pag. 1 OBIECTIVE - familiarizarea studenților cu principalele caracteristici ale nucleului, structura și funcțiile acestuia; - definirea ciclului celular și a punctelor de restricție ca elemente importante de verificare și control; - înțelegerea etapelor diviziunii celulelor somatice (mitozei). NUCLEUL Nucleul este un organit esențial al celulei eucariote, care stochează materialul genetic (ADN), în care sunt codificate informațiile ce determină caracteristicile morfologice și funcționale specifice fiecărui tip celular. Nucleul conține elementele necesare replicării ADN și sintezei de ARN. Nucleul există ca entitate distinctă numai în interfază (fază a ciclului celular dintre două diviziuni) și este separat de citoplasmă prin învelișul nuclear. În timpul mitozei, învelișul nuclear se fragmentează și astfel conținutul nuclear se dispersează în citoplasmă, urmând a se reorganiza la sfârșitul diviziunii celulare. Caracteristici generale 1. Număr Majoritatea celulelor au un singur nucleu. Există celule cu doi nuclei (unele hepatocite, unele celule musculare cardiace), cu zeci de nuclei (osteoclastele) sau cu sute de nuclei (celula musculară striată scheletale). 2. Formă În general, forma nucleului este asemănătoare cu a celulei din care face parte (aplatizat în celulele pavimentoase, alungit în celulele cilindrice etc.). În cazul celulelor care acumulează material în citoplasmă (ex: celulele adipoase, celulele caliciforme), nucleul va avea un aspect turtit. Unele tipuri celulare pot prezenta nuclei cu un contur neregulat, fie cu aspect polilobat (eozinofile, neutrofile), fie cu aspect înmugurit (megacariocitul). 3. Poziție În general, nucleul se găsește în centrul celulei, dar există și excepții: adipocitul alb are nucleul deplasat la periferie (fiind împins de incluziunea lipidică), celulele secretoare au nucleul la polul opus celui de acumulare a produsului de secreție (ex: celulele caliciforme, celulele seroase din parotidă sau pancreas). 4. Dimensiuni Dimensiunea nucleului este variabilă, în funcție de tipul și starea de activitate a celulei în care se găsește. O valoare aproximativă este de 10% din volumul celulei. Celulele tinere și cele maligne (ambele cu activitate metabolică intensă) prezintă în general un raport nucleu:citoplasmă crescut (adică volumul nucleului este > volumul citoplasmei). Schimbările de morfologie și/sau de dimensiuni ale nucleului pot indica o transformare (potențial malignă) a celulei și reprezintă un important indiciu în examinarea microscopică din anatomia patologică.
pag. 2 Structura nucleului I. ÎNVELIȘUL NUCLEAR Învelișul nuclear este o structură specifică celulei eucariote care există doar în interfază. El separă conținutul nucleului de citoplasmă. Componentele învelișului nuclear sunt: 1. Membrana nucleară externă - Organizare similară cu celelalte membrane dar nu conține proteine transportoare (traficul se face exclusiv prin porii nucleari) - Vine în contact cu citoplasma și se află în continuitate cu membrana RER - Are atașați ribozomi pe versantul extern, cu rol în sinteza de proteine. 2. Spațiul perinuclear - Este spațiul cuprins între cele două membrane nucleare (externă și internă): 20-40 nm - Se continuă cu lumenul RER - Aici ajung proteinele sintetizate de ribozomii atașați de membrana nucleară externă. 3. Membrana nucleară internă - Se atașează de lamina nucleară prin intermediul proteinelor componente. Lamina nucleară asigură suportul mecanic al învelișului nuclear. Ea este o rețea subțire (Φ<100nm) de filamente intermediare (polimeri de lamine). Prin fosforilarea tranzitorie a acestor lamine se fragmentează învelișul nuclear la începutul mitozei. 