Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΞΩΓΕΝΟΥΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΩΝ ΤΟΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Α ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθ. Γ. Καρακιουλάκης ΑΚΑΔ. ΕΤΟΣ 2012-13 Αριθμ. 2826 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΞΩΓΕΝΟΥΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΣΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΩΝ ΤΟΜΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΚΑΛΟΥΣΗΣ Ιατρός ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΙΑ ΜΥΡΩΝΙΔΟΥ-ΤΖΟΥΒΕΛΕΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΦΟΡΟΓΛΟΥ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΙΑ ΜΥΡΩΝΙΔΟΥ-ΤΖΟΥΒΕΛΕΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΦΟΡΟΓΛΟΥ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΟΚΚΑΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΕΣΙΣΟΓΛΟΥ ΙΣΑΑΚ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΟΥΤΣΟΝΙΚΟΛΑΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» Ν. 5343/32, αρθρ. 202, παρ. 2 και Ν. 1268/82, αρθρ. 50, παρ.8 2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ 3

4

Στη μητέρα μου Στη μνήμη του πατέρα μου 5

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ.. 9 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ..11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΤΡΑΥΜΑ ΚΑΙ ΕΠΟΥΛΩΣΗ... 15 1.1. Τραύμα.... 15 1.1.1. Τραύματα εξαιτίας κακώσεων..... 15 1.1.2. Ιατρογενή τραύματα 15 1.1.3. Χρόνια τραύματα... 16 1.2. Ιστορική αναδρομή. 16 1.3. Ανατομία και φυσιολογία του δέρματος.....18 1.3.1. Ανατομία του δέρματος... 18 1.3.1.1. Επιδερμίδα... 19 1.3.1.2. Χόριο 20 1.3.1.3. Υποδόριος ιστός... 21 1.3.2. Λειτουργίες του δέρματος 21 1.4. Επούλωση... 22 1.4.1. Φάση αιμόστασης.... 24 1.4.2. Φάση της φλεγμονής 26 1.4.3. Παραγωγική φάση... 28 1.4.4. Φάση σχηματισμού ουλής και αναμόρφωσης του τραύματος 31 1.5. Παράγοντες που επηρεάζουν την επούλωση.. 34 2. ΤΟ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ.. 35 2.1. Πρωτεογλυκάνες και γλυκοζαμινογλυκάνες.. 35 2.2. Υαλουρονικό οξύ... 37 2.2.1. Σύνθεση και μεταβολισμός.. 37 2.2.2. Φυσικοχημικές ιδιότητες. 39 2.2.3. Βιολογικές ιδιότητες 40 2.2.3.1. Επιφανειακοί κυτταρικοί υποδοχείς... 40 2.2.3.2. Σύνδεση με συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας... 41 2.2.3.3. Πρωτεΐνες που συνδέονται με το υαλουρονικό οξύ... 42 2.2.3.4. Ο ρόλος των καταβολικών παραγόντων του υαλουρονικού οξέος... 43 2.3. Ρόλος του υαλουρονικού οξέος στην επούλωση του τραύματος..... 45 2.4. Η επούλωση των τραυμάτων στα έμβρυα.. 51 2.5. Επίδραση της εξωγενούς χορήγησης του υαλουρονικού οξέος στην επούλωση 53 2.6. Άλλες θεραπευτικές εφαρμογές του υαλουρονικού οξέος. 56 2.7. Το υαλουρονικό οξύ στην πλαστική χειρουργική και αισθητική ιατρική. 57 2.8. Χρήση στη φαρμακευτική και τη φαρμακευτική κοσμητολογία... 59 3. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΟΥΛΩΝ 61 7

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ... 65 2. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ.. 67 2.1. Δείγμα. 67 2.2. Μέθοδος. 67 3. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΥΠΟΘΕΣΗ...... 71 4. ΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕΤΑΒΛΗΤΩΝ. 71 5. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ.71 6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.. 73 7. ΣΥΖΗΤΗΣΗ.. 87 8. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ..91 9. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...93 10. ABSTRACT... 95 11. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 97 8

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα τραύματα και η επούλωσή τους αποτελούν ένα θέμα συνυφασμένο με την παρουσία της έμβιας ζωής στη γη. Ιδιαίτερο αντικείμενο σκέψης προβληματισμό προκαλεί η δημιουργία ουλής, τόσο μετά από τραυματισμούς ή εγκαύματα, όσο και μετά από χειρουργικές επεμβάσεις, καθώς αυτή μπορεί να συνοδεύεται όχι μόνο από αισθητικά και ψυχολογικά προβλήματα, αλλά κυρίως και από απώλεια της λειτουργικότητας, περιορισμό της κινητικότητας ή παρεμπόδιση της ανάπτυξης της περιοχής στην οποία αυτή δημιουργείται. Η επούλωση ενός τραύματος αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία, η οποία περιλαμβάνει σύνθετους μηχανισμούς με τη συμμετοχή διαφορετικών τύπων κυττάρων. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν σημειωθεί πολλές πρόοδοι τόσο στην κατανόηση των μηχανισμών της επούλωσης, όσο και στον τρόπο αντιμετώπισης των τραυμάτων. Έτσι, εκτός από την σύγκλιση του δερματικού ελλείμματος και την αποκατάσταση της λειτουργικότητάς του, επιβάλλεται πλέον και ένα καλό αισθητικό αποτέλεσμα. Για να επιτευχθεί αυτό, εκτός από άρτια χειρουργική τεχνική, είναι πολλές φορές απαραίτητη και η συνδρομή της σύγχρονης τεχνολογίας, η οποία με ειδικές συσκευές ή επιθέματα μεταβάλλει τις φυσικές ιδιότητες του περιβάλλοντος, στο οποίο λαμβάνει χώρα η επούλωση, αλλά και της φαρμακολογίας, με ουσίες που επιδρούν στους μοριακούς και κυτταρικούς μηχανισμούς της. Το υαλουρονικό οξύ αποτελεί συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας σε όλους σχεδόν τους ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού, και πιστεύεται ότι σχετίζεται με τις διαδικασίες αποκατάστασης των ιστών, γεγονός που οφείλεται στις φυσικοχημικές και βιολογικές ιδιότητες του μορίου του. Οι ιδιότητες αυτές, καθώς και η αποδεδειγμένη συμμετοχή του στους μηχανισμούς της επούλωσης, το καθιστούν μόριο-κλειδί για τη φαρμακολογική πρόληψη της δημιουργίας αντιαισθητικών ουλών. Η ευεργετική δράση του στην επούλωση έχει αποδειχθεί σε in vitro πειραματικά μοντέλα, ζώα του εργαστηρίου (τραύματα δέρματος, διάτρηση τυμπανικής μεμβράνης και επιθηλιακά τραύματα κερατοειδούς), καθώς και σε χρόνια τραύματα και εγκαύματα. Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες στη σύγχρονη βιβλιογραφία σχετικά με την επίδραση εξωγενούς υαλουρονικού οξέος στην επούλωση των τραυμάτων υγιών, κατά τα άλλα, ατόμων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μίας κλινικής μελέτης σχετικά με την επίδραση της εξωγενούς χορήγησης υαλουρονικού οξέος στην επούλωση χειρουργικών τομών, με επικέντρωση στο κλινικό/αισθητικό της αποτέλεσμα. Η μελέτη αυτή αποτελεί συνέχεια και ολοκλήρωση της διπλωματικής μου εργασίας στα πλαίσια του Νέου Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών της Ιατρικής Σχολής (Νέο ΠΡΟ.ΜΕ.Σ.Ι.). Κλείνοντας το προλογικό αυτό σημείωμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους συνετέλεσαν στην πραγματοποίηση της μελέτης: Την Επιβλέπουσά μου, κα. Μαρία Μυρωνίδου Τζουβελέκη, Καθηγήτρια Φαρμακολογίας, η οποία με τίμησε με την εμπιστοσύνη της ήδη από τις προπτυχιακές μου σπουδές και, αναλαμβάνοντας στη συνέχεια την επίβλεψη των μεταπτυχιακών μου σπουδών και της διδακτορικής μου διατριβής, μου πρόσφερε την αμέριστη αρωγή της, την ευχαριστώ θερμά. Η συνεργασία μας συνέβαλε καθοριστικά, όχι μόνο στην εξέλιξή μου ως ιατρού και επιστήμονα, αλλά και ως ανθρώπου. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Περικλή Φόρογλου, Επίκουρο Καθηγητή Πλαστικής Χειρουργικής, για την βοήθειά του στη σύλληψη, διεξαγωγή και οργάνωση του κλινικού μέρους της μελέτης και την καθοδήγησή του κατά τη εκτέλεση της. 9

Tον Καθηγητή Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής, κ. Γεώργιο Καρκαβέλα ευχαριστώ για τις πρόθυμες και αμέριστες συμβουλές του στα θέματα της εργαστηριακής ερευνητικής μεθοδολογίας και κλινικής εφαρμογής τους. Στον Φαρμακοποιό κ. Συλλιγνάκη Ιωάννη, ο οποίος αφιλοκερδώς επιμελήθηκε την παρασκευή των σκευασμάτων που χορηγήθηκαν στους ασθενείς, είμαι βαθύτατα υποχρεωμένος. Τον αείμνηστο Καθηγητή κ. Λάμπη Λαζαρίδη και τη διάδοχό του στη Διεύθυνση της Κλινικής Πλαστικής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Ευτέρπη Δεμίρη ευχαριστώ για τη φιλοξενία τους στην Κλινική. Ο Καθηγητής κ. Michel Mayer, Διευθυντής μου στην Κλινική Γενικής Χειρουργικής του Evangelisches Krankenhaus Lippstadt Γερμανίας με υποστήριξε ιδιαίτερα κατά τη συλλογή των εκεί περιστατικών και για αυτό τον ευχαριστώ. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Dr Αντώνιο Αντωνίου, Επιμελητή Β Ε.Σ.Υ. της Κλινικής Πλαστικής Χειρουργικής Α.Π.Θ., την κ. Ειρήνη Λιοδάκη, ειδικευόμενη στην Πλαστική Χειρουργική και τον Dr Γεώργιο Τζουβελέκη, παιδίατρο, για τη συμβολή τους στην ολοκλήρωση της μελέτης. 10

