TSH ELISA. .D D S. DIAGNOSTIC Str. Vatra Luminoasa, nr. 45, sect. 2, Bucuresti telefon: , fax: ,

Transcript

1 .D D S. DIAGNOSTIC Str. Vatra Luminoasa, nr. 45, sect. 2, Bucuresti telefon: , fax: , office@ddsdiagnostic.ro Manual de utilizare TSH ELISA Determinarea imunoenzimatica directa a tireotropinei (TSH) din ser uman Varianta teste LOT TSH018 var

2 CUPRINS Scopul 3 1 Semnificatia clinica 3 2 Principiu 4 3 Componente trusa 4 4 Materiale necesare neincluse in trusa 4 5 Preparare reactivi 5 6 Conditii de pastrare 5 7 Proba biologica 5 8 Precautii 5 9 Procedura de lucru 6 10 Controlul de calitate 8 11 Calculul rezultatelor 8 12 Exemplu de curba standard 8 13 Valori asteptate 9 14 Performante si caracteristici 9 15 Managementul deseurilor Bibliografie Schema analizei 12 2

3 Tireotropina hormon de stimulare tiroidiana (TSH) Determinarea imunoenzimatica directa a tireotropinei (TSH) din ser uman SCOPUL Acest kit se utilizeaza pentru determinarea cantitativa prin metoda imunoenzimatica, colorimetrica (ELISA) a TSH din ser. 1. SEMNIFICATIA CLINICA Sinteza si secretia de hormoni tiroidieni se afla sub controlul unui sistem de feedback negativ la care participa tireotropina hipofizara (TSH), hormonul hipotalamic eliberator de tireotropina (TRH) si hormonii tiroidieni circulanti (T3 si T4). Sinteza si secretia de TRH este controlata de centri nervosi din creier prin intermediul hormonilor tiroidieni din plasma. Nivele scazute de T3 stimuleaza formarea de TRH care la randul sau determina sinteza si secretia de TSH. TSH actioneaza asupra tiroidei activand secretia de hormoni tiroidieni in sange. Cresterea nivelului plasmatic al hormonilor tiroidieni provoaca o actiune inhibitore la nivelul hipotalamusului si reduce secretia de TSH. Aceasta ultima actiune pare a fi mediate de somatostatina. T3 si T4 stimuleaza sinteza de stomatostatina care, la randul ei, inhiba eliberarea de TSH. TSH este o glicoproteina cu structura dimerica α, β. Subunitatea α din structura TSH se prezinta sub forma unui lant polipeptidic care se regaseste identic si la alti hormoni hipofizari glicoproteici: FSH (hormon de stimulare foliculara), LH (hormon luteinizant) si hcg (human chorionic gonadotropin). Subunitatea β difera de la un hormon la altul. Aceasta similaritate structurala poate conduce foarte usor la reactii incrucisate cu anumite antiseruri policlonale TSH. In aceasta trusa au fost utilizati anticorpi monoclonali, pentru a elimina reactiile incrucisate, respectiv valori fals crescute ale concentratiei TSH. Determinarea concentratiei TSH in ser este importanta pentru diagnosticarea hiper/hipotiroidismului, interpretarea rezultatelor realizandu-se si in functie de nivelul concentratiei hormonilor T3 si T4. De exemplu, valori crescute ale TSH si T3, T4, pot indica disfunctii ale hipotalamusului si hipofizei. In acest caz, cresterea concentratiei TSH este de multe ori produsa de un adenom de hipofiza. Valori scazute ale TSH corelate cu valori scazute ale T3 si T4 indica o functie scazuta a hipofizei. Daca exista simptome clare de hipotiroidism, dar nivelul de TSH nu este crescut se suspecteaza un hipotiroidism secundar in cadrul unui hipopituitarism. Valori scazute de TSH se intalnesc in hipertiroidism. Dozarea TSH este utila si in monitorizarea tratamentului la pacientii hipotiroidieni: valori scazute se intalnesc in cazul dozelor excesive de hormoni tiroidieni de substitutie. Valorile normale de TSH indica un tratament echilibrat. 3

