Virusul Herpes simplex tip2 (HSV 2) IgG Cod: C31ER1091

Virusul Herpes simplex tip2 (HSV 2) IgG Cod: C31ER1091 Trusă pentru determinarea calitativă a anticorpilor antihsv 2 IgG din ser sau plasma umana Metodă imunoenzimatică Trusa destinata exclusiv diagnosticului invitro. 1. INTRODUCERE Herpes simplex este un virus ADN anvelopat (150200 nm in diametru) care apartine familiei alfaherpesviridae. In functie de diferentele antigenice, biochimice si biologice, virusurile Herpes simplex sunt impartite in doua categorii: HSV 2 si HSV 2. Omul este singurul rezervor natural cunoscut al virusului. HSV 2 reprezinta agentul etiologic al leziunilor herpetice orale in timp ce HSV 2 afecteaza de regula regiunea genitala. In majoritatea cazurilor de infectie la om, HSV1 si HSV2 raman inactive sau dormante si nu declanseaza nicio simptomatologie; exista insa situatii in care anumiti indivizi infectati, pe fondul unei imunitati deficitare, dezvolta la nivel oral sau genital leziuni si ulceratii specifice HSV. Odata ce virusul a fost contactat, individul ramane infectat pe toata durata vietii. HSV este probabil cel mai raspandit agent infectios in randul populatiei umane, oricare dintre cele doua tipuri (HSV 2 sau 2) putand infecta regiuni similare ale corpului. Aprox. 90% din populatia adulta este seropozitiva pentru HSV1; in functie de situatia socioeconomica, mai ales in tarile in curs de dezvoltare, 1030% din populatie este infectata cu HSV2. Infectia primara cu HSV1 este dobandita in primele luni de viata (618 luni). Infectia cu HSV2 prezinta simptomatologie usoara insa la majoritatea indivizilor se manifesta fara simptome identificabile. Persoanele care prezinta risc fata de infectia cu HSV 2 si/sau 2 sunt cele cu deficienta mostenita a limfocitelor T sau indivizii imunodeprimati din cauza HIV/SIDA, transplatului sau terapiei anticanceroase. HSV 2 poate cauza infectii potential fatale la nounascuti daca mama sufera de o infectie virala activa in momentul nasterii. HSV 2 joaca un rol major in propagarea infectiei cu HIV la indivizii heterosexuali: virusul herpetic tip 2 poate creste riscul indivizilor de a fi infectati cu HIV in timp ce indivizii HSV2 si HIV seropozitivi prezinta un grad foarte mare de infectiozitate. Specia Afecţiunea Simptome Mecanismul infecţiei HSV 2 (Herpes genitalis) Herpes genital Herpes neonatal Leziuni specific care de regula se vindeca de la sine, simptome flulike (febra, glande inflamate), ulceratii Infectie cu transmitere sexuala Infecţia poate fi identificată prin următoarele metode: Microscopie: CPE, IF PCR Serologic: detecţia anticorpilor prin metoda ELISA 2. SCOP Trusa HSV 2 recombinant IgG ELISA este destinată determinării calitative a anticorpilor IgG antihsv 2 in ser sau plasma umana (citrat). 3. PRINCIPIUL TESTULUI Determinarea imunoenzimatica calitativa a Ac. IgG antihsv 2 se realizeaza prin tehnica ELISA. Proteina gg2 recombinanta migreaza in gelul de electroforeza sub forma unei benzi difuze de aprox. 43 kda. Antigenul permite detectarea infectiei cu HSV2 chiar daca in serul pacientului exista anticorpi antihsv1. Acest aspect este important deoarece aprox. 90% din indivizii ajunsi la varsta a 3a au fost infectati pe parcursul vietii cu HSV tip 1. HSV 2 se transmite prin intermediul contactului sexual, incidenta infectiei fiind direct proportionala cu frecventa activitatii sexuale si numarul de parteneri. Herpesul genital este foarte important a fi diagnosticat in timpul sarcinii deoarece infectia congenitala cu HSV2 a nounascutului poate sa aiba repercursiuni grave asupra acestuia. Ac. IgG din proba de testat formează un complex imun cu antigenele recombinante HSV 2 care căptuşesc godeurile. Anticorpii nelegaţi sunt înlăturaţi prin spălare cu soluţie tampon. Complexele imune specifice vor fi marcate ulterior cu Ac. antiigg umane cuplati cu peroxidaza din hrean (conjugat). Pentru a fi vizualizate, aceste complexe Ag.Ac. sunt incubate in prezenta TMB, activitatea enzimatică generand un compus de culoare albastra. După adăugarea soluţiei de stopare (acid sulfuric) culoarea se schimbă în galben. Densitatea optică este măsurată spectrofotometric la lungimea de undă de 450 nm. Concentraţia de anticorpi IgG antihsv 2 este direct proporţională cu densitatea optică masurata. 