ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ, ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ & ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΓΕΝΕΣΗΣ ΚΑΤΑ ΜΗΚΟΣ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΝΗΛΙΚΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΧΡΥΣΑΝΘΗ Σ. ΜΠΕΚΙΑΡΗ Κτηνίατρος Θεσσαλονίκη, 2015 1

2

Χρυσάνθη Σ. Μπεκιάρη ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΓΕΝΕΣΗΣ ΚΑΤΑ ΜΗΚΟΣ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΝΗΛΙΚΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Κτηνιατρικής, Τομέα Δομής και Λειτουργίας των Ζωικών Οργανισμών, Ημερομηνία προφορικής εξέτασης:. Συμβουλευτική Επιτροπή Καθηγητής Γ. Χ. Παπαδόπουλος (επιβλέπων) Καθηγήτρια Ε. Μιχαλούδη-Παύλου Επίκουρη Καθηγήτρια Α. Τσιγκοτζίδου Εξεταστική Επιτροπή Καθηγήτρια Ε. Μιχαλούδη-Παύλου Καθηγητής Γ. Χ. Παπαδόπουλος Καθηγήτρια Α. Σιόγκα Αναπληρωτής Καθηγητής Ν. Γρηγοριάδης Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ι. Δωρή Επίκουρη Καθηγήτρια Α. Τσιγκοτζίδου Λέκτορας Ι. Γρίβας 3

ΧΡΥΣΑΝΘΗ Σ. ΜΠΕΚΙΑΡΗ Α.Π.Θ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΓΕΝΕΣΗΣ ΚΑΤΑ ΜΗΚΟΣ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΝΗΛΙΚΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ISBN «Η έγκριση της παρούσας διδακτορικής διατριβής από το τμήμα Κτηνιατρικής της σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (νόμος 5343/1932, άρθρο 202 παρ.2). 4

Στο πλαίσιο εκπόνησης της παρούσας διατριβής χορηγήθηκε στην κ. Μπεκιάρη υποτροφία Αριστείας από την Επιτροπή Ερευνών του Α.Π.Θ. για τα έτη 2011 και 2012. 5

6

Στους γονείς μου και τον αγαπημένο μου αδερφό 7

8

Πίνακας περιεχομένων ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 15 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 23 1.1. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός: σύντομη περιγραφή... 23 1.2. Η οδοντωτή έλικα... 25 1.2.1. Κυτταροαρχιτεκτονική της οδοντωτής έλικας... 25 1.2.1.1. Μοριώδης στιβάδα... 26 1.2.1.2. Κοκκώδης στιβάδα... 27 1.2.1.3. Πολύμορφη στιβάδα... 29 1.2.2. Συνδεσμολογία της οδοντωτής έλικας... 31 1.2.2.1. Συνδέσεις μεταξύ των στιβάδων της οδοντωτής έλικας... 31 1.2.2.2. Προσαγωγοί συνδέσεις της οδοντωτής έλικας... 33 1.2.3. Λειτουργία της οδοντωτής έλικας... 35 1.2.4. Η νευρογένεση στην οδοντωτή έλικα του ενήλικου εγκεφάλου... 36 1.2.4.1. Τα διαδοχικά στάδια ανάπτυξης των νέων νευρώνων (μορφολογική και ανοσοϊστοχημική ταυτοποίηση... 37 1.2.4.1.1. Τα νευρικά στελεχιαία κύτταρα της υποκοκκώδους ζώνης... 38 1.2.4.1.2. Τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα... 41 1.2.4.1.3. Τα μετα-μιτωτικά ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα... 44 1.2.4.1.4. Τα νέα ώριμα κοκκοειδή κύτταρα... 47 1.2.4.2. Λειτουργία των νέων κοκκοειδών κυττάρων της οδοντωτής έλικας... 49 1.2.5. Η αστρογλοιογένεση στην οδοντωτή έλικα του ενήλικου εγκεφάλου... 51 1.2.6. Διαφορές κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας... 52 1.2.6.1. Διαφοροποίηση κατά τη μορφογένεση της οδοντωτής έλικας... 53 1.2.6.2. Κυτταρικές και αγγειακές διαφορές... 55 1.2.6.2.1. Κοκκοειδή κύτταρα... 55 1.2.6.2.2. Βρυώδη κύτταρα... 57 1.2.6.2.3. Διάμεσοι νευρώνες... 57 1.2.6.2.4. Αστροκύτταρα... 59 1.2.6.2.5. Αγγείωση... 59 1.2.6.3. Διαφορές στη γονιδιακή έκφραση... 60 1.2.6.4. Διαφορές στη συνδεσμολογία... 63 1.2.6.5. Λειτουργικές διαφορές... 66 1.2.6.6. Διαφορές στην εγκατάσταση και εξέλιξη σοβαρών παθήσεων του ΚΝΣ... 69 9

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.2.6.6.1. Φλεγμονώδη νοσήματα του ΚΝΣ... 69 1.2.6.6.2. Επιληψία του κροταφικού λοβού.... 70 1.2.6.6.3. Νευροεκφυλιστικές παθήσεις... 72 1.2.6.6.4. Μείζων καταθλιπτική διαταραχή.... 73 1.2.6.7. Διαφορές στη νευρογένεση του φυσιολογικού και παθολογικού εγκεφάλου... 74 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 79 2.1. Προέλευση του πειραματικού υλικού... 79 2.2. Δείκτης σήμανσης των νέων κυττάρων... 79 2.3. Σχήμα χορήγησης της BrdU και πειραματικός σχεδιασμός... 81 2.4. Μονιμοποίηση και λήψη του πειραματικού υλικού... 82 2.5. Χειρισμός των ιστοτεμαχίων... 83 2.6. Απλή ανοσοκυτταροχημεία έναντι της BrdU... 85 2.7. Διπλός ανοσοφθορισμός έναντι της BrdU και επιλεγμένων δεικτών... 86 2.8. Υπολογισμός του συνολικού αριθμού των κοκκοειδών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 89 2.9. Υπολογισμός του πληθυσμού των νέων νευρικών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 91 2.10. Υπολογισμός του δείκτη συνέκφρασης της BrdU με τα επιλεγμένα αντιγόνα... 92 2.11. Στατιστική ανάλυση... 93 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 95 3.1. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα... 95 3.2. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των κοκκοειδών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα........99 3.3. Συγκριτική μελέτη της ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 99 3.4. Συγκριτική μελέτη της ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων του υπερπυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα... 101 3.5. Συγκριτική μελέτη της επιβίωσης των νέων νευρικών κυττάρων στο υπερ-πυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 106 3.6. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων κατά τον διαμήκη άξονα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 108 3.7. Συγκριτική μελέτη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των νευρικών στελεχιαίων κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 114 10

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 3.8. Συγκριτική μελέτη της νευρωνικής διαφοροποίησης και της μετανάστευσης των νέων κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 117 3.9. Συγκριτική μελέτη της έκφρασης της καλρετινίνης από τους νέους νευρώνες του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος... 123 3.10. Συγκριτική μελέτη της έκφρασης των ώριμων νευρωνικών δεικτών και της συναπτογένεσης των νέων νευρώνων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος. 124 3.11. Συγκριτική μελέτη της αστρογλοιογένεσης στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα...127 3.12. Συγκριτική μελέτη της απόπτωσης των νέων νευρικών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα...128 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 129 4.1. Επιλογή της BrdU ως δείκτη σήμανσης των νέων νευρικών κυττάρων της οδοντωτής έλικας... 131 4.2. Το διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα έχουν ισοδύναμη ικανότητα παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων... 132 4.3. Το υπερ-πυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος έχουν ισοδύναμη ικανότητα παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων σε όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα... 133 4.4. Η κατανομή των νέων νευρικών κυττάρων ακολουθεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα... 135 4.5. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των νευρικών στελεχιαίων κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος τροποποιείται σημαντικά προϊόντος του χρόνου... 136 4.6. Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα του διαφραγματικού τμήματος παρουσιάζουν παρατεταμένη έκφραση της διπλοκορτίνης και καθυστερημένη μετανάστευση, αλλά εκφράζουν νωρίτερα ειδικούς νευρωνικούς δείκτες... 131 4.7. Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα δεν εκφράζουν καλρετινίνη... 141 4.8. Οι νέοι νευρώνες του διαφραγματικού τμήματος επιτυγχάνουν ταχύτερη έκφραση ώριμων νευρωνικών δεικτών και συναπτογένεση... 142 4.9. Εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα αστρογλοιογένεσης ανιχνεύονται στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα... 145 4.10. Η εξέλιξη της επιβίωσης των νέων νευρικών κυττάρων διαφέρει στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα... 146 4.11. Το υπερ-πυραμιδικό σκέλος παρουσιάζει αυξημένα επίπεδα επιβίωσης των νέων νευρικών κυττάρων συγκριτικά με το υπο-πυραμιδικό σκέλος σε όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα... 150 11

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 4.12. Το τοπικό μικροπεριβάλλον επηρεάζει την εξέλιξη της νευρογένεσης στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα...151 4.13. Η ειδικότερη λειτουργία του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και το λειτουργικό ρόλο των νέων κυττάρων...153 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...157 SUMMARY......163 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...167 12

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΚΝΣ AMPA (α-amino-3-hydroxymethyl-4-isoxazolepropionic acid) Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) BrdU (5-bromo-2'- deoxyuridine) BLBP (brain lipid binding protein) CA (cornu ammonis) CA1 (cornu ammonis 1) CA2 (cornu ammonis 2) CA3 (cornu ammonis 3) DAB (3,3'-diaminobenzidine) DCX (doublecortin) DG (dentate gyrus) d.p.inj. (days post injection) E (embryonic day) EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) EC (entorhinal cortex) GABA (gamma aminobutyric acid) GCL (granule cell layer) GFAP (glial fibrillary acidic protein) GluR2 HCl (hydrochloric acid) HDC (histidine decarboxylase) IEA (intermediate entorhinal area) IEGs (immediate early genes) LEA (lateral entorhinal area) LTP (long term potentiation) Κεντρικό νευρικό σύστημα α-αμινο-3-υδροξυ-5-μεθυλ-4- ισοξαζολοπροπιονικό οξύ Πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού εξαρτώμενη από τη δραστηριότητα 5-βρωμο-2'-δεοξυουριδίνη Δεσμευτική πρωτεΐνη των λιπιδίων του εγκεφάλου Αμμώνειο κέρας Πεδίο 1 του Αμμώνειου κέρατος Πεδίο 2 του Αμμώνειου κέρατος Πεδίο 3 του Αμμώνειου κέρατος 3,3 - διαμινοβενζιδίνη Διπλοκορτίνη Οδοντωτή έλικα Hμέρες μετά την έγχυση Εμβρυϊκή ημέρα Πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα Ενδορινικός φλοιός γ-αμινοβουτυρικό οξύ Κοκκώδης στιβάδα Όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας Υπομονάδα R2 των υποδοχέων του α-αμινο-3-υδροξυ-5-μεθυλ- 4-ισοξαζολοπροπιονικού οξέος Υδροχλωρικό οξύ Αποκαρβοξυλάση της ιστιδίνης Διάμεσο τμήμα του ενδορινικού φλοιού Άμεσα πρώιμα γονίδια Έξω τμήμα του ενδορινικού φλοιού Μακρόχρονη ενδυνάμωση 13

MDD (major depressive disorder) MEA (medial entorhinal area) ML (molecular layer) NeuN (neuronal nuclear protein) NGS (normal goat serum) NMDA (N-methyl-Daspartate acid) NMDA-R1 NPCs (neural precursor cells) NSCs (neural Stem Cells) PB (phosphate buffer) PBS (phosphate buffer saline) PD (parkinson s disease) PL (polymorphic layer) PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule) SGZ (subgranular zone) Sstr1 (somatostatin receptor 1) TGF-β (transforming growth factor-beta) TLE (temporal lobe epilepsy) VIP (vasoactive intestinal polypeptide) Μείζον καταθλιπτική διαταραχή Έσω τμήμα του ενδορινικού φλοιού Μοριώδης στιβάδα Πυρηνική πρωτεΐνη των νευρώνων Φυσιολογικός ορός αίγας N-μεθυλο-D-ασπαρτικό οξύ Υπομονάδα R1 των υποδοχέων του N-μεθυλο-D-ασπαρτικού οξέος Πρόδρομα νευρικά κύτταρα Νευρικά στελεχιαία κύτταρα Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος Νόσος Πάρκινσον Πολύμορφη στιβάδα Πολυσιαλυλιωμένη μορφή του μορίου συγκόλλησης NCAM του νευρικού κυττάρου Υποκοκκώδης ζώνη Υποδοχέας τύπου 1 της σωματοστατίνης Aυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού των πρωτεϊνών τύπου β Επιληψία του κροταφικού λοβού Αγγειοδραστικό εντερικό πολυπεπτίδιο 14

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η μοναδική κυτταροαρχιτεκτονική του ιπποκάμπειου σχηματισμού και ο θεμελιώδης ρόλος του στους μηχανισμούς της μνήμης και της μάθησης, αξίωσαν το ενδιαφέρον των επιστημόνων, καθιστώντας τον μία από τις πλέον μελετημένες δομές στη σύγχρονη εποχή των νευροεπιστημών. Επιπλέον η ανακάλυψη της ικανότητας μίας περιοχής αυτού, της οδοντωτής έλικας, να παράγει νέα νευρικά κύτταρα ακόμη και μετά την ολοκλήρωση της περιόδου ανάπτυξης του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), και καθ όλη τη διάρκεια της ζωής, όξυνε περαιτέρω το ερευνητικό ενδιαφέρον. Την δεκαετία του 1960, η δημοσίευση της εργασίας του J. Altman με τίτλο Autoradiographical and histological evidence of postanatal neurogenesis in rats (Altman και Das, 1965), η οποία με τη μέθοδο της τριτιούχου θυμιδίνης και τη χρήση της αυτοραδιογραφίας εντόπισε για πρώτη φορά νεοπαραγόμενα νευρικά κύτταρα στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπειου σχηματισμού των ενήλικων τρωκτικών, κλόνισε τον μέχρι τότε επικρατούντα αφορισμό του Ramon y Cajal: «Στον ενήλικο εγκέφαλο τα νευρικά μονοπάτια είναι σταθερά και αμετάβλητα: όλα μπορεί να πεθάνουν, τίποτα όμως δε δύναται να αναγεννηθεί» (Cajal, 1928). Μεσολάβησαν όμως τρείς δεκαετίες ακόμη έως ότου η κοινότητα των νευροεπιστημόνων να αποδεχθεί την ικανότητα του εγκεφάλου να παράγει νευρικά κύτταρα καθ ολη τη διάρκεια της ενήλικου ζωής. Η εκτεταμένη μελέτη του φαινομένου της νευρογένεσης στον ενήλικο στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, έχει αποκαλύψει με εξαιρετική λεπτομέρεια τη διαδικασία παραγωγής και ενσωμάτωσης των νέων νευρικών κυττάρων στο υπάρχον λειτουργικό κύκλωμα (Kempermann και συν., 2004α Duan 15

ΠΡΟΛΟΓΟΣ και συν., 2008 von Bohlen und Halbach, 2011). Συγχρόνως, πληθώρα ερευνητικών μελετών πραγματοποίησαν σημαντικές ανακαλύψεις γύρω από τη διεγερτική ή την κατασταλτική επίδραση ποικίλων παραγόντων (ενδογενών και εξωγενών) στην εξέλιξη της διαδικασίας παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων (Kuhn και συν., 1996 Cecchini και συν., 2003 Eadie και συν., 2005 Mirescu και Gould, 2006 Tanti και συν., 2013). Η διαμερισματοποίηση της οδοντωτής έλικας κατά το διαμήκη άξονά της (Moser και συν., 1993 Bannerman και συν., 1999 Grivas και συν., 2003 Zhang και συν., 2004 Leonardo και συν., 2006 Liagkouras και συν., 2008 Christensen και συν., 2010 Fanselow και Dong, 2010 McHugh και συν., 2011), πιθανόν να αποτελεί άλλον έναν παράγοντα που επηρεάζει σημαντικά την παραγωγή των νέων νευρικών κυττάρων. Σύγχρονες ερευνητικές προσεγγίσεις αποδεικνύουν ότι τόσο ο ρυθμός παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων (Snyder και συν., 2009β Snyder και συν., 2009γ Jinno, 2010) όσο και ο ρυθμός της μορφολογικής και λειτουργικής ωρίμανσης αυτών (Piatti και συν., 2011 Snyder και συν., 2012) διαφοροποιούνται σημαντικά μεταξύ των διαφόρων επιπέδων της οδοντωτής έλικας κατά τον διαμήκη (ή διαφραγματο κροταφικό) άξονά της. Οι παρατηρούμενες ανομοιογένειες μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της οδοντωτής έλικας αποδίδονται κύρια στα αυξημένα επίπεδα της βασικής ηλεκτροφυσιολογικής δραστηριότητας που καταγράφονται στο διαφραγματικό τμήμα της (Piatti και συν., 2011), δημιουργώντας την πεποίθηση ότι το εξαρτώμενο από τη δραστηριότητα φαινόμενο της νευρογένεσης, πιθανώς να παρουσιάζει και άλλες σημαντικές διαφοροποιήσεις κατά την εξέλιξή του μεταξύ των δύο διακριτών τμημάτων. Στην παρούσα ερευνητική προσπάθεια ταυτοποιήσαμε τα νεοπαραγόμενα κύτταρα στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της οδοντωτής έλικας του 16

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ιπποκάμπειου σχηματισμού του επίμυος πραγματοποιώντας ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση της ουσίας 5-βρωμο-2 -δεοξυουριδίνης (ΒrdU), την οποία παραλαμβάνουν τα διαιρούμενα κύτταρα, και εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική σήμανσή τους με διάφορους κυτταρικούς δείκτες. Με τον τρόπο αυτό και τη βοήθεια του κοινού και του συνεστιακού μικροσκοπίου, μας δόθηκε η δυνατότητα να παρακολουθήσουμε την πορεία των νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων, από τη γέννησή τους μέχρι και την μορφολογική και λειτουργική ωρίμανσή τους, καθώς και την ενσωμάτωσή τους στο υπάρχον νευρωνικό κύκλωμα του ιππόκαμπου. Η εργασία αυτή διαιρείται σε τέσσερις ενότητες: Εισαγωγή, Υλικά και Μέθοδοι, Αποτελέσματα και Συζήτηση. Στην ενότητα «Εισαγωγή» αρχικά γίνεται μία παρουσίαση της κυτταροαρχιτεκτονικής, της συνδεσμολογίας και της λειτουργίας της οδοντωτής έλικας. Ακολουθεί μία σύντομη περιγραφή της μέχρι σήμερα γνωστής διαμερισματοποίησής της κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονά της, καθώς και αναλυτική περιγραφή των διαδοχικών σταδίων της διαδικασίας παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων στην οδοντωτή έλικα κατά την ενήλικο ζωή. Στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» περιγράφονται διεξοδικά η προέλευση του πειραματικού υλικού, ο τρόπος χειρισμού του, καθώς και οι ιστολογικές, ανοσοϊστοχημικές και στερεολογικές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν. Ακολουθεί η ενότητα «Αποτελέσματα» όπου παρατίθενται τα πειραματικά ευρήματα της συγκριτικής μελέτης των διαδοχικών σταδίων της διαδικασίας παραγωγής και ανάπτυξης των νέων νευρικών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της οδοντωτής έλικας. Τέλος, στην ενότητα «Συζήτηση» γίνεται μία προσπάθεια ερμηνείας των πειραματικών αποτελεσμάτων και συσχέτισης αυτών με την υπάρχουσα βιβλιογραφία. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω εκ βάθους καρδίας τον 17

ΠΡΟΛΟΓΟΣ επιβλέποντα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, Καθηγητή κ. Γεώργιο Χ. Παπαδόπουλο, για τη μοναδική ευκαιρία που μου προσέφερε να γαλουχηθώ υπό την επιστημονική, και συχνά πατρική, του καθοδήγησή όλα αυτά τα χρόνια. Η πάγια προσήλωσή του στην αδιάκοπη, παραγωγική και προπάντων συνετή μελέτη του νευρικού συστήματος δρούσε πάντοτε διεγερτικά για εμένα σε όλα τα στάδια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Τον ευχαριστώ θερμά που μου δίδαξε πως ακόμη και στους δύσκολους αυτούς καιρούς η προσήλωση στην επίμονη επιστημονική γνώση και στην αδιάλειπτη εργασία είναι ικανές να παράξουν ουσιαστική επιστήμη. Την Καθηγήτρια κα. Ελένη Μιχαλούδη-Παύλου, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής μου επιτροπής, ευχαριστώ ιδιαιτέρως για την πολύπλευρη καθημερινή υποστήριξή της σε πολλά στάδια εκτέλεσης του παρόντος πειραματισμού, για τις καίριες διορθώσεις της επί του κειμένου της παρούσας διατριβής και για το εξαίρετο ήθος που όλα αυτά τα χρόνια μου εμφύσησε. Μεγάλη ευγνωμοσύνη οφείλω στην Επίκουρη Καθηγήτρια κα. Τσιγκοτζίδου Αναστασία, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής μου επιτροπής, η οποία αρκετά χρόνια πριν με εισήγαγε στον άγνωστο για εμένα κόσμο της πειραματικής έρευνας και με την προσωπική ευγένεια και την επιστημονική αρτιότητα που διαθέτει παραμένει έως και σήμερα πολύτιμος καθοδηγητής μου. Tην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του εργαστηρίου Ανατομικής & Ιστολογίας κα. Δωρή Ιωάννα ευχαριστώ θερμά για τις πολύτιμες συμβουλές της και τη συμπαράστασή της. Τους Καθηγητές του ίδιου εργαστηρίου κ. Ντινόπουλο Αθανάσιο και κ. Αντωνόπουλο Ιωάννη ευχαριστώ για την ευγένεια που υπέδειξαν απέναντί μου όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστίες οφείλω και στους ζωοκόμους του εργαστηρίου, τωρινούς και παρελθόντες, κ. Τζουμπελίδη Πολυχρόνη, κ. Φαρδέλλα 18

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Κώστα και κ. Σινάκο Λεωνίδα για τη σημαντική βοήθειά που προσέφεραν στην καθημερινή παρακολούθηση και φροντίδα των πειραματοζώων. Τον συνταξιοδοτηθέντα τεχνικό του Εργαστηρίου Ανατομικής & Ιστολογίας κ. Δρόσο Χρυσέλη καθώς και τη βιολόγο, ΕΔΔΙΠ του ίδιου εργαστηρίου κα. Χιωτέλη Μαρία ευχαριστώ εκ βάθους καρδίας για τη μεγάλη αγκαλιά που μου προσέφεραν από την πρώτη ημέρα παραμονής μου στο εργαστήριο. Τους ευχαριστώ θερμά που γέμιζαν με ζωντάνια την καθημερινότητά μου και παρείχαν ουσιαστική συμπαράσταση κατά τις πολυάριθμες ώρες εργασίας μου στον πάγκο του εργαστηρίου. Τους αγαπημένους μου συναδέλφους κ. Γρίβα Ιωάννη, λέκτορα του Εργαστηρίου Ανατομικής & Ιστολογίας, και κα. Γιαννακοπούλου Αγγελική, ΕΔΔΙΠ του ίδιου εργαστηρίου, ευχαριστώ ιδιαίτερα γιατί πέρα από τη γνώση και την εμπειρία που απλόχερα μου μετέδωσαν αποτελούν για εμένα πολύτιμους συνεργάτες και προπάντων αγαπημένους φίλους. Τον νεότερο συνάδελφο και φίλο, ανθυπολοχαγό κ. Σίσκο Νικήστρατο ευχαριστώ για την καθοριστική συμβολή του στις μετρήσεις ομάδων κυτταρικών πληθυσμών, μέρος των οποίων αναφέρεται στην παρούσα διατριβή, αφιερώνοντας πολυάριθμες ώρες για το σκοπό αυτό. Τον λέκτορα του Εργαστηρίου Οικονομίας Ζωϊκής Παραγωγής κ. Θεοδωρίδη Αλέξανδρο ευχαριστώ για την πολύτιμη συμβολή του στην ερμηνεία των στατιστικών όρων. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην κτηνίατρο κα. Τσομπάνη-Κολώνη Φωτεινή και το σύζυγό της κ. Κολώνη Αντώνη οι οποίοι με αγκάλιασαν από τα προπτυχιακά μου ακόμη έτη. Αποτέλεσαν τους δασκάλους μου της κλινικής άσκησης του κτηνιατρικού επαγγέλματος και με την μοναδική ποιότητα και καλοσύνη που διαθέτουν με ώθησαν να πραγματοποιήσω τα μετέπειτα βήματά μου. Την κα. Σιώτου Ελένη, υπεύθυνη κτηνίατρο του Πειραματικού Κέντρου της 19

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Αιματολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Παπανικολάου, ευχαριστώ από καρδιάς για την άπλετη καλοσύνη και την αμέριστη εμπιστοσύνη που υπέδειξε στο πρόσωπό μου, εισάγοντάς με μορφωτικά και επαγγελματικά στην επιστήμη των ζώων εργαστηρίου. Ευχαριστίες οφείλω και στην Επιτροπή Ερευνών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, η οποία μου απένειμε την Υποτροφία Αριστείας για δύο συνεχόμενα έτη, προάγοντας ηθικά και οικονομικά την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Για τις ταξιδιωτικές υποτροφίες που μου παρείχαν προκειμένου για τη συμμετοχή μου σε συνέδρια αιχμής και την παρουσίαση της παρούσας ερευνητικής εργασίας ευχαριστώ την Ελληνική Εταιρεία για τις Νευροεπιστήμες, το Εθνικό Ινστιτούτο Nευρολογικών διαταραχών και Εγκεφαλικού των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής (National Institute of Neurological Disorders and Stroke, ΝΙNDS) και τον Καθηγητή Gerd Kempermann του Πανεπιστημίου της Δρέσδης που μου παρείχαν τη δυνατότητα παρακολούθησης του 9 ου Πανευρωπαϊκού συνεδρίου των Νευροεπιστημών (9 th FENS Forum, Ιούλιος 14, Μιλάνο, Ιταλία), του συμποσίου Κeystone αφιερωμένο στη νευρογένεση στον ενήλικο εγκέφαλο (Μάϊος 14, Στοκχόλμη, Σουηδία) και της συνάντησης Route 28 για τη νευροβιολογία με τίτλο Νευρογένεση στον ενήλικο εγκέφαλο: νέες προοπτικές (Σεπτέμβριος 14, Frauenchiemsee, Γερμανία), αντίστοιχα. Όλα τα αγαπημένα μου πρόσωπα, που αποτελούν σταθερές αξίες στη ζωή μου, ευχαριστώ για την αγάπη, κατανόηση και στήριξη που όλα αυτά τα χρόνια απλόχερα μου έδειξαν. Το μεγαλύτερο όμως ευχαριστώ ανήκει στους αγαπημένους μου γονείς, οι οποίοι μου δίδαξαν από νωρίς ότι οφείλω να κάνω όνειρα, πως πρέπει να αγωνίζομαι εργατικά και δίκαια προσπαθώντας να τα πραγματοποιήσω και είναι πάντα στο 20

ΠΡΟΛΟΓΟΣ πλευρό μου ως σιωπηλοί και πολύτιμοι συνοδοιπόροι. 21

22

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός: σύντομη περιγραφή Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός ή ιππόκαμπος, σε κάθε πλάγιο, αποτελείται από τρεις κυτταροαρχιτεκτονικά διακριτές περιοχές: τον κυρίως ιππόκαμπο, την οδοντωτή έλικα (dentate gyrus, DG) και το υπόθεμα του ιππόκαμπου. Ορισμένοι ερευνητές θεωρούν και τον ενδορινικό φλοιό ως τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Amaral και Witter, 1989 Amaral, 1995 Andersen, 2007). Ο κυρίως ιππόκαμπος ή «Αμμώνειο κέρας» (cornu ammonis, CA), διαιρείται περαιτέρω στα πεδία CA1, CA2 και CA3. Στον επίμυ, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός εντοπίζεται εξωτερικά του θαλάμου και εσωτερικά του κροταφικού κέρατος της πλάγιας κοιλίας, με το κοίλο χείλος του να φέρεται προς τα εμπρός και διαφραγματικά, ενώ το κυρτό προς τα πίσω και κροταφικά (Cooper και Lowenstein, 2002). Το πρόσθιο άκρο του συνορεύει με το διάφραγμα και καλείται διαφραγματικός ή ραχιαίος πόλος και το οπίσθιο άκρο του με τον κροταφικό λοβό και καλείται κροταφικός ή κοιλιακός πόλος. Στον άνθρωπο, η μεγαλύτερη ανάπτυξη του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, οδήγησε στην μετατόπιση του ιπποκάμπειου σχηματισμού ουραία και κοιλιακά με αποτέλεσμα να εντοπίζεται εντός του κροταφικού λοβού, αποτελώντας το κύριο τμήμα του εδάφους του κοιλιακού κέρατος της πλάγιας κοιλίας, με αποτέλεσμα ο κροταφοδιαφραγματικός άξονας να καλείται ορθότερα κεφαλο ουραίος (Andersen, 2007). Το βασικό νευρωνικό κύκλωμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού αποτελείται από τρεις αλληλοδιάδοχες διεγερτικές οδούς, οργανωμένες κατά τον εγκάρσιο άξονά του (Εικ. 1.1). Το «τρισυναπτικό» αυτό κύκλωμα επαναλαμβάνεται με μικρές διαφοροποιήσεις καθ όλο τον διαμήκη άξονά του (Andersen και συν., 1971 Sloviter 23

ΕΙΣΑΓΩΓΗ και Lomo, 2012). Οδός των παράπλευρων κλάδων του Schaffer Διατιτραίνουσα οδός Οδός των βρυωδών ινών Ενδορινικός φλοιός Οδοντωτή Έλικα Υποκοκκώδης Ζώνη Εικόνα 1.1.: Σχηματογράφημα του «τρισυναπτικού» διεγερτικού κυκλώματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, οργανωμένο εγκάρσια στον διαμήκη άξονά του (τροποποιημένο σχήμα από McCaffery και συν., 2006). Η πρώτη διεγερτική οδός του κυκλώματος σχηματίζεται από τις νευρικές ίνες των κυττάρων της δεύτερης κυρίως στιβάδας του ενδορινικού φλοιού (EC), οι οποίες απολήγουν συναπτόμενες με τις απολήξεις των κοκκοειδών κυττάρων της DG (διατιτραίνουσα οδός). Οι νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων (βρυώδεις ίνες) με τη σειρά τους, συνάπτονται με τις απολήξεις των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3 του κυρίως ιππόκαμπου (οδός των βρυωδών ινών). Το τρίτο και τελευταίο νευρικό μονοπάτι σχηματίζεται από τους νευράξονες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3, οι οποίοι συνάπτονται με τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA1 (οδός των παράπλευρων κλάδων του Schaffer). Οι νευρικές ίνες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 απολήγουν στις βαθύτερες στιβάδες του EC, είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω του υποθέματος (Andersen, 2007), ολοκληρώνοντας το κλειστό διεγερτικό κύκλωμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του «τρισυναπτικού κυκλώματος» είναι το γεγονός ότι τα νευρικά μονοπάτια και των τριών διεγερτικών οδών του είναι «μονόδρομα», σε 24

