ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΟΣΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1α. Μορφολογική εξέταση και ταυτοποίηση κυττάρων αίματος 1β. Απομόνωση Λεμφοκυττάρων μονοπύρηνων κυττάρων - από περιφερικό αίμα 2. Βασικές Αρχές Κυτταρομετρίας Ροής (Flow cytometry, FACS) Ανοσοδοκιμασία : ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσεως με σύνδεση ενζύμου (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 3α. Ανοσοφθορισμός (Immunofluorescence, IFT) 3β. Ανοσοδοκιμασία : ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσεως με σύνδεση ενζύμου (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
1 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ Μορφολογική εξέταση των κυττάρων του αίματος ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΑ ΑΙΜΑΤΟΣ (BLOOD SMEARS/FILMS) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΧΡΩΣΗ (MGG STAIN)
Οδηγίες για την ασφαλή διεξαγωγή του πειράματος: Φοράμε τις εργαστηριακές ποδιές. Το αίμα θεωρείται πάντοτε ΜΟΛΥΣΜΑΤΙΚΟ. Φοράμε γάντια όταν χειριζόμαστε αντικείμενα επιμολυσμένα με αίμα!!!! Τα επιμολυσμένα ΑΙΧΜΗΡΑ αντικείμενα τοποθετούνται σε ειδικό waste δοχείο που περιέχει χλωρίνη. Τα επιμολυσμένα ΜΗ ΑΙΧΜΗΡΑ αντικείμενα τοποθετούνται στις μαύρες σακούλες της επιφάνειας εργασίας.
1. Ποια είναι τα κύτταρα του αίματος; 2. Ποια είναι η λειτουργία των κυττάρων του αίματος ; 3. Ποια είναι τα απύρηνα κύτταρα του αίματος ; Ποια τα εμπύρηνα και ποια είναι απλά θραύσματα ; 4. Αν από το αίμα (+αντιπηκτικό) αφαιρέσουμε τα κύτταρα παραμένει το ΠΛΑΣΜΑ. Με ποιο τρόπο μπορούμε να διαχωρίσουμε τα κύτταρα από το πλάσμα 5. Ποια από τα κύτταρα του αίματος είναι ετερογενή ; 6. Ποια κύτταρα του αίματος παρουσιάζουν ενδιαφέρον ως προς την ποικιλομορφία τους και θα μελετήσουμε σήμερα ;
Τι είναι το Αίμα; Το αίμα είναι ένας εξειδικευμένος τύπος συνδετικού ιστού που αποτελείται από κύτταρα, τα οποία αιωρούνται μέσα σε ένα υγρό, το πλάσμα. Στον ενήλικα υπάρχουν 5,5 λίτρα αίματος
Ποια είναι τα κύτταρα του αίματος;
Αίμα = Λευκοκύτταρα + Ερυθροκύτταρα + Αιμοπετάλια Αίμα - κύτταρα = ΠΛΑΣΜΑ Αίμα - ινική = ΟΡΟΣ (ινωδογόνο ινική)=σχηματισμοσ ΘΡΟΜΒΟΥ) Αίμα + αντιπηκτικό φυγοκέντρηση ΠΛΑΣΜΑ κύτταρα Αίμα φυγοκέντρηση ΟΡΟΣ
Κύτταρα στο περιφερικό αίμα: ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΑ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΑ ή ΚΟΚΚΙΟΚΥΤΤΑΡΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ* ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΑ ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΑ Β λεμφοκύτταρα ΒΑΣΕΟΦΙΛΑ Τ λεμφοκύτταρα *Τα μονοκύτταρα που εξέρχονται στους ιστούς ονομάζονται ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ!