4 2. PRINCIPIUL TESTULUI Metoda consta in formarea unui complex sandwich antigen-anticorp, astfel: in godeurile placii ELISA acoperite cu anticorp anti-tsh, se introduce proba (ser, controale, calibratori) care contine antigenul nativ TSH. Se adauga solutia conjugat care contine anticorp anti-tsh marcat cu peroxidaza din hrean (HRP). Are loc imunoreactia dintre anticorpii anti-tsh (din placa si din conjugatul enzimatic) si antigenul nativ TSH (din proba), reactie necompetitiva si fara impiedicare sterica, cu formarea unui complex solubil sandwich antigen-anticorp. Dupa incubare, godeurile sunt spalate cu solutie de spalare pentru indepartarea fractiei de anticorp nelegat. Se adauga o solutie substrat de TMB, se incubeaza si se obtine o coloratie albastra. Reactia este oprita prin adaugarea solutiei de stopare, cand are loc virarea culorii de la albastru la galben. Concentratia de TSH este direct proportionala cu intensitatea culorii dezvoltate. Absorbanta este masurata cu spectrofotometru la 450 nm cu referinta nm pentru minimizarea imperfectiunilor godeurilor. 3. COMPONENTE KIT 3.1 Placa ELISA: 1 x 96 godeuri acoperite cu anticorp anti-tsh, ambalate in folie de aluminiu. Dupa deschidere, placa se poate pastra la 2-8ºC pana la data de expirare a trusei. 3.2 Standarde TSH: 6 flacoane, S0 x S5 1ml/flacon. Concentratii: 0 ; 0,5 ; 2 ; 5 ; 10 si 20 µiu/ml. Nota: Dupa deschidere, standardele se pot pastra pana la 2 luni la C in flacoane bine inchise Control 1: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 ml apa distilata. Control 2: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 ml apa distilata. Concentratiile exacte sunt trecute pe flacon si in Certificatul de analiza. Dupa reconstituire, controlele se pot pastra pana la 2 luni la C, in flacoane bine inchise. 3.3 Solutie conjugat: 1 flacon x 6 ml, culoare rosie. Contine anticorp anti-tsh (in tampon Tris-NaCl) conjugat cu HRP. Contine conservanti: Proclin 300 0,1 %; sulfat de gentamicina 0,004 %. Nota. Dupa deschidere, solutia conjugat se poate pastra pana la 2 luni la C la intuneric, in flacon bine inchis. 3.4 Solutie substrat-tmb: 1 flacon x 12 ml, culoare roz. Contine tetrametilbenzidina in solutie tampon de acid citric si H2O2. Nota. Dupa deschidere, solutia substrat se poate pastra pana la 2 luni la C la intuneric, in flacon bine inchis. 3.5 Solutie de stopare: 1 flacon x 7,5 ml. Contine acid sulfuric 0.2 M. 4

5 Nota. Dupa deschidere, solutia substrat se poate pastra pana la 2 luni la C la intuneric, in flacon bine inchis. 3.6 Solutie de spalare concentrata (de 40X): 1 flacon x 25 ml. Contine tampon fosfat (PBS) cu Tween. Nota. Dupa deschidere se pastreaza asa cum este specificat la punctul MATERIALE NECESARE NEINCLUSE IN KIT 4.1. Apa distilata 4.2. Pipete automate cu volum reglabil 4.3. Incubator de microplaci 4.4. Spalator automat pentru sistem ELISA 4.5. Cititor ELISA cu filtru pentru lungime de unda 450 nm si referinta nm Hartie de filtru/absorbanta 4.7. Cronometru 4.8. Materiale control de calitate 5. PREPARARE REACTIVI 5.1. Standardele sunt gata de lucru Solutia de spalare: Se dilueaza continutul solutiei de spalare cu apa deionizata sau distilata in raport 1 volum solutie de spalare concentrata + 39 volume apa (ex. 25 ml solutie spalare concentrata cu 975 ml apa deionizata/distilata). Solutia preparata se poate pastra timp de 2 luni la temperatura camerei. Solutia concentrata dupa deschidere este stabila pana la data de expirare a trusei. 5.3 Preparare controale incluse in trusa. Se adauga 1 ml de apa distilata, se omogenizeaza usor si se lasa sa se dizolve 30 minute. 5.4 Se seteaza incubatorul la temperatura de 37 0 C. 6. CONDITII DE PASTRARE Toate componentele trusei se pastreaza la 2-8 o C. Nu se utilizeaza dupa data de expirare. Reactivii sunt stabili timp de 2 luni dupa deschiderea trusei, daca sunt pastrati la 2-8 o C si la intuneric. Placa este stabila dupa deschidere, pana la data de expirare a trusei. 5

