ОДРЕЂИВАЊЕ ОСТАТАКА ИПРОДИОНА У ТРЕШЊАМА И ВИШЊАМА

Универзитет у Новом Саду Пољопривредни факултет Департман за фитoмедицину и заштиту животне средине Здравко Бјелица ОДРЕЂИВАЊЕ ОСТАТАКА ИПРОДИОНА У ТРЕШЊАМА И ВИШЊАМА Мастер рад Нови Сад, 2015

Универзитет у Новом Саду Пољопривредни факултет Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Кандидат Здравко Бјелица Ментор проф. др Сања Лазић ОДРЕЂИВАЊЕ ОСТАТАКА ИПРОДИОНА У ТРЕШЊАМА И ВИШЊАМА Мастер рад Нови Сад, 2015

КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА: др Сања Лазић, Редовни професор за ужу научну област Фитофармација, Пољопривредни факултет, Нови Сад Mентор др Вера Стојшин Редовни професор за ужу научну област Фитопатологија, Пољопривредни факултет, Нови Сад Председник комисије др Славица Вуковић Доцент за ужу научну област Фитофармација, Пољопривредни факултет, Нови Сад Члан комисије

Садржај: 1. УВОД... 4 2. ТЕОРИЈСКИ ДЕО... 6 2.1 Трешња и вишња... 6 2.2 Болести трешње и вишње... 8 2.3 Фунгициди за сузбијање болести трешње и вишње... 12 2.4 Фунгициди дикарбоксимиди... 21 2.4.1 Ипродион... 21 2.4 Хроматографија... 24 2.4.1 Течна хроматографија... 25 2.4.2 HPLC са DAD детектором... 26 2.5 Методе анализе пестицида...29 2.5.1 QuEChERS метода екстракције и пречишћавања... 29 2.6 Методе анализе пестицида у трешњама и вишњама... 30 3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА... 32 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА... 33 4.1 Опрема... 34 4.2 Хемикалије... 34 4.3 Дефинисање хроматографских услова... 35 4.4 Провера приноса екстракције ипродиона из вишања и трешања QuEChERS методом... 37 5. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА... 38 5.1 Одређивање ипродиона применом HPLC/DAD... 38 5.2 Параметри валидације... 41 5.2.1 Линеарност одзива детектора... 41 5.2.2 Лимит детекције (LOD) и лимит квантификације (LOQ)... 42 5.2.3 Прецизност... 43 5.2.4 Тачност одређивања ипродиона у узорцима вишања... 44 5.2.5 Тачност одређивања ипродиона у узорцима трешања... 44 5.2.6 Зависност површине пика ипродиона од ињектоване запремине... 45 5.2.7 Матрикс ефекат... 46 5.3 Oстаци ипродиона у вишњама и трешњама... 48 6. ЗАКЉУЧАК... 51 ЛИТЕРАТУРА... 57

Велику захвалност дугујем свом ментору, проф. др Сањи Лазић и доц. др Драгани Шуњки на помоћи и саветима који су допринели изради овог мастер рада. Такође се захваљујем својој породици на несебичној подршци у току студирања, као и свима који су ми на било који начин помогли током мастер студија и при изради мастер рада.

Р Е З И М Е Одређивање остатака ипродиона у трешњама и вишњама У оквиру рада спроведен је оглед са циљем да се утврди ток разградње ипродиона у плодовима трешања и вишања након почетне примене препарата, као и његов коначни садржај након истека каренце. Препарат на бази ипродиона коришћен је за третирање у препорученој дози, на засадима средње касне сорте трешње и средње ране сорте вишње на локалитету Книћанин, у околини Зрењанина. Након примене препарата обављано је периодично узорковање, и то: (1) непосредно након примене; (2) након 2. дана; (3) након 4. дана; (4) након 6. дана; (5) након 8. дана; (6) након 10. дана. За екстракцију ипродиона коришћена је QuEChERS метода, а одређивање остатака је изведено течном хроматографијом са DAD детектором (Agilent 1100, United States) и Agilent Zorbax Eclipse C18 колоном. Као мобилна фаза коришћен је ацетонитрил и вода у односу (55/45), са протоком 0.9 ml/min, температуром колоне 25 C и ињектованом запремином 20 µl и таласном дужином од 250 nm. Метода је валидована у складу са стандардом SANCO/12495/2011. Постигнута је висока репродуктивност одређивања ипродиона примењеном методом са RSD < 0,93% за узорке трешања, односно 1,8% за узорке вишања. У испитивању линеарности одговора детектора у зависности од концентрације добијена је линеарна зависност са коефицијентом корелације R² од 0,998 за вишњу и 0,994 за трешњу. Лимити детекције и квантификације за одређивање ипродиона у трешњама за коришћену методу износе 0,02 mg/kg и 0,06 mg/kg, а за вишњу 0,02 mg/kg и 0,06 mg/kg. Резултати одређивања утицаја матрикса вишања и трешања на одговор детектора износе за вишњу 94,10%, а за матрикс трешње 97,59%. Највећи ниво остатака је утврђен у узорцима вишње и трешње 1 сат након примене пестицида. Средња вредност остатака износила је 0.40 mg/kg и 0,29 mg/kg респективно. Ниво остатака ипродиона опадао је у току експеримента, достижући нивое испод 0,37 и 0,121 mg/kg код вишње, односно испод 0,29 и 0,1 mg/kg код трешње. Ови резултати показују да су седам дана након примене, остаци ипродиона били испод вредности МДК (3,0 mg/kg) дозвољеног у Србији (Службени Гласник 29/2014) и Европској Унији. Време полураспада ипродиона у вишњама је 3,30 дана, а у трешњама 3,47 дана. Кључне речи: ипродион, трешње, вишње, остаци, DT 50

