάλυση : Για τη συνολική ανάλυση, από τα κλινικά, μικροβιολογικά και ανοσολογικά δεδομένα υπολογίστηκαν καταρχήν οι μέσοι όροι για κάθε ασθενή και στη συνέχεια οι τελευταίοι χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του μέσου όρου του δείγματος, ξεχωριστά για τις δύο χρονικές στιγμές. Ειδική ανάλυση, προσδιορίζοντας το μέσο όρο με τον ίδιο τρόπο, έγινε για όλα τα ευρήματα ξεχωριστά για κάθε κατηγορία βάθους θυλάκου (βαθείς 7 mm, μέσους 4 6 mm, αβαθείς 1 3 mm). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στα επίπεδα όλων των παραμέτρων (κλινικών, μικροβιολογικών και ανοσολογικών) μεταξύ των δύο χρονικών στιγμών, καθορίστηκε με τη χρήση του Wilcoxon rank test. Για τον προσδιορισμό του συντελεστή συσχέτισης μεταξύ των μέσων όρων των ανοσολογικών παραμέτρων και ανάμεσα στους μέσους όρους κλινικών, μικροβιολογικών και ανοσολογικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε το Spearman rank test. Η ύπαρξη των παραπάνω συσχετίσεων διερευνήθηκαν στις χρονικές στιγμές της αρχικής δειγματοληψίας και του επανελέγχου καθώς και στα επίπεδα των μεταβολών που επέφερε η αρχική αιτιολογική φάση της περιοδοντικής θεραπείας σε όλες τις εξεταζόμενες παραμέτρους. Οι παραπάνω αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο SPSS 12.0. Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε το p< 0,05. 14

Αποτελέσματα Είκοσι ασθενείς πληρούσαν τα κριτήρια συμμετοχής στη μελέτη κατά την αρχική εξέταση. Από το σύνολο των ασθενών, δύο χρειάστηκε να λάβουν αντιβιοτική αγωγή κατά τη διάρκεια της μελέτης, ένας ασθενής δεν προσήλθε για επανέλεγχο, ενώ τα ανοσολογικά δεδομένα άλλων δύο δεν ήταν δυνατό να αναλυθούν για λόγους που αφορούν εργαστηριακά σφάλματα. Οι παραπάνω εξαιρέθηκαν πλήρως από την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Έτσι, το τελικό πειραματικό δείγμα αποτέλεσαν δεκαπέντε περιοδοντικοί ασθενείς (135 οδοντικές επιφάνειες), επτά άντρες και οκτώ γυναίκες, με μέσο όρο ηλικίας τα 48,4 έτη. Αναλυτικά, τα δημογραφικά στοιχεία του πληθυσμού αναγράφονται στον πίνακα 1. Στην αρχική εξέταση το μέσο βάθος θυλάκου ήταν 5,25 ± 0,09 mm και η μέση απώλεια πρόσφυσης 6,43 ± 0,28 mm. Οι μέσες τιμές για την αιμορραγία κατά την ανίχνευση και τον όγκο του ΥΟΣ ήταν 0,69 ± 0,06 και 0,54 ± 0,06 μl αντίστοιχα. Ο όγκος του ΥΟΣ εμφάνισε θετική συσχέτιση με το βάθος του θυλάκου και την απώλεια πρόσφυσης στην αρχική εξέταση (Πίνακας 4). Η φάση επούλωσης μετά την συντηρητική περιοδοντική θεραπεία ήταν ομαλή για όλους τους ασθενείς και οδήγησε σε μείωση όλων των κλινικών παραμέτρων με υψηλά επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας και με μοναδική εξαίρεση την αιμορραγία κατά την ανίχνευση. Συγκεκριμένα, το βάθος θυλάκου μειώθηκε από 5,25 ± 0,09 mm σε 3,58 ± 0,1 mm (p=0,001), η απώλεια πρόσφυσης από 6,43 ± 0,28 mm σε 5,57 ± 0,24 mm (p=0,001), η αιμορραγία κατά την ανίχνευση από 0,69 ± 0,06 σε 0,52 ± 0,05 (p=0,09) και ο όγκος του ουλικού υγρού από 0,54 ± 0,06 μl σε 