Interactii moleculare generatoare de chiralitate evidentiate prin corelarea datelor de dicroism circular indus cu calcule cuantice -RAPORT STIINTIFIC AL ETAPEI - INTRODUCERE Dicroismul circular indus (DCI) isi poate avea originea fie in modificarea geometriei moleculei achirale care devine, astfel, chirala, fie in interactia intre momentele de tranzitie magnetic si electric ale celor doua molecule care interactioneaza si inducerea unei puteri rotatorii nenule pentru molecula chirala []. Spectrul de dicroism circular este sensibil la modificarile de mediu, de geometrie si de densitate electronica, avind drept caracteristica, pe linga pozitia si intensitatea benzii, semnul acesteia. In acest fel, moleculele achirale pot deveni un senzor al interactiilor necovalente. Rezultate preliminare [,] au aratat ca, prin corelarea datelor experimentale cu cele teoretice, se pot estima atit specia care interactioneaza, cit si modificarile conformationale care au loc. Totusi, este necesar un studiu mai aprofundat al modului in care cele doua mecanisme de generare a unui semnal DCI se combina si care este rezultatul asupra spectrului experimental. METODE EXPERIMENTALE SI TEORETICE Spectrele de dicroism circular si absorbtie au fost inregistrate cu un spectropolarimetru V6 Jasco. S-a lucrat pe banda ligandului achiral, urmarindu-se aparitia semnalului dicroic indus al acestuia prin interactia cu un mediu chiral. Pentru fiecare pereche ligand achiral-mediu chiral studiata au fost selectate conditiile optime de lucru. Calculele cuantice in vid si in solvent au fost efectuate cu programul Gaussian9, folosind metoda DFT cu o functionala BLYP si o baza de orbitali atomici 6-G(d,p). Solvatarea a fost tratata in cadrul modelului PCM. REZULTATE SI DISCUTII Obiectivele propuse in aceasta etapa au fost: O.. Implementarea si optimizarea metodei pe sisteme model O.. Studiul unor interactii necovalente in complecsi bimoleculari O.. Studiul interactiilor chirale in medii anizotrope (partea I - ciclodextrine) In acest scop s-au studiat urmatoarele aspecte: Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru sisteme simple (model) si complecsii lor bimoleculari de tipul molecula chirala- molecula achirala in diferite rapoarte molare. Compusii chirali utilizati au fost: S-(+)--butilamina, D-luciferina, acidul S-(+)--izobutil-α-metil-fenilacetic, bromura de (-)-N-dodecil-N-metilefedriniu, β-ciclodextrina (β-cd) si β-ciclodextrina modificata cu fragmente izopropil (-HP- β-cd). Compusii achirali au fost derivati de cumarina, p-nitrozodimetilanilina, kaempferol. Un caz aparte il constituie moleculele achirale ce prezinta benzi electronice n-π*, interzise in spectrul de absorbtie, dar care pot fi permise in spectrul DCI. O a treia categorie de interes sint amestecurile racemice, anume bilirubina (BLB) si amestec racemic de R- si S-warfarina. Sistemele binare susceptibile de a forma complecsi prin interactii necovalente au fost monitorizate prin spectroscopie DC si, ca o metoda de control, ce poate evidentia formarea de complecsi, spectroscopia Raman. Sensibilitatea spectrului DC la conformatia adoptata in urma interactiei il recomanda ca o metoda de studiu al modificarilor conformationale []. Problema se complica in cazul sistemelor labile, care pot adopta mai multe conformatii, iar spectrul experimental este o medie a spectrelor acestora. Dezavantajul este necesitatea unor calcule laborioase pentru simularea spectrului. Pentru exemplificare, am considerat un sistem foarte simplu acetona-s-(+)-- butanol, in care acetona are tendinta de a accepta protoni in legaturi de H, iar butanolul de a ceda. Prin optimizarea geometriei de echilibru a complexului, am identificat doua conformatii la energii cvasiegale cu spectre foarte diferite (Figura a), in care semnul benzilor nu este acelasi. Cautarea conformationala nu a fost exhaustiva. Dar de aici rezulta, pe de o parte, ca semnul benzii DCI nu este intotdeauna acelasi cu cel al componentului chiral care il induce, iar pe de alta parte ca o abordare riguroasa a simularii acestor spectre ar implica luarea in considerare a dinamicii sistemului studiat prin dinamica moleculara. Nu in ultimul rind, moleculele de solvent pot juca si ele un rol, astfel ca solvatarea ar trebui considerata explicit.