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ BMP Bone Morphogenic Protein Μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών EGF Epidermal Growth Factor Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας FGF Fibroblast Growth Factor Αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών HA Hyaluronic Acid Υαλουρονικό οξύ HAS Hyaluronic Acid Synthases Συνθάσες του υαλουρονικόυ οξέος HMWHA High Molecular Weight Hyaluronic Acid Υαλουρονικό οξύ μεγάλου μοριακού βάρους ICAM-1 IntraCellular Adhesion Molecule-1 Μόριο ενδοκυτταρικής συγκολλήσεως-1 IL InterLeukine Ιντερλευκίνη IαI Inter-α-Inhibitor LMWHA Low Molecular Weight Hyaluronic Acid Υαλουρονικό οξύ μικρού μοριακού βάρους LTs LeukoTrienes Λευκοτριένια LYVE LYmphatic Vessel Endotheliac HA receptor Υποδοχέας υαλουρονικού οξέος του ενδοθηλίου λεμφικών αγγείων PAF Platelet Activating Factor Ενεργοποιητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων PDGF Platelet Derived Growth Factor Αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων PGs ProstaGlandins Προσταγλανδίνες PKC Protein Kinase C Πρωτεϊνικήκινάση C PLCγ1 PhosphoLipase Cγ1 Φωσφολιπάση Cγ1 RHAMM Receptor for HyaloronAn Mediated Motility Υποδοχέας κινητικότητας εξαρτώμενης από το υαλουρονικό TGF-β Transforming Growth Factor-β Μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-β TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α TSG-6 Tumor necrosis factor-stimulated Gene-6 Ενεργοποιούμενο από τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων γονίδιο-6 VEGF VascularEndothelialGrowthFactor Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας 11

12

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13

14

1. ΤΡΑΥΜΑ ΚΑΙ ΕΠΟΥΛΩΣΗ 1.1. Τραύμα Ως τραύμα ορίζεται κάθε διαταραχή μίας φυσιολογικής ανατομικής δομής με επακόλουθη απώλεια της λειτουργικότητας, η οποία μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες 1. Ο μηχανισμός πρόκλησης ενός τραύματος έχει ιδιαίτερη σημασία, όχι μόνο για λόγους ταξινόμησης, αλλά κυρίως γιατί καθορίζει την περαιτέρω αντιμετώπισή του, αλλά και την πιθανότητα πλήρους ή μη θεραπείας. Έτσι, αιτιολογικά, διακρίνονται τα τραύματα: ως αποτέλεσμα κάκωσης ιατρογενή και χρόνια. 1.1.1. Τραύματα εξαιτίας κακώσεων Τα τραύματα εξαιτίας κακώσεων είναι αποτέλεσμα επίδρασης εξωτερικής βίας και αποτελούν την πλειοψηφία τους. Είναι δυνατό να περιλαμβάνουν τόσο επιφανειακές δομές (δέρμα), όσο και βαθύτερες (μαλακά μόρια, οστά). Η μορφή και η έκτασή τους εξαρτώνται από το είδος και την ένταση της εξωτερικής επίδρασης, τη διάρκειά της, αλλά και το σημείο του σώματος, στο οποίο αυτή ασκείται. Λαμβάνοντας υπόψη και τους παραπάνω παράγοντες τα διαχωρίζουμε σε μηχανικά, θερμικά, χημικά και ακτινικά τραύματα. 1.1.2. Ιατρογενή τραύματα Τα ιατρογενή τραύματα είναι αποτέλεσμα της αρχής vulnerando sanamus, δηλαδή ίαση μέσω τραυματισμού. Μπορεί να είναι αποτέλεσμα χειρουργικών, διαγνωστικών ή άλλων θεραπευτικών χειρισμών. Διακρίνονται σε: τομές παρακεντήσεις και ανατρήσεις εφαρμογές laser 15

περιοχές δότριες δερματικών μοσχευμάτων ακρωτηριασμούς 1.1.3. Χρόνια τραύματα Ιστικά και ιδιαίτερα δερματικά ελλείμματα που μετά την πάροδο τεσσάρων εβδομάδων δεν εμφανίζουν τάση επούλωσης ονομάζονται χρόνια τραύματα. Συνήθως αποτελούν εκδήλωση χρόνιων παθήσεων (περιφερειακή αγγειοπάθεια, σακχαρώδης διαβήτης κλπ.) 2. Η αναλυτική ταξινόμηση των τραυμάτων παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. 1.2. Ιστορική αναδρομή Η ιστορία της Ιατρικής έχει ως αφετηρία την εμφάνιση του ανθρώπου στη γη. Έτσι, και οι τραυματισμοί και οι επιπλοκές τους είναι ένα φαινόμενο τόσο αρχαίο, όσο και η ύπαρξη του ανθρώπου 3. Ακόμη και η δημιουργία της Εύας από το πλευρό του Αδάμ αποτελεί τραύμα (για αυτό και τελείται σε κατάσταση ύπνωσης), το οποίο μάλιστα επουλώθηκε χωρίς τη δημιουργία ουλής 4. Όπως φαίνεται από τα διασωσμένα γραπτά κείμενα, τα αρχαιολογικά ευρήματα, αλλά και την παράδοση, ο άνθρωπος κάθε εποχής, από τα προϊστορικά κιόλας χρόνια προσπαθούσε να αντιμετωπίσει τα τραύματά του, είτε αυτά προέρχονταν από ατυχήματα είτε από εχθρικές ενέργειες άλλων ανθρώπων 5. Η αιμορραγία, ο πόνος και η φλεγμονή που συνεπάγεται ένα τραύμα προκαλούσαν ανικανότητα και περιόριζαν τον προϊστορικό άνθρωπο στις καθημερινές του δραστηριότητες. Οι πρώτες προσπάθειες αντιμετώπισης των τραυμάτων βασίζονταν στην παρατήρηση των συνηθειών των ζώων (π.χ. τραυματολειχεία). Αργότερα εφαρμόστηκε η άσκηση πίεσης, χειρωνακτικά ή με άλλα μέσα 5. Στην αρχαία Αίγυπτο υπάρχουν ήδη αναφορές για την εφαρμογή πιεστικής περίδεσης, διαφόρων επιδέσμων, αλλά και καυτηριασμών με πυρωμένο σίδερο για την πρόκληση αιμόστασης. Οι αρχαίοι Έλληνες εκλογίκευσαν την Ιατρική, απαλλάσσοντάς την από προλήψεις και δεισιδαιμονίες. Τόσο στα Ομηρικά έπη, όσο και στα έργα του Ηράκλειτου και της Ιπποκρατικής συλλογής αργότερα, περιγράφονται τρόποι αφαίρεσης βελών και φροντίδας των τραυμάτων. 16

Εικόνα 1. Ταξινόμηση των τραυμάτων ανάλογα με την αιτιολογία τους 17

Περίπου το 300 π.χ. το επίκεντρο της Ιατρικής μεταφέρθηκε στην Αλεξάνδρεια και μετέπειτα στη Ρώμη. Στην περίοδο αυτή χρονολογούνται οι πρώτες αναφορές για την απολίνωση αγγείων. Κατά την αραβική περίοδο της Ιατρικής (περίπου 600-1492 μ.χ.) η χρήση νυστεριών και καυτηριασμών αποτελούσαν τις συνήθεις χειρουργικές πρακτικές. Την περίοδο του Μεσαίωνα, ως συνέπεια του γενικότερου τέλματος των επιστημών, εγκαταλείφθηκαν και οι ορθολογιστικές πρακτικές αντιμετώπισης των τραυμάτων. Η επούλωση κατά πρώτο χειρουργικό σκοπό αποτελούσε πλέον εξαίρεση, καθώς τα περισσότερα τραύματα έμεναν αφρόντιστα, διαπυούνταν και επουλώνονταν κατά δεύτερο σκοπό, με δύσμορφες ουλές. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, οι χειρουργοί διαχωρίζονταν και θεωρούνταν κατώτεροι από τους υπόλοιπους ιατρούς. Με την εισαγωγή της αναισθησίας και, λίγο αργότερα, τη διατύπωση των αρχών της αντισηψίας από τον Lister (1867) και την ανακάλυψη των μικροβίων και από τον Koch (1878) δόθηκε μεγάλη ώθηση στις χειρουργικές πρακτικές. Το 1898 ο Friedrich περιέγραψε τις αρχές αντιμετώπισης των τραυμάτων, οι οποίες ισχύουν μέχρι σήμερα («νεαροποίηση κατά Friedrich»). Ο 20 ος αιώνας σημαδεύτηκε από τους δύο Παγκοσμίους πολέμους, και τις ιδιαίτερες απαιτήσεις στη φροντίδα των θυμάτων τους, αλλά και την ανακάλυψη της πενικιλλίνης από τον Flemming (1928) και στη συνέχεια των υπόλοιπων αντιβιοτικών 3,6. Επιπλέον, η ανάπτυξη της μοριακής Ιατρικής συνετέλεσε σε πολύ μεγάλο βαθμό στην κατανόηση των μηχανισμών της επούλωσης των τραυμάτων σε κυτταρικό επίπεδο και επέφερε σημαντική μεταβολή στους στόχους της αντιμετώπισής τους. Έτσι, πλέον στόχο των ιατρικών παρεμβάσεων δεν αποτελεί απλά η επούλωση ενός τραύματος, αλλά και ο έλεγχός της, καθώς και η βελτιστοποίηση της δημιουργούμενης ουλής. Για την επίτευξη του στόχου αυτού δεν αρκεί απλά μία ολοκληρωμένη χειρουργική εκπαίδευση απαιτούνται γνώση των μηχανισμών της επούλωσης, παρεμβάσεις στο περιβάλλον του τραύματος, αλλά και γνώση της τεχνολογικής και της φαρμακολογικής συνδρομής. 1.3.Ανατομία και Φυσιολογία του δέρματος 1.3.1. Ανατομία του δέρματος Το δέρμα αποτελεί το μεγαλύτερο όργανο του ανθρωπίνου σώματος, με επιφάνεια που φτάνει, ανάλογα με το ύψος, τα 2m 2 και βάρος περίπου 3kg. Ιστολογικά διακρίνεται στις ακόλουθες στιβάδες: επιδερμίδα, χόριο και υποδόριο ιστό (Εικόνα 2). 18