0,28 ± 0,03 μl (p=0,006), η μεταβολή του οποίου συσχετίστηκε θετικά με την ελάττωση του βάθους θυλάκου (Πίνακας 6). Τα κλινικά αποτελέσματα της περιοδοντικής θεραπείας παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Σημαντική ήταν η επίδραση της θεραπείας και στον περιορισμό του μικροβιακού φορτίου του θυλάκου καθώς, οι πληθυσμοί και των τριών περιοπαθογόνων βακτηρίων υποπολλαπλασιάστηκαν (Πίνακας 3). Συγκεκριμένα, τα επίπεδα του P. gingivalis (x10 5 ) περιορίστηκαν από 9,53 ± 2,26 στην αρχική εξέταση σε 1,84 ± 0,78 στον επανέλεγχο των έξι εβδομάδων (p=0,00). Οι αντίστοιχες μειώσεις ήταν από 6,96 ± 1,39 σε 1,13 ± 0,47 για την Τ. forsythia (p=0,00) και από 6,7 ± 1,51 σε 1,2 ± 0,52 για την T. denticola (p=0,00). Τα τρία αυτά βακτήρια εμφάνισαν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ τους σε κάθε χρονική στιγμή, καθώς και σε 15

ότι αφορά τη μεταβολή των επιπέδων τους, ενώ αντίθετα δεν εμφανίστηκε σημαντική συσχέτιση με τις κλινικές παραμέτρους, παρά μόνο ανάμεσα στον P. gingivalis και στον όγκο του ΥΟΣ στις έξι εβδομάδες (Πίνακες 4,5 και 6). Οι προς μελέτη κυτοκίνες ανιχνεύθηκαν στο σύνολο σχεδόν της πειραματικής ομάδας. Η IL-1β ανιχνεύτηκε σε όλους τους ασθενείς και στις δύο χρονικές στιγμές, όπως και o TNF-α και η IL-6 στην αρχική εξέταση. Ο TNF-α δεν ανιχνεύθηκε σε έναν ασθενή στον επανέλεγχο και η IL-6 σε πέντε. Οι μέσοι όροι των συνολικών ποσοτήτων ανά οδοντική επιφάνεια πριν την έναρξη της θεραπείας ήταν 225,01 ± 114,84 pg για την IL-1β, 71,79 ± 23,71 pg για τον TNFα και 44,52 ± 11,27 pg για την IL-6. Οι αντίστοιχες τιμές έξι εβδομάδες μετά τη λήξη της θεραπείας διαμορφώθηκαν σε 174,7 ± 70,16 pg για την IL-1β, 29,37 ± 12,56 pg για τον TNF-α και 7,69 ± 3,0 pg για την IL-6 (Πίνακας 3). Οι ελαττώσεις αυτές εκτιμήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές για τον TNF-α και την IL-6 (p=0,00), αλλά όχι και για την IL-1β (p=0,263). Γενικά, δεν εμφανίστηκαν ισχυρές συσχετίσεις ανάμεσα στους κλινικούς δείκτες της περιοδοντικής νόσου και στα επίπεδα των κυτοκινών, εκτός από τις τιμές της IL-6 που συνόδευαν τις αντίστοιχες της απώλειας πρόσφυσης στην αρχική εξέταση (p=0,014) και τον όγκο του ΥΟΣ στον επανέλεγχο (p=0,031). Οι συσχετίσεις ανάμεσα στις κυτοκίνες και τα βακτήρια αφορούσαν τον TNF-α και την Τ. forsythia στην αρχική εξέταση (p=0,025) και στις διαφοροποιήσεις τους (p=0,035), καθώς και τη διαφοροποίηση του TNF-α με την αντίστοιχη της T. denticola (p=0,015). Η IL-6 συσχετιζόταν με τα επίπεδα της T. denticola μετά τη θεραπεία (p=0,046). Τέλος, η μοναδική σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στις ίδιες τις κυτοκίνες παρατηρήθηκε πριν την έναρξη της θεραπείας μεταξύ του TNF-α και της IL-6 (p=0,023). Το σύνολο των σχέσεων αυτών παρουσιάζονται στους πίνακες 4-6. Όταν κατά την ανάλυση των δεδομένων λήφθηκε υπόψη το βάθος του θυλάκου οι κλινικές παράμετροι εμφάνισαν ανάλογες τάσεις μεταβολών με το συνολικό δείγμα και παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα 7. Η περιοδοντική θεραπεία οδήγησε τους βαθείς, μέσους και αβαθείς θυλάκους σε στατιστικά σημαντική μείωση του βάθους τους. Η απώλεια πρόσφυσης μεταβλήθηκε ανάλογα με εξαίρεση τους αβαθείς θυλάκους, στους οποίους αυξήθηκε μετά τη θεραπεία, χωρίς η αύξηση αυτή να αγγίζει τα όρια της στατιστικής σημαντικότητας. Η αιμορραγία κατά την ανίχνευση εμφάνισε μικρή βελτίωση σε όλες τις κατηγορίες των θυλάκων. Τέλος, ο όγκος του ΥΟΣ, ο οποίος ήταν διπλάσιος σχεδόν στους 16

βαθείς και μέσους θυλάκους σε σχέση με τους αβαθείς, μειώθηκε και στις τρεις κατηγορίες, μη σημαντικά ωστόσο σε βάθη θυλάκων μεγαλύτερα των 7 mm. Στον πίνακα 8 αναγράφονται οι ανοσολογικές και μικροβιολογικές μεταβολές με βάση το βάθος των θυλάκων. Τα επίπεδα, τόσο των βακτηρίων, όσο και των κυτοκινών, πριν την έναρξη της θεραπείας κυμαίνονται αναλογικά με το βάθος των θυλάκων, παρουσιάζοντας στους βαθύτερους τις υψηλότερες τιμές τους. Μοναδική εξαίρεση η IL-1β, της οποίας η συνολική ποσότητα στους βαθείς θυλάκους ήταν η χαμηλότερη. Έξι εβδομάδες μετά τη λήξη της περιοδοντικής θεραπείας τα περιοπαθογόνα βακτήρια μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά σε κάθε κατηγορία θυλάκων. Από τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες το ίδιο συνέβη μόνο για την IL-6, καθώς ο TNF-α μειώθηκε μεν χωρίς να φτάσει όμως το όριο της σημαντικότητας, ενώ η IL-1β παρουσίασε αύξηση της τιμής της στον επανέλεγχο των βαθιών θυλάκων, αν και μη σημαντική (p=0,575). Στους πίνακες 9-17 παρουσιάζονται αναλυτικά όλες οι συσχετίσεις ανάμεσα στις κλινικές, ανοσολογικές και μικροβιολογικές παραμέτρους, ανά κατηγορία θυλάκων και ανά χρονική στιγμή. Οι σταθερότερες είναι αυτές που αφορούν τα τρία κύρια περιοπαθογόνα βακτήρια. Στους βαθείς θυλάκους και κατά την αρχική εξέταση ο TNF-α εμφάνισε ισχυρή συσχέτιση με την IL-1β (p=0,021) και με την IL-6 (p=0,004). Η συσχέτιση ανάμεσα στον TNF-α και την IL-6 διατηρήθηκε και στις διαφοροποιήσεις των κυτοκινών αυτών κατά την θεραπεία (p=0,004), ενώ επίσης παρατηρήθηκε και στην αρχική εξέταση των μέσων θυλάκων (p=0,047). Οι συσχετίσεις ανάμεσα στους κλινικούς δείκτες και τις κυτοκίνες εμφανίστηκαν γενικά ασταθείς και ασθενείς. Παρόλα αυτά, και στις τρεις κατηγορίες θυλάκων συχνά συσχετιζόταν ισχυρά ο όγκος του ΥΟΣ με τον TNF-α και την IL-6. Στους θυλάκους μέσου βάθους οι τιμές της IL-1β στον επανέλεγχο ακολουθούσαν τις διακυμάνσεις της αιμορραγίας κατά την ανίχνευση (p=0,008), ενώ ανάλογα συσχετίστηκε και η IL-6 με αυτό το δείκτη φλεγμονής κατά τις διαφοροποιήσεις τους μετά τη θεραπεία (p=0,033). Στους αβαθείς θυλάκους παρουσιάστηκε ισχυρή συσχέτιση ανάμεσα στο βάθος θυλάκου και στην IL-6 μετά την θεραπεία (p=0,004), καθώς και στις διαφοροποιήσεις των τιμών του TNF-α και της απώλειας πρόσφυσης (p=0,041). Τέλος, οι μόνες σημαντικές συσχετίσεις ανάμεσα στις κυτοκίνες και τα βακτήρια αφορούσαν την IL-6 με την T. denticola μετά τη λήξη της θεραπείας στους βαθείς θυλάκους (p=0,042) και με τις διαφοροποιήσεις της Τ. forsythia στους αβαθείς θυλάκους (p=0,047). 17