R / - erg esu cm/gauss BLB M BLB M-S-butilamina : BLB M-S-butilamina : BLB M-R-butilamina : - /nm a) b) Figura. Spectre DC simulate ale complecsilor acetona-r-butanol (a), BLB-butilamina (b). Interactia S-(+)--butilaminei cu derivati achirali ai -carboxicumarinei. In cazul interactiei S-(+)--butilaminei cu mai multi derivati achirali ai -carboxicumarinei, in functie de aciditatea acestora, sunt in principiu posibile cazuri: inexistenta unei interactii, formarea unui complex bimolecular cu legatura de hidrogen, formarea unei perechi de ioni liberi in solutie prin transfer de proton. Incadrarea intr-o categorie sau alta este guvernata de marimea energiei libere a procesului de transfer de proton. Considerind structurile celor doi parteneri, aparitia unui semnal dicroic indus in spectrul derivatului carboxicumarinic ar trebui sa aiba loc numai in cel de-al doilea caz (formare de complex). Derivatii studiati au urmatoarele valori ale pka: acid carboxi,6- benzocumarinic (),., acid -carboxicumarinic (),., acid 7-dimetilamino--carboxicumarinic (),.6, acid 7- metoxi--carboxicumarinic (),.98. Dupa cum se observa din Figura, comportamentul compusilor studiati in prezenta moleculei chirale este diferit, in functie si de polaritatea solventului in care are loc interactia. Daca prezinta un semnal indus in ACN, si in hexan si ACN, il prezinta numai in hexan. Un caz special il constituie, ale carui spectre in ACN si hexan se prezinta ca imagine in oglinda, cu doua benzi de tip excitonic, desi compusul nu prezinta in molecula doi cromofori identici. Acest lucru nu a putut fi explicat deocamdata. - - - - a) in ACN 6 - - b) in hexan c) in ACN 7 7 - - - - - d) in hexan e) in ACN f) in hexan Figura. Spectre experimentale DCI. [amina]= - M; gri: ligand; negru: ligand+amina
Energia libera a procesului de transfer de proton depinde de energia de protonare/deprotonare a celor doi componenti, de taria legaturii de hidrogen care se formeaza si de polaritatea solventului. Cu cit aciditatea derivatilor de cumarina creste, energia libera devine mai negativa, favorizind procesul de transfer de proton. Pentru formare de complecsi, transferul de proton trebuie sa fie reversibil. Aceasta se poate asigura modificind polaritatea solventului. Simularea spectrelor de DC ale complecsilor permite aprofundarea modului de interactie intre cei doi componenti si felul in care aceasta influenteaza tranzitiile electronice si puterea rotatorie, conducind uneori la concluzii surprinzatoare. Spectrul DC simulat al complexului bimolecular format de compusul cu butilamina coreleaza ca lungime de unda a benzilor si intensitate cu spectrul experimental (Figura a). Geometria optimizata a complexului care corespunde acestui spectru indica formarea unei legaturi de H (. A). In acest mod, pe baza corelarii dintre spectrul experimental si cel simulat pentru mai multe geometrii posibile ale complexului, se poate atribui geometria reala in solutie, in diferite medii, intr-un mod similar atribuirii configuratiei absolute [ ]. Spectrul simulat al compusului in prezenta butilaminei in hexan (Figura b) prezinta benzi in domeniul nm, nm (+); nm (-); 9 nm (+), care coreleaza ca pozitie si semn cu datele experimentale: 66 nm (+); 8 nm (-); 88 nm (+). a) b) Figura. a) Spectrul simulat si experimental in ACN al complexului butilaminei cu si geometria complexului; b) spectrul simulat al compusului (gri) si al complexului lui cu amina (negru) in hexan. Pentru a avea inca o dovada experimentala