Εικόνα 2. Ιστολογική δομή του δέρματος 8 1.3.1.1. Επιδερμίδα Η επιδερμίδα αποτελεί την ανώτερη στιβάδα του δέρματος, με μέσο πάχος 50 μm, το οποίο κατά τόπους μπορεί να φτάσει τα 2mm. Αποτελείται από πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο, το οποίο διαθέτει μεγάλη αναγεννητική ικανότητα. Ανάλογα με το στάδιο της διαφοροποίησης των κυττάρων της διακρίνουμε 5 στιβάδες: τη βασική, την ακανθωτή, την κοκκιώδη, τη διαυγή (ασταθής) και την κεράτινη (Εικόνα 3) 7,8. Η βασική στιβάδα είναι η κατώτερη και χαρακτηρίζεται από την παρουσία πολλών μιτώσεων. Η ακανθωτή στιβάδα αποτελείται από 2-5 σειρές κυττάρων (ακανθοκυττάρων) που ενώνονται με δεσμοσωμάτια. Τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας χαρακτηρίζονται από βασεόφιλα κοκκία (που περιέχουν κερατοϋαλίνη) και εμφανίζουν διάταξη σε στήλες. Η διαυγής στιβάδα ανευρίσκεται μόνο σε περιοχές με πεπαχυσμένη επιδερμίδα (παλάμες, πέλματα). Τέλος, η κεράτινη στιβάδα χαρακτηρίζεται από 10-20 στρώσεις πλακωδών κυττάρων με ισχυρές διακυττάριες συνδέσεις 7,8. 19

Εικόνα 3.Διαφοροποίηση των στιβάδων της επιδερμίδας 8 Τα κύτταρα της επιδερμίδας διακρίνονται σε κερατινοκύτταρα (που προέρχονται από τα στελεχιαία κύτταρα της βασικής στιβάδας και διαφοροποιούνται κατά τη μετανάστευση προς ανώτερες στιβάδες), μελανινοκύτταρα (που βρίσκονται στη βασική στιβάδα και με την παραγωγή μελανίνης ευθύνονται για το χρώμα του δέρματος), τα κύτταρα Langerhans (που ανήκουν ως αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα στο ανοσοποιητικό σύστημα) και τα κύτταρα Merkel (μηχανικοί υποδοχείς) 7. 1.3.1.2. Χόριο Το χόριο εμφανίζει ισχυρή σύνδεση με την επιδερμίδα μέσω της χοριοεπιδερμικής ζώνης. Χαρακτηρίζεται από αγγειο- και νευροβρίθεια. Διακρίνεται ιστολογικά στην θηλώδη και δικτυωτή στιβάδα, οι οποίες αποτελούνται από ίνες κολλαγόνου (κυρίως τύπου Ι), ελαστικές ίνες, ουσίες του στρώματος 20

(γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες) και από κυτταρικά στοιχεία (κυρίως ινοβλάστες, αλλά και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως κοκκιοκύτταρα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα κ.ά.). 1.3.1.3. Υποδόριος ιστός Ο υποδόριος ιστός χαρακτηρίζεται από την παρουσία χαλαρού συνδετικού ιστού και συνδέει το δέρμα με τα υποκείμενα στοιχεία (περιτονίες, περιόστεο). Περιέχει νεύρα, αγγεία, θύλακους τριχών, αδένες και σε ορισμένες περιοχές, λείες μυϊκές ίνες. Επιπλέον, λόγω του λίπους που περιέχει, συμβάλλει στη μόνωση του οργανισμού και την απώλεια θερμότητας 7,8 όπως και στο μεταβολισμό του 9. 1.3.2. Λειτουργίες του δέρματος Το δέρμα με τις φυσικοχημικές του ιδιότητες προστατεύει τα υποκείμενα όργανα από εξωτερικές μηχανικές βλαπτικές επιδράσεις, αποτρέπει την εξάτμιση του υγρού των υποδορίων ιστών και εμποδίζει την είσοδο μικροβίων και επιβλαβών χημικών ουσιών. Ακόμη, προστατεύει τον οργανισμό από την ηλιακή ακτινοβολία με τη μελανίνη που περιέχει, σχηματίζει, με την επίδραση των υπεριωδών ακτινών, την αντιρραχητική βιταμίνη D από την εργοστερόλη και επιτελεί σημαντικό ανοσοβιολογικό ρόλο. Εκτός από τα παραπάνω το δέρμα χρησιμεύει και: ως αισθητήριο όργανο για την αφή, την πίεση, τον πόνο και τη θερμοκρασία, τα υποδεκτικά όργανα των οποίων βρίσκονται σε όλο το πάχος του δέρματος ως αναπνευστικό όργανο, διενεργώντας την άδηλη αναπνοή ως εκκριτικό όργανο, παράγοντας το γάλα ως απεκκριτικό όργανο, αποβάλλοντας με τον ιδρώτα και το σμήγμα προϊόντα της ανταλλαγής της ύλης ως θερμορυθμιστικό όργανο με τη δυνατότητα της αυξομειώσεως του εύρους των αγγείων που έχει, αλλά και με την έκκριση και εξάτμιση του ιδρώτα, καθώς και τις τρίχες και το υποδόριο λίπος, πού αποτελούν θερμομονωτικά στρώματα 10. Συνεπώς, η απώλεια της συνέχειας του δέρματος, ως αποτέλεσμα τραυματισμού ή πάθησης, συνοδεύεται από πλήθος λειτουργικών, αλλά και αισθητικών προβλημάτων. Υπολογίζεται ότι μόνο στις Η.Π.Α. συμβαίνουν περίπου 35 εκατομμύρια δερματικά τραύματα ετησίως, τα οποία απαιτούν ιατρική παρέμβαση. Οι κυριότερες 21

αιτίες οξείας λύσης της συνέχειας του δέρματος είναι τα εγκαύματα, τα τραύματα, οι εκτομές δερματικών όγκων, οι εν τω βάθει βακτηριακές και μυκητιασικές λοιμώξεις, όπως οι υποδερματίτιδες, και άλλες καταστάσεις, όπως, οι αγγειίτιδες, η σκληροδερμία και η τοξική επιδερμική νεκρόλυση 11. Οι κύριοι στόχοι της αντιμετώπισης ενός τραύματος είναι αφενός μεν η άμεση και ταχεία αποκατάσταση της συνέχειας και της λειτουργικότητας των ιστών, και αφετέρου ένα αισθητικά και λειτουργικά ικανοποιητικό αποτέλεσμα. Η μεγάλη πρόοδος που σημειώθηκε τα τελευταία χρόνια στην κυτταρική και μοριακή βιολογία έχει διευρύνει κατά πολύ τις γνώσεις μας σχετικά με τις διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την επούλωση των τραυμάτων και την αναγέννηση των ιστών, με αποτέλεσμα σημαντική βελτίωση στη θεραπευτική αντιμετώπισή τους 12. 1.4. Επούλωση Ως επούλωση ορίζεται η αποκατάσταση της ανατομικής ακεραιότητας και της λειτουργικότητας των τραυματισμένων ιστών. Στον ανθρώπινο οργανισμό, αναγέννηση των φυσιολογικών στοιχείων παρατηρείται μόνο στο επιθήλιο και στο ήπαρ. Συνεπώς, η επούλωση των τραυμάτων δεν αποτελεί «ίαση», με την έννοια της πλήρους αποκατάστασης της αρχικής μορφολογίας, αλλά οδηγεί στο σχηματισμό ουλώδους ιστού 13. Η δημιουργία ουλής από τελεολογική/εξελικτική άποψη βοηθά στην επιβίωση των οργανισμών, καθώς εξολοθρεύει γρήγορα τους παθογόνους μικροοργανισμούς, βοηθά στην απομάκρυνση ξένων σωμάτων και απομονώνει το εσωτερικό του οργανισμού από το εξωτερικό περιβάλλον 14. Οι ουλές που σχηματίζονται εμφανίζουν ποικιλομορφία, ξεκινώντας από τις ασυμπτωματικές, αισθητικά αποδεκτές ουλές και καταλήγοντας στις υπερτροφικές ουλές ή και τα χηλοειδή, που προκαλούν αισθητικά και λειτουργικά προβλήματα και μπορούν ακόμη και να επηρεάσουν την περαιτέρω ανάπτυξη του οργανισμού 15. Η διεργασία της ιστικής επούλωσης περιλαμβάνει μία αλληλένδετη διαδοχική σειρά γεγονότων, τα οποία απαιτούν συνδυασμένη εκτέλεση συγκεκριμένων κυτταρικών ενεργειών, όπως η φαγοκυττάρωση, η χημειοταξία, η μίτωση, η σύνθεση κολλαγόνου και επιπρόσθετων επιθηλιακών στοιχείων. Όλες αυτές οι διεργασίες δεν επιτελούνται σε τυχαία σειρά, αλλά αποτελούν ακριβή και επαναλαμβανόμενη αλληλουχία, που σχετίζεται άμεσα με την παρουσία διάφορων τύπων κυττάρων στην περιοχή του τραύματος 16. 22