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντίθεση με τα «αμφίδρομα» νευρικά μονοπάτια του νεοφλοιού (Andersen, 2007), κάτι που είχε ήδη παρατηρήσει ο Cajal από τα τέλη του 19 ου αιώνα. Λειτουργικά, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός αποτελεί μέρος του συστήματος του κεντρικού κροταφικού λοβού, που είναι η υπεύθυνη δομή για τη διαμόρφωση της έκδηλης μνήμης (Cohen και Squire, 1980 Squire, 1992 Andersen, 2007). Παρ όλα αυτά πειραματικές μελέτες σε επίμυες καταδεικνύουν την εμπλοκή του στην κωδικοποίηση και την ανάκτηση και άλλων μορφών μνήμης (Andersen, 2007). Έχει δειχθεί ότι βλάβη στον ιππόκαμπο οδηγεί σε αδυναμία σχηματισμού νέας μνήμης και ορισμένες φορές σε ταυτόχρονη αδυναμία ανάκλησης παλαιότερων μνημονικών γεγονότων αποδεικνύοντας ότι ο ιππόκαμπος είναι ένας προσωρινός σταθμός αποθήκευσης της νεοαποκτηθείσας μνήμης μέχρι την μόνιμη αποθήκευσή της στις φλοιϊκές περιοχές (Bunsey και Eichenbaum, 1995 McDonald και συν., 2004). 1.2. Η οδοντωτή έλικα Η οδοντωτή έλικα αποτελεί μία από τις τρεις διακριτές περιοχές του ιπποκάμπειου σχηματισμού και εκτείνεται κατά μήκος της έσω και κοίλης επιφάνειας του. Σε εγκάρσια διατομή έχει σχήμα V στο διαφραγματικό τμήμα της, ενώ οδεύοντας προς τον κροταφικό της πόλο σταδιακά παίρνει τη μορφή U. Το σκέλος της που απαντάται ανάμεσα στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3 και του πεδίου CA1 καλείται εγκλεισμένο ή υπερ-πυραμιδικό σκέλος ενώ το σκέλος που εντοπίζεται κάτω από την πυραμιδική στιβάδα του πεδίου CA3 ονομάζεται ελεύθερο ή υπο-πυραμιδικό σκέλος. Τα δύο σκέλη ενώνονται στην κορυφή της DG. 1.2.1. Κυτταροαρχιτεκτονική της οδοντωτής έλικας Ενώ μέχρι πρότινος το πλέον μελετημένο κύτταρο του ιπποκάμπειου σχηματισμού ήταν το πυραμιδοειδές κύτταρο του πεδίου CA1, η ανακάλυψη της 25

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων αποκλειστικά από την DG, ώθησαν τη σύγχρονη έρευνα γύρω από τα κύτταρα της περιοχής αυτής. Η DG παρουσιάζει τη χαρακτηριστική τρίστιβη διάταξη, που συναντάται και στον κυρίως ιππόκαμπο (Εικ. 1.2). Από επιπολής προς εν τω βάθει συναντούμε τη μοριώδη στιβάδα (molecular layer, ML), τη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων ή κοκκώδη στιβάδα (granule cell layer, GCL) και την πολύμορφη στιβάδα ή πύλη (polymorphic layer, PL ή hilus). Η κάθε στιβάδα εποικίζεται από διαφορετικούς τύπους κυττάρων ενώ διαθέτει και διαφορετική συνδεσμολογία. Eικόνα 1.2: Μικροφωτογραφία μικροσκοπίου φθορισμού τομής της διαφραγματικής DG, σημασμένη με αντίσωμα έναντι της όξινης πρωτεΐνης των ινιδίων της αστρογλοίας. Διακρίνονται από επιπολής προς εν τω βάθει η μοριώδης (ML), η κοκκώδης (GCL) και η πολύμορφη (PL) στιβάδα. 1.2.1.1. Μοριώδης στιβάδα Η μοριώδης στιβάδα αποτελεί την επιπολής στιβάδα της DG. Καταλαμβάνεται κυρίως από τους δενδρίτες των κυττάρων της GCL και της PL, καθώς και από τους εισερχόμενους στον ιπποκάμπειο σχηματισμό νευράξονες των πυραμιδοειδών κυττάρων του EC και νευρώνων άλλων εγκεφαλικών περιοχών (Amaral, 1995 Andersen, 2007). Στη ML συναντώνται και δύο κύριοι τύποι 26

ΕΙΣΑΓΩΓΗ νευρικών κυττάρων. Στο έσω τμήμα της εντοπίζονται νευρικά κύτταρα με πολυγωνικό ή τριγωνικό σχήμα, των οποίων ο νευράξονας και οι δενδρίτες διακλαδίζονται εντός των ορίων της, ενώ στα όρια της με την GCL συναντώνται τα κηροπηγιόμορφα ή αξο-αξονικά κύτταρα. Τα αξο-αξονικά κύτταρα διαθέτουν έναν κύριο νευράξονα ο οποίος εισέρχεται στην GCL και συνάπτεται με το αρχικό τμήμα των νευραξόνων των κοκκοειδών κυττάρων ενώ οι δενδρίτες τους παραμένουν αυστηρά εντός των ορίων της ML και πιθανώς συνάπτονται με τις νευρικές απολήξεις της διατιτραίνουσας οδού (Andersen, 2007). Λόγω του γ-αμινοβουτυρικού οξέος (γ- Aminobutyric acid, GABA) που συνθέτουν, εικάζεται ότι αποτελούν, μαζί με τα καλαθοειδή κύτταρα της GCL, τους ανασταλτικούς ρυθμιστές της δράσης των κοκκοειδών κυττάρων (Amaral, 1995 Andersen, 2007). Ορισμένοι ερευνητές περιγράφουν και την ύπαρξη μίας κατηγορίας διάμεσων νευρώνων εντός της ML, οι οποίοι σημαίνονται ανοσοϊστοχημικά έναντι του αγγειοδραστικού εντερικού πολυπεπτιδίου (vasoactive intestinal polypeptide, VIP) (Andersen, 2007). 1.2.1.2. Κοκκώδης στιβάδα Eνώ η ML καταλαμβάνεται κυρίως από τις νευρικές ίνες των κυττάρων των υπόλοιπων στιβάδων της DG, η GCL αποτελείται από πυκνά διαταγμένους κύριους νευρώνες, τα κοκκοειδή κύτταρα, οι οποίοι συνάπτονται άμεσα με τα γειτονικά τους ομοειδή κύτταρα, συχνά με απουσία ενδιάμεσης νευρογλοίας (Amaral, 1995). Τα κυτταρικά σώματα των κοκκοειδών κυττάρων είναι μικρού μεγέθους και ελλειπτικού σχήματος (μικρή διάμετρος 10μm μεγάλη διάμετρος 18μm), από το κορυφαίο τμήμα των οποίων αναδύεται ένας κύριος δενδριτικός κλάδος ο οποίος διακλαδίζεται σε μικρή απόσταση από την έκφυσή του, δημιουργώντας ένα δενδριτικό δίκτυο κωνικού σχήματος (Claiborne και συν., 1990). Σε αντίθεση με τους κύριους νευραξονικούς 27

ΕΙΣΑΓΩΓΗ κλάδους των κοκκοειδών κυττάρων (βρυώδεις ίνες), οι οποίοι διατρέχουν την PL και συνάπτονται με τις νευρικές απολήξεις των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3, οι δενδριτικοί τους κλάδοι, οι οποίοι διαθέτουν μεγάλο αριθμό ακάνθων, εισέρχονται στη ML, και συχνά απολήγουν είτε εντός των ορίων αυτής, είτε φτάνουν έως τα όρια της ιπποκάμπειας σχισμής ή ακόμη και του τοιχώματος των πλάγιων κοιλιών του εγκεφάλου (Andersen, 2007). Στην GCL ανιχνεύεται, επίσης, μεγάλος αριθμός διάμεσων νευρώνων (Seress και Pokorny, 1981). Οι κυριότεροι από αυτούς είναι τα καλαθοειδή κύτταρα, που εντοπίζονται κύρια στο έσω τμήμα της, στο όριο με την PL (Ribak και Seress, 1983), ενώ ένα μικρότερο ποσοστό αυτών ανιχνεύεται και στα όρια της με τη ML (Seress and Pokorny, 1981). Το κυτταρικό σώμα τους έχει σχήμα πυραμίδας, διαμέτρου 25-35μm, ενώ ο κύριος νευραξονικός τους κλάδος διακλαδίζεται περίτεχνα γύρω από τα σώματα των κοκκοειδών κυττάρων, δημιουργώντας ένα χαρακτηριστικό πλέγμα καλαθοειδούς σχήματος, σχηματίζοντας ταυτόχρονα συνάψεις με αυτά (Seress και Ribak, 1983). Τα καλαθοειδή κύτταρα εκφράζουν τον ανασταλτικό χημικό διαβιβαστή GABA και θεωρούνται ως οι κύριοι ανασταλτικοί νευρώνες των κοκκοειδών κυττάρων (Andersen, 2007). Οι σύγχρονες προσεγγίσεις αναφερόμενες στη μικροσκοπική οργάνωση της DG, διακρίνουν μία επιπλέον περιοχή αυτής, με μοναδική κυτταρική και αγγειακή σύσταση. Η περιοχή αυτή καλείται υποκοκκώδης ζώνη (subgranular zone, SGZ) και εκτείνεται παράλληλα με την GCL, από το εσώτερο όριο αυτής έως και την PL, έχοντας διάμετρο ίση με το πάχος δύο κυτταρικών σωμάτων των κοκκοειδών κυττάρων (Kempermann και συν., 2003 Steiner και συν., 2008) (Εικ. 1.1). Κατά το σχηματισμό της DG, η SGZ αποτελεί την κύρια πηγή προέλευσης των προγονικών κοκκοειδών κυττάρων που εποικίζουν την διαμορφούμενη DG, κατά το τελευταίο 28

ΕΙΣΑΓΩΓΗ στάδιο της ανάπτυξής της (Schlessinger και συν., 1975 Altman και Bayer, 1990). Η SGZ, διατηρεί την ικανότητα παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων ακόμη και μετά την ολοκλήρωση της μορφογένεσης της DG, γεννώντας νέα κοκκοειδή κύτταρα, τα οποία μεταναστεύουν στην GCL (Ehninger και Kempermann, 2008). Η ικανότητα της SGZ για συνεχή υποστήριξη της διαδικασίας παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων οφείλεται κύρια στην ιδιαίτερη αρχιτεκτονική της, αφού είναι μία περιοχή με ιδιαίτερα ανεπτυγμένο αγγειακό δίκτυο (Palmer και συν., 2000), εποικισμένη από μικρογλοιακά κύτταρα, μακροφάγα, και κυρίως από αστροκύτταρα και από νευρικά προγονικά κύτταρα διαφόρων σταδίων ανάπτυξης ( Mercier και συν., 2002 Kempermann, 2011α). Ο αστροκυτταρικός πληθυσμός της αποτελείται από δύο τύπους κυττάρων: τα αστροκύτταρα του ακτινωτού τύπου, τα οποία διαθέτουν κυτταρικό σώμα τριγωνικού σχήματος και μία κύρια αποφυάδα η οποία διεισδύει στην GCL και απολήγει εντός της ML, και τα αστροκύτταρα του οριζόντιου τύπου, τα οποία εκτείνουν τις μικρού μήκους αποφυάδες τους παράλληλα με την SGZ ενώ οι μικρότεροι δευτερογενείς κλάδοι τους εισέρχονται εντός της GCL και της PL (Seri και συν., 2004). Έχει πλέον αποδειχθεί ότι τα αστροκύτταρα του ακτινωτού τύπου είναι οι πρόγονοι των νέων κοκκοειδών κυττάρων που παράγονται καθ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής (Seri και συν., 2001 Bonaguidi και συν., 2011), ενώ τα αστροκύτταρα του οριζόντιου τύπου εκκρίνουν τροφικούς παράγοντες που έχουν παρακρινή δράση, προάγοντας τη νευρογενή ικανότητα της SGZ (Seri και συν., 2004 Morrens και συν., 2012). 1.2.1.3. Πολύμορφη στιβάδα Η πολύμορφη στιβάδα αποτέλεσε αντικείμενο πολύχρονης διαφωνίας για το εάν ανήκει στον κυρίως ιππόκαμπο ή στην DG. Ο Lorente de Nó (1934) θεωρούσε την PL ως προέκταση της πυραμιδικής στιβάδας του πεδίου CA3 δίνοντάς της το 29

ΕΙΣΑΓΩΓΗ όνομα CA4, ενώ ο Blackstad θεωρούσε ότι η κυτταρική σύνθεση της στιβάδας αυτής την κατέτασσε μάλλον στην DG (Blackstad, 1956). Η διεξοδική μελέτη της από τον Amaral (1978) κατέδειξε τελικά ότι η PL αποτελεί τμήμα της DG. Η PL εποικίζεται κυρίως από τα βρυώδη κύτταρα. Είναι μεγάλου μεγέθους πολύπολα νευρικά κύτταρα (25-35μm) με τριγωνικό σχήμα. Διαθέτουν τρεις ή περισσότερους δενδριτικούς κλάδους οι οποίοι διακλαδίζονται και απολήγουν εντός των ορίων της, ενώ μικρός αριθμός δενδριτικών κλάδων μπορεί να ανευρεθεί και στην GCL ή την ML. Ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών είναι ότι οι εγγύς δενδρίτες τους διαθέτουν μεγάλες, πυκνά διατεταγμένες και σύνθετες άκανθες που αποτελούν τα σημεία σύναψης με τις βρυώδεις ίνες των κοκκοειδών κυττάρων (Frotscher και συν., 1991 Buckmaster και συν., 1996). Οι κύριοι νευραξονικοί κλάδοι τους απολήγουν στην εν τω βάθει ML, τόσο της ομοπλάγιας (συνδετικές ίνες) όσο και της ετεροπλάγιας (συνδεσμικές ίνες) DG, όπου και συνάπτονται με τους δενδρίτες των κοκκοειδών κυττάρων (Buckmaster και συν., 1996 Andersen, 2007). Είναι κύτταρα ανοσοδραστικά έναντι του γλουταμινικού οξέος και θεωρούνται ως οι κύριοι διεγερτικοί νευρώνες των κοκκοειδών κυττάρων. Στην PL, επίσης, συναντώνται και αρκετοί τύποι κυττάρων ατρακτοειδούς σχήματος, που διαχωρίζονται ανάλογα με τον πληθυσμό και την πυκνότητα των δενδριτικών ακάνθων τους και κατατάσσονται στους διάμεσους νευρώνες (Ribak και Seress, 1988). Τα πιο σημαντικά εξ αυτών είναι τα κύτταρα που διαθέτουν δύο με τρεις κύριους δενδρίτες, οι οποίοι οδεύουν παράλληλα με την GCL και διαθέτουν άφθονες διακλαδιζόμενες άκανθες, ενώ οι νευράξονές τους απολήγουν στην επιπολής ML, όπου και συνάπτονται με τους δενδρίτες των κοκκοειδών κυττάρων, αποτελώντας άλλον έναν ανασταλτικό ρυθμιστικό μηχανισμό της δράσης τους (Andersen, 2007). Οι νευράξονες αυτοί διατρέχουν μεγάλη απόσταση κατά μήκος 30

ΕΙΣΑΓΩΓΗ του διαφραγματο κροταφικού άξονα της DG, καλύπτοντας απόσταση ίση με το ένα τρίτο του συνολικού της μήκους (Amaral, 1978 Claiborne και συν., 1986). Τα κύτταρα αυτά είναι θετικά έναντι του GABA και της σωματοστατίνης (Andersen, 2007). Σώματα διάμεσων νευρώνων με λιγότερο ανεπτυγμένες δενδριτικές απολήξεις, που στερούνται ακάνθων, εντοπίζονται επίσης εντός της PL, με τις απολήξεις τους να διατρέχουν την GCL και να απολήγουν στο έσω τμήμα της ML. Πληθώρα άλλων τύπων νευρικών κυττάρων εντοπίζονται, επίσης, εντός της PL, των οποίων όμως η ακριβής μορφολογία και λειτουργία παραμένουν προς διερεύνηση. 1.2.2. Συνδεσμολογία της οδοντωτής έλικας Τα κοκκοειδή κύτταρα της DG δέχονται προσαγωγούς ίνες από τον EC και από αρκετές άλλες περιοχές του εγκεφάλου, ενώ οι νευράξονες τους προβάλλουν αποκλειστικά στα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3. Συγχρόνως, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και το εσωτερικό δίκτυο συνδέσεών της, κύριος ρόλος του οποίου είναι η ρύθμιση της λειτουργίας των κοκκοειδών κυττάρων. 1.2.2.1. Συνδέσεις μεταξύ των στιβάδων της οδοντωτής έλικας Οι αμύελοι νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων (βρυώδεις ίνες) διερχόμενοι από την PL, διακλαδίζονται και συνάπτονται με τις δενδριτικές απολήξεις των βρυωδών κυττάρων (διεγερτικά κύτταρα) και των διάμεσων νευρώνων (ανασταλτικά κύτταρα) (Claiborne και συν., 1986 Buckmaster και συν., 1996). Οι βρυώδεις ίνες απολήγουν σε μία στενή ζώνη, εντοπιζόμενη στα όρια της πυραμιδικής στιβάδας του CA3, τη διαυγή στιβάδα, όπου και δημιουργούν συνάψεις με τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3. Τα κοκκοειδή κύτταρα αλληλεπιδρούν με τα βρυώδη κύτταρα τόσο εντός της PL, όσο και εντός της ML, αφού έχουν ανιχνευθεί ασύμμετρες διεγερτικές συνάψεις 31

ΕΙΣΑΓΩΓΗ των βρυωδών κυττάρων με τις δενδριτικές άκανθες των κοκκοειδών κυττάρων στο έσω ένα τρίτο της ML (Blackstad, 1956 Scharfman και συν., 1990). Οι νευρικές αυτές ίνες των βρυωδών κυττάρων σχηματίζουν τη συνδετική/ συνδεσμική οδό, αφού προέρχονται από τα βρυώδη κύτταρα της ομόπλευρης αλλά και της ετερόπλευρης PL, εξασφαλίζοντας την επικοινωνία μεταξύ των δύο ετεροπλάγιων DG (Amaral, 1995 Andersen, 2007). Συγχρόνως, οι νευρικές ίνες των βρυωδών κυττάρων διανέμονται όχι μόνο στα κοκκοειδή κύτταρα του ίδιου διαφραγματο-κροταφικού επιπέδου, αλλά και σε κοκκοειδή κύτταρα πιο απομακρυσμένων περιοχών. Είναι χαρακτηριστικό ότι οι νευράξονες των βρυωδών κυττάρων ενός συγκεκριμένου επιπέδου διατρέχουν σχεδόν το 75% του διαμήκους άξονα της DG (Amaral και Witter, 1989). Με αυτό τον τρόπο, τα βρυώδη κύτταρα εξασφαλίζουν την επικοινωνία απομακρυσμένων μεταξύ τους κοκκοειδών κυττάρων (Andersen, 2007). Τα βρυώδη κύτταρα, εκτός από την απευθείας διεγερτική δράση επί των κοκκοειδών κυττάρων, δημιουργούν συνάψεις και με τους δενδριτικούς κλάδους των καλαθοειδών κυττάρων. Έτσι, είναι επιφορτισμένα με το έργο της άμεσης διέγερσης αλλά και της έμμεσης καταστολής της δράσης των κοκκοειδών κυττάρων (Seress και Ribak, 1984). Η έμμεση ανασταλτική δράση των βρυωδών κυττάρων στη λειτουργία των κοκκοειδών κυττάρων αποτελεί ένα μόνο τμήμα του δικτύου των ανασταλτικών νευρώνων επί της δράσης των κοκκοειδών κυττάρων που διαθέτει η DG. Το κύριο ανασταλτικό δίκτυο αποτελείται από τις συνάψεις των καλαθοειδών κυττάρων με τα κυτταρικά σώματα και τις δενδριτικές άκανθες των κοκκοειδών κυττάρων (Kosaka και συν., 1984). Eνδιαφέρον είναι το γεγονός ότι αν και η αναλογία καλαθοειδών/ κοκκοειδών κυττάρων είναι ιδιαιτέρως μικρή, οι αποφυάδες των καλαθοειδών κυττάρων εκτεινόμενες σε μεγάλες αποστάσεις κατά μήκος του διαφραγματο- 32

ΕΙΣΑΓΩΓΗ κροταφικού, αλλά και του εγκάρσιου άξονα, επιτυγχάνουν τον έλεγχο μεγάλου αριθμού κοκκοειδών κυττάρων (Struble και συν., 1978). Έχει δειχθεί ότι ένα και μόνο καλαθοειδές κύτταρο ελέγχει τη δράση περίπου 10.000 κοκκοειδών κυττάρων (Andersen, 2007). To δεύτερο δίκτυο αναστολής των κοκκοειδών κυττάρων αποτελείται από τους GABA-εργικούς νευρώνες της ML, οι νευράξονες των οποίων σχηματίζουν συμμετρικές συνάψεις με τους νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων λίγο μετά την έκφυσή τους (Amaral, 1995). Το ανασταλτικό δίκτυο ολοκληρώνουν οι GABAεργικοί/ σωματοστατινεργικοί διάμεσοι νευρώνες της PL, οι νευράξονες των οποίων συνάπτονται με τους δενδρίτες των κοκκοειδών κυττάρων εντός του εξώτερου ορίου της ML (Amaral, 1995). 1.2.2.2. Προσαγωγοί συνδέσεις της οδοντωτής έλικας Αν και η μόνη περιοχή στην οποία προβάλλουν οι απαγωγοί νευρικές ίνες της DG είναι η πυραμιδική στιβάδα του πεδίου CA3, εντούτοις, δέχεται προσαγωγούς νευρικές ίνες από αρκετές περιοχές του εγκεφάλου. Οι κύριες προσαγωγοί ίνες προέρχονται από τον EC, σχηματίζουν κατά την πορεία τους τη διατιτραίνουσα οδό, και απολήγουν στο μέσο και επιπολής τμήμα της ML, όπου και συνάπτονται με τις δενδριτικές απολήξεις των κοκκοειδών κυττάρων (Dolorfo και Amaral, 1998). Τη διατιτραίνουσα οδό συνθέτουν ίνες προερχόμενες από τους πυραμιδοειδείς νευρώνες, κυρίως της στιβάδας ΙΙ, αλλά και των στιβάδων V και VI του EC (Steward και Scoville, 1976 Deller και συν., 1996). Οι ίνες της διατιτραίνουσας οδού συγκροτούν την έξω και την έσω διατιτραίνουσα οδό, προερχόμενες από τα πυραμιδοειδή κύτταρα που εποικίζουν το έξω (lateral entorhinal area, LEA) ή το έσω τμήμα του EC (medial entorhinal area, MEA), αντίστοιχα, ενώ και το διάμεσο τμήμα του ενδορινικού φλοιού (intermediate 33

ΕΙΣΑΓΩΓΗ entorhinal area, ΙΕΑ) προβάλει στην DG (Steward, 1976). Οι προερχόμενες από το έξω τμήμα του EC ίνες απολήγουν στο έξω τμήμα της ML, ενώ οι ίνες του έσω τμήματος απολήγουν στο μέσο τμήμα της ML. Mαζί με τις προσαγωγούς ίνες του έξω και έσω ενδορινικού φλοιού πορεύονται ίνες προερχόμενες από το προϋπόθεμα και το παραϋπόθεμα (Kohler, 1985). Θεωρείται ότι επειδή το προϋπόθεμα δέχεται απευθείας νευρικές ίνες από τον πρόσθιο πυρήνα του θαλάμου, είναι ο μόνος τρόπος επικοινωνίας της DG με το θάλαμο. H DG δέχεται επίσης προσαγωγούς ίνες από τον έσω διαφραγματικό πυρήνα και τον πυρήνα της διαγώνιας ταινίας του Broca, οι οποίες απολήγουν εντός της PL, ενώ μέρος αυτών διανέμεται και στη ML (Lewis και Shute, 1967 McKinney και συν., 1983). Το μεγαλύτερο μέρος των ινών αυτών είναι χολινεργικές, ενώ έχει αποδειχθεί ότι ένα τμήμα αυτών είναι και GABA-εργικές (Nyakas και συν., 1987 Freund, 1989). Οι GABA-εργικές ίνες απολήγουν στους GABA-εργικούς διάμεσους νευρώνες κυρίως της PL και της GCL, ενώ οι χολινεργικές ίνες συνάπτονται με τις δενδριτικές απολήξεις των κοκκοειδών κυττάρων εντός του έσω τμήματος της ML. Ο υποθάλαμος είναι μία άλλη εγκεφαλική δομή που συνδέεται με την DG. Οι περισσότερες υποθαλαμο-οδοντωτές ίνες προέρχονται από τους νευρώνες της υπερμαστιακής περιοχής, οι οποίες απολήγουν στο όριο της GCL και της ML, δημιουργώντας συνάψεις με τον αρχικό δενδριτικό κλάδο των κοκκοειδών κυττάρων (Vertes, 1992). Εικάζεται ότι κύτταρα και από άλλους πυρήνες του υποθαλάμου επικοινωνούν με την DG αλλά το πεδίο αυτό δεν έχει ακόμη μελετηθεί επαρκώς. Στην DG εισέρχονται επίσης νοραδρενεργικές, ντοπαμινεργικές και σεροτονινεργικές ίνες, οι οποίες προέρχονται από τον υπομέλανα τόπο, την κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας, και τον μέσο και ραχιαίο πυρήνα της ραφής, αντίστοιχα 34

ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Andersen, 2007). Η εκκρινόμενη νοραδρεναλίνη, επιδρώντας στο τοπικό δίκτυο των διάμεσων νευρώνων (Harley, 2007), καταστέλλει τη δράση των κοκκοειδών κυττάρων (Rose και Pang, 1989 Brown και συν., 2005), προάγοντας την μακρόχρονη ενίσχυση της διατιτραίνουσας οδού (Harley και Milway, 1986), ενώ η έκκριση της ντοπαμίνης επιδρά απευθείας στη διατιτραίνουσα οδό, τροποποιώντας την εξαρτόμενη από τη δραστηριότητα ενίσχυση των συνάψεών της (Otmakhova και Lisman, 1998). Η επίδραση της σεροτονίνης στα κοκκοειδή κύτταρα μπορεί να είναι είτε διεγερτική είτε κατασταλτική, ανάλογα με τον τύπο των σεροτονινεργικών υποδοχέων που κάθε φορά διεγείρονται (Djavadian, 2004). 1.2.3. Λειτουργία της οδοντωτής έλικας Παρόλη την εξέχουσα θέση της DG στο «τρισυναπτικό κύκλωμα» του ιπποκάμπειου σχηματισμού, ο ακριβής λειτουργικός της ρόλος δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως. Από τη θέση της στο βασικό αυτό λειτουργικό κύκλωμα είναι εμφανές πως αποτελεί την «πύλη» μέσω της οποίας εισέρχονται στον ιπποκάμπειο σχηματισμό οι εξωτερικές πληροφορίες και επομένως λειτουργεί ως ένα πρώτο σημείο επεξεργασίας, διαχωρισμού και ενσωμάτωσης των εισερχόμενων μνημονικών πληροφοριών (Lemon και συν., 2009). Έχει δειχθεί ότι η έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, ενδεικτικών του βαθμού της λειτουργικής ενεργοποίησης ενός κυττάρου, αυξάνει σημαντικά στα κοκκοειδή κύτταρα κατά την αναγνώριση ενός νέου γεγονότος και κατά τη μετέπειτα ενσωμάτωση αυτού, αποδεικνύοντας την εμπλοκή της DG στη διαδικασία της μάθησης και της δημιουργίας της μνήμης (Montag-Sallaz και συν., 1999). Τα κοκκοειδή κύτταρα έχουν την ικανότητα να μετατρέπουν παρόμοια εισερχόμενα πρότυπα σε διακριτά μεταξύ τους πρότυπα, τα οποία μεταφέρουν ακολούθως στα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3, όπου και αποθηκεύονται 35

ΕΙΣΑΓΩΓΗ προσωρινά μέχρι την μόνιμη αποθήκευσή τους στις περιοχές του συνειρμικού φλοιού (Gilbert και συν., 2001 McHugh και συν., 2007). Κάθε κοκκοειδές κύτταρο δύναται να εκδηλώνει διαφορετικά επίπεδα διέγερσης ως απόκριση σε παρόμοια ερεθίσματα, υποδηλώνοντας πως ακόμη και εάν συναφή ερεθίσματα διεγείρουν τον ίδιο ακριβώς πληθυσμό κοκκοειδών κυττάρων, τα κοκκοειδή κύτταρα διαθέτουν την ικανότητα να τα διαφοροποιούν (Leutgeb και συν., 2007 Aimone και συν., 2010β). Η παράλληλη δράση του τοπικού ανασταλτικού δικτύου ενισχύει περαιτέρω την ικανότητα του διαχωρισμού, επιτρέποντας μόνο στα κοκκοειδή κύτταρα που δέχονται τα πλέον ειδικά ερεθίσματα να διεγερθούν, καταστέλλοντας τη δράση των αδύναμα ενεργοποιημένων κοκκοειδών κυττάρων (Coulter και Carlson, 2007). Πέρα από τον μηχανισμό του διαχωρισμού και της ενσωμάτωσης μνημονικών πληροφοριών, πειραματικές μελέτες αποδεικνύουν πως η DG εμπλέκεται και στη διαδικασία της κωδικοποίησης αυτών, ενώ φαίνεται να μη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία ανάκλησης των ήδη αποθηκευμένων στο συνειρμικό φλοιό πληροφοριών, ρόλος που αποδίδεται στη διατιτραίνουσα οδό (Lee και Kesner, 2004 Rolls, 2013). Την τελευταία δεκαετία προτάθηκε και ο καθοριστικός ρόλος της DG ενάντια στην καταστροφική παρεμβολή των ήδη αποθηκευμένων στο πεδίο CA3 μνημονικών γεγονότων από την εισροή νέων γεγονότων, λειτουργία στην οποία εισφέρει η συνεχής παραγωγή των νέων κοκκοειδών κυττάρων (Wiskott, 2004 Zhao και συν., 2008). Συγχρόνως, η πιθανή συμμετοχή της στην ανάκληση της βραχύχρονης μνήμης και στην ικανότητα του χρονικού διαχωρισμού παλαιότερων αναμνήσεων βρίσκεται υπό διερεύνηση (Kesner, 2007). 1.2.4. Η νευρογένεση στην οδοντωτή έλικα του ενήλικου εγκεφάλου Όπως είναι σήμερα ευρέως αποδεκτό, δύο τουλάχιστον περιοχές του ενήλικου εγκεφάλου, η υποκοιλιακή ζώνη (subventricular zone, SVZ) των πλάγιων κοιλιών και 36