a formarii complexului, au fost efectuate masuratori de spectroscopie Raman pentru compusii separati si pentru complex (Figura pentru interactia - amina). Spectroscopia Raman evidentiaza efectul interactiei bimoleculare la nivel local, al gruparilor functionale. De asemeni, constituie o metoda de validare a geometriei de echilibru determinata prin calcule cuantice, pentru care se simuleaza si spectrul Raman. Analiza spectrelor a presupus identificarea benzilor compusului care isi modifica pozitia/intensitatea in urma complexarii si care sunt situate in regiuni spectrale in care amina nu prezinta benzi. Aceste benzi sunt indicate in Figura, alaturi de atribuirea vibratiilor corespunzatoare, facuta pe baza unui calcul DFT. Modificarile observate arata in mod clar formarea complexului, remarcandu-se fapul ca fragmentele afectate de complexare sunt carboxilul si carbonilul. 7 7 6 69 6 79 CCA-BuNH Banda Atribuire (cm- ) 77 ν C=Ocarbox 68 ν C=Ocetona 6 ν C-Ocarbox, δ C-H 67 δ C=Ocetona, δ C=C 97 δ O=C-O, δ C=C 6 δ C=C in afara planului 6 BuNH 77 68 97 67 6 CCA 8 6 8 6 (cm - ) Figura. Spectre Raman ale compusului, aminei si complexului bimolecular.
CD (mdeg) CD (mdeg) CD (mdeg) Interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca amestec racemic. Un alt aspect studiat a fost interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca amestec racemic. Un astfel de compus este bilirubina (BLB), ai carei enantiomeri sunt notati P si M. Spectrul lor ECD se prezinta ca obiect si imagine in oglinda, cu doua benzi excitonice, de intensitati aproximativ egale, dar semne diferite, pozitiv-negativ pentru P. Ele au fost evidentiate in interactie cu albuminele serice []. In prezenta S-(+)-sec-butilaminei este indus un semnal dicroic de diferite forme, in functie de mediu. In DCM si DMSO semnalul prezinta doua benzi excitonice negativ-pozitiv centrate la maximul de absorbtie ( nm), caracteristice conformerului M, in DMSO, in prezenta de SDS, o singura banda pozitiva la nm, ca in Figura a, b. Un caz special il constituie interactia cu o micela chirala, care presupune probabil doua etape, in functie de concentratia de BLB (Figura, c), deoarece forma spectrului se modifica. Simularea spectrului DC al conformerilor P si M ai BLB in interactie cu S-(+)-sec-butilamina (: si :) arata doua benzi excitonice la si nm (in vacuo), care se regasesc si in spectrul simulat al conformerilor izolati (Figura b). Chiar in interactie cu R-(-)-sec-butilamina, forma spectrului si semnul benzilor se pastreaza practic nemodificata. Acest fapt pare sa indice ca aparitia benzilor in spectrul BLB in prezenta unor molecule chirale se datoreaza inducerii unui exces enantiomeric. [BLB] =.7 * M [BLB]=9.7* M 6 M M 6 M 8 M M [BLB]= M - - - - - - [BLB]=.7* M 6 [BLB] (M) -6 a) b) c) Figura. Spectre de dicroism circular ale BLB in DCM (a); DMSO in prezenta de SDS (b); micele chirale (c). Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru compusi achirali inclusi in cavitatea chirala a cilcodextrinelor Derivati de fenoxatiina Includerea,-dioxid-fenoxatinei si a -brommetil-,-dioxid-fenoxatinei in cavitatea -, -, - si - hidroxipropil- -ciclodextrinei a fost evidentiata prin masuratori de dicroism circular [6]. Desi cei doi derivati de fenoxatiina au elemente de chiralitate, si anume miscarea de flip-flap a ciclului si rotatia gruparii CH Br, experimental acestia nu prezinta semnal dicroic. In schimb, in prezenta ciclodextrinei s-a observat apariatia unui semnal de