6 Ambalajul placii ELISA se deschide NUMAI dupa ce a ajuns la temperatura camerei, se scoate numarul de godeuri necesar, dupa care se reambaleaza IMEDIAT si se introduce la frigider. Godeurile se lucreaza IMEDIAT. 7. PROBA BIOLOGICA Recoltarea de probe de sange se implementeaza in acord cu practicile curente. Proba folosita poate fi doar ser. Separarea serului se face cat mai rapid dupa recoltare pentru a evita hemoliza, care poate afecta performantele testului. Fibrina din probe poate da rezultate fals positive. Probele de ser pot fi pastrate la temperatura camerei ( C) nu mai mult de 8 ore, la 2-8 o C nu mai mult de 7 zile sau la -20 o C pana la 30 zile. Probele de ser cu concentratii mai mari dacat standardul de 20 µiu/ml trebuie diluate 1:2 cu standard 0. Rezultatul probei se calculeaza inmultind cu factorul de dilutie. Atentie! Serul decongelat se lucreaza imediat si NU se recongeleaza! Folosirea probelor hemolizate, lipemice precum si cele cu fibrina pot da rezultate false. 8. PRECAUTII 8.1 Trusa se utilizeaza NUMAI pentru diagnostic in vitro in laboratoare medicale si NUMAI de catre personal specializat. 8.2 Pentru informatii privind substantele chimice si componentele biologice din trusa va rugam sa solicitati Fisa Tehnica de Securitate. 8.3 Toti reactivii din trusa care contin ser/plasma umane au fost testate si gasiti non reactivi pentru HBsAg, HIV1/2 si anticorpi HCV. Cu toate acestea se recomanda utilizarea lor ca si cum ar fi potential infectate Evitati ca Solutia de stopare sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine acid sulfuric 0,2 M), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact accidental se recomanda spalarea zonei cu cantitati mari de apa si neutralizarea cu solutie diluata de bicarbonat de sodiu. Se va solicita consult medical. 8.5 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine tetrametilbenzidina si peroxid), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact accidental se recomanda spalarea zonei cu cantitati mari de apa. Se va solicita consult medical. 8.6 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu lumina directa, metale sau oxidanti. 8.7 Nu se va pipeta cu gura. 8.8 Nu se mananca, bea sau fumeaza in zona de lucru. 8.9 Este obligatorie purtarea echipamentului de protectie: halat, manusi latex. Contaminarea microbiana a reactivilor si a probelor poate conduce la rezultate false. 6

7 8.10 Manipularea reactivilor si a probelor, precum si indepartarea reziduurilor se va face respectand legislatia nationala in vigoare Pentru a obtine rezultate optime se recomanda respectarea protocolului de lucru, precum si calibrarea pipetelor si a cititorului Este interzisa utilizarea componentelor kit-urilor de la loturi diferite A nu se lasa godeurile sa se usuce dupa spalare pana la adaugarea solutiei substrat Etapa de spalare a godeurilor este o etapa importanta de aceea se impune respectarea numarului de cicluri de spalare si asigurarea ca in timpul spalarii godeurile sunt complet umplute cu solutie de spalare si apoi complet golite. O spalare incorecta poate conduce la rezultate false A fost demonstrat efectul heparinei (atat in vivo cat si in vitro) asupra concentratiei de TSH. De aceea probele nu vor fi recoltate in prezenta acestui anticoagulant Trusa NU se va folosi pentru screening-ul noilor nascuti. 9. PROCEDURA DE LUCRU 9.1 Instructiuni generale: Reactiile imunoenzimatice sunt puternic influentate de temperatura si timpul de reactie. Reactivii, materialele de control trebuie sa fie la temperatura camerei inainte de inceperea testului; Pentru a evita contaminarea se vor folosi varfuri de pipeta separate pentru fiecare standard, control, proba. Se vor respecta cu strictete timpul si temperatura de incubare. Testul odata inceput, nu poate fi intrerupt. Asigurati-va ca aveti pregatiti toti reactivii si consumabilele necesare, precum si aparatura. Se recomanda ca standardele, controalele si probele sa se lucreze in duplicat. Pentru fiecare set de probe lucrate se recomanda sa se realizeze curba de calibrare. 9.2 Modul de lucru: 1. Se scoate numarul de godeuri necesar din ambalaj. Godeurile care nu se utilizeaza, se introduc in folia aluminizata (cu desicator), apoi in punga de plastic cu fermoar si se inchide bine. 2. Se pipeteaza 50 µl din fiecare standard, control si proba (cu varf nou) in godeul corespunzator. Pipetarea probelor nu trebuie sa depaseasca zece minute pentru evitarea erorilor de procedura. 7

