Ο ρόλος του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου στην επιδημιλογικής επιτήρηση και διερεύνηση επιδημιών

Ο ρόλος του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου στην επιδημιλογικής επιτήρηση και διερεύνηση επιδημιών (Τμήμα των σημειώσεων του Μαθήματος «Μικροβιολογία της Δημόσιας Υγείας) Α. Βατόπουλος, Σ. Βουρλή, Π. Γιακκούπη. Εργαστήριο Μικροβιολογίας Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας. Στην παθογένεια και άρα στην επιδημιολογία κάθε λοιμώδους νοσήματος εμπλέκονται δύο οργανισμοί: Ο μικροοργανισμός-αίτιο του νοσήματος και ο ξενιστής-ασθενής. Συνεπώς η λοίμωξη προϋποθέτει την μετακίνηση του μικροοοργανισμού στην εστία της λοίμωξης. Η μετακίνηση μπορεί να γίνεται από άλλη περιοχή του σώματος του ασθενούς, όπως το δέρμα ή το γαστρεντερικό σωλήνα (λοιμώξεις ενδογενούς αιτιολογίας) ή από άλλο ασθενή κάποιο ζώο ή το άψυχο περιβάλλον (λοιμώξεις εξωγενούς αιτιολογίας). Οι λοιμώξεις εξωγενούς αιτιολογίας, όταν εκδηλώνονται ως επιδημικά επεισόδια, μπορεί να είναι: Από κοινή πηγή, όλοι οι ασθενείς να κόλλησαν από την ίδια πηγή (πχ λιστερίωση από μια συγκεκριμένη παρτίδα τυριού) Μολυσματικές, να υπάρχει δηλαδή αλυσίδα μετάδοσης από ασθενή σε ασθενή (πχ επιδημία γρίπης) Σε κάθε περίπτωση, η διευκρίνηση της επιδημιολογίας κάθε λοιμώδους νοσήματος προϋποθέτει, πέρα από την εφαρμογή της κλασσικής επιδημιολογικής μεθοδολογίας, την διερεύνηση του τρόπου διασποράς των μικροοργανισμών-αιτιών της λοίμωξης. Ετσι μια επιδημία (είτε από κοινή πηγή είτε μολυσματική) θα τεκμηριωθεί τελικά και με την τεκμηρίωση της κλωνικότητας του μικροβιολογικού αίτιου, δηλαδή την τεκμηρίωση της μετακίνησης του μικροβιακού αιτίου (και βασικά των απογόνων του) από την (κοινή) πηγή στους ασθενείς στις επιδημίες κοινής πηγής, ή από την μία γενιά ασθενών στην άλλη, στις μολυσματικές. Στο σημείο αυτό πρέπει να διευκρινιστεί ότι παρόλο που στην μεγάλη τους πλειοψηφία τα επιδημικά επεισόδια οφείλονται στην διασπορά ενός (επιδημικού) μικροβιακού κλώνου, είτε από κάποια (κοινή) πηγή είτε μολυσματικά από ασθενή σε ασθενή, είναι δυνατόν να παρατηρηθούν επιδημικά επεισόδια που να είναι αποτέλεσμα: Τοποχρονικής συρροής ενδογενών λοιμώξεων, όπως πχ μπορεί να παρατηρήσουμε σε μια Μονάδα Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ). Εκεί, λόγω του τρόπου αντιμετώπισης του έλκους από το στρες (stress ulcer), οι ασθενείς υφίστανται έντονη αγωγή με φάρμακα που ανεβάζουν το ph του στομάχου με αποτέλεσμα υπερανάπτυξη της χλωρίδας του στομάχου και πνευμονίες από εισρόφηση. Οι πνευμονίες αυτές μπορεί να πάρουν την μορφή επιδημίας, αλλά οι υπαίτιοι μικροοργανισμοί δεν έχουν μεταξύ τους συνάφεια, αλλά προέρχονται από την χλωρίδα κάθε ασθενούς Πολυκλωνικές επιδημίες. Σπάνια μία επιδημία μπορεί να οφείλεται σε περισσότερους από ένα μικροβιακούς κλώνους ή και σε περισσότερα από ένα μικροβιακά είδη, όπως σε 1

παράδειγμα σε περίπτωση επιδημίας λόγω εκτεταμένης μόλυνσης του συστήματος ύδρευσης από λύματα. Η τεκμηρίωση της μικροβιακής συνάφειας των κρουσμάτων της επιδημίας προϋποθέτει την κατανόηση της έννοιας του μικροβιακού κλώνου. Όπως είναι γνωστό οι μικροοργανισμοί πολλαπλασιάζονται δια διχοτομήσεως, συνεπώς η γενετική πληροφορία μεταβιβάζεται κάθετα στους απογόνους (Εικόνα 1). Οι απόγονοι αυτοί απαρτίζουν τον μικροβιακό κλώνο (Εικόνα 2) που αποτελεί το σύνολο των απογόνων ενός συγκειμένου κύτταρου μικροοργανισμού, ή καλύτερα μιας συγκεκριμένης απομόνωσης (isolate) από έναν ασθενή ή μια εστία του περιβάλλοντος. Αντίστοιχα οι μικροοργανισμοί που εμπλέκονται σε μία επιδημία, που απομονώνονται δηλαδή από τους ασθενείς, τα εμπλεκόμενα ζώα ή παράγωγα αυτών (τρόφιμα) και από της άψυχες πηγές, προφανώς είναι μέλη ενός μικροβιακού κλώνου, Ο μικροβιακός κλώνος μπορεί λοιπόν να οριστεί: Α. Μικροβιολογικά ως: «Ομάδα επιδημιολογικά σχετιζόμενων μικροβιακών απομονώσεων (isolates) ενός μικροβιακού είδους από ανεξάρτητες πηγές, διαφορετικές περιοχές και (ίσως) διαφορετικό χρόνο, με τέτοιες όμως φαινοτυπικές και γενετικές ομοιότητες οι οποίες να εξηγούνται μόνο από κοινή προέλευση» Β Επιδημιολογικά ως «Σύνολο στελεχών ενός μικροβιακού είδους που απομονώθηκαν από επιδημιολογικά άμεσα ή έμμεσα σχετιζόμενα περιστατικά που μπορεί να θεωρηθούν απόγονοι κοινού μικροβιακού στελέχους προγόνου». Οι (μικροβιολογικές) τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να διευκρινιστεί η κλωνικότητα των μικροβιακών στελεχών (isolates) και συνεπώς η πιθανή εμπλοκή τους στην επιδημία καλείται «μικροβιακή τυποποίηση». Οι διάφορες τεχνικές της μικροβιακής τυποποίησης θα αναφερθούν στην συνέχεια, εδώ όμως καλό είναι να τονιστούν ορισμένα βασικά θεωρητικά ζητήματα που αφορούν την τεκμηρίωση της κλωνικότητας των μικροοργανισμών. Όπως ήδη αναφέρθηκε ο πολλαπλασιασμός των μικροβίων δια διχοτομήσεως έχει ως αποτέλεσμα την κάθετη μεταβίβαση όλης της γενετικής πληροφορίας και την δημιουργία πανομοιότυπων απογόνων που αποτελούν τον κλώνο. Την θεωρητική αυτή αρχή όμως της απόλυτης ομοιότητας μεταξύ των μελών του κλώνου περιορίζουν δύο γενετικές λειτουργίες: Οι μεταλλαγές και η οριζόντια μετακίνηση γενετικού υλικού. Το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών αποτελείται από το γνωστό δεσοξυριβονουκλεϊνικόν οξύ (DNA). Το DNA που απαρτίζεται από δύο αλυσίδες δεσοξυριβόζης (διπλή έλικα) από την οποία «κρέμονται οι βάσεις αδενίνη, θυμίνη κιτοσίνη και γουανίνη (Εικόνα 3). Όπως είναι γνωστό, η ιδιότητα της αδενίνης να ενώνεται μόνο με την θυμίνη, και της γουνίνης μόνο με τη κιτοσίνη καθώς και η αντιστοίχηση κάθε αμινοξέος με μια τριπλέττα βάσεων, αποτελεί τη βάση του γενετικού κώδικα, και της μεταφοράς της πληροφορίας από κυτταρική γενεά σε γενεά (Εικόνα 4) Σημειώνεται επίσης ότι η ένωση αδενίνης με την θυμίνη γίνεται με δύο δεσμούς υδρογόνου, ενώ η ένωση γουνίνης και κιτοσίνης με τρεις, και συνεπώς όσο μεγαλύτερο το ποσοστό του 2

