Baltymų ų skirstymas Chromatografija Baltymų elektroforezinis skirstymas Kapiliarinė elektroforezė SDS/PAGE Izoelektrofokusavimas Dvimatė elektroforezė 2-DIGE sistema
Kodėl analizuojamas proteomas? DNR seka pilnai neatspindi biologinių funkcijų Vienas genas gali koduoti daugiau negu vieną baltymą Genų persitvarkymai RNR sukirpimas (splicing) Baltymų ų modifikacijos Skirtingai nei genomas, proteomas nėra fiksuotas S kirtumai tarp skirtingų ląstelės tipų Audinių skirtumai Vystymosi stadijų skirtumai Aplinkos poveikiai
Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė proteomika Identifikuojama ir tiriama baltymų tam tikra grupė
Tikslinė proteomika kiekybiniai pasikeitimai : kiekis kkbiii kokybiniai pasikeitimai ikiti i: potransliacinės i ė modifikacijos (PTMs) subląstelinės frakcijos : branduoliai, citozolis, membranos, mitochondrijos, citoskeletas. funkciniai įvertinimai : baltymų sąveikos
Chromatografija Chromatography color ir to write Pirmą kartą aprašyta Tswett 1906 metais; metodas augalų pigmento skyrimui per kolonėlę užpildytą CaCO3; pridėjus augalų ekstrakto buvo gautos spalvotos juostelės plaunant kl kolonėlę organiniais i i tirpikliais ikli i Chromatografijos apibrėžimas: metodologija įgalinanti atskirti komponentus pagal skirtingą judėjimą j dėl skirtingo poliariškumo komponentai yra atskiriami dėl skirtingo afiniškumo
Chromatografijoje naudojamų matricų tipai Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2002
Kapiliarinė Elektroforezė (Capillary electrophoresis, CE) Išvystyta 1960 kapiliarinė elektroforezė (CE) naudojama keletoje sričių. CE rutiniškai naudojama daugelyje ligoninių ų ir klinikų, ų,ypač tiriant serumo baltymus ir ligų žymenis. Skirstymas priklauso nuo krūvio/dydžio santykio. Puikiai skirsto makromolekules su krūviu (baltymai, nukleino rūgštys) Naudojama DNR tyrimuose. Kapiliarinės elektroforezės privalumai: - didelis efektyvumas šimtai komponentų gali būti išskirti tuo pačiu metu, - automatizuotas, - reikia mažai pavyzdžio, - gali būti naudojamas kiekybiniam įvertinimui.
Kapiliarinė Elektroforezė Elektroforezės atskyrimo metodas paremtas dalelių su krūviu judėjimu elektros lauke. Elektroferograma panaši į chromatogramą. ą Metodas vykdomas: - buferiu užpildytame kapiliare 10-100 µm diametro ir 40-100 cm ilgio, - kapiliaras patalpinamas tarp dviejų buferio rezervuarų, kuriuose yra elektrodai, - pavyzdys užnešamas i vieną kapiliaro pusę, - tarp dviejų elektrodų 10-30 kv įtampa, - molekulės registruojamos detektoriumi, kuris paprastai būna priešingoje kapiliaro pusėje nei užnešamas pavyzdys.
Kapiliarinės elektroforezės tipai Kapiliarinė i ė zonų elektroforezė lkt ė Kapiliarinis izoelektrofokusavimas Kapiliarinė SDS elektroforezė Kapiliarinė izotakoforezė Ir kt.
Kapiliarinės elektroforezės trūkumai Kai kurias medžiagas sunku paskirstyti KE. Skirstymo pagerinimui yra modifikuojama buferio sudėtis arba įtampa.