Summary S U M M A R Y Determination of Iprodione residues in sweet and sour cherries This thesis presents findings of the evaluated evaluated degradation of iprodione in sweet and sour cherry samples in the period from the product application to the pre-harvest interval. An orchard of sweet cherries and sour cherries located at Knićanin village near Zrenjanin was used in the study. Iprodione was applied in accordance with the manufacturer s recommendations, in order to protect cherries from their most important pests. Cherry fruit samples were collected periodically: (1) immediately upon iprodione application; (2) after 2nd day; (3) after 4th day; (4) after 6th day; (5) after 8th day; (6) after 10th day. To perform the extraction of iprodione, QuEChERS method was utilized. Determination was performed by means of HPLC-UV diode array detection system (Agilent 1100, United States) with Agilent Zorbax Eclipse C18 column As the mobile phase used being acetonitrile and water in the ratio (55/45), with a flow rate 0,9 ml / min, column temperature 25 C, and the injected volume of 20 ml and a wavelength of 250 nm. The method was validated in accordance with SANCO / 12495/2011. Achieved a high reproducibility of the determination of iprodione applied method with RSD <0,93% for samples sweet cherries and 1,8% for samples sour cherries. The detector response linearity tests for drug concentrations obtained a linear relationship with a correlation coefficient R² of 0,998 to 0,994 cherry and cherry. The limits of detection and quantification for the determination of iprodione in the cherries for the method used is 0,02 mg / kg and 0,06 mg / kg, and for the cherry 0,02 mg / kg and 0,06 mg / kg. Results of determining the impact matrix sour cherries and sweet cherries on the response of detectors amounted to sour cherries 94,10% and 97,59% matrix sweet cherries. The highest level of remains was found in samples of sweet and sour cherry 1 hour after application of pesticides. The mean value of residues was 0,40 mg / kg and 0,29 mg / kg respectively. The level of residues of iprodione were declining in the course of the experiment, reaching levels below 0,37 and 0,121 mg / kg in sour cherry or below 0,23 and 0,1 mg / kg in sweet cherry. These results show that seven days after application, iprodione residues were below the MRL (3.0 mg / kg) permitted in Serbia (Official Gazette 29/2014) and the European Union. The half-life of iprodione in sour cherries is 3,30 days and 3,47 days in the sweet cherries. 2

Summary Keywords: iprodione, cherries, remains, DT 50 3

Увод 1. УВОД Здравствени квалитет хране је важан чинилац који директно утиче на здравље људи. Примена средстава за заштиту биља је неопходна да би се произвела довољна количина хране, али је при томе неопходно правилно штитити биљке од проузроковача биљних болести, шеточина и корова. Принос и квалитет производа директно зависи од правилне примене пестицида. Непоштовање временског периода од последњег третирања биљака до бербе или жетве (каренца) доводи до нежељених последица по здравље људи, животиња и корисних инсеката. Из тог разлога је изузетно важна контрола садржаја остатака (резидуа) у храни, води и земљишту. Да би храна била безбедна за здравље, данас је потребно поштовати стандарде од почетне примарне производње до коначне потрошње (www.tehnologijahrane.com). Више од 40% површине земљишта се користи за пољопривреду, тако да пољопривредни произвођачи имају велику одговорност у заштити биодиверзитета. Употребом техника као што су стандардизована и контролисана употреба пестицида, органски начин узгајања и плодоред, произвођачи могу да одрже равнотежу између одрживог развоја, повећања приноса и очувања екосистема (Новитовић и сар., 2009). Воће и поврће су врло кварљив производ посебно за време зрења и након брања, када може доћи до значајних губитака због болести, поремећаја транспирације и старења. Иако је 4