8 3. Se pipeteaza 50 µl solutie conjugat in fiecare godeu. Se roteste placuta cu grija, timp de 30 sec. pentru omogenizare si se acopera godeurile cu folie sau o bucata de hartie. 4. Se incubeaza 60 minute la 37 o C. 5. Se indeparteaza tot continutul godeurilor, prin aspirare. 6. Se spala godeurile de 5 ori cu 350 µl solutie de spalare diluata. Se preseaza energic placuta cu godeurile in jos pe o hartie absorbanta de 2-3 ori, pentru a indeparta cat mai bine picaturile de lichid ramase dupa spalare. Nu se lasa godeurile sa se usuce intre etapa de spalare si adaugarea solutiei substrat. Atentie! Etapa de spalare si indepartare a lichidului din godeuri este esentiala in obtinerea unor rezultate corecte! 7. Se adauga 100 µl solutie substrat TMB in fiecare godeu. 8. Se acopera godeurile si se incubeaza 20 minute la temperatura camerei (22-28 o C), la intuneric. Nota: Sa nu se agita microplaca dupa pipetarea substratului. 9. Se adauga 50 µl solutie de stopare in fiecare godeu. 10. Se roteste usor 30 sec. pentru omogenizare. 11. Se citeste densitatea optica (OD) la 450 nm cu referinta nm pentru minimizarea imperfectiunilor godeurilor. Citirea trebuie sa se efectueze in maxim 15 minute de la adaugarea solutiei de stopare. Atentie! Atat la pipetare cat si la manipularea godeurilor se evita atingerea partii inferioare atat pe interior cat si pe exterior! Pipetarea reactivilor trebuie facuta in aceeasi ordine a godeuri. 10. CONTROLUL DE CALITATE Pentru validarea rezultatelor se recomanda ca fiecare laborator sa utilizeze probe de control, cu valori cunoscute, pentru nivel normal si patologic. Probele de control vor fi lucrate ca si probele de pacient cu valori necunoscute. Pentru a urmari performantele metodei, valorile controalelor se vor inregistra si interpreta statistic. Daca valorile controalelor nu se incadreaza in limitele acceptabile stabilite de laborator, va rugam sa verificati urmatoarele: modul si timpul de pipetare, modul de spalare, conditiile de incubare, modul de pastrare si data de expirare a reactivilor. 8

9 11. CALCULUL REZULTATELOR 11.1 Se calculeaza media absorbantelor pentru standarde, controale si probe (daca s-au lucrat in duplicat). Se scade din media absorbantelor standardelor, controalelor si probelor, media absorbantelor blank-ului Se realizeaza curba de calibrare astfel: pe axa Y (verticala) se inregistreaza absorbanta, iar pe axa X (orizontala) se inregistreaza concentratia. Se reprezinta grafic valorile standardelor absorbanta functie de concentratie, obtinandu-se astfel, o curba. Valoarea absorbantei probei (ser) se extrapoleaza pe curba de calibrare, aflandu-se astfel, valoarea concentratiei probei. Valorile se pot obtine automat cu ajutorul soft-ului cititorului de placi ELISA, se recomanda pentru analizele de imunologie, de exemplu, utilizarea tipului de curba 4PL (Four Parameters Logistic) Concentratia probelor se poate obtine direct de pe curba de calibrare. Pentru probele cu concentratii mai mari decat concentratia celui mai mare standard, se recomanda diluarea acestor probe cu standard S0. Pentru calculul concentratiilor probelor diluate se va tine cont de factorul de dilutie. 12. EXEMPLU DE CURBA STANDARD Absorbanta fiecarui standard citita la lungimea de unda de 450 nm cu referinta nm este reprezentata pe axa Y în functie de concentratia reprezentata pe axa X. Aceasta curba standard este doar un exemplu si nu trebuie folosit pentru a calcula concentratiile probelor necunoscute. Fiecare laborator trebuie sa-si foloseasca propriile rezultate obtinute si curba standard proprie. TSH (µiu/ml) Absorbanta (450 nm cu ref. 630 nm) 0 0,018 0,5 0, , , , , VALORI ASTEPTATE. Un studiu efectuat pe un lot de 140 persoane clinic sanatoase la momentul testarii, a condus la obtinerea urmatoarelor valori (pentru metoda ELISA): Grup Interval (µiu/ml) Adulti 0,4 5,5 9