ΕΙΣΑΓΩΓΗ η SGZ της DG του ιπποκάμπειου σχηματισμού, διατηρούν την ικανότητα να παράγουν νέα νευρικά κύτταρα καθ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής (Altman και Das, 1965 Eriksson και συν., 1998). Η SVZ γεννά κύτταρα τα οποία, μέσω της πρόσθιας μεταναστευτικής δεσμίδας, μετακινούνται προς τους οσφρητικούς βολβούς, όπου και διαφοροποιούνται σε νέους διάμεσους νευρώνες (Luskin, 1993), ενώ η SGZ δημιουργεί νέους κύριους νευρώνες, τα κοκκοειδή κύτταρα, τα οποία ενσωματώνονται πλήρως στα ήδη υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα της DG (Ehninger και Kempermann, 2008). Σύγχρονες έρευνες προτείνουν ότι το φαινόμενο της νευρογένεσης στον ενήλικο πιθανώς να εξελίσσεται και σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου των θηλαστικών, όπως το ραβδωτό σώμα (Van Kampen και συν., 2004 Bedard και συν., 2006 Ernst και συν., 2014), το φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων (Gould και συν., 1999β Takemura, 2005) και τον υποθάλαμο (Migaud και συν., 2010), αλλά αυτό μένει να αποδειχθεί. 1.2.4.1. Τα διαδοχικά στάδια ανάπτυξης των νέων νευρώνων (μορφολογική και ανοσοϊστοχημική ταυτοποίηση) Τα νευρικά στελεχιαία κύτταρα (neural stem cells, NSCs) που εντοπίζονται στην SGZ της DG του ενήλικου εγκεφάλου, ακολουθώντας μία σύνθετη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, γεννούν νέα ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα, τα οποία μεταναστεύουν στην GCL, όπου ωριμάζουν μορφολογικά και λειτουργικά, και ενσωματώνονται πλήρως στα υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα (Gage, 2000). Σε κάθε διαδοχικό στάδιο της ανάπτυξής τους τα νεοπαραγόμενα κύτταρα εκφράζουν ειδικούς νευρωνικούς δείκτες και διαθέτουν ξεχωριστή μορφολογία, επιτρέποντας την πλήρη διερεύνηση της διαδικασίας γέννησης και ωρίμανσής τους (Kempermann και συν., 2004a Duan και συν., 2008 Ehninger και Kempermann, 2008 von Bohlen und Halbach, 2011). Τα ίδια στάδια ανάπτυξης ακολουθούνται και από τα 37

ΕΙΣΑΓΩΓΗ νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα κατά τη μορφογένεση της DG (Esposito και συν., 2005). 1.2.4.1.1. Tα νευρικά στελεχιαία κύτταρα της υποκοκκώδους ζώνης Ο εποικισμός της διαμορφούμενης DG με νέα κοκκοειδή κύτταρα κατά την ανάπτυξη του ΚΝΣ ολοκληρώνεται μεταγεννητικά, κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων εβδομάδων της ζωής (Schlessinger και συν., 1975 Bayer, 1980 Altman και Bayer, 1990). Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα της τελευταίας αυτής περιόδου ανάπτυξης, παράγονται εντός της SGZ από τα NSCs, τα οποία έχουν μεταναστεύσει εκεί από την υποκοιλιακή οδοντωτή ζώνη, κατά τη διάρκεια των τελευταίων εμβρυϊκών ημερών (Schlessinger και συν., 1975 Altman και Bayer, 1990). Σύγχρονες μελέτες της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων επιβεβαιώνουν την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Sox2 (sex determining region Y-box 2), αξιόπιστου δείκτη των NSCs (Thiel, 2013), από τον διαιρούμενο κυτταρικό πληθυσμό της SGZ (Sugiyama και συν., 2013). Η SGZ διατηρεί τα χαρακτηριστικά της νευρογενούς ζώνης (ανεπτυγμένο αγγειακό δίκτυο, αυξημένη συγκέντρωση επενδυματικών κυττάρων, αστροκυττάρων, μικρογλοίας, ώριμων νευρικών κυττάρων και NSCs) καθ όλη τη διάρκεια της ζωής, προάγοντας τη συνεχή μιτωτική δραστηριότητα των τοπικών NSCs (Mercier και συν., 2002 Kempermann, 2011α). Τα NSCs του ενήλικου εγκεφάλου παρουσιάζουν πολλά κοινά μορφολογικά χαρακτηριστικά με την ακτινωτή νευρογλοία και διαθέτουν ιδιότητες αστροκυττάρων (Seri και συν., 2001 Filippov και συν., 2003). To τριγωνικό σώμα τους εντοπίζεται στην SGZ, ενώ η μία αναπτυγμένη αποφυάδα τους διασχίζει την GCL και απολήγει στην επιπολής ML, όπου έρχεται σε άμεση επαφή με τη βασική μεμβράνη των αιμοφόρων αγγείων (Filippov και συν., 2003 Fukuda και συν., 2003) (Εικόνα 1.3, Α). 38

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ανοσοϊστοχημική ταυτοποίηση των NSCs του ενήλικου εγκεφάλου αποδεικνύει πως τα κύτταρα αυτά διατηρούν την ικανότητα τους για αυτοανανέωση και πολυδυναμία (Gage, 2000 Shimozaki, 2014), συνεχίζουν να εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα Sox2 (von Bohlen und Halbach, 2011), αλλά παράλληλα εκφράζουν και τους κυτταροπλασματικούς δείκτες όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας (glial fibrillary acidic protein, GFAP) και δεσμευτική πρωτεΐνη των λιπιδίων του εγκεφάλου (brain lipid binding protein, BLBP) (Kempermann και συν., 2004α Seri και συν., 2004 Duan και συν., 2008). Ο δείκτης GFAP αποτελεί κύριο συστατικό των διάμεσων ινιδίων του κυτταρικού σκελετού των ώριμων αστροκυττάρων του ΚΝΣ (Eng και συν., 2000), ενώ η BLBP είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που έχει ενεργό ρόλο στη σύλληψη, μεταφορά και μεταβολισμό των λιπαρών οξέων, αποτελώντας χαρακτηριστικό δείκτη των κυττάρων της ακτινωτής νευρογλοίας (Schmid και συν., 2006). Οι Seri και συν. (2004), επιβεβαιώνουν περαιτέρω την αστροκυτταρική φύση των NSCs του ενήλικου ιππόκαμπου, αποδεικνύοντας ότι εκφράζουν το ένζυμο 3 φωσφογλυκερινική αφυδρογονάση (3-phosphoglycerate dehydrogenase, 3-PGDH), το οποίο συμμετέχει στο μηχανισμό σύνθεσης του αμινοξέος σερίνη και συναντάται αποκλειστικά στα νευροεπιθηλιακά κύτταρα, την ακτινωτή νευρογλοία και τα αστροκύτταρα (Yamasaki και συν., 2001), καθώς και τη βιμεντίνη, που αποτελεί βασικό συστατικό του κυτταροσκελετού των ανώριμων αστροκυττάρων (Dahl και συν., 1981). Άλλοι ερευνητές δείχνουν ότι τα NSCs της SGZ εκφράζουν και τον μεταγραφικό παράγοντα Pax6 (paired box 6) (Osumi και συν., 2008), που είναι απαραίτητος για τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση των νευρώνων αλλά και των αστροκυττάρων, κατά την περίοδο ανάπτυξης του ΚΝΣ αλλά και κατά την ενήλικο νευρογένεση (Hevner και συν., 2006 Sakurai και Osumi, 2008). 39

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ταυτόχρονα, ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες, αποδίδουν τυπικές ιδιότητες των αστροκυττάρων, όπως τις παθητικές ιδιότητες της μεμβράνης τους, στα NSCs της SGZ (Filippov και συν., 2003 Fukuda και συν., 2003). Εικόνα 1.3: Οι δύο τύποι αστροκυττάρων που συναντώνται στην SGZ: τα αστροκύτταρα του ακτινωτού τύπου (που αποτελούν τα NSCs της ενήλικης SGZ) (Α) και τα αστροκύτταρα του οριζόντιου τύπου (Β). Και οι δύο τύποι αστροκυττάρων είναι ανοσοδραστικοί έναντι του GFAP και διαχωρίζονται με βάση την ιδιαίτερη μορφολογία τους, όπως αυτή περιγράφεται από τους Seri και συν. (2004). Τα NSCs της SGZ του ενήλικου εγκεφάλου διαιρούνται με ασύμμετρο ή συμμετρικό τρόπο, παράγοντας νέα νευρικά κύτταρα μέσω ενδιάμεσων πρόδρομων κυττάρων (Seri και συν., 2001 Bonaguidi και συν., 2011). Ο ρυθμός και το μοτίβο πολλαπλασιασμού τους επηρεάζεται σημαντικά από ποικίλους ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες τόσο στο φυσιολογικό όσο και στον παθολογικό εγκέφαλο. Το χρόνιο στρες (Mirescu και Gould, 2006), το γήρας (Kuhn και συν., 1996) και η χρόνια κατανάλωση αλκοόλ (Geil και συν., 2014) μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των μιτωτικών κυττάρων της SGZ, ενώ η σωματική άσκηση (van Praag και συν., 1999 Eadie και συν., 2005), ο εμπλουτισμός του περιβάλλοντος (Kronenberg και συν., 2003), και οι οξείες φλεγμονώδεις καταστάσεις του ΚΝΣ διεγείρουν τον 40

ΕΙΣΑΓΩΓΗ πολλαπλασιασμό αυτών (Belarbi και Rosi, 2013), χωρίς όμως συχνά να διευκρινίζεται εάν οι παράγοντες αυτοί επιδρούν στα NSCs, στους μιτωτικά ενεργούς απογόνους τους ή και στους δύο διακριτούς αυτούς πληθυσμούς. Το μοτίβο πολλαπλασιασμού των NSCs διαφοροποιείται, όπως για παράδειγμα κατά την πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE), στην οποία παρατηρείται αύξηση της αναλογίας των συμμετρικών προς τις ασύμμετρες μιτωτικές διαιρέσεις αυτών (Giannakopoulou και συν., 2013). 1.2.4.1.2. Τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα Τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα (neural precursor cells, NPCs) προέρχονται από την ασύμμετρη, συνήθως, μιτωτική διαίρεση των NSCs και εντοπίζονται και αυτά στην SGZ (Bonaguidi και συν., 2011). Είναι κύτταρα με έντονη μιτωτική δραστηριότητα και για το λόγο αυτό συνήθως απαντώνται σε συσσωματώματα (Filippov και συν., 2003 Kronenberg και συν., 2003), τα οποία πολύ συχνά περιβάλλουν τα αιμοφόρα αγγεία, ειδικότερα τα τριχοειδή, αποδεικνύοντας για μία ακόμη φορά τη στενή σχέση της νευρογένεσης με το τοπικό αγγειακό δίκτυο (Palmer και συν., 2000). Διαθέτουν πυκνωτικό πυρήνα ακανόνιστου σχήματος, ενώ στο κυτταρόπλασμά τους ανιχνεύεται αυξημένος αριθμός ριβοσωμάτων και ένα έντονα ανεπτυγμένο ενδοπλασματικό δικτυωτό (Seri και συν., 2004), στοιχεία που υποδηλώνουν την έντονη μιτωτική τους δραστηριότητα. Οι μικρές αποφυάδες τους οδεύουν παράλληλα με την SGZ, εξυπηρετώντας τη σταδιακή κυτταρική μετανάστευση εντός της GCL. Τα NPCs συγκροτούν έναν ανομοιογενή πληθυσμό μιτωτικών κυττάρων, αποτελούμενο από αδιαφοροποίητα κύτταρα που συνεχίζουν να εκφράζουν μερικώς δείκτες των αστροκυττάρων και της ακτινωτής νευρογλοίας και από περισσότερο 41

ΕΙΣΑΓΩΓΗ διαφοροποιημένα κύτταρα, τα οποία εκφράζουν ειδικούς νευρωνικούς δείκτες (Ehninger και Kempermann, 2008). Διάφορες ερευνητικές ομάδες έχουν αποδώσει στο παρελθόν ποικίλες ονομασίες στον πληθυσμό των NPCs, ενώ τα διακρίνουν και σε επιμέρους κατηγορίες, όπως κύτταρα D1, D2 και D3 (Seri και συν., 2004) ή κύτταρα τύπου 2, 3 και 4 (Kempermann και συν., 2004α), παραδεχόμενοι την πληθυσμιακή τους ανομοιογένεια. Τα ΝPCs που διαθέτουν, έστω και μερικώς, χαρακτηριστικά της ακτινωτής νευρογλοίας, συνεχίζουν να εκφράζουν τους δείκτες Sox2 και BLBP (Steiner και συν., 2006), ενώ η έκφραση του GFAP έχει πλέον εκλείψει (Seri και συν., 2004). Κύριο χαρακτηριστικό των περισσοτέρων NPCs του σταδίου αυτού είναι η έκφραση της πρωτεΐνης νεστίνης, η οποία στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο εκφράζεται από τα αστροκύτταρα και τα κύτταρα της ακτινωτής νευρογλοίας (Kalman και Ajtai, 2001). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι εντός της SGZ η έκφραση της νεστίνης δεν περιορίζεται στα NPCs, αλλά παρατηρείται και στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Palmer και συν., 2000) καθώς και σε ορισμένα αστροκύτταρα (Kronenberg και συν., 2006). Ο υπόλοιπος πληθυσμός των NPCs εμφανίζεται περισσότερο διαφοροποιημένος, παρουσιάζοντας σταδιακή μείωση στην έκφραση της νεστίνης και παράλληλη αύξηση στην έκφραση δεικτών χαρακτηριστικών της νευρωνικής κατεύθυνσης, όπως η δεσμευτική του ασβεστίου πρωτεΐνη διπλοκορτίνη (doublecortin, DCX) (Kempermann και συν., 2004α Duan και συν., 2008). Η DCX ανιχνεύεται στους αυξητικούς κώνους των νευραξόνων και των δενδριτών των νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων (Ribak και συν., 2004), συμβάλλοντας στη μορφολογική διαφοροποίηση και τη συναπτογένεση τους (Deuel και συν., 2006). Συγχρόνως, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη μετανάστευση των νεοπαραγόμενων νευρώνων τόσο κατά την ανάπτυξη του ΚΝΣ όσο και κατά την 42

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ενήλικο ζωή (Brown και συν., 2003). Στον ενήλικο εγκέφαλο η έκφραση της DCX εντοπίζεται αποκλειστικά στις νευρογενείς περιοχές του (Nacher και συν., 2001), αποτελώντας συχνά τον αποκλειστικό δείκτη εκτίμησης των επιπέδων της νευρογένεσης, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου είναι αδύνατη η χορήγηση εξωγενών δεικτών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Rao και Shetty, 2004 Couillard-Despres και συν., 2005). Στον ενήλικο ιππόκαμπο, η έκφραση της DCX συνοδεύεται από την έκφραση της πολυσιαλυλιωμένης μορφής του μορίου συγκόλλησης NCAM του νευρικού κυττάρου (polysialylated-neural cell adhesion molecule, PSA-NCAM) (Seki και Arai, 1991 Kempermann και συν., 2004α Duan και συν., 2008 von Bohlen und Halbach, 2011). Ο παράγοντας PSA-NCAM, προάγει τη συναπτογένεση και την εξαρτώμενη από τη δραστηριότητα αναδιαμόρφωση των συνάψεων (Dityatev και συν., 2004), αποτελώντας συχνά και δείκτη της συναπτικής πλαστικότητας του ιππόκαμπου (Cremer και συν., 2000). Στις νευρογενείς ζώνες του εγκεφάλου όμως, η έκφρασή του χαρακτηρίζει αποκλειστικά τα νευρωνικής κατεύθυνσης NPCs (Duan και συν., 2008 von Bohlen und Halbach, 2011). Συχνά, τα NPCs συνεκφράζουν τον PSA-NCAM με το μεταγραφικό παράγοντα NeuroD (neuronal differentiation) (Seki, 2002α Seki, 2002β Seri και συν., 2004), ο οποίος προάγει τη διαφοροποίηση των νεοπαραγόμενων κυττάρων σε νευρώνες (Lee και συν., 1995 Tamimi και συν., 1996). Η έναρξη έκφρασης του NeuroD προηγείται αυτής του PSA-NCAM (Seki, 2002β). Άλλοι δείκτες που εκφράζονται από τα NPCs είναι ο Musashi 1, o oποίος ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων απαραίτητων για την περαιτέρω διαφοροποίηση και επιβίωσή τους (Sakakibara και συν., 2002), και ο Tbr-2 (T-box brain gene 2), ένας μεταγραφικός παράγοντας που διαδέχεται την έκφραση του Pax6 στο «κλειστό κύκλωμα» γενετικής 43

ΕΙΣΑΓΩΓΗ έκφρασης του αναπτυσσόμενου αλλά και του ενήλικου εγκεφάλου (Hevner και συν., 2006). Στη διάρκεια των τελευταίων μιτωτικών σταδίων, το νεοπαραγόμενο κύτταρο δέχεται διεγερτικά ερεθίσματα, μέσω των αναπτυσσόμενων δενδριτικών υποδοχέων του, που οφείλονται στη δράση του χημικού διαβιβαστή GABA, ο οποίος παράγεται και απελευθερώνεται από το τοπικό δίκτυο των διάμεσων νευρώνων (Overstreet και συν., 2000 Piatti και συν., 2006). Αν και στον ενήλικο εγκέφαλο το GABA αποτελεί τον κύριο ανασταλτικό διαβιβαστή, στα αρχικά στάδια της νευρογένεσης παρουσιάζει διεγερτική δράση στα νεοπαραγόμενα κύτταρα, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του συν-μεταφορέα-1 του νατρίου, καλίου και χλωρίου (Ν-Κ-Cl cotransporter 1, NKCC1) που διαθέτουν σε αυτή τη φάση ανάπτυξής τους (Ge και συν., 2006). Η διεγερτική επίδραση του GABA στα νεοπαραγόμενα κύτταρα είναι καθοριστική για τη δημιουργία των συνάψεών τους και άρα για την περαιτέρω επιβίωση, διαφοροποίηση και ωρίμανσή τους (Ge και συν., 2006 Markwardt και συν., 2009). 1.2.4.1.3. Τα μετα-μιτωτικά ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα Τα DCX + κύτταρα εξερχόμενα του μιτωτικού κύκλου ξεκινούν τη διαφοροποίησή τους σε νέα ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα. Τα μετα-μιτωτικά ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα κατά την έναρξη της διαφοροποίησής τους ομοιάζουν μορφολογικά με τα NPCs, όμως σταδιακά εμφανίζουν σημαντικές μορφολογικές αλλαγές, ενώ μεταναστεύουν εντός της GCL. Ο νευράξονας, οι δενδρίτες και οι υποδοχείς τους αρχίζουν να αναπτύσσονται (Kempermann και συν., 2004α Seri και συν., 2004), σχηματίζοντας μια ισχυρή αποφυάδα, η οποία εκτείνεται εντός της GCL προς τη ML καθώς και μικρότερες αποφυάδες που κατευθύνονται προς την PL (Seri και συν., 2004). Οι Hastings και Gould (1999) αποδεικνύουν την ύπαρξη συνδέσεων των βρυωδών ινών των ανώριμων κυττάρων με τα πυραμιδοειδή κύτταρα της 44

ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιοχής CA3 του ιπποκάμπειου σχηματισμού από την τέταρτη μόλις μετα-μιτωτική ημέρα, όμως οι συνάψεις αυτές καθίσταται λειτουργικές κατά το τέλος της δεύτερης μεταγεννητικής τους εβδομάδας (Zhao και συν., 2006). To ανώριμο νεοπαραγόμενο κοκκοειδές κύτταρο, συνεχίζει να εκφράζει τους αντιγονικούς δείκτες DCX, PSA NCAM και NeuroD, η έκφραση των οποίων σταδιακά εκλείπει, ενώ αρχίζει η έκφραση των μετα-μιτωτικών νευρωνικών δεικτών. Ο κυριότερος εξ αυτών είναι η πυρηνική πρωτεΐνη των νευρώνων (neuronal nuclei, NeuN), που θεωρείται ως ο πλέον αξιόπιστος δείκτης των νευρώνων του ΚΝΣ (Mullen και συν., 1992). Eίναι μια διαλυτή πρωτεΐνη που εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα των μετα-μιτωτικών νευρώνων (Lind και συν., 2005). Αν και παλαιότερα υπήρχε η πεποίθηση ότι ο NeuN εκφράζεται αποκλειστικά από τους ώριμους νευρώνες, σήμερα έχει πλέον αποδειχθεί η έκφρασή του και κατά τη διάρκεια πρωϊμότερων σταδίων ανάπτυξης ενός νέου νευρώνα (Brandt και συν., 2003 Kempermann και συν., 2004α Steiner και συν., 2004), υποδηλώνοντας τη νευρωνική φύση του νέου κυττάρου και όχι το ακριβές στάδιο ωρίμανσής του. Στο στάδιο αυτό, οι νέοι νευρώνες εκφράζουν και τον μεταγραφικό παράγοντα Prox 1 (prospero homeobox-1), η έκφραση του οποίου παρατηρείται ήδη από τα DCX + κύταρα. Ο Prox-1 θεωρείται απαραίτητος για την ωρίμανση των νέων νευρώνων (Lavado και συν., 2010). Συγχρόνως, παρατηρείται και η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Τbr-1 (T-box brain gene 1), ο οποίος διαδέχεται την έκφραση του Tbr-2 (Hevner και συν., 2006), καθώς και του TUC-4 (dihydropyrimidinase-like 3) (Quinn και συν., 1999). Τα νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα του σταδίου αυτού εκφράζουν και την δεσμευτική του ασβεστίου πρωτεΐνη καλρετινίνη, η οποία είναι απαραίτητη για την περαιτέρω ωρίμανσή τους (Kempermann και συν., 2004α Ehninger και 45

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Kempermann, 2008 von Bohlen und Halbach, 2011). Παρά το γεγονός ότι η καλρετινίνη αποτελεί και δείκτη των βρυωδών κυττάρων της PL, των Cajal-Retzius νευρώνων της ML καθώς και των διάμεσων νευρώνων της SGZ, η συνέκφρασή της με δείκτες ενδεικτικούς του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρατηρείται αποκλειστικά στους μετα-μιτωτικούς ανώριμους νευρώνες (Brandt και συν., 2003). Παρόλο που οι μετα-μιτωτικοί νευρώνες της DG του μυός εκφράζουν καλρετινίνη στην ολότητά τους (Brandt και συν., 2003), ελάχιστα μόνο κύτταρα της SGZ του επίμυ την εκφράζουν (Liu και συν., 1996). Κατά την πρώτη μετα μιτωτική εβδομάδα, τα ανώριμα κύτταρα συνεχίζουν να δέχονται τα διεγερτικά δενδριτικά GABA εργικά ερεθίσματα (Ge και συν., 2006 Piatti και συν., 2006), ενώ στη διάρκεια των επόμενων ημερών αρχίζουν να αναπτύσσουν τις συνδέσεις τους με τους διάμεσους νευρώνες της PL (Tozuka και συν., 2005 Ge και συν., 2006). Την ίδια περίοδο, παρατηρείται και η επίδραση του γλουταμινικού οξέος στους αναπτυσσόμενους νευρώνες, μέσω των αναπτυσσόμενων υποδοχέων τους του N-μεθυλο-D-ασπαρτικού οξέος (N-methyl-D-aspartate acid, ΝΜDA), η οποία κρίνεται καθοριστική για την περαιτέρω επιβίωση και ενσωμάτωσή τους στο νευρωνικό κύκλωμα (Tashiro και συν., 2006). Λαμβάνοντας υπόψη πως η ανάπτυξη των διεγερτικών συνδέσεων των νέων νευρώνων με τον EC λαμβάνει χώρα περίπου ένα μήνα μετά τη γέννηση του κυττάρου (Mongiat και συν., 2009), η παρουσία του γλουταμινικού οξέος από τη δεύτερη κιόλας μεταγεννητική εβδομάδα αποδίδεται κύρια στην απελευθέρωσή του από τα βρυώδη κύτταρα της PL και από τα γειτονικά ώριμα κοκκοειδή κύτταρα, οι συνδέσεις με τα οποία έχουν ήδη αναπτυχθεί (Kumamoto και συν., 2012), και όχι στην απελευθέρωσή του από τη διατιτραίνουσα οδό. Στη διάρκεια της τρίτης μεταγεννητικής εβδομάδας, οι νέοι νευρώνες 46

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αρχίζουν να διαμορφώνουν τους περισωματικούς GABA εργικούς και γλουταμινεργικούς υποδοχείς τους, με αποτέλεσμα από εδώ και στο εξής, να δέχονται κατασταλτικά GABA-εργικά ερεθίσματα από τους διάμεσους νευρώνες και διεγερτικά γλουταμινεργικά ερεθίσματα από το υπόλοιπο κύκλωμα (Esposito και συν., 2005 Overstreet Wadiche και συν., 2005 Ge και συν., 2006 Piatti και συν., 2006 Duan και συν., 2008). Το ίδιο χρονικό διάστημα αρχίζουν να αναπτύσσονται και οι συνάψεις με τις χολινεργικές ίνες από τον διαφραγματικό πυρήνα (Vivar και van Praag, 2013), ενώ μία εβδομάδα αργότερα, δέχονται και τα διεγερτικά ερεθίσματα από την διατιτραίνουσα οδό (Witter, 2007 Vivar και van Praag, 2013). Τις ημέρες αυτές παρατηρείται και η λειτουργική ενεργοποίηση του νέου κυττάρου, γεγονός το οποίο αποδεικνύεται με τη θετική σήμανσή τους έναντι των άμεσων πρώιμων γονιδίων (immediate early genes, ΙΕGs) c fos και Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated) (Duan και συν., 2008). 1.2.4.1.4. Τα νέα ώριμα κοκκοειδή κύτταρα Περί την τρίτη μεταγγενητική εβδομάδα, την έκφραση της καλρετινίνης διαδέχεται η ομοειδής της πρωτεΐνη καλβινδίνη (Εικ. 1.4) (Kempermann και συν., 2004α Duan και συν., 2008), που αποτελεί αξιόπιστο δείκτη των ώριμων κοκκοειδών κυττάρων της DG (Seress και συν., 1991). Παράλληλα με την καλβινδίνη, τα νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα αρχίζουν να εκφράζουν και την ειδική των νευρώνων β-τουμπουλίνη τύπου ΙΙΙ, ενώ συνεχίζουν να εκφράζουν τους δείκτες NeuN και Prox-1 (Kempermann και συν., 2004α Duan και συν., 2008). Η έκφραση της καλβινδίνης έχει δειχθεί ότι ταυτίζεται με την έναρξη της συναπτογένεσης των νευρικών κυττάρων του αναπτυσσόμενου ιπποκάμπειου σχηματισμού (Rami και συν., 1987), γεγονός που φαίνεται να επιβεβαιώνεται και στον ενήλικο ιππόκαμπο, αφού η έναρξη της έκφρασης της καλβινδίνης συμβαδίζει με την ανάπτυξη των διεγερτικών 47

ΕΙΣΑΓΩΓΗ γλουταμινεργικών περι-σωματικών υποδοχέων των νέων νευρώνων (Esposito και συν., 2005 Overstreet Wadiche και συν., 2005 Ge και συν., 2006 Piatti και συν., 2006 Duan και συν., 2008). Εικόνα 1.4: Σχηματική απεικόνιση των διαδοχικών σταδίων ωρίμανσης των νεοπαραγόμενων κοκκοειδών κυττάρων της DG και των χρησιμοποιούμενων στην παρούσα διατριβή ανοσοϊστοχημικών δεικτών για τη διάκριση τους. Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα ενσωματώνονται πλήρως στα υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα του ιπποκάμπειου σχηματισμού και είναι απόλυτα λειτουργικά, με αποτέλεσμα από την έβδομη εβδομάδα και έπειτα να είναι ανέφικτος ο διαχωρισμός τους από τα κοκκοειδή κύτταρα που παρήχθησαν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (van Praag και συν., 2002 Laplagne και συν., 2006). Τα νέα, όπως και τα γειτονικά τους κοκκοειδή κύτταρα που παρήχθησαν κατά την ανάπτυξη, έχουν την ικανότητα σύνθεσης και απελευθέρωσης δύο διαφορετικών χημικών διαβιβαστών με αντίθετη δράση, του GABA και του γλουταμινικού οξέος (Sandler και Smith, 1991 Gutierrez, 2005 Piatti και συν., 2006 Markwardt και συν., 2009). 48

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2.4.2. Λειτουργία των νέων κοκκοειδών κυττάρων της οδοντωτής έλικας Τα κοκκοειδή κύτταρα που παράγονται κατά την ενήλικο ζωή εμπλέκονται σε σημαντικές λειτουργίες της DG. Ο συνδυασμός της καταστολή της νευρογένεσης στον ενήλικο με συμπεριφορικές δοκιμασίες που ελέγχουν συγκεκριμένες λειτουργίες της DG αποκάλυψε ότι τα νέα κοκκοειδή κύτταρα είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική λειτουργία της αλλόκεντρης μνήμης, την έκφραση της επαγωγικής μνήμης, τον ακριβή χρονικό προσδιορισμό των γεγονότων, ενώ συμμετέχουν και στην αποθήκευση και ανάκληση της μακρόχρονης μνήμης (Koehl και Abrous, 2011). Συγχρόνως, η εξαρτώμενη από τη δραστηριότητα συναπτική πλαστικότητα της DG, και ειδικότερα η επαγωγή και έκφραση της μακρόχρονης ενδυνάμωσης των συνάψεων (long term potentiation, LTP), προϋποθέτει τη συνεχή παραγωγή νέων κοκκοειδών κυττάρων (Snyder και συν., 2001). Κύρια λειτουργία της DG είναι ο διαχωρισμός των εισερχόμενων από τον EC χωρικών προτύπων πριν τη μόνιμη αποθήκευσή τους στο πεδίο CA3 του κυρίως ιππόκαμπου. Τα νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ικανότητας αυτής της DG, αφού έχει δειχθεί ότι η καταστολή της νευρογένεσης οδηγεί σε μειωμένη ικανότητα διαχωρισμού (Clelland και συν., 2009 Tronel και συν., 2010). Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα είναι απαραίτητα για το διαχωρισμό των συναφών γεγονότων βάση των επιμέρους χωροταξικών και χρονικών τους χαρακτηριστικών (Koehl και Abrous, 2011). Μάλιστα υποστηρίζεται ότι τα νέα κοκκοειδή κύτταρα ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης στο οποίο βρίσκονται συμμετέχουν με διαφορετικό τρόπο στη διαδικασία του διαχωρισμού: τα ανώριμα κοκκοειδή κύτταρα μετέχουν στο διαχωρισμό των γεγονότων που βιώνονται σε πολύ κοντινές χρονικές στιγμές, ενώ τα ώριμα κοκκοειδή κύτταρα, τα οποία επιδέχονται με μεγαλύτερη ευκολία τη μάθηση των νέων γεγονότων, εμπλέκονται στη δημιουργία 49