4. Porii nucleari - Sunt discontinuități ale învelișului nuclear care asigură schimburile moleculare selective dintre nucleu și citoplasmă - Numărul lor este proporțional cu activitatea de sinteză proteică a celulei (în medie învelișul nuclear conține la om 3000-4000 pori) - Diametrul porului este de 80nm. Fiecare por are la interior o formațiune proteică (complexul porului nuclear). Acesta prezintă un canal central (Φ 9nm), în jurul căruia se găsește un aranjament octogonal simetric, format dintr-un ansamblu de >150 proteine (nucleoporine). Transportul prin porii nucleari se poate realiza: pasiv (ionii și moleculele mici cu Φ<9nm) activ (cu consum de energie, pentru substanțele cu Φ>9nm). Acesta este selectiv și se desfășoară cu ajutorul unor proteine specializate din nucleu și din citoplasmă care direcționează moleculele către pori. Astfel distingem două direcții ale transportului: o dinspre Nucleu à Citoplasmă: molecule de ARN m, care sunt sintetizate în nucleu, complexate cu proteine (ribonucleoproteine) și exportate în citoplasmă o dinspre Citoplasmă à Nucleu: proteine sintetizate în citoplasmă, dar cu rol în activitatea nucleară (ADN-polimeraze, ARN-polimeraza, histone, proteine nonhistonice, proteine ribozomale etc.)
pag. 3 Rolurile învelișului nuclear sunt de a delimita compartimentul nuclear (protejarea ADN de interferența moleculelor din citoplasmă) și de a separa procesele biochimice din celulă (transcripția ADN = sinteza ARN m în nucleu și translația ARN m = sinteza de proteine în citoplasmă). II. CROMATINA. CROMOZOMII Cromatina este alcătuită din ADN legat de histone, dar și cantități mici de proteine non-histonice. ADN-ul este împachetat cu ajutorul proteinelor histonice, fapt ce face posibil ca lungimea totală a celor 46 molecule de ADN (de 2m) să încapă într-un nucleu cu Φ<10μm. Histonele sunt proteine specifice celulelor eucariote, cu o greutate moleculară mică și un pronunțat caracter bazic (dat de conținutul bogat în aminoacizi bazici - arginina, lizina). Puternica încărcătură pozitivă le permite interacțiunea cu grupările negative PO 4 de la suprafața ADN. Proteinele non-histonice sunt proteine acide (ex: ADN-polimerazele, ARN-polimeraza) care formează în principal structura de susținere pentru complexele ADN-histone. La nivelul nucleilor celulelor eucariote întâlnim două tipuri de cromatină: eucromatina și heterocromatina. Raportul eucromatină/heterocromatină dintr-un nucleu reflectă starea metabolică a celulei. 1. Eucromatina - porțiunea activă funcțional a cromatinei, la nivelul căreia are loc transcripția ADN (àarn); - este necondensată, se colorează slab cu coloranți bazici. - nucleii eucromatici (în care predomină eucromatina) sunt clari, mai puțin electronodenși și se întâlnesc în celulele implicate activ în sinteza proteică (ex: hepatocite, celule secretoare ale glandelor exocrine, neuronii) 2. Heterocromatina - porțiunea inactivă funcțional a cromatinei, netranscriptibilă întrucât ADN-ul este puternic spiralizat și nu poate fi transcris, fiind inaccesibil pentru proteinele implicate în transcripție; - rămâne condensată în interfază, se colorează intens cu coloranți bazici. - nucleii heterocromatici se găsesc în general în celulele cu activitate metabolică scăzută și în celulele senescente. Heterocromatina este subdivizată în: Heterocromatină constitutivă, care rămâne condensată și inactivă funcțional în toate țesuturile și tipurile celulare; fiind compusă în special din secvențe de ADN care nu sunt transcrise, dar se repetă de sute/mii ori (ADN repetitiv) Heterocromatină facultativă este transcrisă numai într-o anumitp perioadă de dezvoltare a organismului (ex: corpusculul Barr=cromatina de sex, prezentă în nucleii