4. MATERIALE 4.1. Reactivi furnizati in trusa : Godeuri tapetate cu antigene recombinante HSV2: 12 stripuri a cate 8 godeuri detasabile ambalate in folie de aluminiu, resigilabile. Diluant pentru probe IgG***: 1 flacon continand 100 ml solutie tampon pentru dilutia probelor: ph 7,2 ± 0,2; solutie de culoare galbena, gata de utilizare, capac alb. Solutie Stop:1 flacon cu capac rosu, continand 15 ml acid sulfuric 0,2 mol/l, gata de utilizare. 1

Solutie de spalare (concentratie 20X)*: 1 flacon cu capac alb, continand 50 ml solutie concentrata 20x (ph 7,2 ± 0,2), pentru spalarea godeurilor. Conjugat enzimatic HRP cu antiigg umane**: 1 flacon cu capac negru, continand 20 ml solutie antiigg umane (iepure) cuplate cu peroxidaza de hrean, solutie de culoare albastra, gata de utilizare. Substrat TMB: 1 flacon cu capac galben,continand 15 ml 3, 3, 5, 5 tetrametilbenzidina (TMB), gata de utilizare. HSV 2 IgG Control Pozitiv***: 1 flacon cu capac rosu, continand 2 ml de solutie de culoare galbena, gata de utilizare. HSV 2 IgG Control CutOff***: 1 flacon cu capac verde, continand 3 ml de solutie de culoare galbena, gata de utilizare. HSV 2 IgG Control Negativ***: 1 flacon cu capac albastru, continand 2 ml de solutie de culoare galbena, gata de utilizare * contine 0.1 % Bronidox L dupa diluare ** contine 0.2 % Bronidox L *** contine 0.1 % Kathon 4.2 Materiale furnizate in trusa: 1 placa pentru godeuri 1 folie adeziva, pentru acoperire 1 protocol de lucru 1 schema de distributie si identificare a reactivior. 4.3. Echipament si materiale necesare: cititor de microplaci ELISA, pentru citirea absorbantei la 450 / 620 nm incubator 37 C spalator pentru godeuri manual sau automat pipete automate pentru volume intre 10 si 1000 µl agitator Vortex apa distilata sau deionizata (proaspata) eprubete de unica folosinta cronometru 5. PASTRAREA SI STABILITATEA REACTIVILOR Reactivii sunt stabili si pot fi utilizati pana la data de expirare daca sunt stocati la temperatura 2... 8 C 6. PREPARAREA REACTIVILOR Este foarte important ca înainte de utilizare reactivii, probele şi controalele să fie aduse la temperatura camerei 20 25 C. Godeurile tapetate cu antigene HSV 2: pot fi stocate la temperaturi de 2... 8 C. Imediat dupa utilizare stripurile ramase se acopera cu folia de protectie si se pastreaza in folia de aluminiu impreuna cu materialul desicant, la temperaturi cuprinse intre 2... 8 C; pastrate in aceste conditii, godeurile vor fi valabile pana la data expirarii inscrisa pe ambalaj. Soluţia de Conjugat enzimatic: Flaconul contine 20 ml solutie de antiigg umane cuplate cu peroxidaza de hrean, tampon, conservanti si un colorant albastru. Solutia este gata de utilizare. Se pastreaza la 2... 8 C. Dupa prima utilizare, este stabila pana la data inscrisa pe eticheta originala, cu conditia sa fie pastrat la 2... 8 C. Controalele: Flacoanele etichetate de Control Pozitiv, CutOff si Control negativ, sunt gata de utilizare, contin 0.1% Kathon, se pastreaza la 2... 8 C. Dupa prima utilizare, sunt stabile pana la data inscrisa pe eticheta originala, cu conditia sa fie pastrate la 2... 8 C. Diluentul IgG: Flaconul contine 100 ml tampon fosfat, stabilizatori, conservant si un colorant galben. Este utilizat pentru dilutia probelor pacientilor. Gata de utilizare, solutia se pastreaza la 2... 8 C. Dupa prima utilizare, este stabil pana la data inscrisa pe eticheta originala, cu conditia sa fie pastrat la 2... 