ΕΙΣΑΓΩΓΗ των νέων συναπτικών μονοπατιών προκειμένου να εξασφαλιστεί η αποθήκευση και η ανάκληση των μνημονικών γεγονότων (Aimone και συν., 2010α Deng και συν., 2010). Αν και από την ωρίμανσή τους και έπειτα τα κοκκοειδή κύτταρα που παράγονται κατά την ενήλικο ζωή δεν διαχωρίζονται από τα κοκκοειδή κύτταρα που παρήχθησαν κατά την ανάπτυξη (Laplagne και συν., 2006), υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτά διαφοροποιούνται ως προς την ειδικότερη λειτουργία τους. Οι Tronel και συν. (2014) αποδεικνύουν ότι τα κοκκοειδή κύτταρα που παρήχθησαν κατά την ανάπτυξη ενεργοποιούνται κατά το διαχωρισμό ανόμοιων εισερχόμενων προτύπων, ενώ τα κοκκοειδή κύτταρα που γεννώνται κατά την ενήλικο ζωή ενεργοποιούνται κατά την εκμάθηση των νέων γεγονότων, συμμετέχοντας πιθανώς στο σχηματισμό της χωροταξικής μνήμης. Η συνεχής παραγωγή των νέων κοκκοειδών κυττάρων επιλύει και το πρόβλημα της καταστροφικής παρεμβολής που παρατηρείται στην DG. Η DG κωδικοποιεί τα εισερχόμενα από τον EC πρότυπα ώστε αυτά να αποθηκευτούν μόνιμα στο πεδίο CA3, ενώ είναι απαραίτητη και για την ανάκληση των πληροφοριών αυτών από το πεδίο CA3. Εάν ο αριθμός των κοκκοειδών κυττάρων της DG παρέμενε σταθερός, κάθε νεοεισερχόμενο στην DG γεγονός, προκειμένου να κωδικοποιηθεί και να αποθηκευτεί σωστά από τα υπάρχοντα κοκκοειδή κύτταρα, θα απαιτούσε την συμμετοχή κοκκοειδών κυττάρων που θα είχαν ήδη συμμετάσχει στην κωδικοποίηση παλαιότερων γεγονότων, οδηγώντας στην αλλοίωση των ήδη αποθηκευμένων στο CA3 γεγονότων, και άρα και των νευρωνικών τους μονοπατιών, καθιστώντας αδύνατη την ανάκλησή τους (Wiskott, 2004). Πιστεύεται ότι η συνεχής παραγωγή νέων κοκκοειδών κυττάρων ξεπερνά το φαινόμενο αυτό δημιουργώντας νέες συνάψεις και νευρικά μονοπάτια μέσω των οποίων αποθηκεύονται τα νέα 50

ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρότυπα, αφήνοντας άθικτες τις υπάρχουσες συνάψεις (Kempermann και συν., 2004β). 1.2.5. Η αστρογλοιογένεση στην οδοντωτή έλικα του ενήλικου εγκεφάλου Έχει πλέον αποδειχθεί ότι τα NSCs της SGZ του ενήλικου εγκεφάλου γεννούν και νέα αστροκύτταρα (Kuhn και συν., 1996 Suh και συν., 2007), μέσω των ασύμμετρων μιτωτικών τους διαιρέσεων ή με απευθείας διαφοροποίησή τους σε μεταβατικά αστρογλοιακά κύτταρα (Brunne και συν., 2010). Τα νεοπαραγόμενα αστροκύτταρα είναι του οριζόντιου τύπου και εποικίζουν κύρια την περιφέρεια της GCL, στα όρια με την ML, καθώς και την SGZ, στα σύνορά της με την PL (Encinas και συν., 2011). Είναι ανοσοδραστικά έναντι του GFAP, αλλά από την ωρίμανσή τους και έπειτα εκφράζουν και την δεσμευτική του ασβεστίου πρωτεΐνη S100β (Seri και συν., 2001 Ehninger και Kempermann, 2008). Στην DG του ενήλικου μυ τα νεοπαραγόμενα αστροκύτταρα αρχίζουν να εκφράζουν το δείκτη S100β από την τρίτη εβδομάδα (Encinas και συν., 2011). Τα νεοπαραγόμενα αστροκύτταρα προστίθενται στον υπάρχοντα αστροκυτταρικό πληθυσμό, εκκρίνοντας διάφορους παράγοντες που προάγουν την παράλληλη νευρογένεση (Morrens και συν., 2012). Οι αστροκυτταρικής προέλευσης παρακρινείς παράγοντες Notch, Shh (Sonic hedgehog) και Wnts (Wingless), επηρεάζουν την εξελισσόμενη νευρογένεση, ρυθμίζοντας την είσοδο των NSCs στον κυτταρικό κύκλο, ενώ επιδρούν και στους νέους νευρώνες ρυθμίζοντας την ανάπτυξη και τη μορφολογία των δενδριτών τους και άρα την περαιτέρω επιβίωσή τους (Breunig και συν., 2007 Jiao και Chen, 2008 Kuwabara και συν., 2009 Lugert και συν., 2010). Ταυτόχρονα, τα τοπικά αστροκύτταρα εκκρίνουν πληθώρα νευροτροφικών παραγόντων, όπως ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών τύπου 2 (fibroblast growth factor 2, FGF2), ο αυξητικός παράγοντας του ενδοθηλίου των 51

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αγγείων (vascular endothelial growth factor, VEGF), ο νευροτροφικός παράγοντας των κυττάρων της ακτινωτής νευρογλοίας (ciliary neurotrophic factor a, CNTF-a) και οι αυξητικοί παράγοντες των δεσμευτικών πρωτεΐνών που ομοιάζουν με την ινσουλίνη (insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs) (Aberg και συν., 2003 Shetty και συν., 2005 Xiao και συν., 2007 Yang και συν., 2008), οι οποίοι επιδρούν σε ποικίλα στάδια της εξελισσόμενης νευρογένεσης, ρυθμίζοντας τόσο τον πολλαπλασιασμό των NSCs όσο και τη διαφοροποίηση και επιβίωση των νέων κοκκοειδών κυττάρων. Η επιβίωση των νέων κοκκοειδών κυττάρων επάγεται περαιτέρω και από τα περιβάλλοντα αστροκύτταρα, οι αποφυάδες των οποίων σχηματίζουν λειτουργικές περισυναπτικές συνδέσεις με τους νεοπαραγόμενους νευρώνες, ενδυναμώνοντας τη σύνδεση του νευρωνικού με το αστρογλοιακό δίκτυο και προάγοντας τη συναπτογένεση και τη λειτουργική ενσωμάτωση των νέων νευρώνων (Krzisch και συν., 2014). 1.2.6. Διαφορές κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας Για πολλές δεκαετίες, επικρατούσε η άποψη πως ο ιπποκάμπειος σχηματισμός και οι διακριτές περιοχές αυτού αποτελούν συμπαγείς δομές, ομοιογενούς σύστασης και ενιαίας λειτουργίας καθ όλο το μήκος τους. Σημαντικό ρόλο στην εδραίωση της άποψης αυτής διαδραμάτισε το σταθερά επαναλαμβανόμενο, κατά το διαφραγματοκροταφικό άξονά του ιπποκάμπειου σχηματισμού, «τρισυναπτικό» λειτουργικό του κύκλωμα. Ωστόσο, νεότερες μελέτες ανέδειξαν τη διαμερισματοποίηση της λειτουργίας, της γονιδιακής έκφρασης και της ευαισθησίας στην εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων του ιπποκάμπειου σχηματισμού κατά το διαφραγματοκροταφικό και τον εγκάρσιο άξονά του, υπογραμμίζοντας τη σημασία παλαιότερων 52

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ενδείξεων για την ύπαρξη σημαντικών διαφοροποιήσεων στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, αλλά και στην κυτταρική σύσταση κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού αλλά και του εγκάρσιου άξονα. 1.2.6.1. Διαφοροποίηση κατά τη μορφογένεση της οδοντωτής έλικας Η μορφογένεση της DG είναι μία σύνθετη και μακρόχρονη διαδικασία, η οποία ξεκινά τις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες και ολοκληρώνεται τις πρώτες μεταγεννητικές εβδομάδες (Schlessinger και συν., 1975 Bayer, 1980 Altman και Bayer, 1990). Κατά την εμβρυϊκή νευρογένεση της DG, η PL σχηματίζεται πρώτη, μεταξύ 15 ης και 17 ης εμβρυικής ημέρας, ενώ η διαμόρφωση της ML και της GCL ολοκληρώνεται κατά τις πρώτες μεταγεννητικές εβδομάδες (Schlessinger και συν., 1975 Bayer, 1980), με ένα μεγάλο ποσοστό των κοκκοειδών κυττάρων (περίπου το 80%) να παράγεται μεταγεννητικά (Bayer, 1980). Πέρα όμως από τις παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις στη χρονική στιγμή της δημιουργίας, διαφορές παρατηρούνται και στο πρότυπο διαμόρφωσης των τριών στιβάδων. Ενώ κατά τον σχηματισμό της PL και της ML τα νευρικά κύτταρα τοποθετούνται αρχικά στο εσώτερο όριο των στιβάδων και σταδιακά εποικίζουν τα μεσαία και εξώτερα τμήματά τους, τα κοκκοειδή κύτταρα ακολουθούν το αντίστροφο πρότυπο, αφού εγκαθίστανται με φορά από επιπολής προς εν τω βάθει (Altman και Das, 1965 Schlessinger και συν., 1975) Με τη βοήθεια της αυτοραδιογραφίας αλλά και σύγχρονων τεχνικών ανάλυσης της έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων, έχει μελετηθεί πλήρως η διαδικασία σχηματισμού της DG, και της κύριας στιβάδας αυτής, της GCL. Κατά τις τελευταίες εμβρυϊκές ημέρες (Ε16), τα εμβρυϊκά NSCs που εποικίζουν το πρωτογενές νευροεπιθήλιο της DG πολλαπλασιάζονται έντονα, ενώ από την E18, ξεκινούν τη μετανάστευσή τους προς την περιοχή που θα αποτελέσει τη DG, σχηματίζοντας κατά 53

ΕΙΣΑΓΩΓΗ την πορεία τους την οδοντωτή μεταναστευτική δεσμίδα (Altman και Bayer, 1990). Από την E22 και έπειτα, μόνο ένα μικρό ποσοστό του πληθυσμού των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων ανιχνεύεται πλέον στην υποκοιλιακή οδοντωτή ζώνη και στη μεταναστευτική δεσμίδα, και από εδώ και στο εξής, ο εποικισμός της GCL πραγματοποιείται από κύτταρα τα οποία παράγονται εντός της PL, σε μία περιοχή που εντοπίζεται στην κορυφή της μεταναστευτικής δεσμίδας, η οποία σταδιακά εκτείνεται παράλληλα και κάτω από την GCL, την SGZ (Schlessinger και συν., 1975 Altman και Bayer, 1990). Τα νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα μεταναστεύουν κάθετα από την SGZ στην GCL, εποικίζοντάς την καθ όλο το μήκος της (Bayer, 1980). Η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων αποδεικνύει ότι τα προγεννητικά κύτταρα της υποκοιλιακής οδοντωτής ζώνης και της μεταναστευτικής δεσμίδας εκφράζουν το μεταγραφικό παράγοντα Sox2, που είναι αξιόπιστος δείκτης των εμβρυϊκών NSCs (Thiel, 2013). H έκφρασή του παρατηρείται και στα εντοπισμένα στην SGZ κύτταρα, μερίδα των οποίων όμως εκφράζουν και τον μεταμιτωτικό παράγοντα Prox-1 (Sugiyama και συν., 2013 Seki και συν., 2014), γεγονός που σημαίνει ότι η διαφοροποίηση και η ωρίμανση των νεοπαραγόμενων κοκκοειδών κυττάρων πραγματοποιείται αποκλειστικά εντός της ζώνης αυτής (Lavado και συν., 2010 Iwano και συν., 2012). Τα νέα κοκκοειδή κύτταρα εποικίζουν κατά προτεραιότητα το υπερπυραμιδικό σκέλος της GCL και έπειτα το υπο-πυραμιδικό της σκέλος (Schlessinger και συν., 1975 Altman και Bayer, 1990 Bayer, 1980 Sugiyama και συν., 2013). Όμως, στο τέλος της πρώτης μεταγεννητικής εβδομάδας δεν παρατηρείται καμία διαφορά στο βαθμό ωρίμανσης των κοκκοειδών κυττάρων και στην έκταση των δύο σκελών (Bayer, 1980). Διαφορές όμως παρατηρούνται και κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού 54

ΕΙΣΑΓΩΓΗ άξονα. Τα κοκκοειδή κύτταρα του κροταφικού τμήματος της DG είναι απόγονοι των προγεννητικών κυττάρων της πρώτης μεταναστευτικής περιόδου ενώ αυτά του διαφραγματικού τμήματος προστίθεται μεταγενέστερα (Schlessinger και συν., 1975 Bayer, 1980). Τελευταίο σχηματίζεται το ενδιάμεσο τμήμα της DG, αφού τα κοκκοειδή κύτταρα προστίθενται με φορά από τα άκρα προς το κέντρο κατά τον διαμήκη άξονα (Bayer, 1980). 1.2.6.2. Κυτταρικές και αγγειακές διαφορές Σημαντικές διαφοροποιήσεις παρατηρούνται στην κατανομή του πληθυσμού των κύριων αλλά και των διάμεσων νευρώνων κατά μήκος του διαφραγματοκροταφικού άξονα, οδηγώντας σε διαφορές στην έκφραση ποικίλων νευροδιαβιβαστών, ασβεστο-εξαρτώμενων πρωτεϊνών και πεπτιδίων. Διαφορές όμως παρατηρούνται και στους αστροκυτταρικούς πληθυσμούς του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, όπως και στο αγγειακό δίκτυο, επιβεβαιώνοντας την στενή σχέση και την παράλληλη ανάπτυξη των αστροκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων. 1.2.6.2.1. Κοκκοειδή κύτταρα Τα κοκκοειδή κύτταρα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG του επίμυ εμφανίζουν διαφορές πληθυσμιακές, μορφολογικές και συνδέσεων. Μετρήσεις του συνολικού πληθυσμού των κοκκοειδών κυττάρων της DG υπολογίζουν τον αριθμό τους σε 635.000±33.000 κύτταρα (Seress και Pokorny, 1981), χωρίς να αναφέρονται συγκριτικά στην ειδικότερη κατανομή αυτών στο διαφραγματικό ή το κροταφικό τμήμα. Ανατομικές μελέτες αναφερόμενες στο μέγεθος αλλά και την πυκνότητα κατανομής των κοκκοειδών κυττάρων στα δύο τμήματα της DG αποδεικνύουν ότι ενώ το μέγεθος των κοκκοειδών κυττάρων αυξάνεται καθώς προχωρούμε από το 55

ΕΙΣΑΓΩΓΗ διαφραγματικό προς τον κροταφικό πόλο, η πυκνότητα κατανομής αυτών μειώνεται (Gaarskjaer, 1978α Seress και Pokorny, 1981) (Εικ. 1.5). Όμως και η αναλογία των κοκκοειδών προς τα πυραμιδοειδή CA3 κύτταρα είναι υψηλότερη στο διαφραγματικό τμήμα (12:1) συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα (2:3) (Gaarskjaer, 1978α), ενώ και οι προβολές του πεδίου CA3 προς τα κοκκοειδή κύτταρα αυξάνουν στο κροταφικό τμήμα (3-4 φορές συγκριτικά με το διαφραγματικό) (Ishizuka και συν., 1990). Συγχρόνως, το μήκος των βρυωδών ινών αυξάνεται σταδιακά καθώς μετακινούμαστε από το διαφραγματικό πόλο προς το ενδιάμεσο τμήμα της DG, όπου κορυφώνεται και έπειτα σταδιακά μειώνεται (Gaarskjaer, 1978α Gaarskjaer, 1978β). Διαφορές παρατηρούνται επίσης και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα. Έντονη είναι η διαφορά στο μήκος των δύο σκελών, με το μήκος του υποπυραμιδικού σκέλους να παραμένει αμετάβλητο εντός του διαφραγματικού τμήματος, αλλά να μειώνεται σημαντικά κατά μήκος του κροταφικού τμήματος, με αποτέλεσμα να μην είναι ορατό στο τέλος αυτού. Αντίθετα, το μήκος του υπερ-πυραμιδικού σκέλους μεταβάλλεται κατά μήκος του διαφραγματικού τμήματος, φτάνοντας στο μέγιστο περί το μέσον του διαφραγματικού τμήματος, και έπειτα σταδιακά μειώνεται, ενώ τα δύο σκέλη έχουν σχεδόν το ίδιο μήκος καθ όλη την έκταση του ενδιάμεσου τμήματος της DG. Συγχρόνως, η αναλογία των κοκκοειδών κυττάρων προς τα καλαθοειδή κύτταρα είναι σχεδόν διπλάσια στο υπερ-πυραμιδικό σκέλος (Schmidt και συν., 2012), με τους δενδρίτες των κοκκοειδών κυττάρων του σκέλους αυτού να έχουν μεγαλύτερο συνολικό μήκος (3.500 μm έναντι 2.800 μm) (Desmond και Levy, 1985 Claiborne και συν., 1986), και επομένως να προβάλουν σε πιο απομακρυσμένους CA3 νευρώνες (Desmond και Levy, 1985), ενώ διαθέτουν και μεγαλύτερο αριθμό ακάνθων (περίπου 5.600 άκανθες/ κοκκοειδές κύτταρο του υπερπυραμιδικού σκέλους και 3.640 άκανθες/ κοκκοειδές κύτταρο του υπο-πυραμιδικού 56

ΕΙΣΑΓΩΓΗ σκέλους) (Desmond και Levy, 1985 Hama και συν., 1989). Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα Υπερ-πυραμιδικό Υπο-πυραμιδικό Υπερ-πυραμιδικό Υπο-πυραμιδικό σκέλος σκέλος σκέλος σκέλος Εικόνα 1.5: Τα δύο σκέλη του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG, χρωσμένα με την τεχνική Nissl, όπου φαίνονται οι διαφορές στο μέγεθος και την πυκνότητα κατανομής των κοκκοειδών κυττάρων. 1.2.6.2.2. Βρυώδη κύτταρα Τα βρυώδη κύτταρα δεν κατανέμονται ομοιόμορφα κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG. Πειραματικές μελέτες στον επίμυ αποδεικνύουν ότι ο μεγαλύτερος πληθυσμός των βρυωδών κυττάρων ανιχνεύεται στο ενδιάμεσο τμήμα της, ενώ μειώνεται σταδιακά καθώς κατευθυνόμαστε προς τους δύο πόλους (Gaarskjaer, 1978α Gaarskjaer, 1978β). Συγχρόνως, σημαντικές διαφοροποιήσεις και στη μορφολογία τους συναντώνται, αφού τα κύτταρα του κροταφικού τμήματος είναι μικρότερα, περισσότερο κυκλικά και με αυξημένη αναλογία πυρήνα:κυτταροπλάσματος σε σχέση με αυτά του διαφραγματικού τμήματος (Gaarskjaer, 1978α Gaarskjaer, 1978β). 1.2.6.2.3. Διάμεσοι νευρώνες Οι κύριοι ανασταλτικοί νευρώνες της DG είναι τα καλαθοειδή κύτταρα της 57

ΕΙΣΑΓΩΓΗ GCL, η κατανομή των οποίων είναι ανομοιογενής κατά μήκος και του διαφραγματοκροταφικού αλλά και του εγκάρσιου άξονά της (Seress και Pokorny, 1981). Στο διαφραγματικό τμήμα, η αναλογία των καλαθοειδών κυττάρων προς τα κοκκοειδή κύτταρα είναι 1:100 για το υπερ-πυραμιδικό σκέλος και 1:180 για το υπο-πυραμιδικό, ενώ στο κροταφικό τμήμα οι αντίστοιχες τιμές είναι 1:150 και 1:300. Η κατανομή των χημικά καθορισμένων πληθυσμών των ανασταλτικών διάμεσων νευρώνων της DG έχει μελετηθεί διεξοδικά στον επίμυ, ενώ έχει εξεταστεί και η ειδικότερη κατανομή αυτών στις τρεις στιβάδες της. Η κατανομή των ανοσοδραστικών έναντι των πρωτεϊνών καλρετινίνη και παρβαλβουμίνη κυττάρων, παρουσιάζει σημαντικές διαφοροποιήσεις κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα. Η πυκνότητα των καλρετινίνη + νευρώνων στο κροταφικό τμήμα είναι διπλάσια από την αντίστοιχη του διαφραγματικού τμήματος (2,6 έναντι 1,2 x 10 3 / mm 3 ), με τις σημαντικότερες διαφοροποιήσεις να παρατηρούνται στην GCL και την PL (Nomura και συν., 1997α Nomura και συν., 1997β). Αντίθετα, η κατανομή των παρβαλβουμίνη + νευρώνων, οι οποίοι εντοπίζονται κυρίως στην GCL, εμφανίζεται ομοιογενής κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα, αλλά και μεταξύ των τριών στιβάδων της DG και των δύο τμημάτων (Nomura και συν., 1997α Nomura και συν., 1997β). Η πυκνότητα των σωματοστατίνη + νευρώνων ανιχνεύεται όμοια μεταξύ των δύο τμημάτων της DG, καθώς και μεταξύ των τριών στιβάδων αυτών, όπως και η πυκνότητα των ανοσοδραστικών νευρώνων έναντι του VIP και της χολοκυστοκινίνης (Nomura και συν., 1997α Nomura και συν., 1997β). Η πυκνότητα των νευρώνων που εκφράζουν το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (nitic oxide synthase, ΝΟS) ανευρίσκεται αυξημένη κατά 1,5 φορά στο σύνολο της DG του κροταφικού τμήματος, αλλά η αύξηση αυτή δεν 58

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντικατοπτρίζεται στις επιμέρους στιβάδες της, αφού η έκφρασή τους φαίνεται να μη διαφέρει από τις αντίστοιχες στιβάδες του διαφραγματικού τμήματος (Nomura και συν., 1997α Nomura και συν., 1997β). Ειδικότερα, η πυκνότητα των ανοσοδραστικών νευρώνων έναντι της νευρικής μορφής της NOS (neuronal NOS, nnos), αν και ανιχνεύεται αυξημένη και στις τρεις στιβάδες της DG του κροταφικού τμήματος, συγκριτικά με τις αντίστοιχες στιβάδες του διαφραγματικού τμήματος, η αύξηση αυτή δεν κρίνεται ως στατιστικά σημαντική (Grivas, 2006). 1.2.6.2.4. Αστροκύτταρα Στη μοναδική υπάρχουσα ερευνητική μελέτη της κατανομής του αστροκυτταρικού πληθυσμού κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG του επίμυ (Grivas, 2006), καταμετρήθηκε σημαντικά μεγαλύτερη πυκνότητα GFAP-ανοσοδραστικών στοιχείων στο διαφραγματικό τμήμα της. Στη μελέτη αυτή, η πυκνότητα των αστροκυτταρικών στοιχείων εντοπίστηκε ιδιαίτερα αυξημένη στην GCL και την PL του διαφραγματικού τμήματος, καθώς και στη ML του κροταφικού τμήματος, συγκριτικά με τις αντίστοιχες στιβάδες του άλλου τμήματος της DG. 1.2.6.2.5. Αγγείωση Η στενή σχέση των αστροκυττάρων με το αγγειακό δίκτυο έχει διαπιστωθεί από πολύ νωρίς. Λαμβάνοντας υπόψη πως οι μυζητικοί ποδίσκοι των αστροκυττάρων περιβάλλουν το τοίχωμα των τριχοειδών αγγείων, ενδιαφέρον παρουσιάζει το ερώτημα εάν το διαφραγματικό τμήμα, το οποίο παρουσιάζει μεγαλύτερη πυκνότητα αστροκυτταρικών στοιχείων, διαθέτει συγχρόνως αυξημένη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων. Η συγκριτική μελέτη της έκτασης του αγγειακού δικτύου στα δύο τμήματα της DG του επίμυ επιβεβαιώνει τα αστροκυτταρικά ευρήματα, αποδεικνύοντας ότι το διαφραγματικό τμήμα περιέχει συγκριτικά υψηλότερη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων (διαμέτρου 8μm), ειδικότερα στην PL 59

ΕΙΣΑΓΩΓΗ και τη ML (Grivas και συν., 2003). Συγχρόνως, αυξημένη εμφανίζεται η συνολική πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων στο κροταφικό τμήμα, ενώ μειωμένη είναι η πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων στο ίδιο τμήμα, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως το κροταφικό τμήμα της DG διαθέτει συγκριτικά περισσότερα αιμοφόρα αγγεία μεγάλης διαμέτρου (> 20μm) (Grivas και συν., 2003). 1.2.6.3. Διαφορές στη γονιδιακή έκφραση Παλαιότερες μέθοδοι, όπως η αυτοραδιογραφία και οι ιστοχημικές τεχνικές χρώσης, αποκάλυψαν τις δομικές και μορφογενετικές διαφορές μεταξύ των δύο τμημάτων της DG. Οι σύγχρονες μοριακές τεχνικές όμως, προσδιορίζουν τις διαφορές που παρατηρούνται στη γονιδιακή έκφραση, αποδεικνύοντας πως ένα σύνολο 229 γονιδίων παρουσιάζει εκλεκτικά αυξημένη έκφραση στο διαφραγματικό ή το κροταφικό τμήμα (Christensen και συν., 2010). To διαφραγματικό τμήμα, το οποίο είναι υπεύθυνο για το σχηματισμό και την εδραίωση της χωροταξικής μνήμης, παρουσιάζει αυξημένη έκφραση των γονιδίων για τη σύνθεση της αποκαρβοξυλάσης της ιστιδίνης (histidine decarboxylase, HDC), των γονιδίων που ρυθμίζουν την αντιγραφή της κοκαΐνης και της αμφεταμίνης (cocaineand amphetamine-regulated transcript, Cart) και του γονιδίου της 5-νουκλεοτιδάσης (5'-nucleotidase, Nt5) (Christensen και συν., 2010). Και τα τρία αυτά γονίδια συμβάλλουν στη λειτουργική ιδιαιτερότητα του διαφραγματικού τμήματος: α. η ΗDC καταλύει τη σύνθεση της ισταμίνης από την ιστιδίνη και η ισταμίνη είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της αναφορικής μνήμης, της μνήμης εργασίας και της χωροταξικής μνήμης (Dere και συν., 2003 Xu και συν., 2009), β. το Cart εμπλέκεται στο μηχανισμό της ανταμοιβής, ο οποίος εξελίσσεται κύρια στο διαφραγματικό τμήμα (Christensen και συν., 2010), γ. η αυξημένη έκφραση της Nt5, που αποτελεί αξιόπιστο δείκτη των πλαστικών συνάψεων (Lie και συν., 1999), αποκαλύπτει την 60

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αυξημένη εκδήλωση του LTP στο διαφραγματικό τμήμα (Maggio και Segal, 2007). Αντίθετα, στο κροταφικό τμήμα της DG, η αυξημένη έκφραση του γονιδίου του υποδοχέα τύπου Ι της σωματοστατίνης (somatostatin receptor 1, Sstr1) (Christensen και συν., 2010), είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη ικανότητα εκδήλωσης του LTP, αφού έχει αποδειχθεί πως η σωματοστατίνη μειώνει τα επίπεδα των ιόντων ασβεστίου Ca(2 + ) στις δενδριτικές απολήξεις (Baratta και συν., 2002). Σύγχρονες μελέτες αποδεικνύουν πως τα βασικά επίπεδα της ηλεκτροφυσιολογικής δραστηριότητας τoυ διαφραγματικού τμήματος είναι αυξημένα συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα (Piatti και συν., 2011), οδηγώντας στην αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική βιοσύνθεση και τον μεταβολισμό (Christensen και συν., 2010). Εντούτοις, η έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων του αναστολέα των ιστικών μεταλλοπρωτεϊνασών τύπου 2 (tissue inhibitor of metalloproteinase 2, Timp2) και της δεκορίνης, που αποτελούν βασικά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (Kishioka και συν., 2008 Benet και συν., 2012), παρουσιάζεται αυξημένη στο κροταφικό τμήμα (Leonardo και συν., 2006 Christensen και συν., 2010). Τα συστατικά αυτά εικάζεται ότι συνεισφέρουν στη διαβίβαση των νευροτροφικών παραγόντων, αναστέλλοντας τη δράση ορισμένων κυτοκινών όπως ο αυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού των πρωτεΐνών τύπου β (transforming growth factor-beta, TGF-β) (Sometani και συν., 2001). Αν και για την πλειονότητα των γονιδίων η επιλεκτική έκφρασή τους στο διαφραγματικό ή το κροταφικό τμήμα είναι ξεκάθαρη, η έκφραση του γονιδίου του υποδοχέα του απελευθερωτικού παράγοντα της θυρεοτροπίνης (thyrotropin-releasing hormone receptor, Trhr) ανευρίσκεται αυξημένη και στα δύο τμήματα της DG (Thompson και συν., 2008 Christensen και συν., 2010 Fanselow και Dong, 2010). Η θυρεοτροπίνη εμπλέκεται στο μηχανισμό της χωροταξικής μνήμης (Horita και συν., 61

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1989 Horita, 1998) και επομένως θα έπρεπε να ανευρίσκεται αυξημένη στο διαφραγματικό τμήμα. Όμως, κατά την εκτέλεση συμπεριφορικών δοκιμών ελέγχου της χωροταξικής μνήμης στα τρωκτικά η συγκέντρωση της Trhr αυξάνει σημαντικά και στα δύο τμήματα της DG (Aguilar-Valles και συν., 2007). Νεότερες μελέτες εξηγούν την έκφραση της Trhr καθ όλο το μήκος της DG, αφού αποδεικνύουν την εμπλοκή και του κροταφικού τμήματος του ιππόκαμπου στο σχηματισμό της χωροταξικής μνήμης (Nadel και συν., 2013). Η χαρτογράφηση της γονιδιακής έκφρασης στα δύο τμήματα της DG στον ενήλικο εγκέφαλο, οδήγησε σε ευρήματα συμβατά με τη συνεχή παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονά της. Η έκφραση γονιδίων που συνδέονται με τα NPCs, όπως η προμινίνη-1 (Walker και συν., 2013), και με τους νεοπαραγόμενους νευρώνες, όπως το CD24 (cluster of differentiation 24) (Belvindrah και συν., 2002), αποδεικνύεται αυξημένη στο κροταφικό τμήμα της οδοντωτής έλικας (Christensen και συν., 2010), όπως και η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη διαδικασία της νευρωνικής διαφοροποίησης και της συναπτικής διαβίβασης (Christensen και συν., 2010). Επίσης, στο ίδιο τμήμα της DG παρατηρείται έντονη έκφραση του γονιδίου της κινάσης της σερίνης/θρεονίνης 23, η οποία έχει δειχθεί πως επηρεάζει τη δραστηριότητα των TGF-β κυτοκινών (Soderstrom και συν., 1996), οι οποίες αποτελούν σηματοδοτικά μόρια που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των NSCs στον ενήλικο εγκέφαλο (Wachs και συν., 2006). Παράλληλα, στο διαφραγματικό τμήμα παρουσιάζεται αυξημένη η έκφραση των γονιδίων του υποδοχέα της τυροσινικής κινάσης EphA7 (Ephrin A7) (Leonardo και συν., 2006 Christensen και συν., 2010), η οποία εμπλέκεται στη μετανάστευση των νεοπαραγόμενων νευρώνων στον ενήλικο εγκέφαλο (Yamaguchi και Pasquale, 2004 Rodger και συν., 2012), και του αυξητικού παράγοντα του 62

ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετασχηματισμού των πρωτεΐνών τύπου α (transforming growth factor-alpha, TGF-α) (Christensen και συν., 2010), ο οποίος αυξάνει την έκφραση της νεστίνης από τις νευρογενείς ζώνες (Alipanahzadeh και συν., 2013). 1.2.6.4. Διαφορές στη συνδεσμολογία Οι προβολές του EC δεν κατανέμονται ομοιόμορφα κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG. Οι πλάγιες και οπίσθιες περιοχές του EC απολήγουν κυρίως στο διαφραγματικό τμήμα της, ενώ οι μεσαίες και πρόσθιες περιοχές αυτού απολήγουν στο κροταφικό τμήμα (Steward, 1976 Steward και Scoville, 1976 Amaral, 2004 Ohara και συν., 2013). Ειδικότερα, το διαφραγματικό τμήμα δέχεται προσαγωγούς ίνες από το ραχιαίο και το κοιλιακό τμήμα του LEA και από το μεσο-οπίσθιο, το άκρως οπίσθιο και το πλαγιο-οπίσθιο τμήμα του MEA και του IEA. Αντίθετα, στο κροταφικό τμήμα προβάλουν ίνες προερχόμενες από το μεσο-οπίσθιο τμήμα του πλαγιο-κοιλιακού τμήματος του LEA, του οπίσθιου τμήματος του μεσο-κοιλιακού τμήματος του LEA και των μεσο-πρόσθιων τμημάτων του MEA και του IEA (Ruth και συν., 1982 Ruth και συν., 1988 Ohara και συν., 2013). Οι ίδιες μελέτες, αποκαλύπτουν και την ακριβή συνδεσμολογία του ενδιάμεσου τμήματος της DG, το οποίο δέχεται προσαγωγούς ίνες προερχόμενες από την κοιλιακή περιοχή του πλάγιου τμήματος του LEA και από το κοιλιακό και το μεσο-πρόσθιο τμήμα του IEA. Όμως και οι προεβολές του ετεροπλάγιου EC στην DG παρουσιάζουν σημαντική διαφοροποίηση, με τον αριθμό τους να μειώνεται καθώς οδεύουμε από το διαφραγματικό προς τον κροταφικό πόλο (Gottlieb και Cowan, 1973 Steward και Scoville, 1976). Διαφορές στην κατανομή των ενδορινικών προβολών εντοπίζονται και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα της DG. Έχει δειχθεί ότι οι προερχόμενες από τον MEA προσαγωγοί ίνες, απολήγουν στο υπο-πυραμιδικό σκέλος, ενώ στο υπερ-πυραμιδικό 63

ΕΙΣΑΓΩΓΗ σκέλος προβάλει ο LEA (Squire, 1992 Tamamaki, 1997). To μοτίβο αυτό επαναλαμβάνεται καθ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα. Πέραν του EC, η DG δέχεται προσαγωγούς συνδέσεις από το μέσο διαφραγματικό πυρήνα και από την υπερ-μαστιακή περιοχή του υποθαλάμου. Οι μη χολινεργικοί νευρώνες του μέσου τμήματος του μέσου διαφραγματικού πυρήνα προβάλουν κύρια στο διαφραγματικό τμήμα της DG, ενώ οι ακετυλοχολίνη + νευρώνες του πλάγιου τμήματος του ίδιου πυρήνα προβάλουν στο κροταφικό τμήμα (Amaral και Kurz, 1985 Ohara και συν., 2013). Άλλες ερευνητικές προσπάθειες αποδεικνύουν πως και το διαφραγματικό τμήμα δέχεται ορισμένες χολινεργικές απολήξεις, προερχόμενες από τα νευρικά κύτταρα του κάθετου σκέλους της διαγώνιας περιοχής του Broca (Nyakas και συν., 1987), τα οποία προβάλουν ταυτόχρονα και στο κροταφικό τμήμα. Η εικόνα είναι πιο ξεκάθαρη για το μοτίβο των απολήξεων των νευρώνων της υπερ-μαστιακής περιοχής κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού αλλά και του εγκάρσιου άξονα της DG, αφού έχει δειχθεί ότι το διαφραγματικό τμήμα δέχεται προσαγωγούς ίνες από τον έξω και τον έσω πυρήνα του μαστίου, ενώ οι νευρώνες του μέσου πυρήνα του μαστίου προβάλουν στο κροταφικό τμήμα. Συγχρόνως, το υπερ-πυραμιδικό σκέλος δέχεται διπλάσιο αριθμό απολήξεων συγκριτικά με το υπο-πυραμιδικό σκέλος και στα δύο τμήματα της DG. Οι νοραδρενεργικές και οι ντοπαμινεργικές ίνες κατανέμονται ομοιόμορφα σε όλο το μήκος του εγκάρσιου άξονά της DG (Hoglinger και συν., 2014). Το ομοιογενές μοτίβο όμως δεν ακολουθείται και κατά μήκος του διαφραγματοκροταφικού άξονα αφού απολήγουν μαζικότερα στο κροταφικό τμήμα (Gage και συν., 1978 Gasbarri και συν., 1994 Loy και συν., 1980). Οι σεροτονινεργικές ίνες είναι πιο πυκνές στο κροταφικό τμήμα της DG, όπως και στο υπο-πυραμιδικό σκέλος και των δύο τμημάτων (Bjarkam και συν., 2003). 64

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η κατανομή των απολήξεων των βρυωδών ινών των κοκκοειδών κυττάρων στα CA3 πυραμιδοειδή κύτταρα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, η οποία καθορίζεται από την επιμέρους κυτταροαρχιτεκτονική των δύο τμημάτων. Το διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού διαθέτει, συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα, μεγαλύτερο αριθμό κοκκοειδών και μικρότερο αριθμό CA3 νευρώνων, με αποτέλεσμα, η αναλογία της επιφάνειας προβολής των βρυωδών ινών προς τον αριθμό των CA3 νευρώνων να ανευρίσκεται αυξημένη κατά τέσσερεις με πέντε φορές στο τμήμα αυτό της DG (Gaarskjaer, 1978α Gaarskjaer, 1978β). Συγχρόνως, οι παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις στην έκταση της πυραμιδικής στιβάδας αλλά και στην πυκνότητα κατανομής των CA3 νευρώνων εντός αυτής, οδηγούν σε διαφορές στον τρόπο απόληξης των βρυωδών ινών στα CA3 πυραμιδοειδή κύτταρα των δύο τμημάτων. Στο διαφραγματικό τμήμα, τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3 ακολουθούν το αντίστροφο μοτίβο κατανομής από αυτό των κοκκοειδών κυττάρων του ίδιου τμήματος, όντας αραιά κατανεμημένα εντός της ιδιαίτερα εκτεταμένης πυραμιδικής στιβάδας. Οι βρυώδεις ίνες επομένως, δύνανται να διεισδύουν εντός της στιβάδας των πυραμιδοειδών κυττάρων, όπου και απολήγουν, σε αντίθεση με τις βρυώδεις ίνες του κροταφικού τμήματος, οι οποίες προβάλουν στα επιπολής τμήματα της στενής και με πυκνά κατανεμημένα κύτταρα της κροταφικής πυραμιδικής στιβάδας (Gaarskjaer, 1978α Gaarskjaer, 1978β). Αντίστοιχες πειραματικές μελέτες (Claiborne και συν., 1986) αποδεικνύουν πως διαφορές παρατηρούνται και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα, αποδεικνύοντας ότι οι βρυώδεις ίνες των κοκκοειδών κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού σκέλους και των δύο τμημάτων της DG, απολήγουν στα επιπολής τμήματα της πυραμιδικής στιβάδας, ενώ οι βρυώδεις ίνες των κυττάρων του υπο-πυραμιδικού σκέλους διεισδύουν βαθύτερα, απολήγοντας σε εσώτερα 65

ΕΙΣΑΓΩΓΗ τμήματα της πυραμιδικής στιβάδας. Διαφορές παρατηρούνται και στην κατανομή των συνδεσμικών/συνδετικών ινών κατά το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG. Αν και οι συνδετικές προβολές διανέμονται σχετικά ομοιόμορφα στο υπερ-πυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος της DG (Gottlieb και Cowan, 1973), το ίδιο μοτίβο δεν παρατηρείται και κατά το διαφραγματο-κροταφικό άξονα, όπου η πυκνότητα των προβολών μειώνεται καθώς προχωρούμε προς τον κροταφικό πόλο (Gottlieb και Cowan, 1973 West και συν., 1979). Επιπρόσθετα, οι συνδεσμικές ίνες του κροταφικού τμήματος έχουν την ικανότητα να προβάλουν σε πιο απομακρυσμένα κατά τον διαμήκη άξονα κοκκοειδή κύτταρα, συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα του διαφραγματικού τμήματος (Buckmaster και συν., 1996). 1.2.6.5. Λειτουργικές διαφορές Οι παρατηρούμενες διαφορές στη γονιδιακή έκφραση και τη συνδεσμολογία μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG, οδηγούν στη λειτουργική διαμερισματοποίηση των δύο τμημάτων. Η διαφραγματική DG, μέσω του LEA, λαμβάνει ερεθίσματα προερχόμενα από το συνειρμικό, τον οπτικό και τον ακουστικό φλοιό (Dolorfo και Amaral, 1998), ενώ το κροταφικό της τμήμα δέχεται προβολές από τον MEA και γειτνιάζει με τον προμετωπιαίο φλοιό, την αμυγδαλή και άλλες υπο-φλοιϊκές περιοχές που συνδέονται με τον άξονα υποθάλαμος-υπόφυσηεπινεφρίδια (Dolorfo και Amaral, 1998 Kerr και συν., 2007). Επομένως, στο διαφραγματικό τμήμα, η DG συνεισφέρει στο διαχωρισμό, την ενσωμάτωση και την κωδικοποίηση των εισερχόμενων πληροφοριών που σχετίζονται με τις γνωστικές λειτουργίες και ειδικότερα με τη χωροταξική μνήμη, ενώ, στο κροταφικό τμήμα, επιτελεί τις ίδιες λειτουργίες κατά τη διαμόρφωση και ρύθμιση της συμπεριφοράς που σχετίζεται με το συναίσθημα. Η εμπλοκή του διαφραγματικού τμήματος στη 66

ΕΙΣΑΓΩΓΗ διαμόρφωση της χωροταξικής μνήμης υποστηρίζεται και από την ύπαρξη σε αυτό μεγαλύτερου αριθμού κυττάρων θέσης, τα οποία διαθέτουν αυξημένη ικανότητα για εξειδικευμένη χωρική ανάλυση, συγκριτικά με τα αντίστοιχα κύτταρα του κροταφικού τμήματος (Jung και συν., 1994). Σε αντίθεση με τις προσαγωγούς ίνες του EC, οι οποίες κατανέμονται ανομοιογενώς κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG, οι προερχόμενες από τον οσφρητικό βολβό ίνες εμφανίζουν ομοιογενή κατανομή (Kosel και συν., 1981). Παρά ταύτα, ορισμένες μελέτες υποστηρίζουν ότι κύρια το κροταφικό τμήμα εμπλέκεται στην «οσφρητική» μνήμη, όντας υπεύθυνο για την επεξεργασία των εισερχόμενων οσφρητικών πληροφοριών (Kesner και συν., 2011), πραγματοποιώντας το διαχωρισμό παρόμοιων εισερχόμενων οσφρητικών ερεθισμάτων (Weeden και συν., 2014). Παλαιότερες ερευνητικές μελέτες βασισμένες σε πειραματικές βλάβες, μηχανικές ή χημικές, του ενός ή του άλλου τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, αλλά και πιο σύγχρονες μελέτες συνέβαλαν καθοριστικά στη διερεύνηση της ειδικότερης λειτουργίας του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος. Βλάβες στον διαφραγματικό ιππόκαμπο δημιουργούν διαταραχές στην πλοήγηση, τη μετακίνηση και την εξερεύνηση κατά την εφαρμογή ποικίλων δοκιμών της χωρικής μνήμης (Moser και Moser, 1998 Bannerman και συν., 1999 Zhang και συν., 2004), επηρεάζοντας και την αναφορική μνήμη αλλά και τη μνήμη εργασίας (Pothuizen και συν., 2004). Απεναντίας, βλάβες στο κροταφικό τμήμα του ιππόκαμπου, δεν επηρεάζουν τη χωροταξική μνήμη (Bannerman και συν., 2003), αλλά επιδρούν σημαντικά στη συμπεριφορά που σχετίζεται με το άγχος, οδηγώντας στην εμφάνιση έντονης αγχολυτικής δράσης (Bannerman και συν., 2003). Τα παραπάνω ευρήματα επιβεβαιώνονται και από τη μελέτη της έκφρασης 67

ΕΙΣΑΓΩΓΗ των IEGs, Αrc, zif268 (Zinc finger 268) και c-fos, τα οποία ανευρίσκονται σε αυξημένα επίπεδα επιλεκτικά στο διαφραγματικό ή το κροταφικό τμήμα, κατά την εκτέλεση των χωροταξικών δοκιμασιών ή των δοκιμασιών σχετιζόμενων με το άγχος, αντίστοιχα (Vann και συν., 2000 Guzowski και συν., 2001 Calfa και συν., 2007 Smith και συν., 2007). Η μελέτη των IEGs αναδεικνύει επίσης και τις υπάρχουσες λειτουργικές διαφοροποιήσεις κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα της DG, και αποδεικνύει πως το υπερ-πυραμιδικό σκέλος παρουσιάζει συγκριτικά αυξημένη έκφραση των γονιδίων Arc και zif268, ενδεικτικών της αυξημένης λειτουργικής ενεργοποίησης των εκεί εντοπισμένων κοκκοειδών κυττάρων (Schmidt και συν., 2012). Παράλληλα, η in vivo τεχνική της αμπερομετρίας σταθερού δυναμικού (constant potential amperometry, CPA), η οποία μετρά με υψηλή χρονική ανάλυση τις αλλαγές στη ροή του αίματος ως αποτέλεσμα της αύξησης της συναπτικής δραστηριότητας μίας εγκεφαλικής περιοχής σε ελεύθερα κινούμενα ζώα, εμπλέκει το διαφραγματικό ιππόκαμπο και στο μηχανισμό της κίνησης και στο στάδιο των γρήγορων κινήσεων των ματιών κατά τη διάρκεια του ύπνου (rapid eye movement, REM) (McHugh και συν., 2011). Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνονται και από ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες (Sabolek και συν., 2009). Αν και οι διαφορές στη συνδεσμολογία και η ειδικότερη απόκριση στις εντοπισμένες πειραματικές βλάβες, συνηγορούν υπέρ του λειτουργικού διαμερισμού του ιπποκάμπειου σχηματισμού, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα λειτουργικά δίκτυα που εμπλέκονταιι στο μηχανισμό της χωροταξικής μνήμης και του συναφούς φόβου, δεν περιορίζονται αυστηρά εντός των ορίων του διαφραγματικού ή του κροταφικού τμήματος, αντίστοιχα, αλλά παρουσιάζουν μια ευρύτερη διανομή. Πειραματικές βλάβες στο διαφραγματικό ιππόκαμπο οδηγούν σε εμφάνιση αγχολυτικής 68

ΕΙΣΑΓΩΓΗ συμπεριφοράς κατά την εκτέλεση συμπεριφορικών δοκιμών του άγχους (McNish και συν., 1997). Βλάβες στο κροταφικό τμήμα από την άλλη, υποδεικνύουν την εμπλοκή του τμήματος αυτού και στη χωροταξική μνήμη, αφού προκαλούν καθυστέρηση της πρώιμης μάθησης κατά τη διάρκεια ενός συμπεριφορικού τεστ που αφορά την αναζήτηση ενός συγκεκριμένου στόχου (Ruediger και συν., 2012). Παράλληλες μελέτες αποδεικνύουν πως μετά από εντοπισμένη βλάβη σε μία περιοχή του ιππόκαμπου που είναι υπεύθυνη για μία συγκεκριμένη λειτουργία, ο υπόλοιπος υγιής ιππόκαμπος συνεισφέρει σε αυτές τις λειτουργίες, αν και λιγότερο αποτελεσματικά (Maren και συν., 1997 Anagnostaras και συν., 2001 de Hoz και Martin, 2014). Έλεγχος του ρόλου του ενδιάμεσου τμήματος του ιππόκαμπου στις παραπάνω εργασίες αποκαλύπτει ότι το ενδιάμεσο τμήμα αποτελεί συνδετικό/ μεταβατικό τμήμα των δύο πόλων (Bast και συν., 2009 Fanselow και Dong, 2010). 1.2.6.6. Διαφορές στην εγκατάσταση και εξέλιξη σοβαρών παθήσεων του ΚΝΣ Οι σοβαρές διαταραχές του ΚΝΣ που σχετίζονται (και) με τον ιπποκάμπειο σχηματισμό εισβάλλουν με διαφορετική ένταση στο διαφραγματικό ή το κροταφικό τμήμα αυτού. H επιλεκτική αυτή ευαισθησία παρατηρείται συνήθως στα αρχικά στάδια εμφάνισης της νόσου, αφού τελικώς πλήττεται ο ιπποκάμπειος σχηματισμός στο σύνολό του. Τα φλεγμονώδη νοσήματα του ΚΝΣ, όπως η πολλαπλή σκλήρυνση και η νόσος του Alzheimer, δημιουργούν κύρια αλλοιώσεις στο διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, ενώ η επιληψία του κροταφικού λοβού και η μείζων καταθλιπτική διαταραχή πλήττουν πρωταρχικά το κροταφικό τμήμα αυτού. 1.2.6.6.1. Φλεγμονώδη νοσήματα του ΚΝΣ Η αυξημένη έκφραση των φλεγμονωδών παραγόντων, όπως οι κυτοκίνες και οι χημειοκίνες, φέρεται να επηρεάζει αρχικά το διαφραγματικό τμήμα της DG, όπως αποδεικνύουν πειραματικές μελέτες σε μύες με EAE, το ζωϊκό μοντέλο της 69

ΕΙΣΑΓΩΓΗ πολλαπλής σκλήρυνσης του ανθρώπου (Ekdahl και συν., 2003 Das και Basu, 2008 Pluchino και συν., 2008 Ekdahl και συν., 2009 Huehnchen και συν., 2011 Voloboueva and Giffard, 2011 Belarbi και συν., 2012 Giannakopoulou και συν., 2013). Πιθανώς το γεγονός αυτό να οφείλεται στην αυξημένη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων που παρατηρείται στο διαφραγματικό τμήμα της DG (Grivas και συν., 2003). Παράλληλα, οι ασθενείς της νόσου, εμφανίζουν ταυτόχρονα με τις κινητικές και τις αισθητικές ανεπάρκειες, και σοβαρές γνωστικές ανεπάρκειες (Rao και συν., 1991), ως εκδήλωση της προκαλούμενης δυσλειτουργίας και ατροφίας του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Geurts και συν., 2007 Papadopoulos και συν., 2009). Η γνωστική αυτή ανεπάρκεια εκδηλώνεται κύρια με μειωμένη ικανότητα επεξεργασίας των εισερχόμενων ερεθισμάτων, σοβαρή ανεπάρκεια της μνήμης εργασίας και δυσλειτουργίας της χωροταξικής μνήμης (Rovaris και συν., 2000), υποδεικνύοντας και κλινικά την πιθανή πρωταρχική εμπλοκή του διαφραγματικού τμήματος του ιππόκαμπου. 1.2.6.6.2. Επιληψία του κροταφικού λοβού Η επιληψία του κροταφικού λοβού εκδηλώνεται με δύο κύριες μορφές: τις οξείες επιληπτικές κρίσεις (status epilepticus, SE) και τις αυθόρμητες, επαναλαμβανόμενες επιληπτικές κρίσεις που συνοδεύουν τη χρόνια επιληψία του κροταφικού λοβού (temporal lobe epilepsy, TLE). Και οι δύο μορφές φέρονται να εγκαθίστανται αρχικά στο κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, και σταδιακά να επεκτείνονται σε όλο το μήκος αυτού. Σε επίμυες με πειραματικά προκαλούμενες επιληπτικές κρίσεις μετά από τη χορήγηση πιλοκαρπίνης, βρέθηκε ότι το κροταφικό τμήμα του ιππόκαμπου ήταν η περιοχή του εγκεφάλου που εμφάνισε την πρωϊμότερη επιληπτική δραστηριότητα (Toyoda και συν., 2013). Εικάζεται ότι η πρώιμη και έντονη ενεργοποίηση του 70

ΕΙΣΑΓΩΓΗ κροταφικού τμήματος του ιππόκαμπου ευθύνεται, τουλάχιστον εν μέρει, για τις σοβαρότερες βλάβες των κοκκοειδών κυττάρων και των νευρικών κυττάρων της PL που ανευρίσκονται στο τμήμα αυτό της DG, συγκριτικά με το διαφραγματικό τμήμα αυτής (Fujikawa, 1996). Η αυξημένη ευαισθησία της κροταφικής DG στην εκδήλωση των επιληπτικών κρίσεων (Papatheodoropoulos και συν., 2005 Ekstrand και συν., 2011), ερμηνεύεται και από την υπερέκφραση του Sstr1 σε αυτήν (Christensen και συν., 2010), αφού η σωματοστατίνη εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία της ασθένειας. Η μείωση των σωματοστατίνη + διάμεσων νευρώνων στην PL οδηγεί σε μη φυσιολογική διέγερση των κοκκοειδών κυττάρων προάγοντας την εκδήλωση των κρίσεων (Baratta και συν., 2002). Όμως, παρ όλη τη μεγαλύτερη ευαισθησία στην εμφάνιση των επιληπτικών κρίσεων, το κροταφικό τμήμα φαίνεται πως διαθέτει αυξημένη ανθεκτικότητα σε αυτές, αφού ο βαθμός της νευρικής βλάβης είναι σταθερός ανεξάρτητα από τη διάρκεια του χρόνου ανάνηψης μετά την κρίση, ενώ στο διαφραγματικό τμήμα η έκταση της βλάβης αυξάνεται αναλογικά με το χρόνο ανάνηψης (Fujikawa, 1996). Οι ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες επιβεβαιώνουν την παρατηρούμενη αυξημένη ευαισθησία του κροταφικού τμήματος στην εμφάνιση των επιληπτικών κρίσεων, αποδεικνύοντας πως ο κροταφικός ιππόκαμπος εμφανίζει μεμονωμένες επιληπτικές εκφορτίσεις με μεγαλύτερη συχνότητα, διάρκεια και ένταση, καθώς και ταχύτερο ρυθμό, συγκριτικά με το διαφραγματικό τμήμα, ενοχοποιώντας κύρια τους υποδοχείς του NMDA του κροταφικού τμήματος (Papatheodoropoulos και συν., 2005). Οι επιληπτικές κρίσεις δε βλάπτουν μόνο τους κύριους νευρωνικούς πληθυσμούς της DG, αλλά επηρεάζουν σημαντικά και τους διάμεσους νευρώνες αυτής. Έχει δειχθεί ότι η έκφραση της αποκαρβοξυλάσης 67 του γλουταμινικού οξέος (glutamate decarboxylase 67, GAD67), του ενζύμου που απαιτείται για τη 71

ΕΙΣΑΓΩΓΗ μετατροπή του γλουταμινικού οξέος σε GABA, και του NPY μειώνεται σημαντικά στο διαφραγματικό τμήμα της DG, και ειδικότερα στην PL, οδηγώντας πιθανώς αντισταθμιστικά, σε σημαντική αύξηση της έκφρασης των δύο αυτών πρωτεϊνών από την GCL του ίδιου τμήματος (Marx και συν., 2013). Η αυξημένη έκκριση του NPY και του GAD67 από την GCL του διαφραγματικού τμήματος μειώνει την ευαισθησία των κοκκοειδών κυττάρων στην εμφάνιση των επιληπτικών κρίσεων (Vezzani και συν., 2002) ενώ ενισχύει και την ανασταλτική επίδραση του δικτύου σε αυτά (Marx και συν., 2013), ερμηνεύοντας τις εντονότερες βλάβες που παρατηρούνται στα κοκκοειδή κύτταρα του κροταφικού τμήματος και την καθυστερημένη εμφάνιση των επιληπτικών κρίσεων στο διαφραγματικό τμήμα. 1.2.6.6.3. Νευροεκφυλιστικές παθήσεις Δύο από τις πλέον μελετημένες και με μεγάλη συχνότητα εμφάνισης στον πληθυσμό νευροεκφυλιστικές ασθένειες, είναι η νόσος Alzheimer και η νόσος Parkinson (PD). Η συμπτωματολογία της νόσου Alzheimer περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων, την οσφρητική ανεπάρκεια, την σταδιακή απώλεια μνήμης και τη μείωση των γνωστικών λειτουργιών, αναδεικνύοντας τις σοβαρές αλλοιώσεις που προκαλούνται στον ιπποκάμπειο σχηματισμό. Η παρατηρούμενη απώλεια του προσανατολισμού, που εμφανίζεται από τα πρώτα κιόλας στάδια της νόσου, και συχνά αποτελεί το πρώιμο σημείο της έγκαιρης διάγνωσης αυτής, υποδηλώνει την πιθανή πρωταρχική εμπλοκή του διαφραγματικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού στην παθοφυσιολογία της νόσου. Μορφομετρικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στον ιππόκαμπο ασθενών της νόσου επιβεβαιώνουν την υπόθεση αυτή, αφού διαπιστώνουν την αυξημένη συχνότητα εντόπισης των νευροϊνιδιακών κόμβων και των κοκκοειδών κενοτοπικών εκφυλίσεων στο διαφραγματικό (ή οπίσθιο στο άνθρωπο) τμήμα του κυρίως ιππόκαμπου (Ball, 1978). Συγχρόνως, μελέτες της γονιδιακής έκφρασης των 72

ΕΙΣΑΓΩΓΗ δύο τμημάτων της DG, αποκαλύπτουν ότι η μειωμένη έκφραση του γονιδίου της HDC συνοδεύει την ασθένεια (Shan και συν., 2012). Το γονίδιο της HDC όπως αναλύθηκε προηγουμένως είναι πρωταρχικής σημασίας για την ειδικότερη λειτουργία του διαφραγματικού τμήματος στη χωροταξική μνήμη. Σε αντίθεση με την ανεπάρκεια της χωροταξικής μνήμης που συνοδεύει τα αρχικά στάδια της νόσου του Alzheimer, κατά την προκινητική φάση της νόσου PD, το αυξημένο άγχος και η κατάθλιψη είναι τα συνήθη νευροψυχολογικά συμπτώματα (Tolosa και Poewe, 2009). Απεικονιστικές εξετάσεις στο εγκεφαλικό παρέγχυμα ασθενών αναφέρουν σημαντική μείωση στον συνολικό όγκο της φαιάς ουσίας του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Reetz και συν., 2010), αλλά δεν μνημονεύουν πιθανώς μεγαλύτερη συγκριτική απώλεια στα τμήματα του ιππόκαμπου. Το κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού συνδέεται στενά με τον άξονα υποθάλαμος-υπόφυσηεπινεφρίδια (Dolorfo και Amaral, 1998 Kerr και συν., 2007), ενώ δέχεται και αυξημένο αριθμό ντοπαμινεργικών και σεροτονινεργικών απολήξεων (Loy και συν., 1980 Bjarkam και συν., 2003), ερμηνεύοντας μερικώς την εμφάνιση των νευροψυχολογικών συμπτωμάτων. 1.2.6.6.4. Μείζων καταθλιπτική διαταραχή H μείζων καταθλιπτική διαταραχή (major depressive disorder, MDD) συνοδεύεται από την εκδήλωση γνωστικών (μείωση των εκτελεστικών λειτουργιών) αλλά και συναισθηματικών διαταραχών (θλίψη, ανηδονία), οι οποίες αντικατοπτρίζουν κύρια αλλοιώσεις εγκεφαλικών περιοχών άλλων από τον ιππόκαμπο, όπως ο φλοιός του προσαγωγίου και ο επικλινής πυρήνας (Krishnan και Nestler, 2008 Russo και συν., 2012). Το κροταφικό όμως τμήμα του ιππόκαμπου έχει συνδεθεί με τον έλεγχο της εκτελεστικής λειτουργίας (Tanti και Belzung, 2013), και η απεικονιστική διερεύνηση των ασθενών με MDD αποκαλύπτει σημαντική 73

ΕΙΣΑΓΩΓΗ μείωση στο συνολικό όγκο του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Frodl και συν., 2006), γεγονός που ενδεχομένως υποδηλώνει και τη δική του εμπλοκή στην παθοφυσιολογία της νόσου. Αναλυτικές μελέτες καταδεικνύουν τη μείωση του όγκου μόνο της κροταφικής (ή πρόσθιας στον άνθρωπο) GCL σε ασθενείς με MDD, την οποία αποδίδουν σε σημαντική μείωση του αριθμού των κοκκοειδών κυττάρων (Boldrini και συν., 2013). Συγχρόνως, η χορήγηση αντικαταθλιπτικής αγωγής έχει βρεθεί ότι αυξάνει την κυτταρική αναγέννηση και την αγγειογένεση επιλεκτικά στο κροταφικό τμήμα της DG (Boldrini και συν., 2012 Tanti και συν., 2013), το οποίο συνδέεται στενά με τον άξονα υποθαλάμου-επίφυσης-επινεφριδίων (Dolorfo και Amaral, 1998 Kerr και συν., 2007), δυσλειτουργίες του οποίου οδηγούν στην εκδήλωση της MDD (Belzung και Billette de Villemeur, 2010). Η MDD και η δράση των αντικαταθλιπτικών φαρμάκων, που επηρεάζουν αρχικά το κροταφικό τμήμα της DG (Banasr και συν., 2006 Tanti και Belzung, 2013), οφείλονται κύρια σε αλλαγές των επιπέδων της σεροτονίνης (Rahola, 2001 Martinez και συν., 2013). Η έκφραση του γονιδίου του υποδοχέα 3α της σεροτονίνης (5-hydroxytryptamine 3a receptor, 5- HT3AR) ανευρίσκεται αυξημένη στην κροταφική DG (Christensen και συν., 2010), γεγονός που ίσως υποδηλώνει την επιλεκτική εμπλοκή της. 1.2.6.7. Διαφορές στη νευρογένεση του φυσιολογικού και παθολογικού εγκεφάλου Τα τελευταία έτη οι νευροεπιστήμονες άρχισαν να διερευνούν τις πιθανές ανομοιογένειες της εξελισσόμενης νευρογένεσης κατά μήκος του διαφραγματοκροταφικού άξονα της DG. Διαπιστώθηκε ότι η κατανομή των νεοπαραγόμενων κυττάρων δεν είναι ομοιογενής καθ όλο το μήκος της DG, και ότι το διαφραγματικό τμήμα αυτής επιδεικνύει μεγαλύτερη ικανότητα για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων (Snyder και συν., 2009b Snyder και συν., 2009c Jinno, 2010). 74