Συζήτηση Η εκδήλωση της περιοδοντικής νόσου είναι το αποτέλεσμα σύνθετων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στους βακτηριακούς πληθυσμούς και την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή, της οποίας τα χαρακτηριστικά πιθανόν να απορρέουν από τη δομή του γενετικού του υποστρώματος. Στην παρούσα μελέτη έγινε διερεύνηση των συσχετισμών ανάμεσα στα κύρια περιοπαθογόνα βακτήρια και τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες (IL-1β, TNF-α, IL-6), καθώς και των τάσεων με τις οποίες οι συσχετισμοί αυτοί συμβάλλουν στη διαμόρφωση της κλινικής εικόνας της χρόνιας περιοδοντίτιδας. Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των κυτοκινών στο υγρό της ουλοδοντικής σχισμής πραγματοποιήθηκαν με την εφαρμογή μιας νέας ανοσοαποτυπωτικής τεχνικής ( Checkerboard Immunoblotting technique CBIB). Οι τεχνικές ELISA που χρησιμοποιούνται ευρέως για τον σκοπό αυτό είναι αρκετά ευαίσθητες και αυτοματοποιημένες, απαιτούν ωστόσο περισσότερο χρόνο και μεγαλύτερο κόστος από την CBIB. Επιπλέον, η CBIB παρέχει τη δυνατότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης πολλαπλών ανοσολογικών δεικτών στο ίδιο δείγμα, χαρακτηριστικό που παρακάμπτει το πρόβλημα των διαδοχικών αραιώσεων των δειγμάτων που απαιτούνται στην ELISA και που μπορεί να αλλοιώσει τα αποτελέσματα των ποσοτικών προσδιορισμών. Το γεγονός αυτό πιθανότατα ερμηνεύει τις υψηλότερες τιμές των προφλεγμονωδών κυτοκινών που ανευρέθηκαν στο ΥΟΣ των περιοδοντικών ασθενών στην παρούσα μελέτη, σε σχέση με προηγούμενες που χρησιμοποίησαν την ELISA (Reinhardt και συν. 1994, Hanioka και συν. 2000, Al-Shammari και συν. 2001, Giannopoulou και συν. 2003). Ακόμα και σε αυτές όμως τις εργασίες οι διακυμάνσεις στα ανιχνεύσιμα επίπεδα των κυτοκινών είναι μεγάλες. Εκτός από την τεχνική που εφαρμόζεται, άλλη παράμετρος που υπεισέρχεται είναι η μεθοδολογία λήψης του ΥΟΣ. Σε μια μελέτη (Ozmeric και συν., 1998) το ΥΟΣ συλλέχθηκε με ταινίες χάρτου για περιόδους των τριών λεπτών, ενώ άλλοι (Mathur και συν., 1996) διατήρησαν τις ταινίες στην ουλοδοντική σχισμή για είκοσι δευτερόλεπτα. Στη δική μας μελέτη επιλέχθηκε ο χρόνος των τριάντα δευτερολέπτων, που είναι ο πλέον συνήθης στη βιβλιογραφία, με ελαφριά πίεση των ταινιών χάρτου, προκειμένου να αποφευχθεί κατά το δυνατόν μηχανικός ερεθισμός, ικανός να προάγει την επιπλέον έκκριση κυτοκινών. Τα αποτελέσματα των ποσοτικών προσδιορισμών των κυτοκινών επιλέχτηκε να εκφραστούν σε pg ανά δείγμα (συνολική ποσότητα) 18