8 C. Solutie de spalare (concentratie 20x): Flaconul contine 50ml solutie tampon concentrata 20x. Diluati 1 + 19 pentru a obtine solutia de spalare (ex. 10 ml solutie de spalare concentrata + 190 ml apa proaspata dublu distilata). Aceasta solutie diluata este stabila 5 zile la temperatura camerei. Cristalele din solutia concentrata dispar prin incalzirea acesteia in baia de apa, la 37 C. Valabila pana la data inscrisa pe eticheta originala. Substratul TMB: Flaconul contine 15 ml TMB, gata de utilizare. Se va pastra la temperatura 2... 8 C, ferit de lumina. Solutia trebuie sa fie transparenta sau sa aiba o tenta usoara de albastru. Daca substratul devine albastru mai intens, nu se va folosi deoarece este posibil sa fi fost contaminat. Valabil pana la data expirarii daca se pastreaza la 2... 8 C. Solutia stop: Flaconul contine 15 ml de acid sulfuric 0.2 M (R36/38, S 26). Gata de utilizare, solutia se pastreaza la 2... 8 C. Valabila pana la data expirarii daca se pastreaza la 2... 8 C. 7. RECOLTAREA SI PREGATIREA PROBELOR BIOLOGICE Testarea se face utilizand probe de ser sau plasma umana (citrat). Serurile se pot pastra pana la 5 zile dupa recoltare, la temperaturi de 2... 8 C. Daca se vor lucra mai tarziu de 5 zile, vor fi portionate si congelate la 70...20 C. Probele congelate se omogenizeaza bine inainte de a fi testate. Evitati inghetul si dezghetul repetat. Nu este recomandata inactivarea probelor prin incalzire. 7.1. Dilutia probelor Inainte de testare, probele se vor dilua 1 + 100 cu diluant IgG. Dispensati 10 µl proba si 1 ml diluant IgG intro eprubeta pentru a obtine o dilutie de 1+100 si agitati bine cu agitatorul tip Vortex. 2

8. PROCEDURA DE LUCRU: 8.1 Pregatirea sesiunii de lucru: Instructiunile de lucru trebuie citite cu atentie inainte de inceperea testarii. Calitatea rezultatelor depinde de respectarea stricta a cerintelor din protocolul de lucru. Daca testul ELISA se va efectua automat este necesar ca numarul ciclurilor de spalare sa creasca de la 3 la 5 si volumul solutiei de spalare sa creasca de la 300 l la 350 l. Inainte de inceperea testului, pe fisa inclusa in trusa trebuie facut planul de distribuire si identificare a probelor si controalelor. Ulterior, godeurile necesare vor fi plasate pe placa ELISA in pozitiile predefinite. Se vor utiliza : 1 godeu(a1) pentru blank 1 godeu(b1) pentru Controlul Negativ 2 godeuri (C1+D1) pentru CutOff 1 godeu (E1) pentru Controlul Pozitiv Se recomanda ca serurile de control si probele de pacienti sa fie testate in duplicat!!! Etapele testului trebuie urmate in ordinea data, fara intarzieri semnificative. Controalele si probele de testat trebuie pipetate cu varfuri de unica folosinta. Setati incubatorul la 37 0 C. a. Se pipetează 100 l seruri de control/cutoff şi ser de pacient diluat 1/100 în godeurile corespunzatoare. Se pastreaza godeul A1 pentru blank. b. Acoperiţi godeurile cu folie adezivă pentru prevenirea evaporării. c. Incubaţi 1 ora ± 5 min. la 37± 1 C. d. Se spala fiecare godeu de 3 ori cu câte 300 l soluţie de spalare. Trebuie evitata depasirea volumului godeurilor. Timpul de inmuiere dintre ciclurile de spalare trebuie sa fie >5 secunde. Dupa ultimul ciclu de spalare, se absoarbe excesul de lichid inversand placuta pe hartie absorbanta! Nota: Etapa de spalare este critica! O spalare insuficienta poate genera valori ridicate ale absorbantei si o precizie mai scazuta a rezultatelor. e. Se pipetează 100 l conjugat enzimatic in fiecare godeu, cu exceptia godeului A1 şi se acoperă cu folie adezivă. f. Incubaţi 30 min. la temperatura camerei. Evitati expunerea la lumina directa. g. Se repetă pasul d. h. Se pipetează 100 l substrat TMB în fiecare godeu, inclusiv A1 şi se acoperă cu folie adezivă. i. Se incubează 15 min. la întuneric, la temperatura camerei. j. Se pipeteaza cate 100 μl de solutie stop in toate godeurile, in aceeasi ordine si cu aceeasi rata cu care a fost pipetat substratul TMB. Culoarea albastra generata de substrat in timpul incubarii vireaza acum in galben. Nota: O Proba intens pozitiva poate genera un precipitat inchis la culoare al cromogenului ce poate afecta masurarea absorbantei. Este recomandata diluarea acestor probe intens pozitive cu ser fiziologic, 1 la 1. Ulterior, se efectueaza dilutia cu solutie tampon 1+100 si rezultatul final exprimat in NTU se inmulteste cu 2 (factorul de dilutie utilizat la diluarea probei cu ser fiziologic). k. Se măsoară la densitatea optică la 450/620 nm in maxim 30 de minute de la adaugarea solutiei de stopare. 