Λαμβάνοντας υπόψη τα προαναφερθέντα μπορούμε να ορίσουμε την επούλωση του τραύματος ως «την πολυσύνθετη, και ταυτόχρονα αυστηρά καθορισμένη διαδικασία που περιλαμβάνει κυτταρικούς και μοριακούς μηχανισμούς και έχει ως αποτέλεσμα τη σύγκλειση ενός ελλείμματος μέσω ουλώδους συνδετικού ιστού, σε συνδυασμό με την αναγέννηση επιθηλίου και παρεγχυματικών κυττάρων» 13. Οι σύνθετες αυτές διαδικασίες, που εμπλέκονται στην επούλωση του τραύματος, διακρίνονται σχηματικά, για την καλύτερη κατανόησή τους, σε τέσσερις φάσεις: της αιμόστασης, της φλεγμονής, την παραγωγική φάση σχηματισμού κοκκιώδους ιστού, παραγωγής κολλαγόνου και αγγειογένεσης, και τέλος, το σχηματισμό ουλής και ανασχηματισμό της 17. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο διαχωρισμός αυτός έχει μόνο διδακτική έννοια, καθώς η επούλωση αποτελεί δυναμική διεργασία, με συνεχή ροή, οι φάσεις της οποίας υπερκαλύπτονται. Οι μηχανισμοί που συνθέτουν το φαινόμενο της επούλωσης και η χρονική τους επικάλυψη παρουσιάζονται σχηματικά στις Εικόνες 4 και 5. Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση της χρονικής αλληλουχίας των φάσεων της επούλωσης 23

1.4.1. Φάση αιμόστασης Κάθε ιστική βλάβη που προέρχεται από εγχείρηση ή άλλη τραυματική βλάβη οδηγεί σε τρώση των μικρών αγγείων, με συνέπεια την έξοδο του αίματος μέσα στην τραυματική επιφάνεια και την έκπλυση μικροοργανισμών και αντιγόνων 1,17. Ακολουθεί μία περίοδος αγγειοσύσπασης, η οποία διαρκεί 5-10 λεπτά, και οφείλεται στη δράση μεσολαβητών, όπως η αδρεναλίνη, η νοραδρεναλίνη, οι προσταγλανδίνες, η σεροτονίνη και η θρομβοξάνη. Η σύσπαση των αγγείων συντελεί στον περιορισμό της αιμορραγίας και συμβάλλει στην αρχική συγκόλληση των αιμοπεταλίων και τη διατήρηση των παραγόντων που βοηθούν την επούλωση στο σημείο του τραύματος 18. Την αγγειακή φάση της αιμόστασης διαδέχεται η αιμοπεταλιακή φάση, κατά την οποία συσσωρεύονται αιμοπετάλια και σχηματίζεται ο αιμοπεταλιακός ή προσωρινός θρόμβος 17. Επιπλέον, τα αιμοπετάλια ευθύνονται για την ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων. Τα άλφα κοκκία των αιμοπεταλίων περιέχουν αυξητικούς παράγοντες, όπως ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από τα αιμοπετάλια (Platelet Dirived Growth Factor, PDGF), ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β) και ο αιμοπεταλιακός παράγοντας IV. Οι παράγοντες αυτοί επάγουν την έναρξη του μηχανισμού της επούλωσης μέσω της προσέλκυσης και ενεργοποίησης των ινοβλαστών, των ενδοθηλιακών κυττάρων και των μακροφάγων. Τα αιμοπετάλια περιέχουν επίσης τα πυκνά σωμάτια, τα οποία απελευθερώνουν αγγειοδραστικές αμίνες, όπως η σεροτονίνη, οι οποίες αυξάνουν τη διαπερατότητα των μικροαγγείων 16. Ακολουθεί η φάση της πήξης του αίματος. Ο καταρράκτης της πήξης ενεργοποιείται από δύο συστήματα: το ενδογενές και το εξωγενές. Το ενδογενές σύστημα ξεκινά με την ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙΙ (παράγοντας Hageman), όταν το αίμα έρχεται σε επαφή με εξωαγγειακές επιφάνειες. Το εξωγενές σύστημα της πήξης δρα μέσω της ενεργοποίησης ενός ιστικού παράγοντα κυττάρων που βρίσκονται εκτός των αγγείων, παρουσία των παραγόντων VII και VIIa 18. Ταυτόχρονα ενεργοποιούνται ο μηχανισμός του συμπληρώματος, και το σύστημα βραδυκινίνης, ισταμίνης και σεροτονίνης 17. Τελικό αποτέλεσμα της δράσης και των δύο συστημάτων είναι η ενεργοποίηση της προθρομβίνης σε θρομβίνη, με τη δράση της θρομβοκινάσης, και τελικά η μετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου σε αδιάλυτο ινώδες, το οποίο αποτελεί 24

Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση των μηχανισμών που ενεργοποιούνται στις διάφορες φάσεις της επούλωσης ενός τραύματος 25

τον ισχυρό θρόμβο. Το ινώδες αποτελεί το απαραίτητο δομικό ικρίωμα, επάνω στο οποίο θα εξελιχθεί η επουλωτική διεργασία. Απομάκρυνση του ινώδους από την επιφάνεια του τραύματος εμποδίζει την εξέλιξη του επουλωτικού μηχανισμού 17. Η αγγειοσύσπαση και η δημιουργία θρόμβου έχουν ως επακόλουθο την ελάττωση της συγκέντρωσης του οξυγόνου, την αύξηση της γλυκόλυσης και μεταβολές στο ph 19. 1.4.2. Φάση της φλεγμονής Την αγγειοσύσπαση διαδέχεται μία φάση αγγειοδιαστολής, με επακόλουθη διαρροή των στοιχείων του πλάσματος γύρω από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σημαντικό ρόλο στη φάση αυτή παίζουν ουσίες με αγγειοδιασταλτική δράση, όπως η ισταμίνη, η βραδυκινίνη, οι προσταγλανδίνες (PGE 1, PGE 2 και PGA 2 ), και τα λευκοτριένια 18,20. Η περίοδος της αγγειοδιαστολής διαρκεί περισσότερο από αυτή της αγγειοσύσπασης και ευθύνεται για το ερύθημα, το οίδημα και την τοπική άνοδο της θερμοκρασίας που παρατηρούνται στο σημείο του τραύματος. Από τελεολογική άποψη η αγγειοδιαστολή συντελεί στην αυξημένη ροή του αίματος στην τραυματική επιφάνεια, και συνεπώς, στην προσέλκυση φλεγμονωδών κυττάρων και παραγόντων, με στόχο την καταπολέμηση των μικροβίων που έχουν τυχόν εισέλθει από τη λύση της συνέχειας του δέρματος και τον καθαρισμό του τραύματος από νεκρωμένους ιστούς. Οι μεταβολές στο ph λόγω της αποδόμησης ιστών και μικροβίων, το τοπικό οίδημα και η υποξαιμία στην περιοχή του τραύματος ευθύνονται για την ενεργοποίηση των αλγοϋποδοχέων και την αίσθηση του πόνου, που συνοδεύει τον τραυματισμό 18. Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα κυριαρχούν τις πρώτες 48 ώρες. Μεταναστεύουν στην περιοχή του τραύματος και, μέσω φαγοκυττάρωσης, οψωνοποίησης και απελευθέρωσης πρωτεασών (ελαστάσης, κολλαγενάσης, καθεψίνης G, κ.ά.), ελεύθερων ριζών οξυγόνου και μεσολαβητών της φλεγμονής (TNF-α, IL-1β, IL- 16), την καθαρίζουν από βακτήρια και νεκρωτικό υλικό. Ωστόσο, δε φαίνεται να αποτελούν απαραίτητο κυτταρικό πληθυσμό για την εξέλιξη της επουλωτικής διεργασίας 1,17,18,21. Αντίθετα, τα μακροφάγα, τα οποία προέρχονται από την ενεργοποίηση των μονοκύτταρων, αποτελούν πιθανόν τα πιο σημαντικά κυτταρικά στοιχεία στα πρώτα στάδια της επούλωσης. Η μέγιστη συγκέντρωσή τους παρατηρείται μέσα σε 3 έως 6 ημέρες. Τα μακροφάγα αποδομούν τους κατεστραμμένους ιστούς, απελευθερώνουν ουσίες που προάγουν την αγγειογένεση στην πρώιμη αυτή φάση και παράγουν 26