Увод погоршање квалитета воћа и поврћа после брања под утицајем великог броја различитих фактора, микробиолошке активности спадају у далеко најважније факторе (Sommer, 1982). У развијеним земљама око 10-30% убраног воћа и поврћа је изгубљенo због кварења након бербе, a у земљама у развоју су губици преко 30-50% годишње, због недостатка санитарних услова и хлађења (Salunkhe et al., 1991). Без примене хемијских средстава за заштиту биља која се користе за сузбијање штетних инсеката, глодара, проузроковача биљних болести, нематода и других, изгубило би се чак и двоструко више. Воће је веома значајан извор људске хране која обезбеђује организму неопходне и корисне материје као што су витамини, минерали, влакна и друге материје које повољно утичу на здравствено стање организма. Пошто су ова корисна једињења лабилна у термичкој обради потребно је користити свеже воће, а ту постоји ризик излагању остацима пестицида кориштеним у току производње. Нежељени остаци пестицида коришћених у производњи трешње и вишње негативно утичу на њихов здравствени квалитет. Максимално дозвољена количина остатака у храни је прописана Правилником за сваку активну материју пестицидa. За одређивање њиховог садржаја потребно је валидовати методе, што је и циљ овог рада. 5

Теоријски део 2. ТЕОРИЈСКИ ДЕО 2.1 Трешња и вишња Приказ изгледа трешње и вишње и њихова систематика дати су на Сликама 1 и 2. Царство Дивизија Ред Породица Род Врста Plantae Magnoliophyta Rosales Rosaceae Prunus Prunus avium Слика 1. Изглед и систематика трешње (Извор: www.wikipedia.org) Царство Дивизија Ред Породица Род Врста Plantae Magnoliophyta Rosales Rosaceae Prunus Prunus cerasus Слика 2. Изглед и систематика вишње (Извор: www.purewellbeing.com) Трешња је веома значајна воћна врста за гајење у многим крајевима наше земље. Она се узгаја у многим деловима света, али никада није стекла такву популарност у Северној Америци коју има у Европи и на Блиском истоку. Трешње су вероватно настале у региону између Каспијског мора и Црног мора, где дрвеће расте и даље у дивљини. Трешње су гајене у Грчкој од пре 300 година пре наше ере, и не дуго након тога пренесене су у Италију. 6

Теоријски део Римљани су донели трешње у Енглеску рано у првом веку, и тамо је настало много сорти до 16. века. Француски колонисти су донели трешње у канадске покрајине, а енглески колонисти су донели семе трешње у Нову Енглеску (Marini, 2014). Трешње и вишње су веома значајне врсте воћа. Поред тога што њихов плод има широку примену у прехрамбеној индустрији и индустрији сокова, веома су цењене и због присуства антиоксиданаса. Преко 80% произведених плодова у свету се прерађује, а око 10% се користи у свежем стању. Трешње и вишње су вишегодишње биљке, чији је животни и биолошки циклус веома сложен, спадају у ред гајених биљака које су осетљиве на болести и штеточине и њихово гајење није могуће ако се не спроводи адекватна заштита, поготово када су услови за развој патогена изузетно повољни. Плодови трешања имају велику хранљиву, технолошку и дијететску вредност, а погодни су и за разноврсну домаћу и индустријску прераду, дубоко смрзавање и за потрошњу у свежем стању. Посебно треба истаћи вредност плодова који садрже богаство и разноврсност хранљивих састојака, као што су: шећери (12%), органске киселине (0,7%,), пектини, минералне материје, витамини (А, B1, B3, B5, B6 И C). Нарочито треба истаћи значај трешње као извора органског јода, која подмирује потребе организма човека за овим елементом. Биолошко-производне особине којима се трешња одликује чине је такође рентабилном и корисном културом (Благојевић и Божић, 2012). У нашој земљи постоје повољни природни услови за успешно гајење трешње на широком простору од равничарских до предпланинских региона, што посебно пружа могућност активирања неискоришћених пространих брдско-планинских региона. Међу континенталним воћкама, трешња се по производњи налази на шестом месту у свету, иза јабуке, крушке, брескве, шљиве и кајсије. Трешња спада међу најстарије воћне врсте које се гаје на нашим просторима. У Србији су дуго биле гајене домаће, аутохтоне сорте, а од средине 1950-тих почиње систематски рад на увођењу и производњи новијих и квалитетнијих сорти трешње. Последњих година, из наше земље је повећан и извоз свежих плодова трешње. Вишња спада у најстарије воћке које је човек користио. Сматра се да је пореклом из Mале Aзије која се пре почетка наше ере преко Грчке и старог Рима ширила у друге земље. Данас се вишња као и трешња узгајају на свим континентима. Европа је као континент, а Русија као земља највећи произвођач вишње у свету 2011, а 2012. Русија се налази на другом месту иза Турске. Плод вишње је богат органским и минералним материјама, и садржи 1,5% беланчевина; 0,5% масти и доста угљених хидрата који су веома корисни за људску исхрану и здравље. Садржај C витамина је до 43 mg, значајна количина P, и мање количине А, B1, B2 и 7