8.2 Masurarea: Se ajusteaza cititorul la zero, cu ajutorul blankului din godeul A1. Daca aceasta ajustare nu este posibila, se va scadea absorbanta godeului A1 din absorbanta tuturor godeurilor. Se masoara absorbanta tuturor godeurilor la 450/620nm si se inregistreaza valorile pentru fiecare control si proba de pacient pe schema de identificare. Se recomanda filtrul de 620 nm drept referinta. Daca este cazul, se calculeaza media valorilor absorbantei duplicatelor. 9. REZULTATE 9.1. Criterii de validare Pentru ca testele sa fie considerate valide, urmatoarele criterii trebuie indeplinite: Blank in A1 valoarea absorbantei < 0.100 control negativ in B1 valoarea absorbantei < 0.200 si < cutoff control cutoff in C1 si D1 valoarea absorbantei 0.150 1.300 control pozitiv in E1 valoarea absorbantei >cutoff Daca aceste criterii nu sunt respectate, testul nu este considerat valid si trebuie repetat. 9.2. Calcularea rezultatelor Rezultatele sunt calculate in functie de valoarea Cutoffului. Valoarea cutoff se obtine calculand absorbanta medie a celor 2 replici ale serului de CO. Ex: CutOff = absorbanta Cutoff control 0.39 + absorbanta Cutoff control 0.37= 0.76/2 = 0.38 9.3. Interpretarea rezultatelor Probele sunt considerate pozitive daca valoarea absorbantei probei este > CutOFF + 10% Probele sunt considerate negative daca valoarea absorbantei probei este < CutOFF 10% Rezultatele cuprinse in zona de ±10% din valoarea cutoff sunt considerate incerte. In cazul probelor INCERTE se recomanda repetarea testului utilizand o proba recoltata dupa 24 saptamani. Daca rezultatul este tot INCERT proba va fi considerata NEGATIVA pentru Ac. antihsv 2 IgG. 3

Rezultatele exprimate in NTU (Unitati Arbitrare): Valoare absorbantei probei x10 = NTU (unitate Arbitrara) Cutoff cutoff 10 NTU incert 9 11 NTU negativ < 9 NTU pozitiv > 11 NTU 10. CARACTERISTICI DE PERFORMANTA 10.1. Precizia Inter testare n medie Cv (%) Ser pozitiv 12 12.8 3.6 12 48.3 5.1 Intra testare n medie Cv (%) Ser pozitiv 20 0.45 3.4 24 1.88 3.7 10.2. Specificitatea diagnostica este de >94.1 % si reprezinta capacitatea testului de a obtine un rezultat negativ in absenta analitului specific. 10.3. Sensibilitatea diagnostica este >87.5 % si reprezinta capacitatea testului de a obtine un rezultat pozitiv in prezenta analitului specific. 10.4. Interferente: nu sau observat interferente la probele hemolizate, icterice sau lipemice cu o concentratie de pana la 10 g/ml hemoglobina, 5 mg/ml trigliceride si 0.2 mg/ml bilirubina. Nota: aceste rezultate se refera la grupurile de probe investigate; ele nu reprezinta specificatii garantate. 11. LIMITARILE PROCEDURII Contaminarea bacteriana a probelor sau expunerea repetata la inghet/dezghet poate afecta rezultatul final. Diagnosticul unei boli infectioase nu trebuie stabilit in baza unui singur test. Pentru un diagnostic cat mai precis, alaturi de serologie se va lua in calcul istoricul clinic al pacientului si simptomatologia. La pacientii imunodeprimati si la nou nascuti serologia are utilitate limitata. Se recomanda confirmarea rezultatelor incerte/pozitive prin metode mai specifice de timp imunoblot. 