ζεύγους γουανίνης κιτοσίνης σε ένα μόριο DNA τόση μεγαλύτερη η θερμοκρασία αποδιάταξης των δυπλόκλωνου μορίου σε μονοκλωνο. Οι Μεταλλαγές στο γενετικό υλικό, μπορεί να είναι αποτέλεσμα προσθήκης, αφαίρεσης είτε αλλαγής κάποιου ζεύγους βάσεων του DNA (Εικόνα 5) που συμβαίνουν κατά την διαδικασία πολλαπλασιασμού και διασποράς του μικροβιακού κλώνου. Ως παράδειγμα αναφέρουμε την επιλογή μεταλλαγών στην DNA γυράση ενός κλώνου P aeruginosa που θα τον καταστήσει στην συνέχεια ανθεκτικό στις κινολόνες. Η ικανότητα οριζόντιας μεταφοράς γενετικού υλικού μεταξύ των μορίων του DNA των μικροοργανισμών αλλά και (κυρίως) μεταξύ διαφορετικών κυττάρων του ιδίου μικροβιακού είδους ή και διαφορετικών μικροβιακών ειδών αποτελεί μια εξαιρετικά σημαντική ιδιότητα των μικροοργανισμών τόσο για την εξέλιξη και προσαρμογή τους στο περιβάλλον όσο και για την διαμόρφωση των διαφόρων μικροβιακών κλώνων που καλούμαστε να μελετήσουμε. Το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών και οι μηχανισμοί οριζόντιας διασποράς του (10-13) Για τις ανάγκες κατανόησης του τρόπου εξέλιξης και διαμόρφωσης των διαφόρων παθογόνων μικροοργανισμών αλλά και των διαφόρων μικροβιακών κλώνων, το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών μπορεί να ταξινομηθεί στο «σταθερό» μέρος που κωδικογραφεί τις βασικές δομές και λειτουργίες του μικροοργανισμού (βασική δομή και βασικό μεταβολισμό house keeping genes) και στο «πρόσθετο» που κωδικογραφεί δομές και λειτουργίες που, ενώ δεν είναι απαραίτητες για αυτή καθεαυτή την ύπαρξη του μικροοργανισμού, αφορούν σημαντικές ιδιότητες όπως είναι οι μηχανισμοί παθογένειας (τοξίνες κ.ά..) οι μηχανισμοί αντοχής (ένζυμα κλπ). Το «σταθερό» γενετικό υλικό που όπως είπαμε αφορά κυρίως τα γονίδια του βασικού μεταβολισμού, που διαφοροποιούνται μέσω μεταλλαγών, που γενικά εμφανίζονται με χαρακτηριστικό ρυθμό, αλλά και γενετικού ανασυνδιασμού, (ανακατανομής των γονιδίων πάνω στο χρωμόσωμα). Σημειώνεται ότι τα γονίδια του βασικού μεταβολισμού γενικά δεν υπόκεινται σε πίεση επιλογής από εξωτερικούς παράγοντες όπως πχ τα αντιβιοτικά ή τα αντισώματα. Το πρόσθετο γενετικό υλικό προέρχεται συνήθως από άλλους μικροοργανισμούς, και βασικά είναι και «κινητό» είχε την δυνατότητα δηλαδή οριζόντιας μετακίνησης από μικροοργανισμό σε μικροοργανισμό. Τέτοιο πρόσθετο γενετικό υλικό είναι τα πλασμίδια, τα τρανσποζόνια, γονίδια που μεταφέρονται με φάγους και τα γονίδια παθογονικότητας. Το πρόσθετο γενετικό υλικό έχει πολύ μεγάλη σημασία για την φυσική ιστορία και την επιδημιολογία των λοιμωδών νοσημάτων διότι κυρίως σε αυτό οφείλεται η συνεχής εξέλιξη των μικροοργανισμών προς πιο ανθεκτικούς στα αντιβιοτικά, η εμφάνιση στελεχών με «νέους» παθογόνους μηχανισμούς κλπ. Πλασμίδια : είναι διπλόκλωνα κυκλικά μόρια DNA που ευρίσκονται στα μικροβιακά κύτταρα ανεξάρτητα από το χρωμόσωμα τους. Φέρουν σημαντικά γονίδια παθογονικότητας και αντοχής στα αντιβιοτικά. Συχνά έχουν την ικανότητα μετακίνησης από μικροροργανισμό σε μικροοργανισμό με την μικροβιακή σύζευξη (εικόνα 6). Τρανσποζόνια. Αποτελούν δομές πάνω στο γενετικό υλικό του μικροοργανισμού (χρωμόσωμα ή πλασμίδιο) που έχουν την ικανότητα μετακίνησης από μόριο DNA σε μόριο DNA (εικόνα 7). 3

Τα απλούστερα τρανσποζόνια που καλούνται και αλληλουχίες εισδοχής (insertion sequences -IS) κωδικογρφούν ένα ένζυμο την τρανσποσάση που καταλύει την μετακίνησή τους (Εικόνα 8), ενώ φέρουν στα άκρα τους τις λεγόμενες ανάστροφες αλληλουχίες (inverted repeats) 20-100 βάσεων απαραίτητες για την μετακίνησή τους. Τα πλέον σύνθετα τρανσποζόνια αποτελούνται από δύο IS που περιβάλουν σειρά γονιδίων παθογένειας, αντοχής κλπ (Εικόνα 9). Ειδική κατηγορία τρανσποζονίων είναι αυτά της οικογένειας TnA-Tn3 που έχουν ειδική δομή, ενώ φαίνεται να παίζουν - σημαντικό ρόλο στην δημιουργία και διάδοση της πολυαντοχής στα αντιβιοτικά (Eικόνα 10). Τα integrons είναι τμήματα των τρανσποζονίων της οικογένειας TnA-Tn3. Αποτελούνται από δύο συντηρημένα άκρα και μια περιοχή ανασυνδυασμού (att I) όπου υπάρχει η δυνατότητα ενσωμάτωσης γονιδίων (κυρίως αντοχής στα αντιβιοτικά) και δημιουργίας έτσι πολυανθεκιτκών στελεχών (Eικόνα 11). Το 5 συντηρημένο άκρο φέρει το ένζυμο ιντεγραση (int I) που είναι απαραίτητο για την ενσωμάτωση των γονιδίων στην περιοχή ανασυνδυασμού καθώς και τους ποαγωγείς (Promoters) της μεταγραφής των γονιδίων αυτών. Το 3 συντηρημένο άκρο φέρει γονίδια αντοχής στις σουλφοναμίδες (sul I) και τα τεταρτοταγή άλατα του αμμωνίου (qac ΕΔ Ι) καθώς και μεταγραφικές περιοχές (Open reading frames- ORF) αγνώστου λειτουργίας. Ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι τα γονίδια που ενσωματώνονται στην atti περιοχή του integron έχουν την μορφή «κασέτας» δηλαδή κάθε γονίδιο ακολουθείται από μια συντηρημένη περιοχή το στοιχείο 59 βάσεων (59 base element Eικόνα 11). Επίσης σημαντικό είναι το γεγονός ότι τα «νεώτερα» γονίδια ενσωματώνονται προς την 5 περιοχή (εικόνα 12 ), μεταξύ δηλαδή των ήδη ενσωματωμένων και των προαγωγών). Νησίδες παθογονικότητας (Pathogenicity islands). Είναι μεγάλα τμήματα DNA που φέρουν γόνους παθογονικότητας, αντοχής κ.ά.. Υπάρχουν σε παθογόνους κλώνους ενός μικροβιακού είδους αλλά λείπουν από μη παθογόνους κλώνους του είδους αυτού. Διαφέρουν ως προς την C+G σύνθεση, και περιβάλλονται από ανάστροφες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, γεγονός συμβατό με πιθανή προέλευση από άλλο μικροβιακό είδος σε κάποια στιγμή της εξελικτικής διαδικασίας. Οι νησίδες παθογονικότητας πάντως γενικά δεν μπορούν να μετακινηθούν εύκολα από μικροοργανισμό σε μικροοργανισμό (Eικόνα 13). Οριζόντια διασπορά γονίδιων Οι μέθοδοι οριζόντιας διασποράς του γενετικού υλικού εκτός από την μικροβιακή σύζευξη και την ικανότητα μετακίνησης των τρανσποζονίων που ήδη αναφέρθηκαν, είναι: Η μεταμόρφωση που αφορά την ικανότητα του μικροοργανισμού να «προσροφά» γυμνό γενετικό υλικό από το περιβάλλον και να το ενσωματώνει στο δικό του γενετικό υλικό. Τα γυμνό αυτό γενετικό υλικό συνήθως προέρχεται από νεκρά και λυμένα μικροβιακά κύτταρα (Eικόνα 14). Οι πνευμονιόκοκοι αποτελούν παράδειγμα μικροβιακού είδους με μεγάλη ικανότητα μεταμόρφωσης 4