προσταγλανδίνες και αυξητικούς παράγοντες (TGFα, TGFβ, PDGF, IL-α) για την έναρξη σχηματισμού του κοκκιώδους ιστού. Τα μακροφάγα είναι απαραίτητα για την ομαλή εξέλιξη της διαδικασίας της επούλωσης. Μάλιστα, έχει παρατηρηθεί ότι ο φαινότυπος των μακροφάγων μεταβάλλεται κατά την πορεία της επούλωσης. Στη φάση αυτή απαντώνται τα μακροφάγα τύπου Μ1 (ενεργοποιούνται με τον κλασικό τρόπο), τα οποία παράγουν μεγάλες ποσότητες TNFα και IL-6, προάγοντας έτσι τη φλεγμονώδη αντίδραση. Σε πειραματόζωα, τα οποία δεν παράγουν μακροφάγα, έχει παρατηρηθεί καθυστέρηση του σχηματισμού κοκκιώδους ιστού και ελαττωματική επούλωση 12,17,18,22. Τα Τ-λεμφοκύτταρα εμφανίζονται στην περιοχή του τραύματος περίπου 72 ώρες μετά τον τραυματισμό και φτάνουν στη μέγιστη συγκέντρωσή τους μέσα σε 8 έως 14 ημέρες. Παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανοσία και την παραγωγή αντισωμάτων και επιπλέον παράγουν κυττοκίνες (TNF, TGF, IL-α), οι οποίες επηρεάζουν τα μακροφάγα και προάγουν την παραγωγή ινοβλαστών 17,18,20. Τέλος, κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους φάσης ξεκινά η μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων. Η επανα-επιθηλιοποίηση ξεκινά λίγες ώρες μετά τον τραυματισμό. Κύτταρα της επιδερμίδας από τα χείλη του τραύματος, αφού υποστούν δομικές μεταβολές που επιτρέπουν την αποκόλλησή τους από τα γειτονικά κύτταρα και τη βασική μεμβράνη (διάσπαση των δεσμοσωματίων, δημιουργία κυτταροπλασματικών ινιδίων ακτίνης) μετακινούνται κατά μήκος της επιφάνειας του τραύματος, διαχωρίζοντας την υπερκείμενη εσχάρα από τον υποκείμενο ζωντανό ιστό. Η μετακίνηση αυτή διευκολύνεται από την παραγωγή κολλαγενασών, οι οποίες διασπούν το κολλαγόνο, και ενεργοποιητή του πλασμινογόνου, ο οποίος ενεργοποιεί την παραγωγή πλασμίνης. Η πλασμίνη με τη σειρά της προκαλεί καταστροφή του θρόμβου κατά τη μετακίνηση των επιθηλιακών κυττάρων 12,17,18. Το έναυσμα για τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων προέρχεται τόσο από την τοπική απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων και ελεύθερων ριζών οξυγόνου, όσο και από την απώλεια της επαφής με τα υπόλοιπα επιθηλιακά κύτταρα, λόγω του τραύματος 12,18,21. Πιστεύεται ότι σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αυτή παίζουν ουσίες με ανασταλτική δράση στη μίτωση, οι οποίες ονομάζονται χαλόνες. Οι ουσίες αυτές παράγονται από τα επιφανειακά επιθηλιακά κύτταρα και εμποδίζουν την διαίρεση των υποκείμενων κυττάρων. Όταν τα επιθηλιακά κύτταρα καταστραφούν, παύει η δράση των χαλονών και δίδεται το ερέθισμα στα γειτονικά κύτταρα για διαίρεση 23. 27

1.4.3. Παραγωγική φάση Η φάση αυτή διακρίνεται στα επιμέρους στάδια παραγωγής κοκκιώδους (ή κοκκιοματώδους) ιστού και κολλαγόνου καθώς και αγγειογένεσης 17. Ο κοκκιώδης ιστός αποτελεί χαλαρό υπόστρωμα ινώδους, ινωδονεκτίνης, κολλαγόνου και γλυκοζαμινογλυκανών, με κύριο εκπρόσωπο το υαλουρονικό οξύ. Σε αυτόν περιέχονται μακροφάγα, ινοβλάστες και νεόπλαστα αιμοφόρα αγγεία. Χρησιμεύει ως πυρήνας προσκόλλησης για την ανάπτυξη νέου ιστού. Η διαδικασία παραγωγής κοκκιώδους ιστού ξεκινά 3-5 ημέρες μετά τον τραυματισμό και μπορεί να διαρκέσει μέχρι την 21 η ημέρα, ειδικά σε μεγάλα ή μη συρραφέντα τραύματα 17. Οι ινοβλάστες, που εμφανίζονται ήδη από την προηγούμενη φάση της φλεγμονής, παίζουν ιδιαίτερο ρόλο σε αυτή τη φάση, καθώς είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή κολλαγόνου, ελαστίνης, ινωδονεκτίνης, γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεασών. Η αύξηση των ινοβλαστών λαμβάνει χώρα μετά την ελάττωση και απενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων, τα οποία δεν είναι πλέον απαραίτητα. Η απελευθέρωση διάφορων παραγόντων, όπως η ινωδονεκτίνη, ο PDGF, ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF), ο TGF και στοιχεία του συμπληρώματος, προκαλεί τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, καθώς και την έκφραση από αυτούς των υποδοχέων των ιντεγκρινών 3,6,7. Και στη φάση αυτή παίζουν σημαντικό ρόλο τα μακροφάγα. Ωστόσο, παρατηρείται μεταβολή στο φαινότυπό τους (σε Μ2, μακροφάγα που ενεργοποιούνται με εναλλακτικούς τρόπους) και κατ επέκταση στο ρόλο τους, ο οποίος είναι περισσότερο ανοσορρυθμιστικός 22,24. Οι διάφοροι τύποι κολλαγόνου αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια πρωτεϊνών στο ανθρώπινο σώμα. Ενισχύουν τη μορφολογική ακεραιότητα σε όλα τα είδη των ιστών και διαδραματίζουν εξέχοντα ρόλο στην αποκατάσταση του τραύματος. Το κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί το κύριο δομικό συστατικό των οστών, του δέρματος και των τενόντων. Ο τύπος ΙΙ ανευρίσκεται κυρίως στους χόνδρους. Ο τύπος ΙΙΙ ανευρίσκεται σε συνδυασμό με τον τύπο Ι, σε διαφορετικές αναλογίες, ανάλογα με το είδος του ιστού. Ο τύπος IV απαντάται στη βασική μεμβράνη του επιθηλιακού ιστού, ενώ ο τύπος V στον κερατοειδή χιτώνα του οφθαλμού 25. Το μόριο του κολλαγόνου εμφανίζει την εξής ασυνήθιστη σύσταση: το 1/3 των αμινοξέων του είναι υπολείμματα γλυκίνης, το 21% υπολείμματα προλίνης και 3- και 4- υδροξυπρολίνης και το 11% υπολείμματα αλανίνης. Το κολλαγόνο συντίθεται αρχικά 28

ενδοκυττάρια ως προκολλαγόνο, το οποίο εκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο, και με τη δράση πρωτεολυτικών ενζύμων μετατρέπεται σε τροποκολλαγόνο. Το τροποκολλαγόνο αποτελείται από 3 πολυπεπτιδικές αλύσους, η καθεμία από τις οποίες περιστρέφεται σε αριστερόστροφη έλικα με 3 αμινοξέα σε κάθε στροφή. Στη συνέχεια οι 3 άλυσοι συγκολλώνται με την ανάπτυξη ομοιοπολικών δεσμών και περιελίσσονται μεταξύ τους με σχοινοειδή διαμόρφωση, σχηματίζοντας ελαφρά δεξιόστροφη υπερέλικα. Η χαρακτηριστική σύσταση των πεπτιδικών αλύσων είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της τριπλής αλύσου 25. Έτσι, σχηματίζονται τα νημάτια κολλαγόνου. Τα νημάτια συνενώνονται και σχηματίζουν ινίδια, τα οποία τελικά δημιουργούν τις ίνες κολλαγόνου 18. Εικόνα 6. Η δομή του κολλαγόνου 29