12. ATENTIONARI SI PRECAUTII In conformitate cu articolul 1, paragraful 2b al Directivei Europene 98/79/EC, utilizarea dispozitivelor medicale pentru diagnosticul invitro este intentionata de producator pentru a asigura performanta si siguranta produsului. Procedura de lucru, informatiile, atentionarile si precautiile mentionate in instructiunile de lucru trebuie urmate cu strictete. Utilizarea acestor reactivi cu analizoare automate sau echipamente similare trebuie sa fie validata. Nu este autorizata nicio modificare in structura, compozitia reactivilor sau in procedura de lucru precum si nicio utilizare a reactivilor in combinatie cu alte produse ce nu sunt aprobate de producator; utilizatorul este strict raspunzator pentru orice astfel de modificare. In cazul nerespectarii acestor reguli, producatorul nu este raspunzator pentru generarea de rezultate false. De asemena, producatorul nu este raspunzator de raportarea rezultatelor in urma unei analize vizuale. Reactivii sunt destinati exclusiv diagnosticului invitro. Toate componentele de origine umana utilizate pentru producerea reactivilor acestei truse au fost testate si sau dovedit a fi negative pentru: Anticorpi antihiv, antihcv si pentru antigen HBs. Cu toate acestea, toate materialele trebuie considerate si manevrate ca fiind potential infectante. Nu se vor combina reactivi sau godeuri din loturi diferite. Nu se vor utiliza reactivi produsi de alta firma in combinatie cu reactivii acestei truse. Nu se vor utiliza reactivi ce au depasit termenul de valabilitate. Se vor folosi exclusiv varfuri curate si instrumentar de laborator curat. Nu se vor schimba intre ele capacele recipientilor de reactivi pentru a se evita contaminarea incrucisata. Recipientele de reactivi trebuie bine inchise dupa utilizare pentru a se evita evaporarea sau contaminarea microbiana a reactivului. Dupa desigilare si depozitarea ulterioara, conjugatul si controalele trebuie verificate pentru a nu fi contaminate bacterian inainte de utilizare. Pentru a evita contaminarea incrucisata si aparitia de rezultate false atat probele pacientilor cat si reactivii trebuie pipetate cu atentie direct pe fundul godeului, fara stropiri accidentale. Trusa ELISA este destinata utilizarii doar de catre personal specializat si familiarizat cu regulile de buna practica in laboratorul medical. 12.1 CONDITII DE ELIMINARE A DESEURILOR Reziduurile de substante chimice sunt considerate deseuri periculoase. Aruncarea acestor deseuri se face dupa reglementarile nationale. Contactati autoritatile locale pentru sfaturi cu privire la aruncarea acestor deseuri. ATENTIE: Acidul sulfuric irita pielea si ochii. Este interzis accesul copiilor la aceste substante. In cazul contactului cu ochii sau pielea, se va clati din abundenta cu apa si se va consulta un medic in cel mai scurt timp!!! ATENTIE: In concentratia folosita, Bronidox L nu prezinta un risc toxicologic ridicat in contact cu pielea sau cu mucoasele!!! 4

SCHEMA DE LUCRU Virusul Herpes simplex tip2 (HSV 2) IgG Pregatirea testului Se pregatesc reactivii si probele asa cum sa descris mai sus. Se realizeaza planul de distribuire si identificare a controalelor si a probelor pe schema continuta in trusa. Se selectateaza numarul de godeuri necesare testului si se plaseaza pe placasuport. Procedura de lucru Substrat bank (A1) Control Negativ Control Pozitiv Control CutOff Probe (dilutie 1+100) Control Negativ Control Pozitiv Control CutOff Probe (dilutie 1+100) Godeurile se acopera cu folie de aluminiu. Incubare 1 ora la 37 C. Spalare 3x cu solutie de spalare, vol. 300 µl. Conjugat Godeurile se acopera cu folie de aluminiu. Incubare 30 min la temperatura camerei. Spalare 3x cu solutie de spalare, vol. 300 µl. Substrat TMB Incubare pentru exact 15 min la temperatura camerei. Stop Solution Masurarea fotometrica la 450 nm (620nm referinta) Rev: AO 03.2015 VT9.09.2011 SC Tody Laboratories INT. SRL Adresa: Str. Vadul Moldovei, nr 22, Sector 1, Bucuresti, Romania Tel.: +4021 269 00 00 Fax: +4021 269 06 41 www.todylaboratories.com 5