Теоријски део различитих биоактивних материја. У сортименту Србије има 75% наше домаће сорте Oблачинска која је врло родна и прилагођена нашим условима (најефикасније искоришћава сунчеву енергију), али има и низ недостатака у квалитету плода што умањује привредни значај ове воћне врсте. Приноси вишње зависе од примене агротехнике, а крећу се и до 20 тона по хектару (Благојевић и сар, 2012 ). 2.2 Болести трешње и вишње Вишња и трешња је мање подложна болестима и штеточинама, али ипак неких година извесни паразити и штеточине наносе знатну штету и умањују њихов принос и квалитет. Hајзначајнији проузроковачи болести трешње и вишње су Monilinia fructicola која није пронађена у Европи, Monilinia laxa која се налази у много земаља света, Blumeriella jaapii која је значајна код вишања, Botrytis cinerea значајна за трешње, као и Alternaria spp, која је такође значајна за трешње. Phytoplasma је опасан проузроковач болести и трешње и вишње (Ciancio and Mukerji, 2008). Производњу вишње и трешње редовно угрожава неколико проузроковача болести међу којима су проузроковач болести лисне пегавости (Blumeriella jaapii) и сушења цветова и гранчица и трулежи плодова (Monolinia spp). Програмом заштите од Blumeriella jaapii и Monolinia spp. уједно се сузбијају и друга обољења вишње и трешње која су од мањег економског значаја. Међу најзначајније паразите спадају: Monilinia laxa, Blumeriella jaapii, Clasterosporium carpophilum, Leucostoma cincta, бројни вируси и фитоплазме. Сушење цветова, гранчица и мрка трулеж плодова коштичавог воћа - Monilinia spp, Monilinia laxa спадају међу економски најштетније паразите трешње и вишње (Слика 3). Изазива је гљива Sclerotinia cinerea чији се конидијски стадијум назива Monillia laxa. Ова болест углавном напада вишњу, трешњу, шљиву, кајсију, а јавља се и на другим воћкама (крушки, дуњи, бадему и јабуци). Monilinia spp. спада у врло опасне проузроковаче болести трешања и вишања која је у стању да проузрокује огромне губитке. 8

Теоријски део Слика 3. Monilinia на трешњи (Извор: www.wikipedia.org) Током 1999. године, која је била изразито кишна и повољна за развој патогена, у већини засада вишње у Војводини где није спроведена адекватна хемијска заштита, забележено је сушење цветова и гранчица и до 100%. Сви делови цвета могу бити заражени: тучак, чашични листићи, крунични листићи. Након продирања у ткиво биљке гљива спорулише врло брзо и покрива заражено ткиво са масом сивкастих конидија (Балаж, 2000). Оболело ткиво постаје светло смеђе, а цветови постају некротични и лако опадају што је посебно изражено код вишње и кајсије. Патогени мицелиј продире кроз петељке у гранчице и гране (Хрустић и сар, 2012). У циљу заштите цветова углавном се изводе до три третирања и једно у фази почетка дозревања плодова (водећи рачуна о каренци). Гљива се одржава у облику мицелије у мумијама или зараженим гранчицама. У нашим условима за остварење првих инфекција и њихово ширење најзначајније су конидије. Апотецији и аскуси са аскоспорама се у природи ретко формирају. По правилу, плодови постају осетљиви у фази почетка дозревања, али у запуштеним и хемијски незаштићеним воћњацима и зелени плодови могу бити заражени (Балаж и сар., 2012). Често се ради избегавања појаве резистентности комбинују системични и протективни фунгициди (Ивановић и Ивановић, 2001). Оптималне температуре за остварење инфекције се крећу у интервалу од 22-25 C. На овим температурама довољно је да цвет буде влажан 3-4 часа (Joseph et al., 1995). Фунгициди који се могу користити су на бази боскалида, пираклостробина, ипродиона, карбендазина, прохлораза и ципродинила. Због могућег развоја резистентности гљиве на наведене фунгициде не сме се примењивати само једно од наведених једињења, већ је потребно алтернативно примењивати фунгициде различитог механизма деловања (Милетић и Тамаш, 2011). У Калифорнији, САД, у борби против овог патогена најбоље резултате показали су фунгициди: Беномил- Бенлејт, течни бакар укључује 9