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ταυτόχρονα, η μελέτη της έκφρασης από τα νεοπαραγόμενα κοκκοειδή κύτταρα δεικτών ειδικών της νευρωνικής κατεύθυνσης (Snyder και συν., 2012) και της λειτουργικής ενεργοποίησης (Piatti και συν., 2011 Snyder και συν., 2012), σε συνδυασμό με ενδοκυτταρικές καταγραφές της ηλεκτρικής δραστηριότητάς τους (Piatti και συν., 2011), καταδεικνύουν σημαντικές διαφοροποιήσεις στο ρυθμό ωρίμανσης τους κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG. Η παρατηρούμενη διαφορά στα επίπεδα ωρίμανσης των νέων νευρώνων αποδίδεται κύρια στα αυξημένα επίπεδα της βασικής ηλεκτροφυσιολογικής δραστηριότητας που παρατηρούνται στο διαφραγματικό τμήμα της DG (Piatti και συν., 2011), η επίδραση όμως και άλλων παραγόντων μένει να αποδειχθεί. Σημαντικές διαφοροποιήσεις ανιχνεύονται και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα της DG, με το υπο-πυραμιδικό σκέλος της να παρουσιάζει αυξημένο ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μεγαλύτερη πυκνότητα νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων, συγκριτικά με το υπερ-πυραμιδικό σκέλος (Olariu και συν., 2007 Snyder και συν., 2009b). Η αυξημένη όμως παραγωγή των νέων κυττάρων συνοδεύεται από μειωμένη επιβίωση αυτών (Snyder και συν., 2012). Παρ όλες τις παρατηρούμενες ανομοιογένειες στα επίπεδα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης, ο ρυθμός ωρίμανσης των νέων κοκκοειδών κυττάρων φαίνεται να μη διαφέρει σημαντικά μεταξύ των δύο σκελών (Snyder και συν., 2012). Η μελέτη της επιλεκτικής επίδρασης διαφόρων παθολογικών και μη παραγόντων στη νευρογένεση του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG είναι ιδιαίτερα εκτεταμένη. Μελέτες σε τρωκτικά αποδεικνύουν ότι ο εμπλουτισμός του περιβάλλοντος και το στρες αυξάνουν το ρυθμό πολλαπλασιασμού των διαιρούμενων κυττάρων της DG αλλά και τον αριθμό των μετα-μιτωτικών ανώριμων νευρώνων επιλεκτικά στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG, 75

ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντίστοιχα (Tanti και συν., 2013). Παράλληλα, διάφορες παθολογικές καταστάσεις του ιπποκάμπειου σχηματισμού επηρεάζουν την εξελισσόμενη νευρογένεση της DG, με τις προκαλούμενες διαταραχές στην παραγωγή των νέων νευρικών κυττάρων να συσχετίζονται με την προοδευτική επιδείνωση των κλινικών συμπτωμάτων της κάθε νόσου. Η επίδραση των διαφόρων παθολογικών καταστάσεων στη διαδικασία παραγωγής των νέων νευρώνων παρουσιάζει εκλεκτικότητα όχι μόνο ως προς το τμήμα της DG (διαφραγματικό ή κροταφικό) που πρωτίστως πλήττει, αλλά και ως προς το στάδιο της εξελισσόμενης νευρογένεσης το οποίο επηρεάζει. Στις φλεγμονώδεις καταστάσεις του ΚΝΣ, οι οποίες φαίνεται να επηρεάζουν εντονότερα το διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, η αυξημένη έκκριση φλεγμονωδών παραγόντων, όπως οι κυτοκίνες, και η ενεργοποίηση των τοπικών μικρονευρογλοιακών κυττάρων, επηρεάζουν σημαντικά, διεγείροντας ή αναστέλλοντας, το ρυθμό πολλαπλασιασμού των διαιρούμενων κυττάρων της DG (Ekdahl και συν., 2003 Das and Basu, 2008 Pluchino και συν., 2008 Ekdahl και συν., 2009 Guo και συν., 2010 Belarbi και Rosi, 2013). Είναι πιθανό ότι η διεγερτική ή ανασταλτική επιρροή εξαρτάται από το ακριβές στάδιο της φλεγμονώδους αντίδρασης δεδομένου ότι οξείες φλεγμονώδεις καταστάσεις διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των NSCs της DG (Giannakopoulou και συν., 2013), ενώ χρόνιες φλεγμονές μειώνουν τον ρυθμό πολλαπλασιασμού αυτών (Aharoni και συν., 2005). Στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των διαιρούμενων κυττάρων της DG επιδρά και η νόσος Alzheimer, όπως αποδεικνύουν πειραματικές μελέτες σε ζωικά μοντέλα της νόσου (Li και συν., 2008 Rodriguez και συν., 2008 Yu και συν., 2009). Η νόσος, που πλήττει αρχικά το διαφραγματικό τμήμα του ιππόκαμπου (Ball, 1978), φαίνεται να επιδρά και σε επόμενα στάδια της διαδικασίας παραγωγής των νέων νευρώνων, 76

ΕΙΣΑΓΩΓΗ οδηγώντας στην πρώιμη ενεργοποίηση των νεοπαραγόμενων κοκκοειδών κυττάρων, με τελικό αποτέλεσμα την ανεπαρκή μορφολογική και λειτουργική τους ωρίμανση και τελικώς τη μειωμένη επιβίωσή τους (Verret και συν., 2007 Li και συν., 2008 Rodriguez και συν., 2008). Μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των διαιρούμενων κυττάρων της SGZ του κροταφικού τμήματος της DG (Tanti και Belzung, 2013), καθώς και της επιβίωσης των νεοπαραγόμενων νευρώνων, παρατηρούνται και κατά την εμφάνιση της MDD (Tanti και συν., 2013). Η κατασταλτική αυτή επίδραση όμως, φαίνεται να αντιστρέφεται σημαντικά μετά από τη χορήγηση της κατάλληλης αντικαταθλιπτικής αγωγής (Banasr και συν., 2006 Boldrini και συν., 2012). Αντίθετα, έντονη διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού της SGZ και αύξηση του αριθμού των νεοπαραγόμενων κοκκοειδών κυττάρων της GCL παρατηρείται μετά από την εμφάνιση των επιληπτικών κρίσεων (Parent και συν., 1997 Ekdahl και συν., 2001 Jessberger και συν., 2005 Kuruba και συν., 2009), με τα νέα κοκκοειδή κύτταρα να παρουσιάζουν έκτοπη εντόπιση, εντός της PL ή της ML, και να δημιουργούν παράπλευρες συνδέσεις με τα CA3 πυραμιδοειδή κύτταρα και τα βρυώδη κύτταρα, επιδεινώνοντας τη μη φυσιολογική διέγερση του κυκλώματος κατά τη διάρκεια των επιληπτικών κρίσεων (Scharfman και συν., 2000 Parent και Lowenstein, 2002 Scharfman και συν., 2003 Jung και συν., 2004 McCloskey και συν., 2006 Shetty και Hattiangady, 2007). Η αυξημένη αυτή νευρογένεση επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα περίπου δύο μήνες μετά την πρώτη εμφάνιση των κρίσεων (Jessberger και συν., 2007), ενώ ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων της DG μειώνεται σημαντικά κατά την εγκατάσταση της χρόνιας μορφής της TLE (Hattiangady και συν., 2004 Hattiangady και Shetty, 2008). Είναι εμφανές πως η καταστολή της νευρογένεσης στην DG συνοδεύει όλα τα 77

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανωτέρω νοσήματα του ΚΝΣ στη χρόνια φάση τους (Eisch και συν., 2008). Η λεπτομερής διερεύνηση των διαφορών της νευρογένεσης, στα διάφορα στάδια αυτής, μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG, θα αποκαλύψει τους ενδογενείς παράγοντες που ελέγχουν την εξελισσόμενη διαδικασία στα δύο τμήματα της DG, και είναι υπεύθυνοι για τις παρατηρούμενες παρεκκλίσεις μεταξύ των δύο τμημάτων, στη φυσιολογική αλλά και την παθολογική DG. 78

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Προέλευση του πειραματικού υλικού Στην παρούσα ερευνητική εργασία χρησιμοποιήθηκαν είκοσι τέσσερις νεαροί ενήλικοι (ηλικίας τριών μηνών κατά την έναρξη του πειραματισμού) αρσενικοί επίμυες της φυλής Wistar. Τα πειραματόζωα προήλθαν από την εγκατάσταση εκτροφής επίμυων του Eργαστηρίου Ανατομικής, Ιστολογίας & Εμβρυολογίας του Tμήματος Κτηνιατρικής (Αρ. αδείας ΕL54BIO25), όπου και διαβιούσαν καθ όλη τη διάρκεια του πειραματισμού. Οι συνθήκες στέγασης και φροντίδας των επίμυων ήταν σύμφωνες με την οδηγία 2010/63 της Ε.Ε. ενώ ο πειραματισμός έλαβε την έγκριση της αρμόδιας Κτηνιατρικής Αρχής της Περιφέρειας Κεντρικής Μακεδονίας (αρ. αδείας πειραματισμού 13/438/14.01.2010). Όλοι οι πειραματικοί χειρισμοί πραγματοποιήθηκαν στις εγκαταστάσεις χρήσης του Eργαστηρίου Ανατομικής, Ιστολογίας & Εμβρυολογίας του Tμήματος Κτηνιατρικής (Αρ. αδείας EL54BIO23). 2.2. Δείκτης σήμανσης των νέων κυττάρων Η πιο διαδεδομένη τεχνική in vivo σήμανσης των νεογεννηθέντων κυττάρων του εγκεφάλου στηρίζεται στη χρήση εξωγενών χημικών αναλόγων της θυμίνης. H μέθοδος αυτή πλεονεκτεί έναντι των υπολοίπων in vivo τεχνικών (χρήση διαγονιδιακών ζώων, ανίχνευση ενδογενών δεικτών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, γενετική σήμανση με ρετροϊούς) επειδή παρέχει τη δυνατότητα χρονικού προσδιορισμού της γέννησης των νέων κυττάρων και τη φαινοτυπική ταυτοποίηση αυτών μέσω παράλληλης σήμανσης με άλλους αντιγονικούς δείκτες (Ming και Song, 2005). Το πλέον χρησιμοποιούμενο χημικό ανάλογο της θυμίνης είναι η ουσία 5-79

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ βρωμο-2 -δεοξυουριδίνη (BrdU), η οποία υπερτερεί σημαντικά έναντι των συγγενών ιωδο-δεοξυουριδίνη (ΙdU) και χλωρο-δεοξυουριδίνη (CldU), επειδή έχει μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα ως προς τη σήμανση των διαιρούμενων κυττάρων (Leuner και συν., 2009). Έχει αποδειχθεί ότι χορηγούμενη ακόμη και σε ίση συγκέντρωση με την ΙdU και την CldU επιτυγχάνει τη σήμανση σημαντικά μεγαλύτερου αριθμού κυττάρων (Leuner και συν., 2009). Η ΒrdU μετά από συστηματική χορήγησή της δεσμεύεται έναντι της θυμίνης, από το γονιδίωμα των κυττάρων εκείνων που βρίσκονται στο στάδιο αναδιπλασιασμού του γενετικού τους υλικού (φάση S) (Εικ. 2.1). Ενσωματώνεται πλήρως στο γενετικό υλικό του μητρικού/ διαιρούμενου κυττάρου και κληροδοτείται σε όλα τα θυγατρικά κύτταρα, των οποίων ο πυρήνας παραμένει εφεξής σημασμένος (Taupin, 2007). Έχει αποδειχθεί ότι ακόμη και μετά από αρκετές μιτωτικές διαιρέσεις του μητρικού κυττάρου, συνήθως έως τέσσερις, η BrdU παραμένει ανιχνεύσιμη (Prickaerts και συν., 2004). Εικόνα 2.1: Σχηματογράφημα στο οποίο απεικονίζεται η ενσωμάτωση της BrdU σε ένα μητρικό κύτταρο κατά τη φάση αναδιπλασιασμού του γενετικού του υλικού (φάση S) και η περαιτέρω μεταβίβασή της στους κυτταρικούς απογόνους. Η BrdU παραμένει ενσωματωμένη στο γενετικό υλικό των θυγατρικών κυττάρων, τα οποία είτε εξέρχονται από τον κυτταρικό κύκλο, είτε εισέρχονται εκ νέου μεταβιβάζοντας τη BrdU στα 80

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ νεοδημιουργούμενα θυγατρικά τους κύτταρα. 2.3. Σχήμα χορήγησης της BrdU και πειραματικός σχεδιασμός Στο παρόν ερευνητικό πρωτόκολλο, η BrdU (Sigma, αρ. καταλόγου B5002) διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό 0,9% υπό ήπια θέρμανση (περίπου 50 ο C), ώστε να προκύψει τελικό διάλυμα συγκέντρωσης 20 mg/ml. Έχει αποδειχθεί ότι χορήγηση της BrdU στη δόση των 100 mg/kg ζώντος βάρους στον επίμυ επιτυγχάνει πλήρη κορεσμό της στο αίμα (έως 100%) για τουλάχιστον μία ώρα, γεγονός που επιτρέπει την πρόσληψή της από το μεγαλύτερο ποσοστό των μιτωτικών κυττάρων της DG (Matiasova και συν., 2014). Εφάπαξ χορήγησή της σε δόση έως 300 mg/kg (Cameron και McKay, 2001) ή αθροιστική δόση έως 480 mg/kg (Hancock και συν., 2009), αποδείχθηκε μη τοξική για τα διαιρούμενα κύτταρα της DG που την προσλαμβάνουν. Στην παρούσα ερευνητική εργασία ο κάθε επίμυς έλαβε δύο ενδοπεριτοναϊκές εγχύσεις του διαλύματος της BrdU εντός 24 ωρών, στη δόση των 100 mg/kg/έγχυση (αθροιστική δόση 200 mg/kg /ζώο). Η χορήγηση των δύο δόσεων του διαλύματος της BrdU πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη σήμανση του μεγαλύτερου μέρους του πληθυσμού των διαιρούμενων κυττάρων της DG εντός 24 ωρών (McDonald και Wojtowicz, 2005). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ακριβής διάρκεια του κυτταρικού κύκλου των διαιρούμενων κυττάρων της DG, σε επίμυες ηλικίας τριών μηνών, είναι 24,7 ώρες, με τη φάση S να διαρκεί 9,7 ώρες (Cameron και McKay, 2001), και ότι η BrdU μετά από χορήγησή της στη συστηματική κυκλοφορία παραμένει βιοδιαθέσιμη και δύναται να προσληφθεί από τα υπό διαίρεση κύτταρα για περίπου δύο ώρες (Packard και συν., 1973 Hayes και Nowakowski, 2000 Matiasova και συν., 2014), το μεσοδιάστημα των δύο χορηγήσεων της BrdU ορίστηκε στις 12 ώρες, ώστε να είναι αδύνατη η 81

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ επαναπρόσληψή της από τον ίδιο πληθυσμό μιτωτικών κυττάρων. Ακολούθως της έγχυσης του διαλύματος της BrdU, τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε έξι ισάριθμες πειραματικές ομάδες (n=4 ανά πειραματική ομάδα), διαχωρισμένες με βάση τη χρονική στιγμή θανάτωσης (Εικ. 2.2). Τα χρονικά διαστήματα θανάτωσης που επιλέχθηκαν ήταν 2, 5, 7, 14, 21 και 30 ημέρες μετά την έγχυση του διαλύματος της BrdU (days post injection, d.p.inj.). Στόχος ήταν να μελετηθεί το φαινόμενο της νευρογένεσης στην πλήρη εξέλιξή του, από τον αρχικό πολλαπλασιασμό των μητρικών κυττάρων έως την τελική μορφολογική και λειτουργική ωρίμανση των νεοπαραγόμενων νευρώνων, που εκτιμάται ότι διαρκεί περί τον ένα μήνα (Kempermann και συν., 2004α Duan και συν., 2008). Εικόνα 2.2: Σχηματογράφημα στο οποίο απεικονίζεται ο πειραματικός σχεδιασμός της παρούσας έρευνας. Όπως απεικονίζεται, τα πειραματόζωα των έξι διαφορετικών ομάδων θανατώθηκαν την 2 η, 5 η, 7 η, 14 η, 21 η και 30 η ημέρα μετά τη χορήγηση της BrdU. 2.4. Μονιμοποίηση και λήψη του πειραματικού υλικού Μετά την παρέλευση του προβλεπόμενου χρονικού διαστήματος, οι επίμυες 82

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ αναισθητοποιήθηκαν μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση διαλύματος ξυλαζίνης και κεταμίνης (5 και 50 mg/kg αντιστοίχως) και τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση στο χειρουργικό τραπέζι, όπου και διανοίχθηκε η θωρακική τους κοιλότητα. Ειδικός καθετήρας (Ν ο 19) προωθήθηκε μέσω της αριστερής κοιλίας στην πρόσθια αορτή και με τη βοήθεια καταθλιπτικής αντλίας εγχύσεων (Ηarvard apparatus) εγχύθηκαν 100 ml διαλύματος φυσιολογικού ορού 0,9% ακολουθούμενα από 300 ml διαλύματος παραφορμαλδεύδης 4% σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (phosphate buffer, PB) 0,1M (ph=7,4). Ακολούθως, διανοίχθηκε η κοιλότητα του εγκεφαλικού κρανίου και αφαιρέθηκε ο μονιμοποιημένος εγκέφαλος, ο οποίος παρέμεινε εντός του μονιμοποιητικού διαλύματος για 24 ώρες σε θερμοκρασία 4 ο C. 2.5. Χειρισμός των ιστοτεμαχίων Οι μονιμοποιημένοι εγκέφαλοι ξεπλύθηκαν αρχικά σε τρεχούμενο νερό για 24 ώρες και έπειτα προετοιμάστηκαν για έγκλειση σε παραφίνη. Για την έγκλεισή τους, τα ιστοτεμάχια εμβαπτίστηκαν διαδοχικά, ανά μία ώρα, σε διαλύματα αλκοολών αυξανόμενης πυκνότητας (50 ο, 70 ο, 95 ο, 100 ο x 2). Έπειτα, εμβαπτίστηκαν για δύο ώρες σε διάλυμα ξυλόλης και εν συνεχεία τοποθετήθηκαν για χρονικό διάστημα δύο ωρών σε κλίβανο θερμοκρασίας 65 o C, εντός ειδικού σκεύους που περιείχε υγρή παραφίνη, ώστε να εμποτιστούν καθ όλο το πάχος τους με αυτή. Τελικώς, τοποθετήθηκαν σε ειδικά μεταλλικά καλούπια εντός υγρής παραφίνης η οποία στερεοποιούνταν μετά από ολιγόλεπτη παραμονή σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Με τη βοήθεια μικροτόμου παραφίνης (MICROM HM315), ο κάθε εγκέφαλος κόπηκε εγκάρσια στον διαμήκη άξονά του (στεφανιαίες τομές) καθ όλο το μήκος του, και συλλέχθηκαν όλες οι διαδοχικές τομές, πάχους 10 μm. Εν συνεχεία, επιλέχθηκαν οι τομές που αντιστοιχούσαν στο διαφραγματικό και το κροταφικό 83

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ τμήμα της DG, όπως καθορίζονται στερεοτακτικά από τον άτλαντα των Paxinos και Watson (1998) και την υπάρχουσα βιβλιογραφία (Rejchrtova και συν., 2005 Snyder και συν., 2012). Με βάση αυτά, το διαφραγματικό τμήμα της οδοντωτής έλικας εκτείνεται από τα -2.56 mm έως τα -4.16 mm οπισθίως του βρέγματος, ενώ το κροταφικό της τμήμα από τα -4.80 έως τα -6.04 mm οπισθίως του βρέγματος. (Εικ. 2.3). Εικόνα 2.3: Απεικόνιση των ορίων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG. Οι χρωσμένες με την τεχνική Nissl τομές της εικόνας αντιστοιχούν στην πρώτη και την τελευταία τομή του κάθε τμήματος, όπως αυτά ορίζονται στον άτλαντα των Paxinos και Watson (1998). Το οριζόντιο επίπεδο που διέρχεται από την ρινική σχισμή (πορτοκαλί βέλος) αποτελεί το όριο μεταξύ κροταφικού και ενδιάμεσου τμήματος. Λαμβάνοντας υπόψη ότι στην παρούσα ερευνητική εργασία χρησιμοποιήθηκαν στεφανιαίες τομές του εγκεφάλου, στις τομές που αντιστοιχούσαν 84

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ στο κροταφικό τμήμα της DG, συμπεριλαμβανόταν και το ενδιάμεσο τμήμα αυτής. Για τον ορθό διαχωρισμό των δύο τμημάτων, υιοθετήθηκαν τα κριτήρια των Fanselow και Dong (2010), οι οποίοι προτείνουν ως σημείο διαχωρισμού των δύο τμημάτων το οριζόντιο επίπεδο που αντιστοιχεί στη ρινική σχισμή (Εικ. 2.3). Με βάση το διαχωρισμό αυτό, το τμήμα της DG που εντοπίζεται αμέσως άνω του oριζόντιου επιπέδου της ρινικής σχισμής αντιστοιχεί στο ενδιάμεσο τμήμα αυτής, ενώ το κροταφικό τμήμα της εκτείνεται κάτω από αυτό. Ακολούθως, οι επιλεγμένες τομές είτε χρωματίστηκαν με την τεχνική Nissl, είτε σημάνθηκαν ανοσοκυτταροχημικά έναντι της BrdU (απλή ανοσοκυτταροχημεία) ή έναντι της BrdU και επιλεγμένων δεικτών (διπλός ανοσοφθορισμός). 2.6. Απλή ανοσοκυτταροχημεία έναντι της BrdU Οι τομές που προορίζονταν για ανοσοκυτταροχημική σήμανση έναντι του αντιγόνου της BrdU, διαδοχικά εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα ξυλόλης και διαλύματα αλκοολών μειούμενης πυκνότητας (100 o x2, 95 o, 70 o, 50 o ). Ακολούθως, εμβαπτίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού 0,01M (ph=6), υπό θέρμανση εντός φούρνου μικροκυμάτων, με παραμονή 3 λεπτών στα 750 Watt και έπειτα για άλλα 9 λεπτά στα 350 Watt. Aφού αφέθηκαν για 45 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, οι τομές τοποθετήθηκαν εντός διαλύματος 2% υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2) και 5% μεθανόλης σε απεσταγμένο H 2 O. Για την αποκάλυψη της προσδεδεμένης στο γενετικό υλικό BrdU, οι τομές εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα υδροχλωρικού οξέος (HCl) κανονικότητας 4Ν όπου και παρέμειναν για 10 λεπτά (Encinas και Enikolopov, 2008). Το HCl μετουσιώνει το DNA του κυττάρου, μετατρέποντας τη δίκλωνη έλικα σε μονόκλωνη, επιτρέποντας την εύκολη ανίχνευση των νουκλεοτιδίων του, και άρα και της BrdU (Sasaki και συν., 1988). 85

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Ακολούθως, οι τομές τοποθετούνταν σε διάλυμα 5% φυσιολογικού ορού αίγας (normal goat serum, NGS) και 1% Triton X σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος (phosphate buffer saline, PBS, ph=7,4) (blocking solution) όπου και αφήνονταν για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Έπειτα επωάζονταν με το διάλυμα που περιείχε το αντίσωμα έναντι της BrdU (monoclonal mouse anti - BrdU clone Bu20a, 1:200, Dako) στους 4 0 C για 12 ώρες. Με το πέρας του απαιτούμενου χρονικού διαστήματος, οι τομές ξεπλένονταν εντός διαλύματος PBS και ακολουθούσε επώασή τους στο διάλυμα που περιείχε το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα έναντι του πρώτου αντισώματος (αντι-αντίσωμα) (monoclonal anti mouse, 1:200, Dako) για 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθούσε η επώασή τους για 30 λεπτά σε διάλυμα 1% του συμπλέγματος αβιδίνης βιοτίνης (ABC Kit, Vectastain, Vector Laboratories) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Για την ανίχνευση της δεσμευμένης βιοτίνης, οι τομές εμβαπτίζονταν σε διάλυμα 3,3 -διαμινοβενζιδίνης (DAB, Peroxidase substrate Kit, SK 4100, Vector Laboratories) για 4 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθούσε έκπλυση των τομών διαδοχικά σε απεσταγμένο H 2 O, διάλυμα PBS, ανιούσα σειρά αλκοολών ώστε να αφυδατωθούν, ξυλόλη και τελικά έγκλειση σε DPX. 2.7. Διπλός ανοσοφθορισμός έναντι της BrdU και επιλεγμένων δεικτών Για την προετοιμασία των τομών για ανοσοφθορισμό, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω με την εξαίρεση του σταδίου εμβάπτισης στο διάλυμα του υπεροξειδίου του υδρογόνου και της μεθανόλης, το οποίο δεν βρίσκει εφαρμογή κατά τη σήμανση με φθοροχρώματα. Προκειμένου για τη διπλή χρώση των τομών έναντι του πυρηνικού αντιγόνου της BrdU και των επιλεγμένων κυτταροπλασματικών ή μεμβρανικών αντιγόνων, οι τομές επωάζονταν για 12 ώρες σε διάλυμα PBS που περιείχε 1% NGS, το αντίσωμα έναντι της BrdU (monoclonal 86

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ mouse anti-brdu clone Bu20a, 1:200, Dako) και ένα από τα ακόλουθα αντισώματα: anti GFAP, anti NeuN, anti calretinin, anti-calbindin D-28K, anti S100, anti NMDAR1, anti GluR2, anti fractin και anti caspase 3 (Πίν. 2.1). Πίνακας 2.1: Πρώτα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα ερευνητική εργασία. A/A ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΙΔΟΣ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΩΔΙΚΟΣ ΑΡΑΙΩΣΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ 1 anti-brdu Mouse DAKO Μ 0744 1:200 Πυρήνας monoclonal 2 anti-brdu Mouse Millipore MAB3510 1:200 Πυρήνας (no HCL monoclonal (Chemicon) pretreatment) 3 anti-gfap Rabbit DAKO Z 0334 1:400 Κυτταρόπλασμα 4 anti-dcx (C- 18) polyclonal Goat polyclonal Santa Cruz Sc-8066 1:100 Κυτταρόπλασμα 5 anti-calretinin Rabbit polyclonal 6 anti-neun Rabbit polyclonal Millipore (Chemicon) Millipore (Chemicon) AB 5054 1:1000 Κυτταρόπλασμα ABN78 1:1000 Πυρήνας & κυτταρόπλασμα 7 anti-calbindin Rabbit Millipore AB1778 1:1000 Κυτταρόπλασμα D-28K polyclonal (Chemicon) 8 anti-s100 (a+b) Rabbit DAKO Z0311 1:500 Κυτταρόπλασμα polyclonal 9 anti-nmda Rabbit Millipore ΑΒ1516 1:100 Κυτταρική subunit R1 polyclonal (Chemicon) μεμβράνη 10 anti- GluR Rabbit Millipore AB1768 1:100 Κυτταρική subunit 2 polyclonal (Chemicon) μεμβράνη 87

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 11 anti-caspase 3 Rabbit polyclonal 12 anti-fractin Rabbit polyclonal Millipore (Chemicon) Millipore (Chemicon) AB 3623 1:100 Κυτταρόπλασμα AB 3150 1:500 Κυτταρόπλασμα Ακολουθούσαν διαδοχικές πλύσεις σε PBS και έπειτα οι τομές επωάζονταν για 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, στο σκοτάδι, σε διάλυμα PBS που περιείχε το δεύτερο αντίσωμα έναντι του αντισώματος της ΒrdU (αντι-αντίσωμα) συνδεδεμένο με πράσινη φθορίζουσα χρωστική (goat anti mouse 488, Βiotium), και το κατάλληλο αντι-αντίσωμα έναντι του χρησιμοποιούμενου κάθε φορά πρώτου αντισώματος, συνδεδεμένο με κόκκινη φθορίζουσα χρωστική (goat anti rabbit 555, Βiotium ή anti goat rhodamine conjugated, Santa Cruz) (Πίν. 2.2). Πίνακας 2.2: Δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα ερευνητική εργασία. A/A ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΩΔΙΚΟΣ ΑΡΑΙΩΣΗ 1. Rabbit anti-mouse IgG DAKO E 0354 1:200 2. Goat anti-mouse IgG (green 488) 3. Goat anti-rabbit IgG (red 555) 4. Rabbit anti-goat IgG (red 555) Biotium 20010 1:200 Biotium 20033 1:200 Santa Cruz sc-3945 1:200 Κατά την εκτέλεση των ανοσοκυτταροχημικών τεχνικών διαπιστώθηκε ότι η προεργασία των τομών με το διάλυμα του HCl έπληττε σοβαρά το ευαίσθητο αντιγόνο της DCX, με αποτέλεσμα να είναι αδύνατη η ταυτόχρονη χρώση έναντι της BrdU και της DCX. Για το λόγο αυτό, στις τομές που προορίζονταν για σήμανση έναντι της DCX χρησιμοποιούνταν ειδικό αντίσωμα έναντι της BrdU, το οποίο δεν 88

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ απαιτούσε προηγούμενη χρήση HCl (Πίν. 2.1). 2.8. Υπολογισμός του συνολικού αριθμού των κοκκοειδών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Αν και υπάρχουν αρκετές πειραματικές μελέτες που καταμετρούν τον πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων στο σύνολο της DG του νεαρού ενήλικου επίμυ (Seress and Pokorny, 1981 Smith και συν., 2008 Aydin και συν., 2011), δεν υπάρχει καμία πληροφόρηση σχετικά με την κατανομή του πληθυσμού αυτού κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονά της DG. Για το σκοπό αυτό, σε τρεις από τους επίμυες του πειράματος, μία στις είκοσι διαδοχικές τομές, εκτεινόμενες σε όλο το μήκος του διαφραγματικού και του κροταφικού ιππόκαμπου, επιλέχθηκαν και σημάνθηκαν με την τεχνική Νissl (τομές αναφοράς). Όπως προαναφέρθηκε, οι τομές είχαν πάχος 10μm, και επομένως οι διαδοχικές τομές απείχαν μεταξύ τους 200μm. Με τη βοήθεια οπτικού μικροσκοπίου (Nikon Eclipse 80i, Y- IDP Japan), το οποίο διέθετε ενσωματωμένο σύστημα φωτογραφικής μηχανής (Nikon D-Eclipse C1), σαρώθηκε σε κάθε επιλεγείσα τομή η DG στην πλήρη έκτασή της, σε μεγέθυνση x40. Σε όλες τις ληφθείσες φωτογραφίες καταμετρήθηκε, με τη βοήθεια του ειδικού λογισμικού Image J (έκδοση 1,47/ ΝIH), ο αριθμός όλων των κοκκοειδών κυττάρων με ευδιάκριτο πυρηνίσκο στο υπερπυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG. Συχνά, τα κοκκοειδή κύτταρα διαθέτουν περισσότερους του ενός πυρηνίσκους (Bayer, 1982) (Εικ. 2.4 Α). Για το λόγο αυτό, για κάθε καταμετρημένη τομή, επιλέχθηκε η γειτονική τομή της (τομή ελέγχου) η οποία μετά από χρώση με Nissl σαρώθηκε υπό το μικροσκόπιο όπως και η γειτονική της τομή αναφοράς. Κοκκοειδή κύτταρα των οποίων ο πυρηνίσκος εμφανιζόταν και στην τομή αναφοράς και στην 89