Η μεταφορά με φάγους (transduction)(εικόνα 15). Οι Φαγοι είναι ειδικοί ιοί βακτηριδίων που παρασιτούν δηλαδή μόνο σε βακτηριακά κύτταρα. Η μεταφορά βακτηριακού γενετικού υλικού μπορεί να γίνει ως «παρενέργεια» του πολλαπλασιασμού του φάγου κατά: Τον λυτικό κύκλο πολλαπλασιασμού (generalized transduction) όπου κατά τον πολλαπλασιασμό του φάγου το βακτηριακό κύτταρο λύεται και τυχαία θραύσματα του γενετικού υλικού του θα εγκλειστούν σε θυγατρικά σωμάτια του φάγου, που στην συνέχει θα μολύνουν άλλα βακτηριακά κύτταρα Τον λυσιγόνο κύκλο αυτού (specialized transduction), όπου ο πολλαπλασιασμός του φάγου περιλαμβάνει μια φάση ενσωμάτωσης του DNA αυτού στο γενετικό υλικό του βακτηριδίου. Η σε δεύτερη φάση «αποκόληση» του DNA του φάγου ενδεχόμενα θα συμπαρασύρει και γειτονικό της περιοχής ενσωμάτωσης γενετικό υλικό του μικροοοργανισμού, που στην συνέχεια επίσης θα μολύνουν άλλα βακτηριακά κύτταρα Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι ένας μικροοργανισμός γενετικά αποτελείται από ένα γενετικό «σκελετό» γονιδίων του βασικού μεταβολισμού και από ένα «πρόσθετο» σύνολο γονιδίων στα οποία συνήθως οφείλονται οι «επιπλέον» ιδιότητές του όπως η παθογένεια, η αντοχή σε φυσικού παράγοντες και η αντοχή σε αντιβιοτικά. Ο πρόσθετος αυτός εξοπλισμός δεν είναι απαραίτητος για την ύπαρξη του μικροβίου, και προέρχεται. από άλλα είδη μικροοργανισμών ή και από άλλα στελέχη του ιδίου είδους. Ο πρόσθετος αυτός εξοπλισμός είναι συχνά κινητός μετακινείται δηλαδή οριζόντια μεταξύ των μικροβιακών στελεχών. Πληθυσμιακή Γενετική τωνμικροοργανισμών (microbial population genetics) Σχηματικά η εξέλιξη των μικροβιακών κλώνων η παραγόμενη ποικιλομορφία και η διαμόρφωση των επάλληλων γενεών των μικροβιακών κυττάρων που τους απαρτίζουν εξαρτάται από τον συνδυασμό του ρυθμού των μεταλλάξεων (κυρίως στο σταθερό μέρος του γενετικού υλικού του) και τις ικανότητας οριζόντιας ανταλλαγής γενετικού (πρόσθετου) υλικού που αυτό το μικροβιακό είδος παρουσιάζει στις συγκεκριμένες συνθήκες που αυτό διασπείρεται. Σημαντικό είναι λοιπόν να γίνει κατανοητό ότι κάθε μικροβιακό είδος αποτελείται από άθροισμα μικροβιακών κλώνων, που εξελίσσονται αφενός μέσω μεταλλαγών αλλά και γενετικού ανασυνδιασμού, αφετέρου μέσω συνεχούς ανταλλαγής γενετικού υλικού είτε μεταξύ των είτε με άλλα μικροβιακά είδη. Την δομή αυτή των πληθυσμών που απαρτίζουν το μικροβιακό είδος την μελετά η επιστήμη της πληθυσμιακής γενετικής (microbial population genetics)(15,16). Τα συμπεράσματά της είναι εξαιρετικά χρήσιμα στην κατανόηση της φυλογένεσης, της επιδημιολογίας, αλλά και της εξέλιξης της παθογένειας των μικροοργανισμών. Έτσι μέσα από αυτή την προσέγγιση έχει βρεθεί ότι ο MRSA, ο ανθεκτικός δηλαδή στην μεθικιλίνη S aureus, αποτελεί το αποτέλεσμα της εισαγωγής του mec γονιδίου σε περιορισμένο αριθμό κλώνων S aureus και εν συνεχεία στην παγκόσμια διασπορά αυτών (17). Αντίστοιχα αυτή η προσέγγιση βοήθησε στην κατανόηση της γενετικής ποικιλομορφίας της E coli(18), του μηνιγγιτιδοκόκκου(19), ή του τρόπου διασποράς των ανθεκτικών στα αντιβιοτικά κλώνων του πνευμονιόκοκκου (20). Επίσης οι μελέτες αυτές βοηθούν και στην κατανόηση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ειδών μικροοργανισμών. 5

Ως παράδειγμα αναφέρουμε την Salmonella Typhi που έχει βρεθεί, με την τεχνική MLST (βλ παρακάτω) ότι αποτελείται από μόλις 4 κλώνους, γεγονός συμβατό με την θεωρία ότι το μικρο-βιακό αυτό είδος είναι σχετικά νέο και συνεπώς δεν έχει ακόμη εξελιχθεί σε περισσότερους διαφοροποιημένους κλώνους (21). Με βάση το βαθμό ποικιλομορφίας τους, οι μικροργανισμοί μπορεί να ταξινομηθούν σε ένα φάσμα που ξεκινά από τα είδη που γενικά εμφανίζουν μικρή συχνότητα ανασυνδιασμού και συνεπώς η κλωνικότητά τους είναι εμφανής. Τέτοιο είδος είναι οι Σαλμονέλες που παρουσιάζουν μικρή ικανότητα οριζόντιας ανταλλαγής γενετικού υλικού. Έτσι οι πληθυσμοί του μικροοργανισμού αυτού διατηρούν επί μακρόν την γενετική ομοιογένεια και υπάρχει δυσκολία στο διαχωρισμό μεταξύ των κλώνων, με αποτέλεσμα δυσκολία στον διαχωρισμό των επιδημιολογικά συσχετιζόμενων isolates από άλλα επιδημιολογικώς άσχετα. Στο άλλο άκρο του φάσματος είναι τα είδη με έντονο το φαινόμενο της ανταλλαγής γενετικού υλικού. Ως παράδειγμα εδώ αναφέρεται ο πνευμονιόκοκκος ο οποίος παρουσιάζει μεγάλη ικανότητα οριζόντιας ανταλλαγής γενετικού υλικού κυρίως με την μέθοδο της μεταμόρφωσης. Αποτέλεσμα αυτού είναι οι επάλληλες γενιές κυττάρων των μικροβιακών κλώνων να χάνουν γρήγορα την γενετική ομοιότητά τους. Έτσι συχνά επιδημιολογικά συσχετιζόμενα κλινικά isolates, που προφανώς ανήκουν στον ίδιο κλώνο, φαίνονται γενετικά ανόμοια, δυσκολεύοντας έτσι την επιδημιολογική παρακολούθηση της διασποράς του μικροοργανισμού Η τεχνική που χρησιμοποιείται στις μελέτες της πληθυσμιακής γενετικής βασίζονται στην μελέτη του «σταθερού» τμήματος του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού, και ειδικότερα των γονιδίων των ενζύμων του βασικού μεταβολισμού (housekeeping genes). Όπως ήδη αναφέρθηκε το «σταθερό» γενετικό υλικό, διαφοροποιείται μέσο μεταλλαγών που εμφανίζονται ομοιογενώς σε όλο το μήκος του χρωμοσώματος. Παρακολουθώντας λοιπόν την εξέλιξη αυτή, μέσω των μεταλλαγών που εμφανίζονται στα διάφορα γονίδια των ενζύμων του βασικού μεταβολισμού μπορούμε να παρακολουθήσουμε την πορεία του μικροβιακού κλώνου. Σημειώνεται ότι οι μεταλλαγές αυτές εμφανίζονται σε σχετικά αργά χρονικά διαστήματα και δεν υφίστανται εξωτερικές πιέσεις επιλογής. Παρακολουθώντας και καταγράφοντας λοιπόν τα άλληλια των γονιδίων του βασικού μεταβολισμού η μεθοδολογία αυτή μελετά και την πληθυσμιακή δομή, την φυλογενετική εξέλιξη του είδους, αλλά και την (συνήθως μακροχρόνια) πορεία των κλώνων στον χρόνο και τον τόπο (επιδημιολογία). Ως μέθοδος αναφοράς εδώ αναφέρεται η Multilocus Sequence Typing (MLST)(21), που θα αναπτυχθεί λεπτομερώς στο κεφάλαιο της μικροβιακής τυποποίησης. Βασικές αρχές μικροβιακής τυποποίησης (για ανασκόπηση: 23-26). Όπως προαναφέρθηκε, οι (μικροβιολογικές) τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να διευκρινιστεί η κλωνικότητα των μικροβιακών στελεχών (isolates) και συνεπώς η πιθανή εμπλοκή τους στην επιδημία, καλούνται «μικροβιακή τυποποίηση». Ως μικροβιακή τυποποίηση (typing) καλούμε λοιπόν ομάδα μικροβιολογικών τεχνικών που: Μελετά τις ομοιότητες (συγγένειες) μεταξύ των isolates που απομονώθηκαν από τους ασθενείς που εμπλέκονται σε μια επιδημία. Κατατάσσει τα isolates στην βάση της ομοιότητας σε κλώνους 6