Теоријски део Бордовску чорбу, ипродион - Rovral, пропиконазол- Orbit, тиофанат-метил- Topsin M и винклозолин Ronilan (Christensen, 2003). Беномил је искључен Анексом 1 Директиве 91-414- EEC, због негативних токсиколошких својстава (тератогеност, мутагеност, токсичност) (EU pesticide Database, 2012). Шупљикавост лишћa трешње и вишње изазива гљивица Clasterosporium Carpophilum(син.Stigmina carpophylla) која штети и осталом коштуњичавом воћу (Слика 4). Слика 4. Шупљикавост лишћа изазвана Clasterosporium carpophilum (Извор: www.agronomija.rs) Услови влажне климе одговарају ширењу паразита па се већ у јуну примети решеткаст изглед лишћа. Услед ове болести долази до превременог опадања лишћа чиме се смањује асимилациона површина па се ствара мање асимилатива што доводи до смањења отпорности при ниским температурама и измрзавању летораста. Прскање вишње пред цветање препаратима Captan 50 WP ili Merpan, Akord, Folicur, бакарним препаратима, показало се као ефикасна мера борбе против ове болести. Као још једна мера заштите препоручује се одсецање и спаљивање сасушених гранчица и ластара на којима се налазе рак ране изазване паразитом. Пегавост лишћа изазива гљива Blumeriella jaapii (Cherry Leaf Spot) која је код нас најштетнији паразит вишње и трешње у производним засадима. У свету је такође широко распрострањена на трешњама и вишњама. У месецу мају и јуну појављују се светле, а затим тамне пеге неправилног облика (Слика 5). 10

Теоријски део Слика 5. Пегавост лишћа трешње (Извор: www.extension.umn.edu) Пеге се спајају тако да лисна површина постаје испуњена тамним пегама. Оболело лишће услед смањења хлорофила не може да врши фотосинтезу, па крајем јула и августа лишће опада и вишња остане без лишћа. Топла влажна јесен доводи до изнуривања вишње што се негативно одражава на отпорност према зимским мразевима што доводи до знатно смањеног приноса следеће године. У влажним климатским условима болест изазива озбиљне дефолијације у другој половини сезоне, тј. средином лета, па услед тога биљке не могу да се аклиматизују на ниске зимске температуре па се угинуће стабала у зимском периоду повећава (Holb et al., 2010). Некроза плодова вишње и трешње Pseudomonas syringae се појављује током маја и јуна у виду мањих тамно зелених и влажних пега елипсастог облика што говори о инфекцији изазваној бактеријама. Пеге се шире захватајући често и цео плод. Ткиво у оквиру пега тамни, изумире и благо се улеже (Слика 6). После кишовитог периода уочавају се светлонаранџасте гомилице спора што представља карактеристичан знак када су у питању и друге сличне микозе воћака. Приликом интезивног развоја некрозе оболели плодови се смежуравају и суше и боја им постаје црна. Проценат оболелих плодова може досећи и 80%. 11

Теоријски део Слика 6. Некроза трешње изазвана Pseudomonas syringae (Извор: extension.oregonstate.edu) Pseudomonas syringae је код нас доста проучаван као проузроковач сушења разних воћака (кајсије, брескве и вишње), али су подаци о овом патогену на трешњи веома оскудни. За сада се на трешњи могу уочити симптоми који указују на бактериозну природу обољења али експериментално нису доказани (Балаж и сар. 2012). Фунгициди за сузбијање болести трешње и вишње У Табели 1 приказани су сви регистровани фунгициди за заштиту трешње и вишње у Републици Србији, Секулић и Јеличић, 2013. 12