dicroism circular indus (Figura 6). Din dependenta acestuia in functie de concentratia de ciclodextrina s-a gasit ca stoechiometria complecsilor formati este de :, constantele de legare fiind cuprinse intre 8 M -, in functie de tipul ciclodextrinei. Lipsa semnalului dicroic in absenta ciclodextrinelor a fost explicata prin calcule DFT-TDDFT, care au aratat ca desi o anumita conformatie poate avea semnal dicroic (Figura 6 c), bariera de rotatie, respectiv bariera miscarii de flip-flap fiind foarte mica (. kcal/mol), semnalul dicroic se mediaza pentru toti conformerii existenti in solutie. Totodata, calculele TDDFT au permis calcularea directiilor momentelor de tranzitie care au fost corelate cu semnul benzilor de dicroism si au indicat, conform regulilor empirice Harata-Kodaka, ca includerea in cavitatea ciclodextrinelor s-a facut axial. Compusi din clasa flavonoidelor-kaempferolul Interactia kaempferolului cu β-cd conduce la aparitia unor benzi de dicroism circular, ca in Figura 6 b), a caror pozitie si semn coreleaza cu spectrul simulat pentru o geometrie plana a formei neutre a acestei molecule (Figura 6 d). in acest caz se poate atribui, pe linga conformatia ligandului in complex, si specia care este inclusa in cavitate, anume specia neutra, desi s-a lucrat la ph=7., iar pka pentru kaempferol este 7..
- [kaemp]=x - M etoh:pbs : [kaemp]=x - M etoh:pbs :; [ -CD]=.x - M a) b) c) d) Figura 6. Spectre DCI ale,-dioxid-fenoxatiinei (a) si kaempferolului (b) in prezenta ciclodextrinei si spectre DC simulate (c) si, respectiv (d). CONCLUZII O.. (A..., A..., A...) In aceasta etapa s-au studiat interactii chirale ale unor molecule relativ simple si s-a confirmat faptul ca dicroismul circular si spectroscopia Raman aduc informatii complementare in ceea ce priveste acest tip de interactii. Corelarea datelor experimentale de dicroism circular indus cu cele teoretice permite determinarea geometriei complexului si a modului de interactie, pe linga constantele de legare si stoechiometrie. Spectroscopia Raman completeaza imaginea prin informatii asupra modificarilor la nivelul gruparilor functionale. O.. (A..., A..., A..., A...) S-au evidentiat interactii chirale in sisteme bimoleculare molecula chirala-molecula achirala, micela chiralamolecula achirala, molecula chirala-amestec racemic. Derivatii de cumarina interactioneaza cu S-sec-butilamina prin formare de legaturi de H. S-sec-butilamina si micelele chirale determina aparitia unui exces enantiomeric pentru BLB. O.. (A..., A..., A...) In cazul complecsilor de incluziune cu ciclodextrinele, pe linga determinarea constantelor de legare si a stoechiometriei, aspectul cel mai important este estimarea, prin corelare spectru DCI experimental-simulat, a speciei incluse si a conformatiei ligandului. Din rezultatele acestei faze s-au publicat/acceptat pina in prezent articole: ref. si 6. BIBLIOGRAFIE. Nina Berova, Prasad L. Polavarapu, Koji Nakanishi, Robert W. Woody, Eds. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy, JOHN WILEY & SONS, INC., New Jersey,.. I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, J. Molec. Model. 8:8 87 ().. I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, Spectrochim. Acta A. 96 79 7 (). Sorana Ionescu, Iulia Matei, Cristina Tablet and Mihaela Hillebrand, Curr. Drug Metab., acceptat.. Marco Pistolozzi, Carlo Bertucci, Chirality, 8 (8). 6. R. Sandu, C. Tablet, M. Hillebrand, J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem.,, DOI.7/s87---7.