Τεκμηριώνει έτσι την τυχόν κλωνική διασπορά του μικροοργανισμού στα κρούσματα της επιδημίας. Διαχωρίζει τις σποραδικές λοιμώξεις από τις επιδημικές. Οι τεχνικές αυτές βασίζονται στη μελέτη της ομοιότητας των isolates και με βάση αυτήν την ιεραρχική ταξινόμηση τους. Η αξιολόγηση μιας τεχνικής τυποποίησης θα γίνει με τα εξής κριτήρια: Τυποποιητική ικανότητα, που εκφράζει την δυνατότητα εφαρμογής της τεχνικής σε όλα τα προς τυποποίηση στελέχη. Έτσι η τυποποιητική ικανότητα της οροτυπίας εξαρτάται από την παρουσία ή όχι στελεχών που μπορεί να οροτυποποιηθούν (raff στελέχη κλπ). Αναπαραγωγιμότητα, που εκφράζει την ικανότητα της μεθόδου πάντα να δίδει τα ίδια αποτελέσματα. Διακριτική ικανότητα, που εκφράζει την ικανότητα της μεθόδου ναι διακρίνει τους μικροβιακούς κλώνους. Ευκολία εφαρμογής Ευκολία ερμηνείας των αποτελεσμάτων Κόστος. Τονίζεται επίσης ότι η τυποποίηση υποστηρίζει την επιδημιολογία και δεν την υποκαθιστά. Δηλαδή αν και ποια θα μικροβιακά στελέχη τυποποιηθούν, αλλά και ποια μέθοδος θα εφαρμοστεί, θα αποφασιστεί όταν έχει με σαφήνεια διατυπωθεί το (επιδημιολογικό) ερώτημα που η τυποποίηση θα κληθεί να απαντήσει. Αντίθετα τα αποτέλεσμα της τυποποίησης στελεχών που δεν συνδέονται μεταξύ τους επιδημιολογικά είναι εξαιρετικά δύσκολο αλλά και συχνά επικίνδυνο να ερμηνευθούν Η ομοιότητα που μελετά η τυποποιητική μέθοδος μπορεί να αφορά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ή το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών. Οι κλασικές (φαινοτυπικές) μέθοδοι τυποποίησης Οι κλασικές μέθοδοι τυποποίησης που χρησιμοποιούνται εδώ και δεκαετίες βασίζονται στην μελέτη φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Η πλέον διαδεδομένη και πλέον καθιερωμένη είναι η οροτυπία που βασίζεται στην ταξινόμηση των μικροοργανισμών σε ορότυπους με βάση την αντιγονικότητα των αντιγόνων του κυτταρικού τοιχώματος (Ο αντιγόνο) των μαστίγιων (Η αντιγόνο) ή της κυτταρικής κάψας (Κ αντιγόνο) (Εικόνα 16). H οροτυπία υπήρξε ιδιαίτερα διαδεδομένη μέθοδος τυποποίησης πολλών παθογόνων βακτηριακών ειδών για πολλές δεκαετίες, ενώ παραμένει και σήμερα σημαντική μέθοδος για την τυποποίηση στελεχών Salmonella, Shigella, Legionella και Streptococcus pneumoniae. Διάσημο είναι το σχήμα οροτυπίας στις σαλμονέλλες που έχει προσφέρει σημαντικές υπηρεσίες στην επιδημιολογία των λοιμώξεων από τους μικροοργανισμούς αυτούς. Όμως ήδη, η επικράτηση συγκεκριμένων οροτύπων σε πολλά gram αρνητικά μικρόβια ελαττώνει την διακριτική ικανότητα της μεθόδου. Άλλη κλασσική μέθοδος τυποποίησης είναι η λυσιτυπία, που στηρίζεται στην ιδιότητα κάθε μικροβιακού κλώνου να λύεται από συγκεκριμένους φάγους (Εικόνα 17), ιδιότητα που 7