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити трешое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013). Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца BAKROCID- S-25 (WP; Cu iz bakar oksi- hlorida 250 g/kg, Župa) BORDOVSKA ČORBA S-20 (WP; Cu izbakar sulfatai kalcijum hidroksida 200 g/kg; Župa) BORDOVSKA ČORBA WP-20 (WP; Cu izbakar sulfata i kalcijum hidroksida 200 g/kg; Zorka) KUPRUBLAU-WP (WP; Cu izbakar sulfata i kalcijum hidroksida 200 g/kg; CNCCJC) 1-1,5% (100-150 g у 10 l впде) 1; ОВП PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar sulfata 250 g/kg; Župa ) PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar sulfata 250 g/kg; Zorka ) PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar Шупљикавпст лишћа У мирпваоу па дп пуцаоа пуппљака (00-03 BBCH ) sulfata 250 g/kg; RTB Bor ) KUPRAGIN (WP; Cu iz bakar oksisulfata 350 g/kg; Župa) 1% (100 g у 10 l впде) BAKARNI OKSIHLORID-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg, Galenika) BAKROCID S-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg, Župa) BAKARNI KREČ-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg Zorka) 0,75% (75 g у 10 l впде) 2; ОВП BEVEBLAU KREČ (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg CNCCJC) 13

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити трешое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца ZIRAM ZORKA (WP; ciram 750 g/kg; Zorka) FITOCIRAM 75-S (WP; ciram 750 g/kg; CNCCJC) CIRAM S-75 (WP; ciram 750 g/kg; Župa) Шупљикавпст лишћа 0,2% (20 g у 10 l впде) -превентивнп ппчеткпм листаоа, већи Инфекципни пптенцијал, ппвпљни услпви за ширеое пбпљеоа -пп ппјави симптпма (мај-јун), маои инфекципни пптенцијал и маое ппвпљ-ни услпви за ширеое пбпљеоа 3; 21 дан MERPAN 50-WP (WP; kaptan 500 g/kg; Makhteshim Chemical) CAPTAN 50-WP (WP; kaptan 500 g/kg; Arysta) VENTURION (WP; kaptan 500 g/kg; Jugohem) Шупљикавпст лишћа 0,2-0,3% (20-30 g(ml) у 10 l впде) -превентивнп ппчеткпм листаоа, већи Инфекципни пптенцијал, ппвпљни услпви за ширеое пбпљеоа -пп ппјави симптпма (мај-јун), маои инфекципни пптенцијал и маое ппвпљ-ни услпви за ширеое пбпљеоа 3; 21 дан KAPTAN 48-SC (SC; kaptan 480 g/l; Veterinarski zavod) Шупљикавпст CАPI (SC; kaptan 480 g/l; VST Hemovet) лишћа 0,2-0,3% (20-30 g(ml) у 10 l Од ппчетка листаоа(10 BBCH ) Дп пред сазреваое плпдпва (77 BBCH) 2; 21 дан впде) Пламеоача Од цветаоа(59 BBCH) дп предсазреваое плпдпва 14

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити трешое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца METOD 480-SC (SC; kaptan 480 g/l; Galenika) Шупљикавпст лишћа 2-3 l/ha (20-30 ml na 100 m² ) Превентивнп, пре пствариваоа услпва за заражаваое 4; 21 дан BLAUVIT (WP; Cu iz bakar hidroksida 500 g/kg Župa) Шупљикавпст лишћа 0,5-1% (50-100 g у 10 l впде) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 1% (100 g у 10 l впде) Превентивнп, дп цветаоа (дп 61 BBCH) 2; ОВП OCTAVE (WP; prohloraz manganhlorid kompleks 500 g/kg Bayer) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва Шупљикавпст лишћа 0,04 %(4 g у 10 l впде) Тпкпм цветаоа (59-69/71 BBCH) У прецветаваоу (69/71 BBCH) и ппсле бербе пп пптреби (91-92 BBCH ) 2; ОВП MANKOGAL-80 (WP; mankozeb 800 g/kg; Galenika) BEVESAN 45-M (WP; mankozeb 800 g/kg; CNCCJC) DITHANE M-45 (WP; mankozeb 800 g/kg; Dow) Мрка пегавпст 0,2-0,25% (20-25 g у 10 l впде Превентивнп пп ппјави првих листпва (11 BBCH), и пп Прецветаваоу (69/71 BBCH) 3; 21 дан CHROMODIN S-65 (WP; dodin 650 g/kg; Agriphar) AGRODIN 65 WP (WP; dodin 650 g/kg; Agriphar) Мрка Пегавпст лишћа 0,1% (10g у 10 l впде) Од прецветаваоа (69 BBCH) 3; 21 дан 15