Η σύνθεση του κολλαγόνου ξεκινά περίπου την 3 η ημέρα μετά τον τραυματισμό και συνεχίζεται με ταχείς ρυθμούς για 2-4 εβδομάδες. Αυτή ελέγχεται από μηχανισμό αρνητικής παλίνδρομης ρύθμισης (negative feedback). Η ανεπάρκεια αυτού του μηχανισμού οδηγεί σε ανεξέλεγκτη παραγωγή κολλαγόνου και στο σχηματισμό παθολογικής ουλής 17,18. Στη φάση αυτή, επίσης, εισέρχονται τριχοειδή αγγεία στην περιοχή του θρόμβου και μέσα σε λίγες ημέρες οργανώνουν ένα μικροαγγειακό δίκτυο μέσα στον κοκκιώδη ιστό. Στα νεόπλαστα αυτά αγγεία οφείλεται το ερυθρό χρώμα της ουλής. Καθώς το κολλαγόνο συσσωρεύεται μέσα στον κοκκιώδη ιστό, η πυκνότητα του αγγειακού αυτού δικτύου ελαττώνεται 26. Η αγγειογένεση οφείλεται στη δράση διάφορων μεσολαβητών, όπως ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών-2 (FGF-2), ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (vascular endothelial growth factor, VEGF), ο TGF-β, η αγγειοποιητίνη κ.ά.. Στη φάση αυτή παρατηρείται δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων, των προαναφερθέντων μεσολαβητών και της εξωκυττάριας ουσίας του κοκκιώδους ιστού 11,12,18. Αρχικά, τα ενδοθηλιακά κύτταρα υπαρχόντων αγγείων ενεργοποιούνται από τους αυξητικούς παράγοντες και εκκρίνουν πρωτεολυτικά ένζυμα, τα οποία διασπούν τις μεταξύ τους συνδέσεις. Έτσι, είναι δυνατή η μετανάστευσή τους, καθοδηγούμενα από επιφανειακά μόρια συγκολλήσεως, τις αντχερίνες ή συγκολλητίνες (adherins). Παράλληλα, η παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών προκαλεί λύση των παρακείμενων ιστών και ευνοεί τη μετανάστευση των κυττάρων. Τα δημιουργούμενα μικρά αγγεία ενώνονται μεταξύ τους, δημιουργώντας αγγειακές αγκύλες, οι οποίες στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε αρτηρίδια και φλεβίδια. Στα δερματικά τραύματα ολικού πάχους, η νεοαγγειογένεση γίνεται πάντα με συγκεκριμένη αλληλουχία. Στην αρχή δημιουργείται ένας εσωτερικός δακτύλιος από αγγεία με κυκλική διάταξη και στη συνέχεια περιφερικά αγγεία με ακτινωτή διάταξη, μέσω των οποίων εισρέει το αίμα. Έτσι, παρατηρείται μία χαρακτηριστική διάταξη, που μοιάζει με ήλιο. Στην πορεία συρρικνώνεται και εξαφανίζεται ο εσωτερικός δακτύλιος, ενώ τα περιφερικά αγγεία συνδέονται μεταξύ τους, σχηματίζοντας ένα αγγειακό δίκτυο 27. Στην παραγωγική φάση γίνεται και η αποκατάσταση της χοριοεπιδερμικής ζώνης επαφής, η οποία είναι ουσιώδους σημασίας για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργικότητας του δέρματος. Αυτή ξεκινά 7 έως 9 ημέρες μετά την επαναεπιθηλιοποίηση. Η χοριοεπιδερμική αυτή ζώνη αποτελείται από πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, κυρίως κολλαγόνο και λαμινίνες. Το ανώτερο τμήμα της 30

λειτουργεί ως θέση προσκόλλησης των κερατινοκυττάρων μέσω του σχηματισμού συμπλεγμάτων ημι-δεσμοσωματίων, ενώ το κατώτερο τμήμα της σταθεροποιεί την προσκόλληση στο υποκείμενο χόριο μέσω ινιδίων 28. 1.4.4. Φάση σχηματισμού ουλής και αναμόρφωσης του τραύματος Ταυτόχρονα με το σχηματισμό ουλώδους ιστού το τραύμα ελαττώνει την επιφάνεια του εμβαδού του με το μηχανισμό της ρίκνωσης. Ως ρίκνωση ορίζεται η κεντρομόλος μετατόπιση των άκρων του τραύματος, η οποία διευκολύνει τη σύγκλιση του ελλείμματος και εμφανίζει το μέγιστό της 5-15 ημέρες μετά τον τραυματισμό. Αποτέλεσμα της ρίκνωσης είναι η ελάττωση του μεγέθους του τραύματος κατά περίπου 40% 28. Ο μέγιστος ρυθμός ρίκνωσης ανέρχεται σε 0,75mm/ημέρα και εξαρτάται από τη χαλαρότητα του ιστού και το σχήμα του τραύματος. Μεγαλύτερη ρίκνωση παρατηρείται σε χαλαρούς ιστούς, καθώς και σε τετράγωνα τραύματα σε αντίθεση με τα κυκλικά. Η ακτινοβόληση της περιοχής και τα φάρμακα που αναστέλλουν την κυτταρική διαίρεση φαίνεται ότι καθυστερούν και το φαινόμενο της ρίκνωσης 18. Η ρίκνωση ενός τραύματος περιλαμβάνει έναν πολύπλοκο μηχανισμό, στον οποίο εμπλέκονται κύτταρα, εξωκυττάρια ουσία και χημικοί μεσολαβητές (κυττοκίνες). Σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό αυτό παίζουν οι ινοβλάστες, οι οποίοι παρουσιάζουν φαινοτυπικές αλλαγές και μετατρέπονται σε μυοϊνοβλάστες. Οι μυοϊνοβλάστες χαρακτηρίζονται από την παρουσία μεγάλων «δεματίων», τα οποία περιέχουν μικρονημάτια α-ακτίνης και βρίσκονται τοποθετημένα στην έσω (κυτταροπλασματική) πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης, καθώς και από συνδέσεις με άλλα κύτταρα, αλλά και την εξωκυττάρια ουσία 12. Aνευρίσκονται γύρω από τα αιμοφόρα αγγεία, στις κατώτερες στιβάδες του χορίου, στον κοκκιωματώδη ιστό και στο πρώιμο στάδιο δημιουργίας των υπερτροφικών ουλών 16. Ο μηχανισμός της ρίκνωσης ενεργοποιείται από αυξητικούς παράγοντες, όπως ο TGFβ 1 ή ο TGFβ 2 και ο PDGF, από την προσκόλληση των ινοβλαστών στο στρώμα του κολλαγόνου μέσω υποδοχέων των ιντεγκρινών και από τις διασταυρούμενες συνδέσεις μεταξύ των δεματίων του κολλαγόνου 12. Η αναμόρφωση του κολλαγόνου κατά τη μετάβαση από τον κοκκιώδη στον ουλώδη ιστό, ο οποίος είναι μεταβολικά ενεργός, βασίζεται στη συνεχιζόμενη σύνθεση και στην ταυτόχρονη αποδόμησή του. Η αποδόμηση του κολλαγόνου γίνεται από ειδικά πρωτεολυτικά ένζυμα, τις κολλαγενάσες και τις μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας 31

ουσίας. Τα ένζυμα αυτά εκκρίνονται από διάφορους κυτταρικούς πληθυσμούς, όπως τα μακροφάγα, τα κύτταρα της επιδερμίδας, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες. Η σύνθεση και η αποδόμηση του κολλαγόνου βρίσκονται σε δυναμική ισορροπία, η οποία διατηρείται με τη βοήθεια ειδικών αναστολέων της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών 12,17,18. Κατά τη φάση της αναμόρφωσης του τραύματος οι ίνες του κολλαγόνου αποκτούν περισσότερο οργανωμένη διάταξη, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αντικαθίσταται από κολλαγόνο τύπου Ι. Η ινωδονεκτίνη προοδευτικά εξαφανίζεται, το υαλουρονικό οξύ και οι γλυκοζαμινογλυκάνες αντικαθίστανται από πρωτογλυκάνες, ενώ η ουλή απορροφά ύδωρ. Οι μεταβολές αυτές δίνουν τη δυνατότητα στις ίνες του κολλαγόνου να συμπλησιάσουν και να σχηματίσουν δεσμούς, με τελικό αποτέλεσμα την ελάττωση του πάχους της ουλής. Οι ενδομοριακοί και διαμοριακοί δεσμοί που σχηματίζονται αυξάνουν την αντοχή του τραύματος σε διάταση, η οποία μεγιστοποιείται στις 60 περίπου ημέρες μετά τον αρχικό τραυματισμό. Ωστόσο, ακόμη και ένα τραύμα που έχει «ιαθεί» πλήρως ποτέ δεν αποκτά την αρχική του ανθεκτικότητα, αλλά διατηρεί μόνο 70-80% της αρχικής του ισχύος 12,18. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται συνοπτικά οι κυριότεροι μεσολαβητές που σχετίζονται με τις διαδικασίες της επούλωσης και ο ρόλος που επιτελεί καθένας από αυτούς. 32

Πίνακας 1. Οι κυριότεροι μεσολαβητές και ο ρόλος τους στην επούλωση του τραύματος 28 Μεσολαβητής Χημειοταξία ράση στα αγγεία Άλλες Κύρια Συστολή ιαστολή ιαπερατότητα δράσεις προέλευση Αγγειοδραστικές αμίνες ισταμίνη + + αιμοπετάλια, μαστοκύτταρα και βασεόφιλα σεροτονίνη + αιμοπετάλια, μαστοκύτταρα Πρωτεάσες του πλάσματος βραδυκινίνη + + πόνος πρωτεΐνη πλάσματος συμπλήρωμα + + + πρωτεΐνη πλάσματος και μακροφάγα Σύστημα πήξης παράγοντας + πήξη πρωτεΐνη Hageman πλάσματος ινοπεπτίδια + + πρωτεΐνη πλάσματος παράγοντας + πρωτεΐνη ΧΙΙα ηπαρίνη αντιπηκτική δράση και ινωδόλυση πλάσματος μαστοκύτταρα PAF + + + λευκοκύτταρα μεσολαβητές + + πήξη αιμοπετάλια αιμοπεταλίων Μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος PGs + + πόνος και πυρετός φωσφολιπίδια μεμβρανών LTs + + + λευκοκύτταρα και φωσφολιπίδια μεμβρανών Ελεύθερες ρίζες μεταβολίτες Ο 2 + + καταστροφή ενδοθηλίου και ιστών λευκοκύτταρα ΝΟ + ιστική καταστροφή μακροφάγα και ενδοθήλιο Κυττοκίνες ILs, TNF + μακροφάγα PDGF, TGF-β + αιμοπετάλια και μακροφάγα 33