οφείλεται στην παρουσία υποδοχέων, που επιτρέπουν στο φάγο να δεσμευτεί στην επιφάνεια του βακτηριακού κυττάρου. Η τεχνική αυτή προσφέρει σημαντικές υπηρεσίες στην επιδημιολογία των λοιμώξεων, είναι όμως εξαιρετικά επίπονη και απαιτεί μεγάλη εξειδίκευση από το εργαστήριο για την εφαρμογή του. Η βιοτυπία (Εικόνα 18), που βασίζεται στη διαφοροποίηση των μικροβιακών ειδών ανάλογα με τα υποστρώματα που χρησιμοποιούν για το μεταβολισμό και την ανάπτυξή τους, χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό του είδους των μικροοργανισμών (ταυτοποίηση). Εκμεταλλευόμενοι τις μικρές διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται στις βιοχημικές αντιδράσεις μεταξύ στελεχών του ίδιου είδους, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη βιοτυπία και σαν τυποποιητική μέθοδο, με μικρή βέβαια διακριτική ικανότητα. Τέλος, ο φαινότυπος αντοχής στα αντιβιοτικά (εικόνα 19), που ελέγχεται σε όλα τα κλινικά μικροβιολογικά εργαστήρια, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την «ομαδοποίηση» των μικροβιακών στελεχών. Πάντως, η αξία του αντιβιογράμματος ως τυποποιητικής μεθόδου είναι περιορισμένη, καθώς στελέχη που δε σχετίζονται επιδημιολογικά ή γενετικά, μπορεί να παρουσιάζουν όμοιο φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά. Μοριακές μέθοδοι τυποποίησης. Οι φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης εμφανίζουν περιορισμούς που πολύ γρήγορα έγιναν αντιληπτοί. Έτσι, συχνά χαρακτηρίζονται από μικρή διακριτική ικανότητα, λόγω της επικράτηση κάποιων οροτύπων ή λυσίτυπων. Για παράδειγμα, το 70% των σαλμονελλών που απομονώνονται στην Ελλάδα αλλά και διεθνώς, τυποποιούνται ως Salmonella Εnteritidis. Επίσης, τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως πχ ο φαινότυπος αντοχής, μπορεί να είναι μεταβλητά. Τέλος, οι τεχνικές αυτές (όπως πχ η λυσιτυπία) απαιτούν σημαντική εξειδίκευση, η αξιολόγησή τους είναι συχνά υποκειμενική, ενώ είναι εξαιρετικά επίπονες στην εφαρμογή τους. Η ανάπτυξη και απλοποίηση των μοριακών τεχνικών που αφορούν τη μελέτη του γενετικού υλικού, σε συνδυασμό με την πρόοδο της πληροφορικής (βιοπληροφορική), έχει οδηγήσει σε μια νέα προσέγγιση στην τυποποίηση και τη μελέτη των επιδημιολογικών σχέσεων των μικροοργανισμών, που βασίζεται στην ανίχνευση, την καταγραφή και την αξιολόγηση των διαφορών του γενετικού υλικού των υπό μελέτη μικροοργανισμών. Οι μοριακές μέθοδοι τυποποίησης έχουν σαν στόχο τη σύγκριση του γενετικού υλικού των μικροβιακών στελεχών που εμπλέκονται σε μια επιδημία, ιδιαιτέρως δε του χρωμοσώματός τους και την ανάδειξη των μεταξύ τους γενετικών σχέσεων. Επειδή στο μικροβιακό χρωμόσωμα υπάρχουν αλληλουχίες αρκετά συντηρημένες ώστε να χαρακτηρίζουν ένα μικροβιακό είδος ή και γένος, αλλά και αλληλουχίες που παρουσιάζουν αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία, οι μέθοδοι που αναλύουν το χρωμόσωμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων αλλά και για το διαχωρισμό του είδους σε κλώνους με επιδημιολογική σημασία. Με δεδομένη την παγκοσμιοποίηση των προβλημάτων δημόσιας υγείας που προκαλούν οι μεγάλες μετακινήσεις ατόμων, ζώων και αγαθών, οι επιδημίες αποκτούν συχνά διεθνή ή και παγκόσμια συνιστώσα και συνεπώς υπάρχει μια ολοένα αυξανόμενη ανάγκη για ανταλλαγή δεδομένων σε διεθνές επίπεδο. Eνα σημαντικά χρήσιμο κριτήριο λοιπόν στην αξιολόγηση μίας μοριακής μεθόδου τυποποίησης (πέραν των ήδη αναφερθέντων), είναι και η ικανότητά της να δημιουργεί 8

δεδομένα ικανά να αποθηκευθούν, δημιουργώντας έτσι ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, προσβάσιμες στην διεθνή επιστημονική κοινότητα. Τέτοιες είναι κυρίως οι μέθοδοι που βασίζονται στην αλληλούχηση τμημάτων του DNA, διότι τα δεδομένα που παράγουν είναι αναπαραγώγιμα (δηλαδή κάθε εργαστήριο θα παράγει το ίδιο αποτέλεσμα) και αποθηκεύσιμα. Χαρακτηριστικότερο παράδειγμα μεθόδου που βασίζεται στον προσδιορισμό νουκλεοτιδικής αλληλουχίας είναι η MLST (που θα αναπτυχθεί στην συνέχεια), τα δεδομένα της οποίας είναι οι αλληλουχίες των γονιδίων που μελετώνται, που μπορούν εύκολα να αποθηκευθούν σε μία ηλεκτρονική βάση δεδομένων και να συγκριθούν με αντίστοιχα δεδομένα που έχουν παραχθεί σε άλλο εργαστήριο άλλη χρονική στιγμή (ως παράδειγμα αναφέρεται η ηλεκτρονική βάση δεδομένων: http://www.mlst.net/). Σημειώνεται πάντως ότι η απλοποίηση και η αυτοματοποίηση της τεχνικής της αλληλούχησης, που πλέον εκτελείται από αυτόματους αναλυτές, έχει επίσης συμβάλει στην υιοθέτηση της τεχνικής αυτής ως μεθόδου τυποποίησης Παραδείγματα τυποποιητικών σχημάτων βακτηριδίων, με ικανότητα αποθήκευσης σε βάσεις δεδομένων αποτελούν: Η τυποποίηση του S pyogenes που βασίζεται στην αλληλούχηση του γονιδίου emm που κωδικογραφεί τη Πρωτεΐνη Μ (Emm genotyping). Η Τεχνική αυτή λοιπόν αποτελεί εξέλιξη της ορολογικής τυποποίησης των στρεπτόκοκκων κατά Lansefield (27). H τυποποίηση του S aureus και κυρίως του MRSA που βασίζεται στην αλληλούχηση τμήματος του γονιδίου της πρωτεΐνης Α (28) (βλέπε και: http://www.seqnet.org). Τονίζεται εδώ ότι το μικρό μέγεθος των ιών έχει είδη καταστήσει την αλληλούχηση μέρους ή και όλου του γενετικού υλικού του ιού, εξαιρετικά δημοφιλή τυποποιητική μέθοδο αυτών. Ως παραδείγματα αναφέρεται η μελέτη της επιδημιολογίας του ιού της Ιλαράς (28) και του ιού της πολιομυελίτιδας(29). Μια άλλη προσέγγιση στην τυποποίηση των μικροοργανισμών (κυρίως βακτηριδίων αλλά και ιών, βασίζονται στην ανίχνευση της θέσης και του αριθμού ειδικών αλληλουχιών στο χρωμόσωμα του μικροοργανισμού. Τέτοιες θέσεις μπορεί να είναι: Θέσεις όπου δρουν κάποια περιοριστικά ένζυμα. Με τον τρόπο αυτό (πέψη με περιοριστικό ένζυμο και σύγκριση των ηλεκτροφορητικών προτύπων) μπορούν να τυποποιηθούν μικρά μόρια όπως είναι τα πλασμίδια ή οι ιοί αλλά, και μεγάλα μόρια, όπως το γενετικό υλικό των βακτηρίων, με κατάλληλες τροποποιήσεις της τεχνικής πέψης και ηλεκτροφόρησης. Αλληλουχίες εισδοχής (insertion sequences) ή επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (repetitive sequences), που βρίσκονται στο χρωμόσωμα των μικροοργανισμών και ανιχνεύονται με τροποποιήσεις της τεχνικής PCR. Παρακάτω περιγράφονται αδρά οι κυριότερες μοριακές μέθοδοι τυποποίησης. Ηλεκτροφόρηση σε Παλλόμενο Ηλεκτρικό Πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis- PFGE) (Eικόνες 20-24) 9