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ τομή ελέγχου δεν καταμετρούνταν, προκειμένου να αποφευχθεί υπερεκτίμηση του συνολικού αριθμού των κοκκοειδών κυττάρων. Το άθροισμα που προέκυπτε από τον υπολογισμό του αριθμού των κοκκοειδών κυττάρων σε όλες τις καταμετρούμενες τομές, πολλαπλασιάστηκε x20, ώστε τελικά να προκύψει ο απόλυτος αριθμός του πληθυσμού των κοκκοειδών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG. Η κοκκώδης στιβάδα, εκτός από τα κοκκοειδή κύτταρα, περιέχει και νευρογλοιακά κύτταρα και διάμεσους νευρώνες, τα καλαθοειδή κύτταρα. Τα νευρογλοιακά κύτταρα είναι ιδιαιτέρως ευδιάκριτα από τα κοκκοειδή λόγω του συγκριτικά μικρού τους μεγέθους, της χαρακτηριστικής μορφολογίας τους (πυκνωτικά κύτταρα με μεγάλο πυρήνα) και της έντονης απορρόφησης της χρωστικής Nissl (Ling και συν., 1973), και επομένως ήταν εφικτός ο διαχωρισμός και η μη καταμέτρησή τους. Δεν ισχύει όμως το ίδιο και για τα καλαθοειδή κύτταρα, τα οποία δε διακρίνονται εύκολα από τα κοκκοειδή λόγω του συναφούς τους μεγέθους και της παρόμοιας απορρόφησης της χρωστικής Nissl, και για το λόγο αυτό ήταν αδύνατο να εξαιρεθούν από τα μετρούμενα κύτταρα. Λαμβάνοντας όμως υπόψη ότι η αναλογία κοκκοειδών:καλαθοειδών κυττάρων είναι 160-220:1, δεν θεωρείται ότι η προσμέτρησή τους στις συνολικές εκτιμήσεις επηρέασαν σημαντικά τα εξαγόμενα αποτελέσματα (Seress και Pokorny, 1981 Hosseini-Sharifabad και Nyengaard, 2007). Συχνά, ορισμένα κοκκοειδή κύτταρα παρουσιάζουν έκτοπη εντόπιση, έξω από τα όρια της GCL, τόσο στο υπερ- όσο και στο υπο- πυραμιδικό σκέλος της DG (Amrein και συν., 2004). Τα έκτοπα αυτά κύτταρα (Εικ. 2.4 Β) συμπεριλήφθηκαν στις μετρήσεις μας. 90

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Α Β Εικόνα 2.4. Κοκκοειδή κύτταρα στο υπερ-πυραμιδικό σκέλος της DG (χρώση Nissl) Α: Κοκκοειδή κύτταρα τα οποία διαθέτουν δύο πυρηνίσκους (μαύρα βέλη). Β: Κοκκοειδές κύτταρο (μαύρο βέλος) που εντοπίζεται εκτός των ορίων της κοκκώδους στιβάδας και μικρά πυκνωτικά συμπαγή κύτταρα στην SGZ της DG, τα οποία πιθανότατα αντιστοιχούν σε NSCs (κόκκινα βέλη). 2.9. Υπολογισμός του πληθυσμού των νέων νευρικών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Η τυχαία κατανομή των νεοπαραγόμενων κυττάρων κατά μήκος της DG, αλλά και ο εξαιρετικά μικρός αριθμός τους αναλογικά με τον αριθμό των ήδη υπαρχόντων νευρώνων στην περιοχή αυτή (Kempermann, 2011α), καθιστά την τροποποιημένη μέθοδο του optical fractionator ως την πλέον κατάλληλη μέθοδο καταμέτρησής τους, η οποία είναι ευρέως αποδεκτή και χρησιμοποιούμενη από αντίστοιχες μελέτες (Kempermann και συν., 1997α Kempermann και συν., 1997β Kronenberg και συν., 2003 Steiner και συν., 2004 Keiner και συν., 2010). Για την υλοποίηση της μεθόδου, μία στις δέκα διαδοχικές τομές (συνολικά δεκατέσσερις από το διαφραγματικό τμήμα και δώδεκα από το κροταφικό τμήμα της DG), σημάνθηκαν ανοσοκυτταροχημικά έναντι του αντιγόνου της BrdU. Όλα τα σημασμένα με BrdU κύτταρα καταμετρήθηκαν, σε μεγέθυνση x40, με τη χρήση οπτικού μικροσκοπίου. Το υπολογιζόμενο άθροισμα πολλαπλασιαζόταν επί 10 ώστε να προκύψει ο απόλυτος 91

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ αριθμός των BrdU + κυττάρων ανά τμήμα της DG ανά επίμυ. Στις μετρήσεις μας συμπεριλαμβάνονται τα BrdU + κύτταρα της SGZ και της GCL. O απόλυτος αριθμός των νεοπαραγόμενων κυττάρων υπολογίστηκε ξεχωριστά για τα δύο σκέλη της DG (υπερ- και υπο- πυραμιδικό σκέλος) τόσο για το διαφραγματικό όσο και για το κροταφικό τμήμα της. 2.10. Υπολογισμός του δείκτη συνέκφρασης της BrdU με τα επιλεγμένα αντιγόνα Για κάθε επίμυ του παρόντος πειραματισμού υπολογίστηκε το ποσοστό συνέκφρασης της BrdU με τον επιθυμητό κάθε φορά αντιγονικό δείκτη, για το διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG. Τουλάχιστον πέντε ισαπέχουσες τομές, με μεταξύ τους απόσταση 200μm, επιλέχθηκαν τόσο από το διαφραγματικό όσο και από το κροταφικό τμήμα της DG κάθε εξεταζόμενου εγκεφάλου, και σημάνθηκαν με διπλό ανοσοφθορισμό έναντι της BrdU και ενός άλλου δείκτη. Τουλάχιστον 50 και 30 κύτταρα ανοσοσημασμένα έναντι της BrdU, μελετήθηκαν για πιθανή συνέκφραση στο διαφραγματικό και κροταφικό τμήμα, αντίστοιχα. Η διαπίστωση της συνέκφρασης κατέστη εφικτή με τη χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου (confocal lazer scanning microscope, CLSM) της εταιρείας Nikon (μοντέλο Eclipse C1), συνδεδεμένου με ηλεκτρονικό υπολογιστή, ο οποίος διέθετε ενσωματωμένο το ειδικό λογισμικό για το χειρισμό του (EZ-C1 3.20 software). Κάθε κύτταρο σημασμένο με BrdU ελεγχόταν για πιθανή συνέκφραση με σάρωση του κυττάρου σε πολλαπλά επίπεδα (οπτικές τομές). Οι διαδοχικές οπτικές τομές αποθηκεύονταν ως «στοίβες» τομών κατά τον κατακόρυφο άξονα (Z-stacks), με τη μεταξύ τους απόσταση να έχει οριστεί στο 1μm. Ως ποσοστό συνέκφρασης θεωρούνταν ο λόγος του αριθμού των κυττάρων που συνέκφραζαν την BrdU και τον επιλεγμένο δείκτη προς το συνολικό μετρούμενο πληθυσμό των BrdU + κυττάρων, πολλαπλασιαζόμενος x100. 92

ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Δείκτης συνέκφρασης % = Αριθμός κυττάρων BrdU + /δείκτη ενδιαφέροντος + x100 Συνολικός αριθμός Βrdu + κυττάρων 2.11. Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 20.0. Η ανάλυση διακύμανσης κατά έναν παράγοντα (oneway ANOVA), με εφαρμογή των ελέγχων του Bonferroni για τις πολλαπλές συγκρίσεις (post hoc analysis), χρησιμοποιήθηκε για τις συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων, ενώ, όπου κρίνονταν αναγκαίο, το T test ανεξάρτητων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για τις επιμέρους συγκρίσεις. Η ομοιογένεια των διακυμάνσεων ελεγχόταν με το τεστ του Levene, και όταν αυτή παραβιαζόταν (Levene s test, P< 0.05), εφαρμοζόταν ο μη παραμετρικός έλεγχος του Kruskal- Wallis για τις πολλαπλές συγκρίσεις, ακολουθούμενος από τον έλεγχο του Mann- Whitney (two-tailed) για τις επιμέρους συγκρίσεις. Όλα τα ποσοτικά αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (mean ± S.E.). Ειδικότερα, για τη μελέτη της τοπογραφικής κατανομής των BrdU + κυττάρων κατά μήκος του διαμήκη άξονα των δύο τμημάτων της DG, καθώς και της επιβίωσης των BrdU + κυττάρων στα δύο σκέλη αυτής, εφαρμόστηκε η ανάλυση προσαρμογής καμπύλης (curve fit analysis), ακολουθούμενη από την ανάλυση της διακύμανσης κατά έναν παράγοντα (one-way ANOVA). Όταν δεν τηρούνταν η υπόθεση των ίσων διακυμάνσεων (Levene s test, P< 0.05), ο μη παραμετρικός συντελεστής συσχέτισης Spearman s Rho (ρ) υπολογιζόταν έναντι του παραμετρικού Pearson (r). Για όλες τις συγκρίσεις το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 5% (P< 0.05). 93

94 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα Εικόνα 3.1.: Μικροφωτογραφίες κοινού οπτικού μικροσκοπίου, στις οποίες απεικονίζονται τα BrdU + κύτταρα της διαφραγματικής DG στις 2 d.p.inj. (Α), στις 15 d.p.inj. (Β) και στις 30 d.p.inj. (Γ). Ενώ τις πρώτες μέρες από τη γέννησή τους τα νέα κύτταρα εντοπίζονται σε συσσωματώματα εντός της SGZ (A), τις επόμενες ημέρες αρχίζουν να μεταναστεύουν εντός της GCL (B & Γ), όπου και διαφοροποιούνται σε νέα κοκκοειδή κύτταρα. Η δακτυλιοειδής κατανομή της BrdU (Γ) χαρακτηρίζει τα διαφοροποιημένα BrdU + κύτταρα. Κλίμακα: Α=50μm, Β & Γ=10μm. Η καταμέτρηση των BrdU + κυττάρων (Εικ.3.1) στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG αποκάλυψε σημαντικές ομοιότητες αλλά και ενδιαφέρουσες διαφορές στον αριθμό των νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων (Πίν. 3.1) καθώς και στη διακύμανση του πληθυσμού τους στα διαδοχικά χρονικά διαστήματα μετά την έγχυση της BrdU. Όπως παρατηρήθηκε, και στα δύο τμήματα της DG, η διακύμανση των δύο πληθυσμών των BrdU + κυττάρων ακολουθεί παρόμοια πορεία (Διαγρ. 3.1). Ο 95

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ αρχικός πληθυσμός των BrdU + κυττάρων, κορυφώθηκε στις 5 d.p.inj. και μειωνόταν σταδιακά έως και τις 30 d.p.inj. Ο απόλυτος αριθμός των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος ήταν σημαντικά μεγαλύτερος από τον απόλυτο αριθμό των BrdU + κυττάρων του κροταφικού τμήματος σε όλες τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU (2 d.p.inj.: P= 0,001 5 d.p.inj.: P= 0,001 7 d.p.inj.: P= 0,004 14 d.p.inj.: P= 0,029 21 d.p.inj.: P= 0,016 30 d.p.inj.: P= 0,009). Πίνακας 3.1: Απόλυτοι αριθμοί των BrdU + κυττάρων, όπως αυτοί καταμετρήθηκαν στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG, σε συγκεκριμένες ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU. Σε όλες τις ημέρες ελέγχου ο πληθυσμός των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος ήταν υπερδιπλάσιος του αντίστοιχου πληθυσμού του κροταφικού τμήματος. d.p.inj. Αριθμός BrdU + κυττάρων Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα 2 1.313,75 ± 100,27 445 ± 50,57 5 1.507,5 ± 100,8 541,25 ± 116,07 7 1.178,33 ± 121,75 500,00 ± 74,07 14 789,00 ± 138,74 391,25 ± 61,45 21 688,33 ± 149,23 246,67 ± 46,31 30 688,33 ± 149,23 270 ± 62,25 Μελετώντας τους διαδοχικούς πληθυσμούς των BrdU + κυττάρων του εκάστοτε τμήματος της DG (Διαγρ. 3.1), στο κροταφικό της τμήμα στατιστικώς σημαντική διαφορά ανιχνεύτηκε μόνο μεταξύ των BrdU + πληθυσμών που καταμετρήθηκαν στις 2 d.p.inj. και στις 30 d.p.inj. (P= 0,038). Αντιθέτως, στο 96

Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ διαφραγματικό τμήμα, ο πληθυσμός των νεοπαραγόμενων κυττάρων που εντοπίστηκε στις 5 d.p.inj. ήταν σημαντικά μεγαλύτερος από αυτόν που καταμετρήθηκε στις 14 d.p.inj. (P= 0,02), στις 21 d.p.inj. (P= 0,001) και στις 30 d.p.inj. (P< 0.001). Η παρατηρούμενη σημαντική μείωση στον απόλυτο αριθμό των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος από τις 5 d.p.inj. και έπειτα είναι ενδεικτική της νωρίτερα εκδηλούμενης και εντονότερης μείωσης του πληθυσμού των νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα, όπου ο αντίστοιχος πληθυσμός μειώνεται με έναν πιο σταθερό και αργό ρυθμό. Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διάγραμμα 3.1: Γραφική απεικόνιση της διακύμανσης των πληθυσμών των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG κατά τη διάρκεια του ενός μηνός μετά την έγχυση της BrdU. Η συγκριτική μελέτη του αριθμού των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος των ετεροπλάγιων DG απέδειξε ότι δεν υπάρχει διαφορά στον απόλυτο αριθμό των BrdU + κυττάρων μεταξύ των αντίστοιχων 97

Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ τμημάτων της DG του δεξιού και του αριστερoύ ημισφαιρίου (P> 0,05) (Διαγρ. 3.2-3.5). Διαφραγματικό τμήμα 3.2 3.3 Αριστερή DG Δεξιά DG Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.2 & 3.3: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των πληθυσμών των BrdU + κυττάρων στα δύο σκέλη της DG του διαφραγματικού τμήματος του δεξιού και του αριστερού εγκεφαλικού ημισφαιρίου. Οι πληθυσμοί των BrdU + κυττάρων του υπερ- και του υπο- πυραμιδικού σκέλους του διαφραγματικού τμήματος της δεξιάς και της αριστερής DG δεν διαφέρουν σημαντικά σε καμία ημέρα ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU. Κροταφικό τμήμα 3.4 3.5 Αριστερή DG Δεξιά DG Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU 98

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαγράμματα 3.4 & 3.5: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των πληθυσμών των BrdU + κυττάρων στα δύο σκέλη της DG του κροταφικού τμήματος του δεξιού και του αριστερού εγκεφαλικού ημισφαιρίου. Οι πληθυσμοί των BrdU + κυττάρων του υπερ- και του υπο- πυραμιδικού σκέλους του κροταφικού τμήματος της δεξιάς και της αριστερής DG δεν διαφέρουν σημαντικά σε καμία ημέρα ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU. 3.2. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των κοκκοειδών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα Οι παρατηρούμενες διαφορές στον όγκο του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG πιθανώς να υποδηλώνουν διαφορά μεγέθους στους πληθυσμούς των κοκκοειδών κυττάρων που εποικίζουν τα δύο τμήματα. Συνεπώς, στην παρούσα ερευνητική εργασία, παράλληλα με τον απόλυτο αριθμό των νεοπαραγόμενων κυττάρων, καταμετρήθηκε και ο απόλυτος αριθμός των κοκκοειδών κυττάρων ανά διαφραγματικό και κροταφικό τμήμα της DG. Στο διαφραγματικό τμήμα καταμετρήθηκαν 436.313,33±14.712,97 κοκκοειδή κύτταρα, ενώ στο κροταφικό της τμήμα μόλις 125.826,67±20.353,73 κοκκοειδή κύτταρα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων απέδειξε ότι ο πληθυσμός των κοκκοειδών κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος είναι σημαντικά μεγαλύτερος (P<0,001) από τον αντίστοιχο πληθυσμό του κροταφικού τμήματος. 3.3. Συγκριτική μελέτη της ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Η παρατηρούμενη διαφορά στον πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος μας ώθησε να υπολογίσουμε το λόγο του αριθμού των νεοπαραγόμενων BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων του κάθε τμήματος της DG, προκειμένου να αποκαλυφθεί με ακρίβεια η ικανότητα των δύο τμημάτων για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων. Οι 99

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ υπολογιζόμενοι λόγοι παρουσιάζονται ως ποσοστά % (Πιν. 3.2). Πίνακας 3.2 d.p.inj. Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα 2 0,301 ± 0,023 0,354 ± 0,040 5 0,346 ± 0,023 0,430 ± 0,092 7 0,345 ± 0,061 0,397 ± 0,059 14 0,181 ± 0,032 * 0,311 ± 0,049 * 21 0,158 ± 0,034 0,196 ± 0,037 30 0,162 ± 0,023 0,215 ± 0,050 Όπως αποδείχθηκε, το κροταφικό τμήμα της DG διαθέτει ελαφρώς υψηλότερη αναλογία νέων προς παλαιότερα κύτταρα σε όλες τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU (Διαγρ. 3.6). Η αύξηση όμως αυτή δεν είναι στατιστικώς σημαντική, παρά μόνο στις 14 d.p.inj. (P= 0,034). Επομένως, ο λόγος των νεοπαραγόμενων κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων παραμένει σχετικά σταθερός καθ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της DG. Στο διάγραμμα 3.6 αποκαλύπτεται ότι ο λόγος των νεοπαραγόμενων προς τα κοκκοειδή κύτταρα ακολουθεί την ίδια διακύμανση στο χρόνο και στα δύο τμήματα της DG. Οι τιμές κορυφώθηκαν στις 5 d.p.inj. και μειώνονταν με σταθερό ρυθμό στα επόμενα χρονικά διαστήματα. Συγκρίνοντας τον λόγο του κάθε τμήματος στα διαδοχικά χρονικά διαστήματα, διαπιστώθηκε ότι στη διαφραγματική DG παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική μείωση μεταξύ των τιμών στις 2 d.p.inj. και 100

Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ στις 14 d.p.inj. (P= 0,021). Όμως και οι λόγοι στις επόμενες ημέρες ελέγχου ήταν σημαντικά μικρότεροι από τον λόγο στις 2 d.p.inj. (21 d.p.inj.: Ρ= 0,005 30 d.p.inj.: Ρ= 0,002). Αντίθετα, στην κροταφική DG, στατιστικώς σημαντική μείωση του λόγου των νεοπαραγόμενων προς των υπαρχόντων νευρικών κυττάρων εκδηλώθηκε μία εβδομάδα αργότερα (21 d.p.inj.: P= 0,013 και 30 d.p.inj.: Ρ= 0,038 συγκρινόμενοι με τις 2 d.p.inj). Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα * Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διάγραμμα 3.6: Γραφική απεικόνιση της διακύμανσης, στο χρόνο, του λόγου του αριθμού των νεοπαραγόμενων/συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων στα δύο τμήματα της DG. Ο υπολογιζόμενος λόγος του διαφραγματικού τμήματος είναι σημαντικά υψηλότερος από τον αντίστοιχο λόγο του κροταφικού τμήματος μόνο στις 14 d.p.inj. 3.4. Συγκριτική μελέτη της ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα 101

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Για τη μελέτη της ικανότητας παραγωγής νέων νευρικών κυττάρων του υπερπυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους της DG υπολογίστηκε ο απόλυτος αριθμός των BrdU + κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους της διαφραγματικής και της κροταφικής DG, παράλληλα με τους πληθυσμούς των κοκκοειδών κυττάρων που εποικίζουν τα δύο σκέλη της DG στα δύο τμήματα αυτής. Τα αποτελέσματα της καταμέτρησης του απόλυτου αριθμού των BrdU + κυττάρων των δύο σκελών καθ όλο το διαφραγματο-κροταφικό άξονα της DG παραθέτονται στον Πίνακα 3.3. Πίνακας 3.3: Απόλυτοι αριθμοί των BrdU + κυττάρων των δύο σκελών της DG του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος κατά τις ημέρες ελέγχου μετά από την έγχυση της BrdU. Οι πληθυσμοί των BrdU + κυττάρων δε διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των δύο σκελών της DG τόσο στο διαφραγματικό όσο και στο κροταφικό τμήμα της, σε καμία από τις ημέρες ελέγχου. d.p.inj. Αριθμός BrdU + κυττάρων Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα Υπερπυραμιδικό σκέλος Υποπυραμιδικό σκέλος Υπερπυραμιδικό σκέλος Υποπυραμιδικό σκέλος 2 572,50 ± 52,87 741,25 ± 90,62 203,75 ± 30,41 241,25 ± 29,49 5 763,75 ±107,04 743,75 ± 58,58 247,50 ± 61,78 293,75 ± 64,53 7 545,00 ± 42,95 633,33 ± 82,77 225,00 ± 40,39 275,00 ± 41,93 14 406,25 ± 57,82 508,75 ± 92,44 213,75 ± 33,06 177,50 ± 30,98 21 530,00 ± 147,35 506,25 ± 108,58 197,50 ± 40,52 137,50 ± 31,15 30 351,25 ± 51,94 356,25 ± 53,32 175,00 ± 38,88 155,00 ± 30,30 102

Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων απέδειξε ότι δεν παρατηρείται καμία στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών των νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους της DG, σε καμία ημέρα ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, τόσο για το διαφραγματικό (Διαγρ. 3.7) όσο και για το κροταφικό τμήμα αυτής (Διαγρ. 3.8). Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα 3.7 3.8 Υπερ-πυραμιδικό σκέλος Υπο-πυραμιδικό σκέλος Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.7 & 3.8: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των πληθυσμών των BrdU + κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους του διαφραγματικού (3.7) και του κροταφικού τμήματος (3.8) της DG. Καμία στατιστικώς σημαντική διαφορά δεν ανιχνεύεται μεταξύ των πληθυσμών των BrdU + κυττάρων του υπερπυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους τόσο στο διαφραγματικό όσο και στο κροταφικό τμήμα της DG. Η παράλληλη καταμέτρηση του συνόλου των κοκκοειδών κυττάρων που εποικίζουν τα δύο σκέλη της DG στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της αποκάλυψε ότι στη διαφραγματική DG εντοπίζονται 237.740±12.224,25 κοκκοειδή 103

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ κύτταρα στο υπερ-πυραμιδικό της σκέλος και 198.573±5.276,39 κοκκοειδή κύτταρα στο υπο-πυραμιδικό της σκέλος. Αντιστοίχως, οι τιμές για το υπερ-πυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος της κροταφικής DG είναι 93.500±4.278,23 και 72.020±3.532,16 κύτταρα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων απέδειξε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών των κοκκοειδών κυττάρων των δύο σκελών και στα δύο τμήματα της DG. Επομένως, η κατανομή των κοκκοειδών κυττάρων είναι ομοιογενής καθ όλο το μήκος του εγκάρσιου άξονα της DG. Ακολούθως, υπολογίστηκε ο λόγος του πληθυσμού των BrdU + κυττάρων προς τον πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων για κάθε σκέλος της DG, για κάθε τμήμα αυτής, και σε κάθε ημέρα ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, ώστε να μελετηθεί η ικανότητα παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων από τα δύο σκέλη της DG. Οι υπολογιζόμενοι λόγοι εκφράζονται ως ποσοστά % (Πιν. 3.4). Πίνακας 3.4 d.p.inj. Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα Υπερπυραμιδικό σκέλος Υποπυραμιδικό σκέλος Υπερπυραμιδικό σκέλος Υποπυραμιδικό σκέλος 2 0,255 ± 0,028 0,340 ± 0,042 0,218 ± 0,033 0,335 ± 0,041 5 0,358 ± 0,058 0,339 ± 0,033 0,265 ± 0,066 0,408 ± 0,090 7 0,247 ± 0,028 0,287 ± 0,030 0,241 ± 0,043 0,382 ± 0,058 14 0,192 ± 0,031 0,220 ± 0,037 0,229 ± 0,035 0,246 ± 0,043 21 0,235 ± 0,068 0,228 ± 0,044 0,211 ± 0,043 0,191 ± 0,043 30 0,160 ± 0,022 0,166 ± 0,030 0,187 ± 0,042 0,215 ± 0,042 104

Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαγραμμική απόδοση και σύγκριση απέδειξε ότι στη διαφραγματική DG ο λόγος στο υπερ-πυραμιδικό σκέλος ήταν μεγαλύτερος από τον αντίστοιχο λόγο στο υπο-πυραμιδικό σκέλος σε τέσσερις από τις έξι μελετούμενες ημέρες ελέγχου (Διαγρ. 3.9). Το ίδιο πρότυπο αποδείχθηκε και για το κροταφικό τμήμα της DG, όπου και εδώ o λόγος των νεοπαραγόμενων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων ήταν αυξημένος στο υπο-πυραμιδικό σκέλος σε πέντε από τις έξι μελετούμενες ημέρες ελέγχου (Διαγρ. 3.10). Όμως, και στα δύο τμήματα της DG οι παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους αποδείχθηκαν στατιστικώς μη σημαντικές, με εξαίρεση μόνο τις 2 d.p.inj. στο κροταφικό τμήμα της DG (Ρ= 0,042). Διαφραγματικό τμήμα 3.9 3.10 Κροταφικό τμήμα Υπερ-πυραμιδικό σκέλος Υπο-πυραμιδικό σκέλος Διαγράμματα 3.9 & 3.10: Συγκριτική γραφική απεικόνιση του λόγου του πληθυσμού των BrdU + κυττάρων/πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού και του υπο-πυραμιδικού σκέλους της DG του διαφραγματικού (3.9) και του κροταφικού τμήματος (3.10) κατά τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU. Οι υπολογιζόμενοι λόγοι δεν διαφέρουν σημαντικά σε καμία ημέρα ελέγχου παρά μόνο στις 2 d.p.inj. στο 105

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ κροταφικό τμήμα της DG. 3.5. Συγκριτική μελέτη της επιβίωσης των νέων νευρικών κυττάρων στο υπερπυραμιδικό και το υπο-πυραμιδικό σκέλος του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Όπως αποδείχθηκε, ο πληθυσμός των BrdU + κυττάρων της DG μειώνεται προοδευτικά κατά τη διάρκεια των ημερών μετά την έγχυση της BrdU. Αν και η μείωση αυτή φαίνεται να είναι ομοιογενής καθ όλο το μήκος του διαφραγματοκροταφικού άξονα της DG, δεν ισχύει το ίδιο και για τον εγκάρσιο άξονά της. Διαπιστώθηκε ότι η μείωση στον απόλυτο αριθμό των BrdU + κυττάρων ήταν εντονότερη στο υπο-πυραμιδικό σκέλος της DG τόσο στο διαφραγματικό όσο και στο κροταφικό τμήμα της. Η στατιστική επεξεργασία επιβεβαίωσε την παρατήρηση αυτή, αποδεικνύοντας ότι η αρνητική συσχέτιση μεταξύ απόλυτου αριθμού BrdU + κυττάρων και χρόνου ήταν ισχυρότερη για το υπο-πυραμιδικό σκέλος και των δύο τμημάτων της DG. Οι υπολογιζόμενες τιμές των συντελεστών συσχέτισης (r) για τη διαφραγματική DG ήταν 0,365 (r 2 = 0,134) για το υπερ-πυραμιδικό σκέλος και 0,530 (r 2 = 0,281) για το υπο-πυραμιδικό σκέλος της. Οι τιμές για το κροταφικό τμήμα ήταν 0,125 (r 2 = 0,016) και 0,408 (r 2 = 0,166) για το υπερ- και το υπο-πυραμιδικό σκέλος, αντίστοιχα. Σε συνέχεια των παραπάνω ευρημάτων διερευνήθηκε εάν η μείωση του αριθμού των BrdU + κυττάρων στα δύο σκέλη της DG ακολουθεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο σε συνάρτηση με τον χρόνο. Στο διαφραγματικό τμήμα της DG, το μοντέλο της γραμμικής παλινδρόμησης επιβεβαιώθηκε και για τα δύο σκέλη της (υπερπυραμιδικό σκέλος, P= 0,013 υπο-πυραμιδικό σκέλος, P= 0,0001), υποδηλώνοντας ότι οι πληθυσμοί των BrdU + κυττάρων μειώνονται γραμμικά με την πάροδο του 106

Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ χρόνου (Διαγρ. 3.11 & 3.12). Διαφραγματικό τμήμα 3.11 Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση Hμέρες μετά την έγχυση της BrdU Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση 3.12 Hμέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.11 & 3.12: Το μοντέλο της γραμμικής παλλινδρόμησης του πληθυσμού των BrdU + κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού (3.11) και του υπο-πυραμιδικού σκέλους (3.12) της διαφραγματικής DG στο χρόνο. Αντιθέτως, στο κροταφικό τμήμα της DG, το μοντέλο της γραμμικής παλινδρόμησης ίσχυε μόνο για το υπο-πυραμιδικό σκέλος της (P= 0,006 υπερ- 107

Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ πυραμιδικό σκέλος, Ρ= 0,421) (Διαγρ. 3.13 & 3.14). Κροταφικό τμήμα 3.13 Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων Hμέρες μετά την έγχυση της BrdU Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση 3.14 Hμέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.13 και 3.14: Το μοντέλο της γραμμικής παλλινδρόμησης του πληθυσμού των BrdU + κυττάρων του υπερ-πυραμιδικού (3.13) και του υποπυραμιδικού σκέλους (3.14) της κροταφικής DG στο χρόνο. 3.6. Στερεολογική μελέτη της κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων κατά τον διαμήκη άξονα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Για κάθε μία από τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU (2, 5, 7, 14, 108

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 21 και 30 d.p.inj.), εφαρμόστηκε η ανάλυση προσαρμογής καμπύλης ώστε να διερευνηθεί και να περιγραφεί η συσχέτιση της αύξουσας απόστασης από το βρέγμα (ανεξάρτητη μεταβλητή) και του αριθμού των BrdU + κυττάρων (εξαρτημένη μεταβλητή). Η ανάλυση προσαρμογής καμπύλης για το διαφραγματικό τμήμα της DG ανέδειξε τις εξής τιμές: 2 d.p.inj.: ρ = 0,039 (P= 0,773) 5 d.p.inj.: r = 0,217 (P=0,085) 7 d.p.inj.: r = 0,003 (P= 0,984) 14 d.p.inj.: r = 0,258 (P= 0,04) 21 d.p.inj.:. r = 0,071 (P= 0,631) 30 d.p.inj.: r = 0,112 (P= 0,379) (Διαγρ. 3.15 & 3.16). Ασθενής γραμμική συσχέτιση εντοπίστηκε μόνο στις 14 d.p.inj., ενώ σε καμία άλλη χρονική στιγμή δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της απόστασης από το βρέγμα και του αριθμού των BrdU + κυττάρων στο διαφραγματικό τμήμα της DG. Αντίστοιχα, οι τιμές της ανάλυσης προσαρμογής καμπύλης για το κροταφικό τμήμα της DG ήταν: 2 d.p.inj.: r = 0,127 (P= 0.35) 5 d.p.inj.: ρ = 0,437 (P=0,001) 7 d.p.inj.: r = 0,435 (P= 0,004) 14 d.p.inj.: ρ = 0,482 (P= 0,0001) 21 d.p.inj.: ρ = 0,321 (P= 0,038) 30 d.p.inj.: ρ = 0,503 (P= 0,001) (Διαγρ. 3.19 & 3.20). Αποδείχθηκε ότι στο κροταφικό τμήμα υπάρχει ισχυρότερη γραμμική συσχέτιση μεταξύ των εξεταζόμενων μεταβλητών σε όλες τις μελετηθείσες ημέρες ελέγχου, εξαιρουμένων των 2 d.p.inj. Ο αριθμός των BrdU + κυττάρων κατά τον διαμήκη άξονα της διαφραγματικής και της κροταφικής DG αυξάνει σταδιακά καθώς κινούμαστε από τον διαφραγματικό ή κροταφικό πόλο προς το ενδιάμεσο τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Το ίδιο πρότυπο όμως ακολουθεί και ο πληθυσμός των κοκκοειδών κυττάρων, ιδιαίτερα στο κροταφικό τμήμα της DG (Εικ. Α-Θ και Ι-Ο). Για να εξαλειφθεί η πιθανότητα σφάλματος, υπολογίστηκε ο λόγος των BrdU + κυττάρων προς τον μετρούμενο πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων για κάθε εξεταζόμενη απόσταση από το βρέγμα, και η ανάλυση προσαρμογής καμπύλης πραγματοποιήθηκε εκ νέου για κάθε 109