2D gelių elektroforezė (2DE, IEF/PAGE) Izoelektro fokusavimas (IEF) Bl Baltymas juda jd pagal savo izoelektro lk tašką, Baltymas sustoja ties ph, kur baltymo krūvis yra neutralus. SDS-PAGE baltymas juda poliakrilamido matriksu pagal molekulinį lkliįsvorį. į
Mėginio užnešimas ir pasiskirstymas (Imobilizuotas ph Gradientas - IPG) 3 10 Rehidratacija + - n - + 3 10 20 h n Sausas strypeli (Drystrip) Išbrinkintas strypelis (Drystrip) 3500 V Pasiskirstymas pagal baltymo Pi
2DE - 200 96 kda 5 h 66 50 MW 40 30 16 + 10
2DE 1 kryptis pi Pasiskirstymas pagal krūvį (izoelektrinis fokusavimas) ph 3 ph 10 2k kryptis Pasiskirstymas pagal molekulinį svorį (SDS-PAGE) kda
Baltymų ų analizė: izoelektrinis fokusavimas (skirstymas pagal krūvį) Izoelektrinio fokusavimo principai Izoelektrinis fokusavimas vyksta ph gradiente. ph gradientą formuoja specialios amfoterinės ė molekulės lklė (amfolitai), i) turinčios buferio savybes, esančios laidžios ir tirpios jų pi taške. ph gradientas yra sukuriamas elektros lauko. Prieš elektros lauko sukūrimą gelis turi vienodą ph-vertę. Sukūrus elektros lkt lauką, neigiamą ii krūvį ū į turintys t amfolitai i jd juda link lik anodo, teigiamą krūvį turintys link katodo, o jų greitis priklauso nuo bendro krūvio. Katodo pusėje yra aukštesnis ph nei anodo pusėje. Amfolitai išsirikiuoja tarp katodo ir anodo priklausomai nuo jų pi ir tokiu būdu sąlygoja savo aplinkoje atitinkamą ph. Suformuojamas ph gradientas priklausomai nuo naudojamų amfolitų mišinio. Kadangi amino rūgštys turi amfoterinių savybių ir turi teigiamą krūvį ph, kuris yra žemiau jų pi ir neigiamą aukščiau jų pi reikšmės, todėl baltymai elektros lauke juda link jų pi. Daugelio baltymų pi yra tarp 5 ir 8,5.
Amfolitai Amfolitai molekulės, turinčios ir rūgštines, ir bazines grupes, todėl yra amfoterinės. Iš graikų kalbos ampho- (αµφί-) reiškia abu". Dėl šių savybių ų jos yra zviterjonai tam tikroje phreikšmėje. ph reikšmė, kurioje bendras krūvis lygus 0 yra molekulės izoelektrinis taškas.
Kas yra IEF? IEF vyksta ph gradiente. Baltymai yra amfoterinės molekulės, turinčios rūgštines ir bazines grupes (šoninės grandinės). Bazinėje aplinkoje rūgštinės grupės įgyja neigiamą krūvį. Rūgštinėje aplinkoje bazinės grupės įgyja teigiamą krūvį. Baltymo krūvis yra visų amino rūgščių šoninių grandinių krūvių suma. Izoelektrinis taškas (pi) tai ph, kuriame baltymo krūvis lygus nuliui.
ph gradiento sukūrimas A. Klasikinė IEF metodika Amfolitai isukuria ph gradientą. B. Moderni IEF metodika Imobilizuotas ph gradientas.
A. Klasikinė IEF metodika Amfolitai sukuria ph gradientą. Pirmą kartą pasiūlyta Svensson (1961). Praktikoje tai realizavo Vesterberg (1969). Dirbtinai sukurtas ph gradientas: alifatiniųų oligoamino-oligokarboksilo g rūgščių izomerų sintezė. CH 2 N (CH 2 ) x N (CH 2 ) x (CH 2 ) x (CH 2 ) x NR 2 COOH R = H ar or (CH 2 ) x -COOH, X=2 X 2 ar or 3
Sintetiniai amfolitai v.s. natūralūs amfolitai Sintetiniai amfolitai: Geros buferinės savybės ir geras tirpumas pi taške. Tinkamas elektros laidumas pi taške. Biologinių efektų nebuvimas. Mažas molekulinis svoris. Natūraliai esantys amfolitai: Amino rūgštys ir peptidai. Neturi savybių, išvardintų aukščiau. Negali būti naudojami IEF.