και όχι σε pg/ml (συγκέντρωση), λόγω της μη ομοφωνίας ως προς τον τρόπο αντικειμενικής αναγωγής των τιμών του Periotron σε όγκο ΥΟΣ. Επίσης, η έκφραση και οι ποσότητες των κυτοκινών έχουν συσχετιστεί με την ενεργότητα της περιοδοντικής νόσου, ιδιαίτερα σε ότι αφορά την IL-1β (Masada και συν. 1990, Stashenko και συν. 1991). Στην παρούσα μελέτη, λόγω του μικρού χρόνου παρατήρησης, ήταν αδύνατη η διάκριση των ενεργών περιοδοντικών βλαβών. Επιπλέον, τα επίπεδα των κυτοκινών δεν μπόρεσαν να συσχετιστούν με τις προς μελέτη κλινικές παραμέτρους. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με τα αντίστοιχα άλλων ερευνών (Masada και συν. 1990, Jandinski και συν. 1991, Wilton και συν. 1992) και ερμηνεύεται από το γεγονός πως οι κλινικές παράμετροι, όπως το βάθος του θυλάκου, η απώλεια πρόσφυσης και η αιμορραγία κατά την ανίχνευση, δεν αντανακλούν απαραίτητα την ενεργότητα της νόσου. Αντανακλούν βέβαια τη βαρύτητα της νόσου, η οποία επίσης έχει συνδεθεί με τις τιμές των προφλεγμονωδών κυτοκινών (Geivelis και συν. 1993, Ishihara και συν. 1997, Roberts και συν. 1997). Τα αποτελέσματά μας δεν επιβεβαιώνουν πλήρως τη σύνδεση αυτή. Εμφανίζουν μια τάση για υψηλότερες τιμές του TNF-α και της IL-6, όσο αυξάνει το βάθος του θυλάκου, η οποία δεν ισχύει για την IL-1β. Γενικότερα, οι ανοσολογικοί συσχετισμοί με τα κλινικά δεδομένα παρουσιάζονται ασταθείς, με εξαίρεση τις συσχετίσεις ανάμεσα στην IL-6 κυρίως και τον όγκο του ΥΟΣ, που όμως και αυτές δεν είναι χαρακτηριστικές μιας κατηγορίας θυλάκων. Κατά την ανάλυση των μέσων όρων του συνόλου του πληθυσμού μελέτης οι μόνες ισχυρές συσχετίσεις αφορούσαν και πάλι την IL-6 με την απώλεια πρόσφυσης στην αρχική εξέταση και με τον όγκο του ΥΟΣ στην επανεξέταση. Με βάση λοιπόν τις τιμές των κυτοκινών που ανευρέθηκαν στη μελέτη μας και τις παραπάνω συσχετίσεις, δεν θα μπορούσαμε να τις θεωρήσουμε δείκτες της βαρύτητας ή της ενεργότητας της νόσου, αλλά της παρουσίας της. Οι μεγάλες διαφοροποιήσεις στα επίπεδα των κυτοκινών από ασθενή σε ασθενή, ακόμα και στα πλαίσια της ίδιας μελέτης, αποτελεί γεγονός που επιβεβαιώνεται και στα δικά μας αποτελέσματα. Ο σημαντικότερος ίσως παράγοντας που καθορίζει τα επίπεδα των κυτοκινών στο ΥΟΣ είναι το ιδιαίτερο γενετικό υπόβαθρο του κάθε ασθενή. Για κάθε μία από τις κυτοκίνες που διερευνήθηκαν στη μελέτη μας έχουν αναγνωριστεί διαφορετικοί γονιδιακοί πολυμορφισμοί, οι οποίοι διαμορφώνουν για τον ξενιστή έναν συγκεκριμένο τύπο ανοσιακής 19

αντίδρασης στο μικροβιακό ερέθισμα. Θεωρείται πλέον πιθανό ότι μια δεδομένη ποσότητα κυτοκινών αποτελεί κυρίως ατομικό χαρακτηριστικό, παρά κλινικό γνώρισμα της περιοδοντικής βλάβης. Οι Engebretson και συν. έδειξαν πως περιοδοντικοί ασθενείς θετικοί στον σύνθετο γονότυπο για την IL-1, δηλαδή στην ταυτόχρονη παρουσία του αλληλόμορφου 2 για τις θέσεις IL-1A+3954 και IL- 1B+4845, εμφανίζουν σημαντικά αυξημένες τιμές της IL-1β στο ΥΟΣ (Engebretson και συν., 1999). Ο γονότυπος αυτός μάλιστα συσχετίστηκε από τους Socransky και συν. με την παρουσία υψηλότερων επιπέδων βακτηρίων του «ερυθρού» συμπλέγματος (Socransky και συν., 2000). Σε ότι αφορά τον TNF-α έχει αναπτυχθεί έντονη ερευνητική δραστηριότητα στον χώρο της ιατρικής προς αναζήτηση των πολυμορφισμών εκείνων που σχετίζονται με το φαινότυπο του ρυθμού παραγωγής του (Wilson και συν., 1997) και την ευπάθεια