10 Se recomanda ca fiecare laborator sa isi stabileasca propriul domeniu de valori normale, in functie de populatie. 14. PERFORMANTE SI CARACTERISTICI a. Precizia Variatia intra-serie S-a determinat prin masurarea concentratiei de TSH in replicat (20x) utilizand 2 seruri de control pe nivele diferite intr-o singura analiza. Control n Concentratia medie (miu/ml) CV (%) ,96 5, ,59 6,8 Variatia inter-serie S-a determinat prin masurarea concentratiei de TSH in replicat (10x) utilizand 2 seruri de control si trei loturi diferite de reactivi, testate o data pe zi timp de 20 zile. Control n Concentratia medie (miu/ml) CV% ,21 4, ,02 5,18 b. Sensibilitatea. Determinarea sensibilitatii s-a realizat prin utilizarea standardului zero (S0) in replicat (20X) in cadrul aceleiasi analize. Concentratia minima de TSH detectata a fost de 0,01 µiu/ml. c. Specificitatea anticorpilor (Reactivitatea incrucisata). Reactivitatea incrucisata a anticorpilor tireotropina este prezentata in tabelul urmator: 10

11 Substanta Reactivitate incrucisata, % TSH 100 % hcg 0 % hgh 0 % LH 0,021 % FSH 0,014 % d. Corelarea cu alte metode Trusa a fost comparata cu Roche Cobas TSH folosind probe de la 121 pacienti. Corelarea s-a realizat prin metoda regresiei liniare: y = x cu un coeficient de corelare de 0, MANAGEMENTUL DESEURILOR Reactivii si deseurile trebuie utilizate si eliminate din circuitul laboratorului conform normelor legislative in vigoare. 16. BIBLIOGRAFIE 1. Dinu V., Trutia E., Cristea-Popa E., Popescu A., Biochimie Medicala Mic tratat, Ed. Medicala, Analize de laborator si alte explorari diagnostice, Ed. MedicArt, Cucuianu, M., Crisnic I., Plesca-Manea L., Biochimie Clinica, Ed. Dacia,

12 SCHEMA ANALIZEI TSH Pregatirea testului Pregatirea reactivilor si probelor conform procedurii descrise. Selectarea numarului de godeuri si inserarea lor în suportul special destinat. Procedura de lucru Standard Control Proba 0-5 Standard 50 µl Control - 50 µl - Proba µl Solutie conjugat 50 µl 50 µl 50 µl Se agita usor placa 30 secunde pentru omogenizare. Se acopera godeurile cu folie. Se incubeaza 60 min. la 37 0 C. Se spală de 5 ori cu 350 µl de solutie de spalare preparata ca la punctul 5.2. Standard Control Proba 0-5 Substrat 100 µl 100 µl 100 µl TMB Se acopera godeurile. Se incubeaza 20 minute la temperatura camerei C, la intuneric. Standard Control Proba 0-5 Solutie stopare 50 µl 50 µl 50 µl Se agita usor placa 30 secunde pentru amestecarea completa a solutiilor. Se citeste absorbanta solutiei din godeuri la 450 nm cu referinta nm, in maxim 15 minute de la stoparea reactiei, cu un spectrofotometru de microplaci. 12