1.5. Παράγοντες που επηρεάζουν την επούλωση Διάφοροι παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν τη διαδικασία της επούλωσης και τη σχηματιζόμενη ουλή. Οι παράγοντες αυτοί διακρίνονται σε τοπικούς και γενικούςσυστηματικούς. Στους τοπικούς παράγοντες περιλαμβάνονται οι αυξητικοί παράγοντες, το οίδημα, η φλεγμονή, η παρουσία αιματώματος, η διαπύηση του τραύματος και η εκτεταμένη ιστική καταστροφή. Επίσης, ανεπαρκής εγχειρητική τεχνική μπορεί να προκαλέσει βλάβη των ιστών, φτωχή αιμάτωση, παραμονή νεκρού χώρου, μη ικανοποιητική συμπλησίαση των χειλέων του τραύματος, συρραφή ιστών διαφορετικής ιστολογικής προέλευσης, κακή συρραφή ή συρραφή υπό τάση. Τέλος και η παράβαση των κανόνων κατάλληλης αντισηψίας δύναται να επιδράσει αρνητικά στην επούλωση ενός τραύματος. Στους γενικούς παράγοντες περιλαμβάνονται: κακή θρέψη αναιμία ηλεκτρολυτικές διαταραχές (υποκαλιαιμία) υποξία και υποβολαιμία σακχαρώδης διαβήτης ουραιμία μεγάλη ηλικία λήψη κορτικοστεροειδών αποφρακτικός ίκτερος νεοπλάσματα προχωρημένου σταδίου ακτινοβολία χημειοθεραπεία συνυπάρχουσες κακώσεις 17,29. 34

2. ΤΟ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ 2.1. Πρωτεογλυκάνες και γλυκοζαμινογλυκάνες Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούν βασικά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας. Αποτελούνται από πεπτιδικές αλύσους, ενωμένες με ομοιοπολικούς δεσμούς με σάκχαρα, περιέχουν μεγάλες ποσότητες υδατανθράκων (συνήθως >95%) και διαθέτουν μεγαλύτερο πρωτεϊνικό τμήμα σε σχέση με τις γλυκοπρωτεΐνες. Οι άλυσοι των σακχάρων είναι γραμμικές, και μπορεί να περιλαμβάνουν περισσότερα από 100 υπολείμματα. Εικόνα 7. Σχηματική αναπαράσταση της δομής των πρωτεογλυκανών Οι γλυκοζαμινογλυκάνες είναι το υδατανθρακικό τμήμα των πρωτεογλυκανών. Αποτελούνται από επαναλαμβανόμενους δισακχαρίτες, οι οποίοι διαφέρουν για κάθε είδος γλυκοζαμινογλυκάνης. Συνήθως πρόκειται για ενώσεις μίας εξοζαμίνης με ένα ουρονικό οξύ. Το αμινοσάκχαρο στις γλυκοζαμινογλυκάνες είναι είτε γλυκοζαμίνη (GlcNH 2 ) είτε γαλακτοζαμίνη (GalNH 2 ) και συνήθως βρίσκεται σε Ν-ακετυλιωμένη μορφή. Σε ορισμένες γλυκοζαμινογλυκάνες (ηπαρίνη, θειική ηπαράνη) η αμινοομάδα είναι συζευγμένη με μία ομάδα που περιέχει θείο. Το ουρονικό οξύ είναι συνήθως γλυκουρονικό οξύ (GlcUA). Εξαιτίας των καρβοξυλικών ομάδων των ουρονικών οξέων και επιπλέον της ύπαρξης θειικών ομάδων σε κάποιες από αυτές, οι άλυσοι των γλυκοζαμινογλυκανών χαρακτηρίζονται από έντονα αρνητικό φορτίο. Οι περισσότερες γλυκοζαμινογλυκάνες συνδέονται με το πρωτεϊνικό τμήμα με τη μεσολάβηση ενός τρισακχαρίτη (Gal-Gal-Xyl). Οι κυριότερες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι το υαλουρονικό οξύ, η θειική δερματάνη, η θειική χονδροϊτίνη, η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη και η θειική κερατάνη 30,31. Η δομή, η εντόπιση και οι μεταβολές που υφίστανται οι γλυκοζαμινογλυκάνες και οι πρωτεογλυκάνες τους επιτρέπει να κωδικοποιούν συγκεκριμένες πληροφορίες και να 35

παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές διεργασίες. Έτσι, μέσω της σύνδεσης ή/και της αλληλεπίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών με την εξωκυττάρια ουσία, αυξητικούς παράγοντες, κυττοκίνες, μόρια προσκόλλησης, ένζυμα και ενζυμικούς αναστολείς, οι πρωτεογλυκάνες επηρεάζουν τη λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων στο δέρμα. Σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν επίσης στη διαδικασία της επούλωσης των τραυμάτων, ελέγχοντας τη δράση των αυξητικών παραγόντων, αλλά και σε αμυντικούς μηχανισμούς, καθώς ενισχύουν την έκφραση απαραίτητων μορίων για την προσκόλληση των λευκοκυττάρων 32. Τραύμα Αποδόμηση GAG Απελευθέρωση αντιμικροβιακών πεπτιδίων ραστηριότητα πρωτεάσης Απελευθέρωση θραυσμάτων GAG Σύνθεση πρωτεογλυκανών Απελευθέρωση διαλυτών πρωτεογλυκανών Έλεγχος δραστηριότητας αυξητικών παραγόντων, ενζύμων και ενζυμικών αναστολέων Έλεγχος δραστηριότητας κυττοκινών. Αύξηση έκφρασης NF-κΒ. Αύξηση έκφρασης ICAM-1 ΕΠΙ ΙΟΡΘΩΣΗ ΙΣΤΩΝ ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΙ ΑΜΥΝΑ Εικόνα 8. Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών (GAG) μετά από τραυματισμό του δέρματος 36

2.2. Υαλουρονικό οξύ Εικόνα 9. Χημικός τύπος του υαλουρονικού οξέος Το υαλουρονικό οξύαπομονώθηκε για πρώτη φορά το 1934 από τους Karl Meyer και John Palmer 33, ενώ η δομή του περιγράφηκε το 1954 34. Aποτελεί τη γλυκοζαμινογλυκάνη, με τη μεγαλύτερη πολυσακχαριδική άλυσο, και τη μόνη που δεν συνδέεται με πρωτεϊνικό μόριο προς σχηματισμό πρωτεογλυκάνης. Πρόκειται για το γραμμικό πολυμερές ενός δισακχαρίτη, που αποτελείται από D- Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη και D-γλυκουρονικό οξύ. Οι δεσμοί που δημιουργούνται ανάμεσα στα επαναλαμβανόμενα μόρια έχουν ως εξής: -β-1,4, γλυκουρονικό οξύ-β1,3- Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη. Οι επαναλαμβανόμενοι δισακχαρίτες κυμαίνονται από 250-25000 (Μ.Β. 2x10 5-10 7 Daltons). Το υαλουρονικό οξύ, ως συστατικό του εξωκυττάριου χώρου, βρίσκεται σχεδόν παντού στον ανθρώπινο οργανισμό. Υπολογίζεται ότι η συνολικό ποσότητα υαλουρονικού οξέος στον οργανισμό μας ανέρχεται σε 20g 35. Κάθε κύτταρο του οργανισμού είτε περιβάλλεται είτε βρίσκεται σε άμεση επαφή με ένα στρώμα πολυσακχαριτών, ανάμεσα στους οποίους το υαλουρονικό οξύ κατέχει σημαντική θέση. Σε ιδιαίτερα μεγάλες ποσότητες ανευρίσκεται στο υαλώδες σώμα του οφθαλμού, στο αρθρικό υγρό, αλλά και στο δέρμα. Ωστόσο, το υαλουρονικό οξύ δε θα πρέπει να θεωρείται απλό δομικό συστατικό. Οι μοναδικές φυσικοχημικές και βιολογικές του ιδιότητες το καθιστούν ρυθμιστικό μόριο σε πολλές βιολογικές διεργασίες 36,37. 2.2.1. Σύνθεση και μεταβολισμός Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες γλυκοζαμινογλυκάνες, οι οποίες συντίθενται μέσα στο σύστημα του Golgi και συνδέονται με πρωτεϊνικούς πυρήνες, το ελεύθερο γραμμικό 37