Μια κατηγορία μοριακών μεθόδων τυποποίησης βασίζεται στην πέψη του χρωμοσώματος των υπό μελέτη μικροοργανισμών με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και την ηλεκτροφόρηση των θραυσμάτων που προκύπτουν σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι διαφορές των ηλεκτροφορημάτων που απεικονίζουν τις διαφορετικές θέσεις που δρουν οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες στο χρωμόσωμα κάθε στελέχους, είναι γνωστές ως restriction pattern lengh polymorphisms (RFLPs). Οι κοινές περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν θέσεις που επαναλαμβάνονται συχνά στο μικροβιακό χρωμόσωμα, με αποτέλεσμα να το κόβουν σε πολυάριθμα κομμάτια και η σύγκριση ηλεκτροφορημάτων να είναι από δύσκολη έως αδύνατη. Αν όμως χρησιμοποιηθεί μια περιοριστική ενδονουκλεάση που αναγνωρίζει σπάνιες θέσεις του χρωμοσώματος, προκύπτουν λιγότερα θραύσματα και, συνεπώς, πιο «ευανάγνωστο» ηλεκτροφορητικό πρότυπο. Επειδή τα θραύσματα που προκύπτουν στην τελευταία περίπτωση είναι πολύ μεγάλα, είναι αδύνατο να διαχωριστούν με συμβατική ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis-PFGE) επιτρέπει το διαχωρισμό τμημάτων DNA μεγαλύτερων των 1000 kbp. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της PFGE έχουν θεσπιστεί κριτήρια, με βάση τα οποία συγκρίνονται οι διαφορές στα πρότυπα πέψεων μεταξύ διαφορετικών isolates και του πιθανού επιδημικού στελέχους και εκτιμάται η πιθανότητα να ανήκουν τα isolates αυτά στον επιδημικό κλώνο. Επειδή αναλύεται ένα μεγάλο ποσοστό, αλλά όχι ολόκληρο το γενετικό υλικό του μικροοργανισμού, τα isolates που έχουν ίδια πρότυπα χαρακτηρίζονται «μη διακριτά» (indistinguishable) και όχι όμοια. Χάρη στην αναπαραγωγιμότητα και τη μεγάλη διακριτική της ικανότητα, η PFGE αποτελεί μέθοδο αναφοράς σε πολλά είδη βακτηριδίων, όπως ο MRSA(30 - Εικόνα 24) Σήμερα, μέσω διεθνών συνεργασιών έχει επιτευχθεί πολύ υψηλή προτύπωση της τεχνικής, γεγονός που έχει επιτρέψει τη δημιουργία βάσεων δεδομένων, που βασίζονται στην σύγκριση εικόνων ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA. Τέτοια βάση δεδομένων είναι το Αμερικάνικο Pulse-NET (http://www.cdc.gov/pulsenet/), αλλά και το Ευρωπαϊκό http://www.pulseneteurope.org. Μέθοδοι που βασίζονται στην PCR (Polymerase Chain Reaction Αλυσωτή Αντίδραση Πολυμεράσης) (Eικόνα 25) Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στον πολλαπλασιασμό τμημάτων του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού, με χρήση κατάλληλων εκκινητών. Οι απλούστερες μέθοδοι αυτής της κατηγορίας βασίζονται στην χρήση ενός τυχαίου εκκινητή, που δεν στοχεύει σε κάποια συγκεκριμένη αλληλουχία του προς μελέτη βακτηριακού DNA. Τέτοιες είναι η AP (arbitrarily primed) PCR και η μέθοδος RAPD (random amplified polymorphic DNA). Κατά την εκτέλεση των παραπάνω τεχνικών, χρησιμοποιείται χαμηλή θερμοκρασία υβριδισμού του εκκινητή στο DNA-στόχο, έτσι ώστε να επιτυγχάνεται ατελής υβριδισμός σε πολλαπλές τυχαίες θέσεις του χρωμοσώματος. Τα πλεονεκτήματα των μεθόδων αυτών είναι η ταχύτητα και η ευκολία στην εφαρμογή τους. Το μειονέκτημά τους είναι η πολύ χαμηλή αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων τους, εξ αιτίας των μη ειδικών συνθηκών (χαμηλή θερμοκρασία) που απαιτούνται για την επιτυχία τους, που τις καθιστά ιδιαίτερα ευάλωτες ακόμη και στις ελάχιστες διαφοροποιήσεις των συνθηκών. Πιο εξιδεικευμένες μέθοδοι (ERIC και REP PCR) εκμεταλλεύονται την παρουσία επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στο χρωμόσωμα ορισμένων βακτηριακών ειδών. Με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τις αλληλουχίες αυτές, πολλαπλασιάζονται τα τμήματα DNA 10

που βρίσκονται μεταξύ τους. Οι περιοχές μεταξύ των επαναλαμβανόμενων στοιχείων διαφέρουν σε μέγεθος στα διαφορετικά στελέχη, με αποτέλεσμα να παράγονται τμήματα διαφορετικών μεγεθών για κάθε στέλεχος, και συνεπώς να προκύπτουν διαφορετικά ηλεκτροφορητικά πρότυπα..η AFLP (amplified fragment lengh polymorphism) χρησιμοποιεί συνδυασμό πέψης του DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και PCR. Ειδικότερα, το DNA πέπτεται κατά τρόπο ώστε να προκύψουν πολυάριθμα θραύσματα. Στη συνέχεια, τα θραύσματα πολλαπλασιάζονται με PCR, χρησιμοποιώντας όμως εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί κατά τρόπο ώστε να είναι ομόλογοι μόνο με το ¼ των θραυσμάτων, και τέλος τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορούνται. Η AFLP είναι απλή στην εφαρμογή της και έχει μεγάλη αναπαραγωγιμότητα, γεγονός που επιτρέπει τη δημιουργία βάσης δεδομένων με πρότυπα AFLP από διαφορετικά εργαστήρια. Ριβοτυπία (Eικόνες 26-27) Το ριβοσωματικό RNA έχει ήδη αναφερθεί ως ένα πολύ χρήσιμο «βιολογικό» ρολόι για την φυλογενετική ταξινόμηση των μικροοργανισμών φέρει όμως και αλληλουχίες χρήσιμες στην τυποποίηση (ριβοτυπία). Η μέθοδος βασίζεται στην πέψη του γενετικού υλικού με κάποιο συνηθισμένο περιοριστικό ένζυμο, οπότε προκύπτει μεγάλος αριθμός θραυσμάτων. Τα θραύσματα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης και μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Southern blot). Στη συνέχεια, γίνεται υβιδισμός με σημασμένο ανιχνευτή, ειδικό για τα γονίδια του ριβοσωματικό RNA. Με τον τρόπο αυτό αναδεικνύεται ο αριθμός των αντιγράφων των γονιδίων του ριβοσωμικού RNA, ο οποίος διαφέρει μεταξύ διαφορετικών στελεχών. Η ριβοτυπία έχει μικρότερη διακριτική ικανότητα από την PFGE και τις τυποποιητικές μεθόδους που βασίζονται στην PCR. Παρ όλα αυτά, χρησιμοποιείται για την τυποποίηση διαφόρων μικροοργανισμών, κυρίως γιατί μπορεί να αυτοματοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό, γεγονός που εξασφαλίζει την επαναληψιμότητα και την ευκολία στην εφαρμογή της. Ανάλυση πλασμιδιακού περιεχομένου Η μελέτη του πλασμιδιακού περιεχομένου ήταν η πρώτη μοριακή μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την τυποποίηση βακτηριακών στελεχών. Η μέθοδος συνίσταται στην απομόνωση του πλασμιδιακού DNA των υπό μελέτη στελεχών και τη σύγκριση του αριθμού και των μεγεθών τους, μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης. Όταν τα πλασμίδια έχουν πολύ μεγάλο μέγεθος (100-150 kb), ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόηση είναι δύσκολος, οπότε η πέψη τους με κάποια περιοριστική ενδονουκλεάση πριν την ηλεκτροφόρηση διευκολύνει τη σύγκριση. Η μέθοδος της ανάλυσης του πλασμιδιακού περιεχομένου έχει μικρή διακριτική ικανότητα, καθώς τα πλασμίδια είναι ανεξάρτητες γενετικές μονάδες, που μπορούν να μετακινηθούν μεταξύ διαφορετικών στελεχών του ίδιου, αλλά και διαφορετικών ειδών. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται κυρίως σε περιπτώσεις που υπάρχει υποψία πλασμιδιακής επιδημίας, γιατί μη σχετιζόμενα μεταξύ τους στελέχη παρουσιάζουν παρόμοιο φαινότυπο αντοχής. Γενικά όλα τα γονίδια του «πρόσθετου κινητού» τμήματος του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού (πλασμίδια, τρανσποζόνια κλπ) μπορεί να χρησιμοποιηθούν για τυποποίηση, μόνο όμως για μελέτες της βραχύχρονης εξέλιξης του μικροβιακού κλώνου στα πλαίσια μιας επιδημίας που κρατά μόνο λίγες μέρες. 11