celulelor somatice la sexul feminin, provenind din condensarea celui de-al doilea cromozom X, vizibil astfel și în interfază. El devine și rămâne inactiv genetic după Z16, astfel egalizând expresia fenotipică a genelor localizate pe cr.x la cele două sexe) CROMOZOMII Unitatea structurală alcătuită din ADN și histonele asociate se numește nucleozom. Fiecare ADN dublu catenar împreună cu proteinele asociate = cromatidă. După replicarea ADN, două cromatide unite cu ajutorul unui complex proteic de coeziune constituie un cromozom. Datorită condensării progresive din timpul diviziunii celulare, cromozomii devin vizibili la MO. Spiralizarea maximă este
pag. 4 atinsă în timpul metafazei, etapă a diviziunii celulare care permite studiul optim al cromozomilor. Astfel sunt vizibile detalii morfologice specifice și anume: - cromozomii sunt alcătuiți din două jumătăți longitudinale simetrice = cromatide-surori (fiecare cromatidă corespunzând unei molecule de ADN). - cromatidele sunt unite la nivelul centromerului (constricția primară), cu o poziția variabilă la diferiți cromozomi. La nivelul centromerului se vor atașa fibrele fusului de diviziune, permițând deplasarea coordonată a cromozomilor către polii celulei în anafază. - capetele cromatidelor se numesc telomere și au rol de menținere a integrității cromozomiale (previn fuzionarea extremităților și ancorează cromozomii de lamina nucleară). Cariotipul reprezintă reprezentarea fotografică a cromozomilor unei celule somatice în metafază, ordonați după criterii specifice: mărime; poziția centromerului și a constricțiilor secundare. Cariotipul este specific fiecărei specii. La om, celulele somatice conțin 46 cromozomi (22 perechi de cromozomi somatici și 1 pereche de cromozomi sexuali XX sau XY). III. NUCLEOLUL Nucleolul este un corpuscul nedelimitat de endomembrană, având drept funcție principală formarea ribozomilor. El se găsește în nucleul celulelor eucariote aflate în interfază (fiind o structură dinamică, dispare la începutul mitozei și se reorganizează la sfârșitul acesteia). Structură - dimensiuni variabile în funcție de tipul celular și rata sintezei proteice din celulă (practic, în funcție de numărul de ribozomi necesari în celulă); - aspect la MO: corpuscul sferic, intens bazofil (la col. HE), cu Φ=1-2μm. - aspect la ME: 3 componente distincte: 1. centrii fibrilari (CF) - situate în centrul nucleolului - aspect de arii circulare palide, formate din fibrile cu Φ=4-8nm - conțin secvențele de ADN care codifică sinteza ARN r (și care vor fi transcrise în ARN r ) secvențe localizate în 10 cromozomi diferiți, unde ocupă zone denumite generic organizatori nucleolari. Aceștia din urmă se grupează în interfază în interiorul nucleolului. 2. componenta fibrilară densă (CFD) - înconjoară CF - alcătuită din fibrile fine (Φ=3-5nm), organizate într-o rețea. - reprezintă locul de acumulare & procesare a moleculelor de ARN r 3. componenta granulară (CG) - situată la periferia nucleolului, este componenta predominantă a nucleolului. - formată din granule de 10-15 nm (= subunități ribozomale în curs de maturare). Funcție Nucleolul are un rol esențial în primele etape ale formării ribozomilor (1-3). Iată toate etapele: 1) În CF: din transcripția ADN r à molecula de ARN 45S, care se acumulează în CFD 2) În CFD: prelucrarea ARN 45S à forma matură a ARN r 3) În CG: cuplarea ARN r cu proteine provenite din citoplasmă à particule ribonucleoproteice, care formează subunitățile ribozomale mare & mică, stocate temporar în CG 4) Transportul separat al celor 2 subunități în citoplasmă se face prin porii nucleari 5) Asamblarea celor 2 subunități în citoplasmă pe lanțul de ARN m (vezi Cursul 2).