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ημέρα ελέγχου και για τα δύο τμήματα της DG. Διαφραγματικό τμήμα Α Β Γ Δ Ε Ζ Η Θ Κροταφικό τμήμα Ι Κ Λ Μ Ν Ξ Ο Εικόνες Α-Θ & Ι-Ο: Μικροφωτογραφίες διαδοχικών τομών, ανά 200μm, του διαφραγματικού (Α-Θ) και του κροταφικού (Ι-Ο) τμήματος της DG, χρωσμένες με την τεχνική Nissl, με την ακριβή απόστασή τους από το βρέγμα. Στις τομές αυτές καταμετρήθηκε τόσο ο αριθμός των BrdU + κυττάρων όσο και ο συνολικός αριθμός των κοκκοειδών κυττάρων, ώστε να μελετηθεί η κατανομή των νεοπαραγόμενων κυττάρων κατά το διαμήκη άξονα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG. Στο διαφραγματικό τμήμα δεν ανιχνεύτηκε καμία συσχέτιση μεταξύ της αύξουσας απόστασης από το βρέγμα και των υπολογιζόμενων λόγων, για καμία ημέρα ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU (2 d.p.inj.: p = 0,064, P= 0,639 5 d.p.inj.: r = 0,043, P=0,755 14 d.p.inj.: r = 0,076, P= 0,580 21 d.p.inj.: ρ = 0,06, P= 0,851 30 d.p.inj.: r = 0,130, P= 0,339) εκτός από τις 7 d.p.inj. (r = 0,310, P= 0,046) (Διαγρ. 110

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.17 & 3.18). Προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν η απουσία συσχέτισης σημαίνει ότι ο πληθυσμός των BrdU + κυττάρων είναι ομοιόμορφα κατανεμημένος καθ όλο το διαμήκη άξονα της διαφραγματικής DG, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση της διακύμανσης κατά έναν παράγοντα (one-way ANOVA) για κάθε εξεταζόμενη ημέρα ελέγχου και συγκρίθηκαν οι υπολογιζόμενοι λόγοι μεταξύ των διαδοχικών αποστάσεων από το βρέγμα. Η ανάλυση απέδειξε ότι ο λόγος της πιο απομακρυσμένης από το βρέγμα τομής (-4.06 mm) ήταν σημαντικά μικρότερος από τουλάχιστον έναν αντίστοιχο λόγο άλλου εξεταζόμενου σημείου, στις τρεις από τις έξι ημέρες ελέγχου. Καμία άλλη διαφοροποίηση δεν αξιολογήθηκε ως στατιστικώς σημαντική, γεγονός που σημαίνει ότι ο λόγος του αριθμού των ΒrdU + κυττάρων:συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων διατηρείται σχετικά σταθερός κατά το διαμήκη άξονα της διαφραγματικής DG. Το πρότυπο αυτό φαίνεται να διαφοροποιείται σημαντικά στο κροταφικό τμήμα της DG, όπου στις τρεις από τις έξι εξεταζόμενες ημέρες ελέγχου διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της αύξουσας απόστασης από το βρέγμα και του λόγου του αριθμού των ΒrdU + κυττάρων προς τον συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων. Στις ίδιες ημέρες ελέγχου επαληθεύτηκε και η ύπαρξη του μοντέλου της γραμμικής παλλινδρόμησης (2 d.p.inj.: r = 0,254, P=0,05 5 d.p.inj.: ρ = 0,337, P=0,011 30 d.p.inj.: r = 0,403, P=0,008) (Διαγρ. 3.21 & 3.22). Επομένως, στο κροταφικό τμήμα της DG ο λόγος των BrdU + κυττάρων προς τον πληθυσμό των κοκκοειδών κυττάρων αυξάνει γραμμικά καθώς κινούμαστε από το βρέγμα σε πιο απομακρυσμένα σημεία, δηλ. από τον κροταφικό πόλο προς το ενδιάμεσο τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. 111

Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαφραγματικό τμήμα Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση 3.15 3.16 Aπόσταση από το βρέγμα Aπόσταση από το βρέγμα 3.17 3.18 Aπόσταση από το βρέγμα Aπόσταση από το βρέγμα Διαγράμματα 3.15-3.18: Τα μοντέλα της γραμμικής παλινδρόμησης που αναπαριστούν τη συσχέτιση του απόλυτου αριθμού των BrdU + κυττάρων (3.15 & 3.16) ή του λόγου του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων (3.17 & 3.18) με την αύξουσα απόσταση από το βρέγμα στο διαφραγματικό τμήμα της DG. Παρουσιάζονται τα μοντέλα της γραμμικής παλινδρόμησης που αναφέρονται στην 5 η και στην 30 η d.p.inj., στις οποίες παρατηρείται η κορύφωση του αριθμού των BrdU + κυττάρων και η επιβίωσή τους στην πιο απομακρυσμένη από τη χορήγηση της BrdU ημέρα ελέγχου. 112

Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Λόγος του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Αριθμός των BrdU + κυττάρων Αριθμός των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Kροταφικό τμήμα Ευρεθείσες τιμές Γραμμική συσχέτιση 3.19 3.20 Aπόσταση από το βρέγμα Aπόσταση από το βρέγμα 3.21 3.22 Aπόσταση από το βρέγμα Aπόσταση από το βρέγμα Διαγράμματα 3.19-3.22: Τα μοντέλα της γραμμικής παλινδρόμησης που αναπαριστούν τη συσχέτιση του απόλυτου αριθμού των BrdU + κυττάρων (3.19 & 3.20) ή του λόγου του αριθμού των BrdU + κυττάρων προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων (3.21 & 3.22) με την αύξουσα απόσταση από το βρέγμα στο κροταφικό τμήμα της DG. Παρουσιάζονται τα μοντέλα της γραμμιικής παλινδρόμησης που αναφέρονται στην 5 η και στην 30 η d.p.inj., στις οποίες παρατηρείται η κορύφωση του αριθμού των BrdU + κυττάρων και η επιβίωσή τους στην πιο απομακρυσμένη από τη χορήγηση της BrdU ημέρα ελέγχου. 113

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.7. Συγκριτική μελέτη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των νευρικών στελεχιαίων κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Η ενσωμάτωση της BrdU στον πυρήνα των διαιρούμενων NSCs και των απογόνων τους, επιτρέπει τη μελέτη του πληθυσμού τους κατά τις διαδοχικές ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU (Εικ. 3.2). A B Γ Εικόνα 3.2: Μικροφωτογραφίες συνεστιακού μικροσκοπίου τομών της DG, όπου απεικονίζονται NSCs (λευκά βέλη) να έχουν πραγματοποιήσει μία ασύμμετρη νευρογενή διαίρεση (Α), μία ασύμμετρη αστρογλοιογενή διαίρεση (Β) και μία συμμετρική διαίρεση (Γ), παράγοντας αντίστοιχα ένα νέο νευρώνα (BrdU + /GFAP - ), ένα νέο αστροκύτταρο (BrdU + /GFAP + ) και ένα νέο NSC (BrdU + /GFAP + ). Κλίμακα= 10μm. Τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU και GFAP για τα δύο τμήματα της DG κατά τις διαδοχικές ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα (Πιν. 3.5). Διαπιστώθηκε ότι παρ όλο που καθ όλο το χρονικό διάστημα του ενός μηνός μετά την έγχυση της BrdU τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/GFAP ήταν υψηλότερα στο διαφραγματικό τμήμα της DG, στατιστικώς σημαντική ήταν η διαφορά τους μόνο στις 7 d.p.inj. (P= 0,049) (Διαγρ. 3.23). Και 114

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ στα δύο τμήματα της DG τα υψηλότερα ποσοστά συνέκφρασης ανιχνεύθηκαν στις 2 d.p.inj., ενώ στις 30 d.p.inj. ένα ιδιαίτερα χαμηλό ποσοστό των BrdU + κυττάρων συνέχιζε να εκφράζει τον δείκτη GFAP. Πίνακας 3.5 d.p.inj. Συνέκφραση BrdU/GFAP % Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα 2 17,393 ± 3,428 14,303 ± 0,955 5 16,288 ± 4,151 10,563 ± 1,467 7 15,437 ± 0,133* 6,437 ± 2,521* 14 12,675 ± 2,546 6,578 ± 1,322 21 4,87 ± 1,823 6,11 ± 0,56 30 4,285 ± 1,083 3,867 ± 1,12 Στο διαφραγματικό τμήμα της DG, σημαντική μείωση στα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/GFAP παρατηρήθηκε μεταξύ των 14 d.p.inj. και των 21 d.p.inj. (P= 0,021). Αντίθετα, στο κροταφικό τμήμα, καμία στατιστικώς σημαντική διαφορά δεν ανιχνεύθηκε, αποκαλύπτοντας τη σταδιακή μείωση του πληθυσμού των BrdU + /GFAP + κυττάρων. Συγχρόνως, υπολογίστηκε ο λόγος του απόλυτου αριθμού των NSCs που έχουν ενσωματώσει BrdU (δηλ. το γινόμενο του απόλυτου αριθμού των BrdU + κυττάρων επί το ποσοστό συνέκφρασης BrdU/GFAP) προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος (Διαγρ. 3.24). 115

Λόγος του αριθμού των BrdU + NSCs προς το συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων % Συνέκφραση BrdU/GFAP % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.23 * Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU 3.24 * * Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.23 & 3.24: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των ποσοστών συνέκφρασης BrdU/GFAP (3.23) και των λόγων του απόλυτου αριθμού των BrdU + NSCs/συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων (3.24) κατά τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, στα δύο τμήματα της DG. Στις 21 και στις 30 d.p.inj. ο λόγος του απόλυτου αριθμού των BrdU + NSCs/συνολικό αριθμό των κοκκοειδών κυττάρων είναι σημαντικά μεγαλύτερος στο κροταφικό τμήμα της DG. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι στις 2 d.p.inj. οι λόγοι ήταν ισοδύναμοι μεταξύ των δύο τμημάτων της DG (διαφραγματικό τμήμα: 116

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 0,058±0,011% κροταφικό τμήμα: 0,047±0,014%), αναδεικνύοντας το γεγονός ότι ίσοι πληθυσμοί NSCs διαιρούνται και προσλαμβάνουν BrdU στη διαφραγματική και την κροταφική DG. Οι λόγοι παρέμειναν ισοδύναμοι και στα ακόλουθα χρονικά διαστήματα (5 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 0,049±0,007%, κροταφικό τμήμα 0,036±0,006% 7 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 0,042±0,004%, κροταφικό τμήμα 0,023±0,005% 14 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 0,024±0,005%, κροταφικό τμήμα 0,018±0,001%). Στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των λόγων των δύο τμημάτων ανιχνεύθηκε μόνο στις 21 d.p.inj. (διαφραγματικό τμήμα: 0,008±0,002% κροταφικό τμήμα: 0,015±0,002% P= 0,038) και στις 30 d.p.inj. (P= 0,033). Ειδικότερα, στις 30 d.p.inj., ο λόγος του κροταφικού τμήματος ήταν σημαντικά υψηλότερος από τον αντίστοιχο του διαφραγματικού τμήματος (διαφραγματικό τμήμα: 0,008±0,002% κροταφικό τμήμα: 0,019±0,002%), υποδηλώνοντας ότι ένα μήνα μετά την αρχική τους διαίρεση, υψηλότερος πληθυσμός BrdU + NSCs ανιχνεύεται στην κροταφική DG. 3.8. Συγκριτική μελέτη της νευρωνικής διαφοροποίησης και της μετανάστευσης των νέων κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Τα νεοπαραγόμενα κύτταρα που είναι προορισμένα να διαφοροποιηθούν σε νέα κοκκοειδή κύτταρα αρχίζουν εντός ολίγων ωρών από τη γέννησή τους, να εκφράζουν την ειδική πρωτεΐνη DCX (Εικ. 3.3) (Brown και συν., 2003). Τις πρώτες ημέρες μετά την έγχυση της BrdU τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/DCX βρέθηκαν να είναι πανομοιότυπα στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG (2 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 51,45±0,56%, κροταφικό τμήμα 51,97±0,97% 5 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 56,53±1,53%, κροταφικό τμήμα 56,28±0,73%) (Διαγρ. 3.25). 117

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α Β Γ Εικόνα 3.3: Τα διαδοχικά στάδια μορφολογικής ωρίμανσης των νεοπαραγόμενων DCX + νευρώνων ως συνάρτηση της ειδικότερης μορφολογίας του δενδριτικού τους κλάδου. Αρχικά, τα DCX + κύτταρα διαθέτουν μικρού μήκους αποφυάδες, οι οποίες κατευθύνονται παράλληλα με την GCL (Α). Στο αρχικό αυτό στάδιο ορισμένα εξ αυτών είναι ικανά για κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ικανότητα που εξαλείφεται κατά τα επόμενα στάδια ανάπτυξης, όταν πλέον τα DCX + κύτταρα διαθέτουν έναν ιδιαίτερα επιμηκυσμένο κύριο δενδριτικό κλάδο (Β). Τελικά, ο κύριος δενδριτικός τους κλάδος αναπτύσσεται περαιτέρω και διατρέχει την GCL, απολήγoντας στη ML (Γ). Κλίμακα= 10μm. Όμως, τo τοπίο διαφοροποιήθηκε σημαντικά από τις 7 d.p.inj. και έπειτα, με τα ποσοστά συνέκφρασης στο διαφραγματικό τμήμα να είναι σημαντικά υψηλότερα (P< 0,05) από τα αντίστοιχα ποσοστά στο κροταφικό τμήμα. Στο διαφραγματικό τμήμα, το ποσοστό των BrdU + κυττάρων που συνέκφραζαν DCX συνέχισε να αυξάνει έως και τις 14 d.p.inj. (61,515±0,515%), ενώ στη συνέχεια τα ποσοστά συνέκφρασης ανιχνεύονταν σε χαμηλότερα επίπεδα (21 d.p.inj.: 25,50±4,50 30 d.p.inj.: 6,020±1,02%). Αντίθετα, στο κροταφικό τμήμα της DG το ποσοστό συνέκφρασης BrdU/DCX έφθασε στη μέγιστη τιμή του αρκετές ημέρες νωρίτερα, στις 5 d.p.inj., 118

Συνέκφραση BrdU/DCX % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ και έπειτα σταδιακά μειωνόταν (7 d.p.inj.: 48,5±1,5% 14 d.p.inj.: 39,835±1,835% 21 d.p.inj.: 7,00±1,00% 30 d.p.inj.: 1,5±0,70%). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι στις 30 d.p.inj. το 6,020±1,02% των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος συνεχίζει να εκφράζει DCX, ενώ την ίδια χρονική στιγμή τα ποσοστά συνέκφρασης του κροταφικού τμήματος είναι σχεδόν μηδενικά. Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διάγραμμα 3.25: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των ποσοστών συνέκφρασης BrdU/DCX κατά τις διαδοχικές ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, στα δύο τμήματα της DG. Τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/DCX είναι πανομοιότυπα στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα κατά τις πρώτες 5 d.p.inj. αλλά διαφοροποιούνται σημαντικά κατά τις ακόλουθες ημέρες ελέγχου. Οι νεοπαραγόμενοι νευρώνες σταδιακά σταματούν να εκφράζουν DCX και αποκτούν έναν περισσότερο ώριμο φαινότυπο, εκφράζοντας τον ειδικό νευρωνικό δείκτη NeuN (Εικόνα 3.4). Ένα σημαντικό ποσοστό των BrdU + κυττάρων βρέθηκε στην παρούσα πειραματική εργασία να εκφράζει το δείκτη NeuN μόλις από τις 2 d.p.inj., τόσο στο διαφραγματικό (43,73±6,55%) όσο και στο κροταφικό τμήμα της 119

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DG (19,63±1,61%), αποδεικνύοντας ότι λίγες μόνο ώρες μετά τη γέννησή τους ένα σημαντικό μέρος των νεοπαραγόμενων κυττάρων εξέρχεται του μιτωτικού κύκλου και εισέρχεται στα πρώτα στάδια της νευρωνικής διαφοροποίησης. Α Β Εικόνα 3.4: Μικροφωτογραφίες συνεστιακού μικροσκοπίου στις οποίες διακρίνεται η έκφραση του ειδικού νευρωνικού δείκτη NeuN από τα νεοπαραγόμενα BrdU + κύτταρα της DG. Α: Στις 2 d.p.inj., ένας σημαντικός αριθμός των νεοπαραγόμενων κυττάρων, εντοπισμένα στην SGZ, συνεκφράζει το δείκτη NeuN (λευκά βέλη). Β: Στις 30 d.p.inj., ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των νεοπαραγόμενων νευρώνων (BrdU + /NeuN + ) εντοπίζονται στο εσώτερο όριο της GCL. Στο διαφραγματικό τμήμα της DG τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/NeuN αυξήθηκαν ομαλά μεταξύ των 2 d.p.inj. και των 5 d.p.inj (2 d.p.inj.: 43,73±6,55% 5 d.p.inj.: 57,43±6,86%). Αντίθετα, στο κροταφικό τμήμα της, τα ποσοστά συνέκφρασης υπερδιπλασιάστηκαν κατά την ίδια χρονική περίοδο (2 d.p.inj.: 19,63±1,61% 5 d.p.inj.: 45,97±5,85). Στις ακόλουθες χρονικές στιγμές, ολοένα και περισσότερα BrdU + κύτταρα συνέκφραζαν το δείκτη NeuN και στα δύο τμήματα της DG (7 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 62,883±4,079%, κροταφικό τμήμα 50,00±0,001% 14 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 61,973±2,453%, κροταφικό τμήμα 37,295±7,713%/ 21 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 77,605±3,677%, κροταφικό τμήμα 120

Συνέκφραση BrdU/NeuN % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 54,250±4,609% 30 d.p.inj.: διαφραγματικό τμήμα 83,770±0,440%, κροταφικό τμήμα 52,085±10,415%). Τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/NeuN στο διαφραγματικό τμήμα ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα ποσοστά του κροταφικού τμήματος καθ όλη τη διάρκεια του ενός μηνός ακολούθως της έγχυσης της BrdU (7 d.p.inj., P= 0,037 14 d.p.inj., P= 0,044 21 d.p.inj., P= 0,007 30 d.p.inj., P= 0,02) (Διαγρ. 3.26). Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την ταχύτερη έκφραση ειδικών νευρωνικών δεικτών από τα νέα κύτταρα του διαφραγματικού τμήματος. Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διάγραμμα 3.26: Συγκριτική γραφική απεικόνιση των ποσοστών συνέκφρασης BrdU/NeuN κατά τις ημέρες ελέγχου μετά την έγχυση της BrdU, στα δύο τμήματα της DG. Τα ποσοστά του διαφραγματικού τμήματος είναι σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα ποσοστά του κροταφικού τμήματος, καθ όλο το εξεταζόμενο χρονικό διάστημα. Οι νεοπαραγόμενοι NeuN + νευρώνες σταδιακά μεταναστεύουν εντός της GCL, αναπτύσσουν πλήρως τους δενδριτικούς τους κλάδους και ενσωματώνονται στα ήδη υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα της DG. Στις 2 d.p.inj., η μεγάλη 121

Ποσοστό % του συνολικού πληθυσμού των BrdU + κυττάρων Ποσοστό % του συνολικού πληθυσμού των BrdU + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ πλειοψηφία του πληθυσμού των νεοπαραγόμενων νευρώνων εντοπιζόταν ακόμη στην SGZ, και στα δύο τμήματα της DG (διαφραγματικό τμήμα: 70,9±10,86% κροταφικό τμήμα: 65,97±16,24%) (Διαγρ. 3.27 & 3.28). Λίγες ημέρες αργότερα, στις 7 d.p.inj., ένα μεγάλο ποσοστό των νέων νευρώνων του κροταφικού τμήματος μετανάστευσε εντός της GCL (SGZ: 43,33±19, 63% GCL: 56,67±29,63%), ενώ την ίδια χρονική περίοδο, οι νεοπαραγόμενοι νευρώνες του διαφραγματικού τμήματος εντοπίζονταν ακόμη στην SGZ (SGZ: 57,59±5,22% GCL: 42,41±5,22%). Διαφραγματικό τμήμα Κροταφικό τμήμα 3.27 3.28 Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διαγράμματα 3.27 & 3.28: Η σταδιακή μετανάστευση των νέων κοκκοειδών κυττάρων από την SGZ προς την GCL κατά τη διάρκεια του ενός μηνός μετά την έγχυση της BrdU στο διαφραγματικό (3.27) και το κροταφικό τμήμα (3.28) της DG. Η μεγάλη πλειοψηφία των διαφραγματικών νεοπαραγόμενων νευρώνων μετανάστευσε εντός της GCL μία εβδομάδα αργότερα (14 d.p.inj.: SGZ 41,82±18,9% GCL 58,18±18,95%). Στο διαφραγματικό τμήμα επίσης, εντυπωσιακός ήταν ο ρυθμός μετανάστευσης που έλαβε χώρα μεταξύ των 14 d.p.inj. και των 21 d.p.inj., με το 89,72±5,99% των νεοπαραγόμενων νευρώνων να 122

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ εντοπίζεται πλέον στην GCL. Στις 30 d.p.inj., το σύνολο των νεοπαραγόμενων νευρώνων είχε μεταναστεύσει εντός της GCL και στα δύο τμήματα (διαφραγματικό τμήμα: 98,61±1,39% κροταφικό τμήμα: 100%). Ενδιαφέρον παρουσιάζει και η ακριβής εντόπιση των νέων νευρώνων εντός της GCL, δηλ. στο έσω, μέσο ή έξω τμήμα αυτής. Διαπιστώθηκε ότι στις 30 d.p.inj., το μεγαλύτερο ποσοστό των νεοπαραγόμενων νευρώνων εποικίζει το έσω τμήμα της GCL (διαφραγματικό τμήμα: 69,45% κροταφικό τμήμα: 70,84%), γεγονός που σημαίνει ότι τα νέα νευρικά κύτταρα διανύουν μικρή απόσταση κατά τη μετανάστευσή τους από την SGZ (Εικ. 3.4, Β). 3.9. Συγκριτική μελέτη της έκφρασης της καλρετινίνης από τους νέους νευρώνες του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος Η έκφραση της καλρετινίνης διαδέχεται την έκφραση της DCX στους νεοπαραγόμενους νευρώνες της DG του μυ (Brandt και συν., 2003). Στην παρούσα ερευνητική εργασία δεν ανιχνεύτηκε κανένας BrdU + /καλρετινίνη + νευρώνας σε κανένα από τα δύο τμήματα της DG, σε καμία από τις ημέρες ελέγχου ακολούθως της έγχυσης της BrdU. Η καταμέτρηση του απόλυτου αριθμού των καλρετινίνη + νευρώνων, στην GCL και στην SGZ (Εικ. 3.5), απέδειξε ότι σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός αυτών εντοπίζεται στο κροταφικό τμήμα της DG (διαφραγματικό τμήμα: 542,50±72,697 κύτταρα κροταφικό τμήμα: 958,571±76,140 κύτταρα, P= 0,005). Αποδείχθηκε ότι και στα δύο τμήματα της DG το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού των καλρετινίνη + νευρώνων εντοπιζόταν στην SGZ συγκριτικά με την GCL (διαφραγματικό τμήμα: SGZ 83,718±2,892%, GCL 16,907±2,940% κροταφικό τμήμα: SGZ 68,269±3,508%, GCL 31,724±3,507%) (Διαγρ. 3.29). 123

Ποσοστό των καλρετινίνη + κυττάρων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α B Εικόνα 3.5: Μικροφωτογραφίες συνεστιακού μικροσκοπίου τομών της DG στις οποίες διακρίνεται η μορφολογία των καλρετινίνη + νευρώνων, οι οποίοι εντοπίζονταν είτε στην SGZ (Α) είτε στην GCL (Β). Κλίμακα= 10μm. Διάγραμμα 3.29: Κατανομή των καλρετινίνη + κυττάρων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG στην SGZ ή στην GCL. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό% των καλρετινίνη + κυττάρων που εντοπίζονται στην SGZ ή στην GCL προς το συνολικό πληθυσμό των καλρετινίνη + κυττάρων. 3.10. Συγκριτική μελέτη της έκφρασης των ώριμων νευρωνικών δεικτών και της συναπτογένεσης των νέων νευρώνων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος 124

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα ώριμα κοκκοειδή κύτταρα της DG εκφράζουν την πρωτεΐνη καλβινδίνη (Εικ. 3.6). Στις 21 d.p.inj. ο πληθυσμός των BrdU + /καλβινδίνη + νευρώνων βρέθηκε αυξημένος στο διαφραγματικό τμήμα της DG 52.135±4.719% συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα αυτής 42.205±4.848%. Η διαφορά όμως αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P= 0,193). Ο πληθυσμός των BrdU + /καλβινδίνη + νευρώνων συνέχισε να αυξάνει κατά τις επόμενες ημέρες, φθάνοντας στις 30 d.p.inj. στο 76,450±5,146% και στο 63,517±1,934% του συνολικού πληθυσμού των BrdU + κυττάρων στο διαφραγματικό τμήμα και στο κροταφικό τμήμα της DG, αντίστοιχα. Στις 30 d.p.inj. σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό των BrdU + κυττάρων συνέκφραζε την καλβινδίνη στο διαφραγματικό τμήμα της DG (P< 0,05) (Διαγρ. 3.30). 3.6 3.7 Εικόνες 3.6 & 3.7: Μικροφωτογραφίες συνεστιακού μικροσκοπίου της DG στις οποίες διακρίνονται νεοπαραγόμενοι BrdU + νευρώνες να συνεκφράζουν τους δείκτες καλβινδίνη (3.6) και NMDAR1 (3.7) στις 30 d.p.inj. Όλα τα ώριμα κοκκοειδή κύτταρα της DG εκφράζουν τους δείκτες καλβινδίνη και NMDAR1. Κλίμακα= 10μm. 125

Συνέκφραση BrdU/καλβινδίνης % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ημέρες μετά την έγχυση της BrdU Διάγραμμα 3.30: Συγκριτική γραφική απεικόνιση της εξέλιξης του πληθυσμού των BrdU + /καλβινδίνη + νευρώνων στο χρόνο, στα δύο τμήματα της DG. Οι δύο πληθυσμοί διαφέρουν σημαντικά μόνο στις 30 d.p.inj. Τα κοκκοειδή κύτταρα της DG είναι ανοσοδραστικά έναντι των υπομονάδων R1 και GluR2 των γλουταμινεργικών NMDA και AMPA υποδοχέων αντίστοιχα (Εικόνα 3.7). Στις 21 d.p.inj. ο πληθυσμός των νεοπαραγόμενων νευρώνων που συνέκφραζε τους δείκτες NMDAR1 και GluR2 ήταν σχετικά μεγαλύτερος στο διαφραγματικό τμήμα (BrdU + /NMDAR1 + : 63,448±6,025%, BrdU + /GluR2 + : 66,110±2,780%) συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα (BrdU + /NMDAR1 + : 53,321±4,623%, BrdU + /GluR2 + : 58,335±8,335%), αν και όχι σημαντικά (BrdU + /NMDAR1 + : P= 0,083 BrdU + /GluR2 + : P= 0,121). Στις 30 d.p.inj., τα ποσοστά της BrdU/NMDAR1 συνέκφρασης αυξήθηκαν περαιτέρω και στα δύο τμήματα της DG (διαφραγματικό τμήμα: 83,717±6,574% κροταφικό τμήμα: 71,517±1,840%), όπως και τα ποσοστά της BrdU/GluR2 συνέκφρασης (διαφραγματικό τμήμα: 88,245±0,751% κροταφικό τμήμα: 75,830±2,183%). Στις 30 d.p.inj., ένας σημαντικά μεγαλύτερος πληθυσμός των BrdU + κυττάρων του διαφραγματικού τμήματος ήταν ανοσοδραστικός έναντι των 126

Συνέκφραση BrdU/NMDAR1 % Συνέκφραση BrdU/GluR2 % ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ γλουταμινικών υποδοχέων NMDA και AMPA συγκριτικά με τον αντίστοιχο πληθυσμό του κροταφικού τμήματος της DG (P<0.05 και για τους δύο δείκτες) (Διαγρ. 3.31 & 3.32). 3.31 3.32 Διαγράμματα 3.31 & 3.32: Συγκριτική γραφική απεικόνιση της εξέλιξης του πληθυσμού των BrdU + /NMDAR1 + κυττάρων (3.31) και των BrdU + /GluR2 + κυττάρων (3.32) του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της DG. Στις 30 d.p.inj. σημαντικά μεγαλύτερος πληθυσμός BrdU + /NMDAR1 + και BrdU + /GluR2 + κυττάρων ανιχνεύεται στο διαφραγματικό τμήμα. 3.11. Συγκριτική μελέτη της αστρογλοιογένεσης στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα Τα NCSs εκτός από νέους νευρώνες παράγουν και νέα αστροκύτταρα (Εικ. 3.8). Τα νεοπαραγόμενα αστροκύτταρα συνεχίζουν να εκφράζουν το δείκτη GFAP, ενώ από την τρίτη εβδομάδα της ζωής τους και έπειτα, είναι ανοσοδραστικά και έναντι της δεσμευτικής του ασβεστίου πρωτεΐνης S100 (Encinas και συν., 2011 von Bohlen und Halbach, 2011). Τα ποσοστά συνέκφρασης BrdU/S100, όπως 127

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μελετήθηκαν στις 21 d.p.inj. και στις 30 d.p.inj., ήταν εξαιρετικά χαμηλά και στα δύο τμήματα της DG. Στις 30 d.p.inj., μόνο το 0,31±0,04% και το 2,76±0,32% του συνολικού πληθυσμού των BrdU + κυττάρων συνέκφραζε το δείκτη S100 στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της DG, αντίστοιχα. Εικόνα 3.8: Μικροφωτογραφία συνεστιακού μικροσκοπίου, στην οποία διακρίνεται ένα νεοπαραγόμενο BrdU + / S100 + αστροκύτταρο στο κροταφικό τμήμα της DG, στις 30 d.p.inj. Κλίμακα= 10μm. 3.12. Συγκριτική μελέτη της απόπτωσης των νέων νευρικών κυττάρων στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα Κατά τις πρώτες ημέρες μετά την έγχυση της BrdU, τα ποσοστά συνέκφρασης της BrdU με τους αποπτωτικούς δείκτες κασπάση-3 και φρακτίνη ήταν ιδιαιτέρως χαμηλά και στα δύο τμήματα της DG. Mόνο 1-2 BrdU + κύτταρα ανά DG συνέκφραζαν κάποιον από τους αποπτωτικούς δείκτες, ποσοστό που αναλογεί στο 2% του συνολικού πληθυσμού των BrdU + κυττάρων. Στα επόμενα χρονικά διαστήματα μετά την έγχυση της BrdU δεν ανιχνεύθηκαν BrdU + /κασπάση-3 + ή BrdU + /φρακτίνη + κύτταρα σε κανένα από τα δύο τμήματα της DG. 128