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити вишое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца KUPRAGIN (WP; Cu iz bakar oksisulfata 350 g/kg;župa) Шупљикавпст лишћа 1% (100 g у 10 l впде) У мирпваоу па дп пуцаоа пуппљака(00-03 BBCH ) 2; ОВП BAKROCID- S-25 (WP; Cu iz bakar oksi- hlorida 250 g/kg, Župa) Шупљикавпст лишћа 1-1,5% (100-150 g у 10 l впде) У мирпваоу (00-03 BBCH ) 2; ОВП BORDOVSKA ČORBA WP-20 (WP; Cu izbakar sulfata i kalcijum hidroksida 200 g/kg; Župa) BORDOVSKA ČORBA WP-20 (WP; Cu izbakar sulfata i kalcijum hidroksida 200 g/kg; Zorka) KUPRUBLAU-WP (WP; Cu izbakar sulfata i kalcijum hidroksida 200 g/kg; Шупљикавпст лишћа 1-1,5% (100-150 g у 10 l впде) У мирпваоу (00-03 BBCH ) 2; ОВП CNCCJC) PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar sulfata 250 g/kg; Župa ) PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar Шупљикавпст лишћа 1-1,5% (100-150 g у 10 l впде) У мирпваоу (00-03 BBCH ) 2; ОВП sulfata 250 g/kg; Zorka ) PLAVI KAMEN (kristali iz rastvora; ; Cu izbakar sulfata 250 g/kg; RTB Bor BAKARNI OKSIHLORID-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 Шупљикавпст лишћа 0,75% (75 g у 10 l впде) У мирпваоу (00-03 BBCH ) 2; ОВП g/kg, Galenika) BAKROCID S-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg, Župa) BAKARNI KREČ-50 (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg, Zorka) BEVEBLAU KREČ (WP; Cu iz bakar oksihlorida 500 g/kg, CNCCJC) 16

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити вишое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца MERPAN 50-WP (WP; kaptan 500 g/kg; Makhteshim Chemical) CAPTAN 50-WP Шупљикавпст лишћа 0,2-0,3% (20-30 g(ml) у 10 l впде) -превентивнп ппчеткпм листаоа, већи Инфекципни пптенцијал, ппвпљни услпви за ширеое пбпљеоа -пп ппјави симптпма (мај-јун), маои инфекципни пптенцијал и маое ппвпљ-ни услпви за ширеое пбпљеоа 3; 21 дан (WP; kaptan 500 g/kg; Arysta) VENTURION (WP; kaptan 500 g/kg; Jugohem) KAPTAN 48-SC (SC; kaptan 480 g/l; Veterinarski zavod) MERPAN 48 SC (SC; kaptan 480 g/l; Makhteshim Chemical) Шупљикавпст лишћа 2,5-3 l/ha (25-30 ml na 100 m² ) 3; 21 дан CАPI (SC; kaptan 480 g/l; VST Hemovet) Шупљикавпст лишћа пламеоача 0,2-0,3% (20-30 g(ml) у 10 l впде) Од ппчетка листаоа(10 BBCH ) Дп пред сазреваое плпдпва (77 BBCH) Од цветаоа(59 BBCH) дп предсазреваое плпдпва 2; 21 дан METOD 480-SC (SC; kaptan 480 g/l; Galenika) Шупљикавпст лишћа 2-3 l/ha (20-30 ml na 100 m² ) Превентивнп, пре пствариваоа услпва за заражаваое 4; 21 дан CUPROXAT 0,2-0,35% ( SC; Cu izbakar sulfatatrobaznog 190 g/l; Nufarm ) Шупљикавпст лишћа (20-35 ml у 10 l впде) У мирпваоу(00-03 BBCH) 1; OVP ZIRAM ZORKA (WP; ciram 750 g/kg; Zorka) FITOCIRAM 75-S (WP; ciram 750 g/kg; CNCCJC) CIRAM S-75 (WP; ciram 750 g/kg; Župa) DIZIRAM 76 WG Шупљикавпст лишћа 0,2% (20 g u 10 l впде) -превентивнп ппчеткпм листаоа, већи Инфекципни пптенцијал, ппвпљни услпви за ширеое пбпљеоа -пп ппјави симптпма (мај-јун), маои инфекципни пптенцијал и маое ппвпљ-ни услпви за ширеое пбпљеоа 3; 21 дан (WP; ciram 760 g/kg; Taminko) 17