Amfolitų krūvis Neigiamą (-) krūvį turintys amfolitai Juda link anodo (+). Turi grupes -COO - Ti Teigiamą i (+)krūvį ū į turintys t amfolitai i Juda link katodo(-). Turi grupes NH + 3
Problemos vykdant tradicinę IEF 1. Ilgas IEF vykdymo laikas. Baltymai šalia jų pi yra mažiau judrūs. Denatūruoti polipeptidai gelyje juda lėčiau nei natyvūs baltymai. 2. Gradiento šleifas. ph gradientas tampa nestabilus. Baziniai baltymai išeina iš gelio. 3. Baltymai juda kaip papildomai pridėti amfolitai. Baltymai pakeičia ph gradientą.
B. Moderni IEF metodika Imobilizuotas ph gradientas, IPG Pirmas pasiūlė Righetti, (1990). Imobilizuotas ph gradientas sukurtas akrilamido junginių (Immobilines) pagalba. Imobilinai yra silpnos rūgštys ar bazės. Bendra struktūra. CH 2 CN C N CH 2 CN C N H CH 2 CN CO NH R CH 2 CN CO NH H 2 N O H O H R = amino ar karboksilo kil grupėė Akrilamidas id
Komerciniai imobilizuoto ph gradiento geliai (IPG strips) Pasiūlyti Gorg. A. Ref: Gorg. A (1994), Westermeier (2001) Geliai gali būti saugomi -20 to -80 C.
Amfolitų pasirinkimo kriterijai Platus ph spektras nežinomų pavyzdžių skirstymui. i Pasirinktų baltymų skirstymas siauruose ph gradientuose. Koncentracija 2-8%.
Siauro ph gradiento amfolitų pasirinkimo kriterijai Rezoliucijos ij pagerinimui i i ph gradiento stabilizavimui aukšto ir žemo ph srityse Siauro ph srityse amfolitai gali būti naudojami kartu su plataus ph spektro amfolitais i Tačiau naudojant siauro ph spektro amfolitus pasiekiamas geresnis pi kalibracijos tikslumas Siauro ph gradiento atveju naudojami tie patys elektrolitai lit i kaip ir plataus ph gradiento atveju
Baltymų ų vizualizavimas 2DE geliuose Dažymas Kumasi Sidabras Fluorescentiniai dažai Matomas baltymų kiekis >75 ng >5 ng >5 ng Kumasi Sidabras Fluorescentiniai dažai
2DE gelių ų analizė ir baltymo dėmių ų įvertinimas Vaizdo analizės programinė įranga, g,pvz. Bio-Rad PDQuest -Vaizdų palyginimai, -Baltymo dėmių įvertinimas, Baltymo dėmių -Baltymo dėmių charakterizavimas.
Pasitaikančios klaidos vykdant 2DE Nesusifokusavęs mėginys Nešvarus rehidratacinis i i tirpalas Pavyzdžio agregacija Veritkalios juostos dėl polimerizacijos klaidų ir kt.
Kritiniai veiksniai 2DE Reproduktyvumas: daugiapakopė p procedūra atvira įvairovei Patikimumas: ypač kokybiniam įvertinimui Įtikinamumas: naudoja kitus, papildomus metodus Pavyzdžio paruošimas: Kruopštus, pastovus metodas sąlygoja nepilną baltymo tirpumą, disagregaciją, denaūraciją ir redukavimą
IEF ko vengti NaCl < 10 mm SDS < 0.25% Tris < 50 mm Nukleino rūgščių fenolų šildymo fosfatų lipidų netirpių medžiagų
Proteomikos eiga Baltymo išskyrimas Analizė ir pasirinkimas Baltymo paruošimas proteominei analizei (tripsinizacija) Masių spektrometrija Skaitiniai metodai