Μέθοδοι που βασίζονται στον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γενετικού υλικού Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ολόκληρου του γενώματος πολλών μικροβιακών ειδών, που επιτεύχθηκε τα τελευταία χρόνια, οδήγησε στην ανάπτυξη νέων μεθόδων τυποποίησης, που βασίζονται στον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός ή πολλαπλών γενετικών τόπων. Τα αποτελέσματα τους είναι απολύτως αναπαραγώγιμα, έχουν εύκολη και αντικειμενική ερμηνεία και είναι κατάλληλα για τη δημιουργία βάσεων δεδομένων. Τονίζεται εδώ ότι το μικρό μέγεθος των ιών έχει είδη καταστήσει την αλληλούχιση μέρους ή και όλου του γενετικού υλικού του ιού, εξαιρετικά δημοφιλή τυποποιητική μέθοδο αυτών. Ως παραδείγματα αναφέρεται η μελέτη της επιδημιολογίας του ιού της ιλαράς (28) και του ιού της πολιομυελίτιδας (29). SLST (Single Locus Sequence Typing) Η SLST βασίζεται στον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός γονιδίου ή μιας περιοχής του γενώματος, που παρουσιάζει ποικιλομορφία μεταξύ των διαφορετικών στελεχών ενός είδους. H SLST εφαρμόζεται για την τυποποίηση του S aureus και κυρίως του MRSA, που βασίζεται στην αλληλούχιση τμήματος του γονιδίου της πρωτεΐνης Α (31) (βλέπε και: http://www.seqnet.org).επίσης χρησιμοποιείται για την τυποποίηση του S. pyogenes που βασίζεται στην αλληλούχιση του emm γονιδίου που κωδικογραφεί τη πρωτεΐνη Μ (emm genotyping). Η τυποποίηση emm αποτελεί εξέλιξη της ορολογικής τυποποίησης των στρεπτόκοκκων κατά Lansefield (27). MLST (Multi Locus Sequence Typing) Η MLST, που είναι η εξέλιξη της Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), χρησιμοποιεί μεγαλύτερο, και άρα πιο αντιπροσωπευτικό, τμήμα του γενετικού υλικού από την SLST. Ειδικότερα, η MLST συγκρίνει τις αλληλουχίες τμημάτων επτά ή περισσότερων γονιδίων του βασικού μεταβολισμού, που βρίσκονται σε όλα τα στελέχη ενός είδους. Τα γονίδια που παρουσιάζουν έστω και μία διαφορά στην αλληλουχία τους θεωρούνται διαφορετικά αλλήλια. Ο συνδυασμός των αλληλίων που διαθέτει κάθε isolate συνιστά το προφίλ αλληλίων του και το κατατάσσει σε έναν τύπο (sequence type). Επειδή υπάρχουν πολλά πιθανά αλλήλια για κάθε γενετικό τόπο, είναι απίθανο πανομοιότυπα προφίλ αλληλίων να έχουν προκύψει τυχαία. Έτσι, isolates με τα ίδια αλλήλια θεωρούνται μέλη του ίδιου κλώνου. Ως παράδειγμα αναφέρεται το ταξινομητικό σχήμα του Campylobacter jejuni (Εικόνα 28) Το σχήμα αυτό περιλαμβάνει τη μελέτη επτά γονιδίων βασικού μεταβολισμού, των aspartase A, glutamine synthetase, citrate synthase, serine hydroxymethyltransferase, phosphoglucomutase, transketolase και ATP synthase subunit). Επίσης στην Εικόνα 29 φαίνεται παράδειγμα ταξινομητικού σχήματος MLST στελεχών MRSA. (Για παράδειγμα ολοκληρωμένης εφαρμογής της MLST ο αναγνώστης παραπέμπεται στο 22) Ήδη υπάρχουν εκτεταμένες διεθνείς βάσεις δεδομένων, προσβάσιμες από το διαδίκτυο για πολλούς μικροοργανισμούς (βλέπε και: http://www.mlst.net/) (πίνακας στην Εικόνα 30). Όπως ήδη αναφέρθηκε τα γονίδια των ενζύμων του βασικού μεταβολισμού που μελετά η MLST, απαρτίζουν το «σταθερό» τμήμα του γενετικού υλικού και παίζουν ταξινομητικό ρόλο, αλλά και ρόλο στην παρακολούθηση της μακροχρόνιας εξελικτικής πορείας των 12

διαφόρων κλώνων των μικροοργανισμών στο χώρο και τον χρόνο. Έτσι τα όρια μεταξύ της επιδημιολογικής διερεύνησης, της μελέτης της πληθυσμιακής δομής και της φυλογενετικής εξέλιξης του μικροβιακού είδους συγχέονται. Τονίζεται πάντως ξανά ότι επειδή οι μεταλλαγές στα ένζυμα του βασικού μεταβολισμού εμφανίζονται σε σχετικά αργά χρονικά διαστήματα και δεν υφίστανται εξωτερικές πιέσεις επιλογής, η MLST παρακολουθεί την μακρόχρονη πορεία του μικροβιακού κλώνου, είναι συνεπώς κατάλληλη για μακροχρόνιες παρατηρήσεις ενώ γενικά δεν είναι κατάλληλη για την παρακολούθηση βραχύχρονων πχ ενδονοσοκομειακών επιδημικών επεισοδίων. Επιλογή της κατάλληλης μεθόδου τυποποίησης Οι μοριακές μέθοδοι τυποποίησης απαιτούν εξειδίκευση, χρόνο και χρήμα. Γι αυτό, πριν επιλεγεί η κατάλληλη τυποποιητική μέθοδος, πρέπει να αποφασιστεί αν πραγματικά υπάρχει ανάγκη τυποποίησης, αν δηλαδή τα αποτελέσματα της τυποποίησης θα χρησιμοποιηθούν για να ληφθούν μέτρα για τη λύση του υπό διερεύνηση προβλήματος. Η επιλογή της μεθόδου που χρησιμοποιείται, αλλά και η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της, εξαρτώνται αφενός από το προς εξέτασιν μικροβιακό είδος και τα γενετικά-πληθυσμιακά χαρακτηριστικά του, αφετέρου από τις συνθήκες και τα επιδημιολογικά ερωτήματα που τίθενται (διερεύνηση νοσοκομειακών λοιμώξεων, μελέτη διαχρονικής διασποράς μικροοργανισμού, τροφιμογενής επιδημία κλπ). Συνήθως πάντως αυτή η επιλογή γίνεται πειραματικά, σε πραγματικά δεδομένα όπου αποφασίζεται η διακριτική της ικανότητα και γενικά η προσφορά της χρήσης της στη διερεύνηση της επιδημίας. Βιβλιογραφία 1 Satcher D: Emerging Infections: Getting ahead of the Curve. Emerging Infectious Diseases, 1995, 1:1-6 2 Mathers CD, Dejan Loncar D: Updated projections of global mortality and burden of disease, 2002-2030: Data sources, methods and results. World Health Organization October 2005. Υπάρχει στο http://www.who.int/healthinfo/statistics/bodprojectionspaper.pdf. 3 Vitek CR and Wharton M: Diphtheria in the Former Soviet Union: Reemergence of a Pandemic Disease. Emerging Infectious Diseases, 1998, 4:539-550. 4 Morse SS: Factors in the Emergence of Infectious Diseases. Emerging Infectious Diseases, 1995, 1: 7-15. 5 McMichael AJ, Woodruff RE, Hales S: Climate change and human health: present and future risks. The Lancet, 2006, 367:859-869. 6 Wilson ΜΕ: Travel and the Emergence of Infectious Diseases. Emerging Infectious Diseases, 1995, 1: 39-46. 7 Rossello-Mora R, and Amann R: The species concept for prokaryotes. 2001 FEMS Microbiology Reviews 25: 39-67. 8 Daubin V and Perriere G: G+C Structuring Along the Genome: A Common Feature in Prokaryotes. Mol. Biol. Evol. 2003, 20(4): 471 483. 9 Woese CR: Interpreting the universal phylogenetic tree. PNAS, 2000, 18:8392 8396. 10 Salyers ΑΑ, Whitt DD: Bacterial Genetics III: Horizontal Gene Transfer Among Bacteria. Στο: Microbiology: Diversity, Disease, and the Environment. Wiley, 2003, 133-155. 11 Arber W: Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiology Reviews, 2000, 24: 1-7. 12 Bennett PM: Integrons and gene cassettes: a genetic construction kit for bacteria. J Antimicrob Chemoth, 1999, 43, 1 4. 13