σε αυτοάνοσες και λοιμώδεις παθήσεις (Wilson και συν. 1994, McGuire και συν. 1994). Τέλος, για την IL-6 οι έρευνες επικεντρώνονται στους γενετικούς μηχανισμούς και τους μεταγραφικούς παράγοντες που ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου της (Ray και συν. 1988, Sehgal και συν. 1992). Είναι αποδεκτό πως οι κυτοκίνες παράγονται τοπικά, όχι μόνο στα πλαίσια της συμμετοχής των αμυντικών κυττάρων στη φλεγμονή, αλλά και άμεσα από την επίδραση των λιποπολυσακχαριτών βακτηριακής προέλευσης. Η επίδραση αυτή έχει αποδειχτεί πως ισχύει και για τους λιποπολυσακχαρίτες των περιοπαθογόνων Gram-αρνητικών βακτηρίων (Jandinski και συν. 1991, Van Dyke και συν. 1993, Hernichel-Gorbach και συν. 1994, Kesavalu και συν. 2002). Οι Bodet και συν. σε καλλιέργειες μακροφάγων και επιθηλιακών κυττάρων έδειξαν πως η παρουσία του «ερυθρού» συμπλέγματος επάγει την παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτοκινών (Bodet και συν., 2006). Στη δική μας μελέτη, επιβεβαιώθηκε η συσχέτιση ανάμεσα στον TNF-α και την T. forsythia κατά την αρχική εξέταση και τη διαφοροποίηση των τιμών τους. Επιπλέον, οι μεταβολές των επιπέδων του TNF-α με τη περιοδοντική θεραπεία ακολουθούσαν τις αντίστοιχες της T. denticola. Η IL-6 εμφάνισε επίσης συσχέτιση με την σπειροχαίτη μετά τη λήξη της θεραπείας, τόσο στο συνολικό δείγμα, όσο και στους βαθείς θυλάκους. Οι σχέσεις αυτές διατυπώνονται για πρώτη φορά και επιβεβαιώνουν την αλληλεπίδραση ανάμεσα στα βακτήρια και την αμυντική αντίδραση του οργανισμού, όπως αυτή εκφράζεται με την παραγωγή των κυτοκινών. 20

Τα βακτήρια P. gingivalis, T. forsythia και T. denticola εμφάνισαν μεταξύ τους ισχυρές και σταθερές συσχετίσεις, τόσο πριν, όσο και μετά την περιοδοντική θεραπεία, επιβεβαιώνοντας την ορθότητα της συμμετοχής τους σε κοινό βακτηριακό σύμπλεγμα. Οι πληθυσμοί τους κυμαίνονται αναλογικά με τα βάθη των θυλάκων και αποτελούν με τον τρόπο αυτό, δείκτη προχωρημένης βλάβης και ιστικής καταστροφής. Η συντηρητική περιοδοντική θεραπεία, απομακρύνοντας, όπως καταδεικνύουν τα αποτελέσματά μας, τον κύριο όγκο του μικροβιακού φορτίου, οδήγησε σε σημαντική βελτίωση των κλινικών παραμέτρων (βάθος θυλάκου και απώλεια πρόσφυσης) και ελάττωση του όγκου του ΥΟΣ. Η άρση της φλεγμονής και η απομάκρυνση της υπερουλικής και υποουλικής μικροβιακής πλάκας αναμενόταν να επαναφέρει τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες σε χαμηλά επίπεδα. Αυτό συνέβη σε κάθε επίπεδο ανάλυσης με την IL-6, η οποία σχετίζεται με την παραγωγή αντισωμάτων (Berglundh και συν., 2002), γεγονός που είναι πιθανό να σχετίζεται με τον περιορισμό των αντιγονικών ερεθισμάτων που ακολουθεί την περιοδοντική θεραπεία. Μάλιστα, σε έξι ασθενείς δεν ανιχνεύτηκε σε καμία περιοδοντική θέση. Το ίδιο συνέβη σε έναν ασθενή για τον TNF-α, ο οποίος παρουσίασε σημαντική ελάττωση στο συνολικό δείγμα, παρατήρηση που δεν διατηρήθηκε όταν πραγματοποιήσαμε ανάλυση με βάση το βάθος θυλάκου. Παρομοίως, τα επίπεδα της IL-1β δεν εμφάνισαν σημαντική μεταβολή στον επανέλεγχο και ανιχνεύτηκαν στο σύνολο των ασθενών. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε αντίθεση με τα δεδομένα άλλων ερευνητών (Hou και συν. 1995, Gamonal και συν. 2000, Goutoudi και συν. 2004), οι οποίοι αναφέρουν μείωση της συνολικής ποσότητας της IL-1β μετά την περιοδοντική θεραπεία, αν και συνοδευόταν από αύξηση της συγκέντρωσής της στο ΥΟΣ. Αντίθετα, σε άλλες μελέτες δεν παρατηρήθηκε σημαντική ελάττωση της IL-1β με την περιοδοντική θεραπεία (Reinhardt και συν. 1993, Al-Shammari και συν. 2001), ενώ οι Yoshinari και συν. αναφέρουν αύξηση των συνολικών επιπέδων της (Yoshinari και συν., 2004). Οι διαφοροποιήσεις αυτές είναι δυνατόν να οφείλονται σε διαφορές σχετικές με την ερευνητική μεθοδολογία που επιλέχθηκε ανά περίπτωση, δηλαδή τον τρόπο δειγματοληψίας του ΥΟΣ, τις εργαστηριακές τεχνικές ανάλυσής του, αλλά και τις κλινικές επιλογές που αφορούν την εφαρμογή της περιοδοντικής θεραπείας και τον καθορισμό του χρόνου των επανελέγχων. Πιθανώς, οι έξι εβδομάδες που επιλέξαμε να μεσολαβήσουν από 21

τη λήξη της θεραπείας μέχρι τη δεύτερη δειγματοληψία να μην είναι ένα ικανοποιητικό χρονικό διάστημα για την αποκατάσταση των φυσιολογικών τιμών των ανοσολογικών δεικτών. Ούτως ή άλλως, στο χρονικό εκείνο πλαίσιο στο οποίο εξελίσσεται η επούλωση των περιοδοντικών ιστών, ο οργανισμός συντηρεί την παρουσία κυτοκινών, μια που εκτός από την προφλεγμονώδη δράση τους συμμετέχουν και στις φυσιολογικές αποκαταστατικές διεργασίες. Μία ακόμη πιθανή ερμηνεία της παρουσίας υψηλών τιμών κυτοκινών στα αποτελέσματά μας είναι η διατήρηση της φλεγμονής, τουλάχιστον των μαλακών ιστών, όπως μαρτυρούν τα υψηλά ποσοστά της αιμορραγίας κατά την ανίχνευση, η οποία δεν περιορίστηκε σημαντικά από την έναρξη της θεραπείας μέχρι την επανεξέταση. Αναφέρεται στην ιατρική και οδοντιατρική βιβλιογραφία πως οι κυτοκίνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, είτε αναπτύσσοντας συνεργική και συμπληρωματική δράση (Bertolini και συν. 1986, Dinarello 1987, Ohasaki και συν. 1992, Graves & Cochran 2003), είτε επάγοντας η μια την παραγωγή των άλλων (Zilberstein και συν. 1986, Bachwich και συν. 1986). Στην ανάλυση του συνόλου των ασθενών της παρούσας μελέτης παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική συσχέτιση στην αρχική εξέταση ανάμεσα στις τιμές του TNF-α και της IL-6, σχέση που διατηρήθηκε και στην ανάλυση με βάση το βάθος του θυλάκου, ιδιαίτερα στις περιοδοντικές θέσεις με μεγαλύτερη ιστική καταστροφή. Στις θέσεις αυτές μάλιστα οι τιμές της μιας κυτοκίνης μεταβλήθηκαν παράλληλα με τις τιμές της άλλης κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Το γεγονός αυτό αποτελεί ένδειξη ενός κοινού ρυθμιστικού μηχανισμού κατά τις φλεγμονώδεις εξεργασίες για τον TNF-α και την IL-6 ή μια ισχυρή σχέση αλληλεξάρτησης, η οποία πιθανώς συντηρείται από τις ίδιες τις κυτοκίνες. Η μόνη συσχέτιση που εμφάνισε η IL-1β ήταν στην αρχική εξέταση των βαθιών