pag. 5 IV. MATRICEA NUCLEARĂ - rețea de filamente proteice, ce asigură un suport pentru cromozomi - servind ca locuri de ancorare ADN-ului spiralizat. Funcțiile nucleului Nucleul conține aproape între ADN-ul celulei eucariote, în structura căruia se găsește (codificat) informația genetică pentru sinteza proteinelor celulare. Astfel, putem spune că nucleul coordonează activitățițe metabolice ale celulei chiar prin organizarea ei structurală. Practic, funcțiile nucleului se pot grupa în: 1. Replicarea ADN (proces prin care molecula de ADN se reproduce înaintea diviziunii celulare, rezultând copii identice care vor fi transmise celulelor-fiică). 2. Transcripția ADN (transcrierea informației din ADN în ARN m. Acesta va trece în citoplasmă unde mesajul va fi decodat, iar proteinele vor fi sintetizate de ribozomi). CICLUL CELULAR Ciclul celular reprezintă desfășurarea periodică a proceselor ce au drept rezultat formarea unor celule noi. Practic reprezintă ciclul de viață al unei celule de la apariție (din momentul în care s-a încheiat diviziunea în care s-a format) până la terminarea propriei diviziuni. Se descriu 4 etape: 1. G 1 - perioada dintre mitoză și replicarea ADN (Gap - pauză în sinteza de ADN). Celula sintetizează proteine și crește în volum, se reface dimensiunea de dinainte de mitoză; 2. S - are loc Sinteza (replicarea) ADN. Cantitatea de ADN se dublează, fiecare cromozom va avea 2 cromatide-surori; 3. G 2 - continuă sinteza proteinelor, celula se pregătește pentru mitoză. Se sintetizează tubulinele, necesare microtubulilor ce vor forma fusul de diviziune. 4. M - etapa diviziunii celulare (mitoza). După încheierea mitozei, celula va intra în faza G 1 și se începe un nou ciclu celular sau se poate opri într-o fază staționară, de repaus faza G 0. Fazele ciclului celular. I (interfaza) cuprinde G 1, S și G 2. M = mitoza. Durata ciclului celular variază în funcție de tipul celular. By Richard Wheeler (Zephyris) 2006. Există puncte de restricție (control) = momente pe care celula trebuie să le depășească pentru a putea parcurge etapele ulterioare. Dacă celula nu îndeplinește condițiile necesare în vreunul dintre aceste puncte, ea se oprește în etapa ciclului celular de dinaintea acelui punct. Principalele puncte de restricție se află la trecerea dintre: G 1 S; G 2 M și în interiorul M între Metafază Anafază (vezi pag. 6) Ciclul celular este reglat de un sistem de control complex, care activează și dezactivează la momentul oportun enzimele necesare desfășurării fiecărui proces. Principalele componente sunt: Ø Kinazele dependente de cicline - enzime care se activează periodic, în anumite momente ale ciclului celular (ex: unele sunt activate la sfârșitul G 1 și determină intrarea celulei în S; altele se activează la sfârșitul G 2 și determină intrarea celulei în M). Aceste enzime acționează prin transferul unei grupări PO 4 de la ATP către un aminoacid din proteina-țintă.