13 Mecsas J Strauss EJ.: Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence: Type III Secretion and Pathogenicity Islands. Emerging Infectious Diseases. 1996. 2:271-288. 14 Schmidt H and Hensel M. Pathogenicity Islands in Bacterial Pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews, 2004, 17: 14 56 15 Spratt BG and Maiden MCJ: Bacterial population genetics, evolution and epidemiology. Phil.Trans. R. Soc. Lond. B, 1999, 354, 701-710. 16 Musser JM: Molecular Population Genetic Analysis of Emerged Bacterial Pathogens: Selected Insights. Emerging Infectious Diseases. 1996, 2:1-17. 17 Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H: Secrets of success of a human pathogen: molecular evolution of pandemic clones of meticillinresistant Staphylococcus aureus. THE LANCET Infectious Diseases 2002, 2: 180-189. 18 Souza V, Rocha M, Valera A, Eguiarte LE: Genetic Structure of Natural Populations of Escherichia coli in Wild Hosts on Different Continents. Applied And Environmental Microbiology, 1999, 65:: 3373 3385. 19 Jolley KA, Kalmusova J, Feil EJ, Gupta S, Musilek M, Kriz P, Maiden MCJ: Carried Meningococci in the Czech Republic: a Diverse Recombining Population. Journal Of Clinical Microbiology, 2000, 38: 4492 4498 20 Mcgee L, Mcdougal L, Zhou J, Spratt BG, Tenover FC, George R, Hakenbeck R, Hryniewicz W, Lefe Vre JC, Tomasz A, Klugman KP: Nomenclature of Major Antimicrobial-Resistant Clones of Streptococcus pneumoniae Defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network. Journal Of Clinical Microbiology, 2001, 39:2565 2571. 21 Urwin R and Martin C.J. Maiden M.C.J: Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology. TRENDS in Microbiology, 2003, 11:479-487. 22 Enright MC, Spratt BG: A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology 1998, 144: 3049 3060 23 Singh A, Goering RV, Simjee S, Foley SL, Zervos MJ: Application of Molecular Techniques to the Study of Hospital Infection Clin Microbiol. Rev 2006, 19:512-530. 24 Van Belkum A, Struelens M, de Visser A, Verbrugh H, Tibayrenc M: Role of Genomic Typing in Taxonomy, Evolutionary Genetics, and Microbial Epidemiology. Clin Microbiol. Rev 2001, 14: 547-560. 25 Foxman B, Zhang L, Koopman JS, Manning SD, Marrs CF: Choosing an appropriate bacterial typing technique for epidemiologic studies. Epidemiologic Perspectives & Innovations 2005, 2:10 Biomed Central, accessed at http://www.epi-perspectives.com/content/2/1/10 26 Van Belkum A Molecular Typing of micro-organisms: at the centre of diagnostics, genomics and pathogenesis of infectious Diseases? J Med Microbiol 2002, 51:7-10. 27 Ho PL, Johnson DR, Yue AW, Tsang DN, Que TL, Beall B, Kaplan EL: Epidemiologic analysis of invasive and noninvasive group a streptococcal isolates in Hong Kong. J Clin Microbiol. 2003; 41:937-42. 28 Waku-Kouomou D, Alla A, Blanquier B, Jeantet D, Caidi H, Rguig A, Freymuth F, Wild FT: Genotyping Measles Virus by Real-Time Amplification Refractory Mutation System PCR Represents a Rapid Approach for Measles Outbreak Investigations. J Clin Microbiol, 2006, 44:487-494. 29 Kyriakopoulou Z, Kottaridi C, Dedepsidis E, Bolanaki E, 2 Levidiotou-Stefanou S, Markoulatos P: Molecular Characterization of Wild-Type Polioviruses Isolated in Greece during the 1996 Outbreak in Albania. J Clin Microbiol, 2006, 44:1150-1152. 30 van Belkum A, van Leeuwen W, Kaufmann ME, Cookson B, Forey F, Etienne J, Goering R, Tenover F, Steward C, O'Brien F, Grubb W, Tassios P, Legakis N, Morvan A, El Solh N, de Ryck R, Struelens M, Salmenlinna S, Vuopio-Varkila J, Kooistra M, Talens A, Witte W, Verbrugh H.: Assessment of resolution and intercenter reproducibility of results of genotyping Staphylococcus aureus by pulsed-field gel electrophoresis of SmaI macrorestriction fragments: a multicenter study. J Clin Microbiol. 1998; 36:1653-9. 31 Strommenger Β, Kettlitz C, Weniger T, Harmsen D, Friedrich AW, Witte W: Assignment of Staphylococcus Isolates to Groups by spa Typing, SmaI Macrorestriction Analysis, and Multilocus Sequence Typing. J Clin Microbiol 2006; 44: 2533-40. 14

Εικόνα 1: Τα βακτηρίδια πολλαπλασιάζονται δια διχοτομήσεως. Εικόνα 2: Ο μικροβιακός κλώνος: Βακτηρίδια απόγονοι κοινού προγόνου. Εικόνα 3: ΗδομήτουDNA 15

Εικόνα 4: Ο γενετικός κώδικας Εικόνα 5: Μοριακήβάσητης Μεταλλαγής Εικόνα 6: Κατά την μικροβιακή σύζευξη μεταφέρεται στο κύτταρο δέκτη ένα αντίγραφο του πλασμιδίου από το κύτταρο δότη. 1) T ran sfer is in itiated b y a n ick Single-stranded break in F factor 3) Entering F plasmid Is copied 2) 5 end is transferred Through pilus to the F- cell 4) conjugation converts the F - c ell in to an F + cell 16

Εικόνα 7: Τα Transposons (Μεταθετά στοιχεία) μετακινούνται από μόριο DNA σε μόριο DNA. Εικόνα 8: Insertion Sequences (ΙS): Τα απλούστερα μεταθετά στοιχεία Inverted repeats Direct repeats Εικόνα 9: Σύνθετο τρανσποζόνιο. 17

Εικόνα 10: Ηδομήτουτρανσπoσονίου (Tn3/Tn 21) Εικόνα 11: Το integron και η γονιδιακή κασέτα. Εικόνα 12: Ενσωμάτωση γονιδίων στο integron. 18

Εικόνα 13: Τα 4 νησίδια παθογονικότητας (Pathogenicity Islands) του ουροπαθογόνου στελέχους Escherichia coli 536 Εικόνα 14: Μεταμόρφωση βακτηριακού κυττάρου με γυμνό DNA Εικόνα 15: Μεταφορά γενετικού υλικού με φάγους Both generalized and specialized transduction use phage as a vector to transfer genes between bacteria. Fig. 18.13 Copyright 2002 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings 19

Σωματικά (Ο) αντιγόνα Εικόνα 16: Οροτυπία Βλεφαριδικά (Η) αντιγόνα Καψιδικά αντιγόνα Εικόνα 17: Λυσσιτυπία Κάθε μικροβιακός κλώνος λύεται από συγκεκριμένο συνδυασμό φάγων Εικόνα 18 Βιότυπος Κάθε μικροβιακός κλώνος παρουσιάζει συγκεκριμένη βιοχημική συμπεριφορά 20

Εικόνα 19. Φαινότυπος αντοχής Κάθε μικροβιακός κλώνος παρουσιάζει αντοχή (η ευαισθησία) σε συγκεκριμένο συνδυασμό αντιβιοτικών Εικόνα 20. PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) PFGE - DNA is Extracted and Cut Isolate DNA from bacterial cells Cut the DNA into pieces Εικόνα 21. PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) CHEF Switch Time Electric Field 1 Electric Field 2 - - - - - - - - + + + + + + + + 21

Εικόνα 22 Εικόνα 23. Markogiannakis et all 2001 Multiple clones within multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium phage type DT104. Εικόνα 24: Τυποποίηση MRSA με PFGE (από: 30) 22

Εικόνα 25. ARBITRARILY PRIMED PCR. Εικόνα 28 Εικόνα 27 23

Εικόνα 28. Multilocus Sequence Typing System for Campylobacter jejuni Γονίδια ενζύμων βασικού μεταβολισμού και θέση τους στο χρωμόσωμα. AspA (aspartase A) glna (glutamine synthetase) glta (citrate synthase) glya (serine hydroxymethyltransferase), pgm (phosphoglucomutase), tkt (transketolase), and unca (ATP synthase subunit). Εικόνα 29: Παράδειγμα MLST ανάλυσης στελεχών MRSA. Από Fossum, A. E. & Bukholm, G, Clinical Microbiology and Infection 2006, 12: 627-633 Πίνακας 30: Βάσεις Δεδομένων MLST 24