θυλάκων με τον TNF-α. Καμιά συσχέτιση δεν εμφανίστηκε ανάμεσα στις κυτοκίνες στους αβαθείς θυλάκους. Ίσως λόγω της περιορισμένης φλεγμονής και ιστικής καταστροφής των θέσεων αυτών να μην εκδηλώνονται σε σημαντικά επίπεδα οι αλληλεπιδράσεις εκείνες μεταξύ των κυτοκινών που χαρακτηρίζουν την εγκατεστημένη φλεγμονή. Συμπερασματικά, αποδεικνύεται στη μελέτη μας πως τόσο οι βακτηριακοί πληθυσμοί, όσο και οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες συνιστούν σύνθετες βιολογικές ομάδες τα μέλη των οποίων αλληλοδιαμορφώνονται και προωθούν τη δράση τους. Εμφανίζουν σαφή οργάνωση και σκοπό, ο οποίος για τα μεν βακτήρια έγκειται στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό τους, για τις δε 22

κυτοκίνες στη διαχείριση της φλεγμονής και την προστασία του οργανισμού. Οι δυο ομάδες συγκρούονται στο πεδίο των περιοδοντικών ιστών με τελικό αποτέλεσμα την ιστική καταστροφή. Η συντηρητική περιοδοντική θεραπεία έχει άμεση επίδραση στη διαδικασία αυτή, επαναφέροντας την ισορροπία. Στόχος μας οφείλει να είναι η εξατομίκευσή της, μια που οι παθογενετικοί μηχανισμοί καθορίζονται σε επίπεδο ξενιστή. Οι ανοσολογικές μελέτες συμβάλλουν στην ώθηση της θεραπευτικής του περιοδοντίου προς την κατεύθυνση αυτή. 23

Βιβλιογραφία Al-Shammari KF, Giannobile WV, Aldredge WA, Iacono VJ, Eber RM, Wang H, Oringer RJ. Effect of non-surgical periodontal therapy on C-telopeptide pyridinoline cross-links and interleukin-1 levels. J Periodontol 2001; 72: 1045-1051. Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Ann Periodontol 1999; 4: 1-6. Bachwich PR, Chensue SW, Larrick JW, Kunkel SW. Tumor necrosis factor stimulates interleukin-1 and prostaglandin E 2 production in resting macrophages. Biochem Biophys Res Commun 1986; 136: 94. Berglundh T, Liljenberg B, Lindhe J. Some cytokine profiles of T-helper cells in lesions of advanced periodontitis. J Clin Periodontol 2002; 29: 705-709. Bertolini DR, Nedwin GE, Bringman TS, Smith DD, Mundy GR. Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumor necrosis factors. Nature 1986; 319: 516-518. Beutler B, Krochnin N, Milark IW, Luedke C, Cerami A. Control of cachectin (tumor necrosis factor) synthesis: mechanisms for endotoxin resistance. Science 1986; 232: 977. Bodet C, Chandad F, Grenier D. Inflammatory responces of a macrophage/epithelial cell co-culture model to mono and mixed infections with Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia. Microb Infect 2006; 8: 27-35. Brikedal-Hansen H. Role of cytokines and inflammatory mediators in tissue destruction. J Periodontal Res 1993; 28: 500-510. Champagne CME, Buchanan W, Reddy MS, Preisser JS, Beck JD, Offenbacher S. Potential for gingival crevice fluid measures as predictors of risk for periodontal diseases. Periodontol 2000 2003; 31: 167-180. Chapple IL, Landini G, Griffiths GS, Patel NC, Ward RS. Calibration of Periotron 8000 and 6000 by polynomial regression. J Periodont Res 1999; 34: 79-86. 24