πολυμερές του υαλουρονικού οξέος συντίθεται στην εσωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης και εκκρίνεται απευθείας στον εξωκυττάριο χώρο 36. Η σύνθεση μίας αλύσου υαλουρονικού οξέος, η οποία περιέχει 10000 επαναλαμβανόμενους δισακχαρίτες, αντιπροσωπεύει μεγάλη δαπάνη ενέργειας για το κύτταρο, καθώς απαιτεί 50000 μόρια ΑΤP, 20000 μόρια ΝΑD και 10000 ομάδες ακετυλοσυνένζυμου Α, εκτός από τους μονοσακχαρίτες που περιέχει. Για το λόγο αυτό, η σύνθεση του υαλουρονικού οξέος υπόκειται σε άτεγκτους μηχανισμούς ρύθμισης. Οι συνθάσες του υαλουρονικού οξέος (Hyaluronic Acid Synthases, HASs) είναι γλυκοσυλτρανσφεράσες της κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τον πολυμερισμό και την εξωκυττάρωσή του. Στα σπονδυλωτά έχουν ταυτοποιηθεί 3 ισοένζυμα των HASs. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό τους είναι ότι διαθέτουν δύο θέσεις με ενζυματική δράση, από τις οποίες η μία προσθέτει το γλυκουρονικό οξύ και η άλλη την ακετυλογλυκοζαμίνη. Η προσθήκη των σακχάρων γίνεται στο αναγωγικό άκρο του πολυσακχαρίτη. Οι αλληλουχίες των αμινοξέων στις συνθάσες είναι κατά 50-70% κοινές, ωστόσο τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεσή τους βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα (χρωμόσωμα 19 για την HAS1, χρωμόσωμα 8 για την HAS2 και 16 για τηνhas3). Θεωρείται ότι η HAS3 εμφανίζει μεγαλύτερη δραστηριότητα, συνθέτει όμως βραχύτερα μόρια υαλουρονικού οξέοςαπό τις άλλες δύο (Μ.Β. 2x10 5 Daltons και 2x10 6 Daltons αντίστοιχα). Συνθάσες του υαλουρονικού οξέος ανευρίσκονται και σε μικροοργανισμούς, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι αυτό συμμετείχε στο σχηματισμό του γλυκοκάλυκα μονοκύτταρων οργανισμών 35,38-40. Για εμπορική χρήση το υαλουρονικό οξύ είτε εξάγεται από το λοφίο αλεκτόρων ή παράγεται από ανασυνδυασμένα στελέχη στρεπτοκόκκων 41. Ο μεταβολισμός του υαλουρονικού οξέος είναι ιδιαίτερα ταχύς. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του είναι 2-5 λεπτά στο αίμα, 12 ώρες στο δέρμα και 1-3 εβδομάδες στους χόνδρους. Η ποσότητα υαλουρονικού οξέος που ανακυκλώνεται στον οργανισμό καθημερινά ανέρχεται στα 15g. Η αποδόμησή του γίνεται με τη βοήθεια ενζύμων (υαλουρονιδάσες, χονδροϊτινάσες, εξοζαμινιδάσες) ή μετά από έκθεση σε ελεύθερες ρίζες οξυγόνου 36. Στα θηλαστικά έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη έξι γονιδίων που κωδικοποιούν τη σύνθεση υαλουρονιδασών, τα οποία εμφανίζουν ομολογία κατά 40%. Από αυτές οι δύο κυριότερες (Hyal1 και Hyal2) διασπούν το υαλουρονικό οξύ σε ολιγοσακχαρίτες ή μεγαλύτερα θραύσματα. Η Hyal1 αποτελεί την πρώτη υαλουρονιδάση που απομονώθηκε στον άνθρωπο. Είναι όξινη γλυκοπρωτεΐνη με ένα πολυπεπτίδιο, μοριακού βάρους 57kDalton. Με τη δράση μίας ενδοπεπτιδάσης σχηματίζεται και ένα 38

δεύτερο ισομερές, με Μ.Β. 45kDalton, το οποίο ανιχνεύεται μόνο στα ούρα, σε εκχυλίσματα ιστών και καλλιέργειες κυττάρων, αλλά και όχι στο πλάσμα. Η Hyal1 χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα υαλουρονικά οξέα οποιουδήποτε μοριακού βάρους. Η Hyal2 έχει επίσης όξινο χαρακτήρα και διασπά μόνο υαλουρονικό οξύ μεγάλου μοριακού βάρους σε θραύσματα μέσου μοριακού βάρους (περίπου 20 kdalton). Από τις υπόλοιπες έχει μελετηθεί καλύτερα μόνο η PH-20, η οποία σχετίζεται με τη γονιμοποίηση 35,39. 2.2.2. Φυσικοχημικές ιδιότητες Το υαλουρονικό οξύ αποτελεί ένα από τα περισσότερο υγροσκοπικά μόρια στη φύση. Έτσι, συμβάλλει στη διατήρηση του εξωκυττάριου χώρου, και διευκολύνει τη μεταφορά θρεπτικών συστατικών και ιόντων. Επίσης, τα διαλύματα υαλουρονικού οξέος χαρακτηρίζονται από μεγάλη ωσμωτικότητα. Η ιδιότητα αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στους νεφρούς, όπου το υαλουρονικό οξύ παίζει ρόλο ρυθμιστικού διαλύματος. Στο δέρμα η μεγάλη ωσμωτικότητα του υαλουρονικού οξέος συμβάλλει στη διατήρηση του υγρού περιβάλλοντος σε περιόδους μεταβολών (εμβρυϊκή ανάπτυξη, φλεγμονώδης φάση επούλωσης), και επιπλέον φαίνεται ότι διευκολύνει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων, αφού η αυξημένη υγρότητα δημιουργεί ευνοϊκές συνθήκες για την αποκόλλησή τους από τα γειτονικά κύτταρα 36,37. Στο εξωκυττάριο ph, οι καρβοξυλομάδες του υαλουρονικού οξέος βρίσκονται σε κατάσταση πλήρους ιονισμού. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι κατά μήκος του μορίου του υαλουρονικού οξέος σχηματίζονται δευτερεύοντες δεσμοί υδρογόνου, οι οποίοι προκαλούν συστροφή της αλύσου, προσδίδουν στο μόριο μεγαλύτερη σταθερότητα και δημιουργούν υδρόφοβες περιοχές, οι οποίες επιτρέπουν τη συνένωση με άλλα μόρια υαλουρονικού παρά το αρνητικό φορτίο και ενισχύουν την αλληλεπίδραση με τις κυτταρικές μεμβράνες και άλλες λιπιδικές δομές. Λόγω της δυσκαμψίας που τα χαρακτηρίζει, τα πολυμερή του υαλουρονικού οξέος παίρνουν το σχήμα τυχαίων σπειραμάτων, τα οποία επικαλύπτονται, σχηματίζοντας ένα ισχυρό δίκτυο με ελαττωμένη κινητικότητα. Επιπρόσθετα, το πλέγμα των μορίων του υαλουρονικού οξέος συμβάλλει στην εμφάνιση του φαινομένου του «χωρικού αποκλεισμού» (stericexclusion) άλλων μακρομορίων. Στο αρθρικό υγρό, για παράδειγμα, περίπου 15% του συνολικού όγκου του ύδατος δεν έρχεται σε επαφή με την αλβουμίνη, με αποτέλεσμα η συγκέντρωσή της στο υπόλοιπο του ύδατος να είναι στην πραγματικότητα αυξημένη 42. 39

Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του υαλουρονικού οξέος είναι το ιξώδες και η ελαστικότητά του, τα οποία δεν είναι σταθερά, αλλά μεταβάλλονται ανάλογα με τις δυνάμεις συνάφειας. Συγκεκριμένα, το υαλουρονικό οξύ παρουσιάζει αυξημένη γλοιότητα σε χαμηλές δυνάμεις συνάφειας, ενώ όταν οι δυνάμεις συνάφειας είναι μεγάλες αυξάνεται η ελαστικότητα, μέσω της οποίας αποθηκεύεται ενέργεια και διευκολύνεται η επαναφορά στο φυσιολογικό έπειτα από παραμόρφωση. Η ιδιότητα αυτή καθιστά το υαλουρονικό οξύ ένα έξοχο λιπαντικό, γεγονός που εξηγεί την παρουσία του σε μεγάλες ποσότητες στο αρθρικό και το υδατοειδές υγρό 36,42. 2.2.3. Βιολογικές ιδιότητες Οι δράσεις του υαλουρονικού οξέος δεν περιορίζονται σε αυτές που οφείλονται στις φυσικοχημικές του ιδιότητες. Το ιδιαίτερο αυτό μόριο εμφανίζει ταυτόχρονα τρεις βιολογικές δράσεις: δρα αυτοκρινώς, συνδεόμενο με επιφανειακούς υποδοχείς στο ίδιο κύτταρο από το οποίο παράγεται, παρακρινώς, αλληλεπιδρώντας με συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας, αλλά και ως μεσολαβητής με την ενεργοποίηση ειδικών υποδοχέων σε άλλα κύτταρα. Η πολλαπλή αυτή δράση του το καθιστά ρυθμιστικό μόριο σε πολλές φυσιολογικές ή παθολογικές διεργασίες 39. 2.2.3.1. Επιφανειακοί κυτταρικοί υποδοχείς Το υαλουρονικό οξύ συνδέεται κυρίως με τρεις τάξεις επιφανειακών κυτταρικών υποδοχέων, τον CD44,τον RHAMM και τον ICAM-1. Ο υποδοχέας CD44 είναι ευρύτατα διαδεδομένος στον οργανισμό και θεωρείται ο κύριος επιφανειακός υποδοχέας, με τον οποίο συνδέεται το υαλουρονικό οξύ. Αποτελεί μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με τέσσερις λειτουργικές θέσεις. Εμφανίζεται με διάφορες ισομορφές, κάθε μία από τις οποίες έχει και διαφορετική ικανότητα σύνδεσης με το υαλουρονικό οξύ. Η θέση σύνδεσης με το υαλουρονικό οξύ έχει εντοπιστεί στην άπω περιοχή του εξωκυτταρίου τμήματος του υποδοχέα. Εκτός από το υαλουρονικό οξύ ο CD44 συνδέεται και με άλλα μόρια, όπως το FGF, η οστεοποντίνη, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, η αγκυρίνη κλπ..η σύνθεση του υποδοχέα επάγεται από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως η IL-1 και ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor, EGF), η μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών (Bone Morphogenic Protein, BNP) και τον TGF-β. Συμμετέχει σε διάφορες κυτταρικές 40