ΕΙΔΗ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΤΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΤΟΥΣ ΣΤΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΑΙΜΑ Ουδετερόφιλα 50-70% Ηωσινόφιλα 2-5% Βασεόφιλα 0.2% Λεμφοκύτταρα 20-30% Μονοκύτταρα 2-6%
ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ (lymphocytes) Εμφάνιση: Τα λεμφοκύτταρα έχουν ένα στρόγγυλο προς οβάλ πυρήνα και το μέγεθός τους μοιάζει περίπου το μέγεθος των ερυθροκυττάρων. Το κυτταρόπλασμα χρωματίζεται γκρι-μπλε. Ο όγκος του κυτταροπλάσματος μπορεί να ποικίλει πολύ. Ως αποτέλεσμα αυτού, το μέγεθος του κυττάρου ποικίλλει από 9 έως 20 μm. Η διαφορά στον όγκο του κυτταροπλάσματος είναι η αιτία διάκρισης των λεμφοκυττάρων σε μικρά και μεγάλα
ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΑ (monocytes) Εμφάνιση: Με διάμετρο 15-20 μm τα μονοκύτταρα είναι τα μεγαλύτερα κύτταρα του περιφερικού αίματος. Η μορφή τους είναι ετερογενής. Μπορούν να σχηματίζουν ψευδοπόδια στην εξωτερική μεμβράνη. Το κυτταρόπλασμα είναι μπλε-γκρι και πολύ συχνά παρουσιάζουν λεπτά αζουρόφιλα κοκκία και οργανίδια. Ο πυρήνας μπορεί να είναι πεταλοειδής ή να παρουσιάζει λοβούς.
ΒΑΣΕΟΦΙΛΑ (basophils) Εμφάνιση: Το βασεόφιλο κοκκιοκύτταρο με διάμετρο 10-14 μm έχει παρόμοιο μέγεθος με το ουδετερόφιλο. Τα σκούρα μωβ κοκκία είναι πολύ πυκνά πακεταρισμένα και επικαλύπτουν τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Τα κοκκία έχουν ενδιάμεσο μέγεθος ανάμεσα στα κοκκία των ουδετερόφιλων και των ηωσινόφιλων. Τα βασεόφιλα έχουν παθολογικά κοκκία σε διάφορες κληρονομικές καταστάσεις.
ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΑ (neutrophils) Εμφάνιση: Ταινιοειδή ουδετερόφιλα (band neutrophils) Ο πυρήνας μοιάζει με λυγισμένη ταινία εν μέρει με στενώσεις Τετμημένα ουδετερόφιλα (segmented neutrophils) Ο πυρήνας γίνεται νηματοειδής σε κάποιες θέσεις
ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΑ (eosinophils) Εμφάνιση: Τα ηωσινόφιλα κοκκιοκύτταρα έχουν διάμετρο 12-17 μm, είναι στρόγγυλα και πολύ λίγο μεγαλύτερα από τα ουδετερόφιλα. Τα κοκκία των ηωσινοφίλων είναι σφαιρικά και σημαντικά μεγαλύτερα από εκείνα των ουδετεροφίλων, καλύπτουν το κυτταρόπλασμα, είναι πολύ πυκνά πακεταρισμένα και βάφονται ανοιχτά κόκκινα προς πορτοκαλί-κίτρινα. Ο πυρήνας είναι συνήθως δίλοβος.
Γιατί είναι σημαντικό να καταμετρήσουμε τους επιμέρους πληθυσμούς των λευκοκύτταρων; Αλλαγές στους λευκοκυτταρικούς πληθυσμούς σε παθολογικές καταστάσεις Παθολογική κατάσταση Μόλυνση από πρωτόζωα, κακή διατροφή Eξαντλητική άσκηση, ρευματοειδής πυρετός, εγκαύματα Μαγουλάδες, κοκκύτης Παρασιτικές μολύνσεις, αλλεργίες Χρόνιες ασθένειες όπως φυματίωση, λευχαιμία Χορήγηση γλυκοκορτικοειδών φαρμάκων Σύμπτωμα Ουδετεροφιλική λευκοπενία Ουδετεροφιλική λευκοκυττάρωση Λεμφοκυττάρωση Εωσινοφιλία Μονοκυττάρωση Λεμφοκυτταροπενία
Επίχρισμα αίματος (blood smear) ΤΟ ΑΙΜΑ ΘΕΩΡΕΙΤΑΙ ΠΑΝΤΑ ΜΟΛΥΣΜΑΤΙΚΟ!!!!!!!!!!!!!
ΧΡΩΣΗ May-Grünwald Giemsa (MGG STAIN) Μπλέ του μεθυλενίου Κυανό Εωζίνη ΜΠΛΕ ΚΟΚΚΙΝΟ- ΜΩΒ ΚΟΚΚΙΝΟ- ΠΟΡΤΟΚΑ ΛΙ RNA,ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ, ΠΥΡΙΝΙΣΚΟΙ DNA, ΠΡΩΤΟΓΕΝΗ ΚΟΚΚΙΑ ΑΙΜΟΓΛΟΒΙΝΗ, ΕΩΖΙΝΟΦΙΛΙΚΑ ΚΟΚΚΙΑ