pag. 6 Ø Ciclinele - proteine ce se acumulează intracelular în anumite momente ale ciclului celular. Se leagă de kinaze și le activează, formând complexe cicline-kinaze ce declanșează diferite etape ale ciclului celular. Punctul de restricție G 1 -S - cel mai important punct de restricție, care controlează inițierea sintezei de ADN, împiedicând intrarea celulei în faza S dacă ADN-ul prezintă alterări structurale (semnalate de acumularea intracelulară a unei proteine reglatoare proteina p53 care va bloca replicarea ADN și va activa mecanismele de reparare). În cazul în care mecanismele de reparare eșuează, se va declanșa apoptoza (moartea celulară programată) în acel moment și nu se va mai ajunge în faza S. Punctul de restricție G 2 -M - împiedică intrarea celulei în mitoză în cazul în care dimensiunea nu este suficient de mare pentru a permite o diviziune eficientă. Punctul de restricție din (Mf-Af) - oprește intrarea celulei în anafază dacă alinierea cromozomilor în placa ecuatorială nu este corectă, fapt ce ar împiedica distribuirea corectă a unui set complet de cromozomi celulelor-fiice. MITOZA Reprezintă modalitatea specifică de diviziune a celulelor eucariote somatice, constând în formarea a 2 celule-fiică identice, cu același material genetic ca și celula mamă (același nr. de cromozomi). Se mai numește și diviziune indirectă, întrucât cuprinde 2 procese asincrone: - cariokineza (diviziunea nucleului); - citokineza (diviziunea citoplasmei). Interfază Reprezentarea grafică a fazelor mitozei, comparativ cu aspectul celulei în interfază. http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-1-cell-biology/16-cell-division/mitosis.html Etapele mitozei sunt: I. Profaza - nucleolii se fragmentează și nu mai pot fi observați la MO; - cromatina replicată se condensează, astfel cromozomii devin vizibili la MO sub forma unor filamente lungi, fiecare cromozom fiind alcătuit din 2 cromatide-surori unite la nivelul centromerului, unde există și un complex proteic (kinetocor) pentru atașarea la microtubuli; - centriolii migrează câte 2 la polii opuși ai celulei, formând corpusculii polari, cu rol de organizare a microtubulilor care vor constitui fibrele fusului de diviziune; - începe formarea fusului de diviziune, alcătuit din microtubuli între cei 2 corpusculi polari; - la sfârșitul profazei, lamina nucleară și complexele porului nuclear se dezasamblează și se dispersează în vezicule citoplasmatice.
pag. 7 II. Metafaza - se definitivează fusul de diviziune, al cărui rol este de a asigura mișcarea și separarea cromozomilor în timpul diviziunii; - cromozomii se condensează suplimentar și se atașează fusului de diviziune prin intermediul kinetocorului și se deplasează astfel încât să se alinieze în planul ecuatorial al celulei, formând placa ecuatorială. Astfel este posibilă repartiția egală a cromozomilor între cele 2 celule rezultate prin diviziune. III. Anafaza - cromozomii se clivează longitudinal, iar cromatidele-surori se separă una de cealaltă, fiecare va constitui un cromozom distinct. Astfel se vor obține 92 cromozomi (câte 46 ptr. fiecare celulă-fiică); - cromozomii (uni-cromatidici de data aceasta) migrează spre cei 2 poli de-a lungul microtubulilor fusului de diviziune, deplasarea având loc cu kinetocorul înainte; - concomitent are loc îndepărtarea polilor celulari (prin alungirea microtubulilor fusului de diviziune); - la sfârșitul anafazei, cromozomii vor fi grupați la cei 2 poli ai celulei. IV. Telofaza - cromozomii aflați la cei 2 poli ai celulei se despiralizează (deci nu mai pot fi vizualizați ca entități separate la MO); - fusul de diviziune se dezintegrează; - nucleolii se reorganizează și reapar, iar în jurul lor se reasamblează învelișul nuclear, prin fuzionarea veziculelor delimitate de membrane care înconjurau fusul de diviziune. Astfel va rezulta câte un nucleu la fiecare dintre cei doi poli ai celulei; - în planul ecuatorial, în citoplasma periferică apare un inel contractil de filamente de actină asociate cu miozină. După formarea completă a celor doi nuclei, la sfârșitul telofazei, în etapa de citokineză, inelul se contractă și determină formarea unui șanț de clivaj în plan ecuatorial, care progresează treptat și desparte citoplasma (și organitele) în două părți, corespunzătoare viitoarelor celule-fiică. Odată cu separarea completă a celor două celule, acestea încep un nou ciclu celular, urmând etapele descrise mai sus. Lectură recomandată Mescher AL, Junqueira - Histologie, tratat & atlas. Ed. a 13-a. Editura Medicală Callisto, București, 2017 (Cap. 3 Nucleul, pag. 55-72)