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити вишое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца BLAUVIT (WP; Cu iz bakar hidroksida 500 g/kg Župa) Шупљикавпст лишћа 0,5-1% (50-100 g у 10 l впде) Сушеое цветпва и 0,5-1% (50-100 g у гранчица и мрка трулеж 10 l впде) плпдпва Превентивнп, дп цветаоа (дп 61 BBCH) 2; ОВП CHORUS 50-WG (WG; Ciprodinil 500 g/kg; Syngenta) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,3-0,5 kg/ha (3-5 ml на 100 m 2 ) Системик. Од ппчетка цветаоа дп пунпг балпна тј. Прецветаваоа (59-65/67 BBCH). 2; 14 дана CIPRODEX (EC Ciprodinil 300 g/l; Makhteshim Chemical Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,05% (5 ml у 10 l впде) Превентивнп, пре услпва за заразу, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа (59-65 BBCH 2; 14 дана CORMAX (WG Ciprodinil 750 g/l; Shangai Mio Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж 0,2 kg/ha (2 g na 100 m²) Од ппчетка цветаоа дп прецветаваоа (59-69 BBCH). 2; 14 дана GALOFUNGIN T (SC; Tiofanat-metil 450 g/l; Galenika Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,05% (5 ml у 10 l впде) Превентивнп, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа 2; ОВП FOLICUR 250-EW (EW; tebukonazol 250 g/l Bayer) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,75 l/ha (7,5 ml na 100 m²) Једнп третираое: Ппчеткпм цветаоа(61-63 BBCH); Два третираоа: пд цветнпг балпна дп пунпг цветаоа (59-67 BBCH) 2; ОВП (21 дан) AKORD (EC; tebukonazol 250 g/l; Galenika) 3; 21 дан AKORD WG (WG; tebukonazol250 g/l; Galenika) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,75 kg/ha (7,5 g na 100 m²) 3; 21 дан Dional 500-SC (SC; Iprodion 500 g/l; Galenika) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 1,5 l/ha (15 ml na 100 m²) Тпкпм зреоа (83-87 BBCH) 2; 7 дана 18

Теоријски део Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити вишое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца KUBIK (SC; Iprodion+ Karbendazim 175+87,5 g/l; Galenika) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,25% (25 ml у 10 l vode) У цветаоу ( 59-65 BBCH) 2; 42 дана КUBIK PLUS (SC; Iprodion + tiofanat metil 167+167 g/l; Galenika Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 2l/ha (20 ml na 100 m²) У цветаоу ( 59-65 BBCH) 2; ОВП GALOFUNGIN 500 SC (SC; karbendazim 500 g/l; Galenika SEKVENCA (EC; difenokonazol 250 G/kg; Galenika Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,06% (6 ml у 10 l впде) 0,2 l/ha (2 ml na 100 m²) Од ппчетка цветаоа дп пунпг цветаоа 1; ОВП У фази белих балпна (59 BBCH) дп пунпг цветаоа (65/67 BBCH) 3; ОВП PRESING (EC; propikonazol 250 g/l; Župa) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,05% (5 ml у 10 l впде) У фази белих балпна (59 BBCH) дп пунпг цветаоа (65 BBCH) 2; ОВП ZAMIR 400 EW (EW; prohloraz + tebukonazol 267+133 g/l; Makhteshim Chemical MYSTIC PRO 500 EC (EC; prohloraz + tebukonazol 300+200 g/l; Nufarm Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 1 l/ha (10 ml na 100 m²) 0,8 l/ha (8 ml na 100 m²) Превентивнп, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа Превентивнп, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа 2; ОВП 2; ОВП DELAN 700-WG (WG; ditianon 700 g/kg; BASF Agro) Сива пегавпст Лишћа, Шупљикавпст лишћа 0,075% (7,5 ml у 10 l впде) Од прецветаваоа дп завршенпг раста младара (67-91 BBCH) 2; ОВП ОRIUS 25-EW (EW; tebukonazol 250 g/l; Irvita Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,75 kg/ha (7,5 g na 100 m²) Првп: у фази белих балпна (59 BBCH) Другп: у прецветаваоу ( 67 BBCH) 2; 21 дан OCTAVE (WP; prohloraz manganhlorid kompleks 500 g/kg Bayer) LENTOS 400 (EC; prohloraz 400 g/l; Nufarm Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва Шупљикавпст лишћа Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж 0,04 % (4 g у 10 l впде) 0,05% (5 ml у 10 l Тпкпм цветаоа (59-69/71 BBCH) 2; ОВП У прецветаваоу (69/71 BBCH) и ппсле бербе пп пптреби (91-92 BBCH ) Превентивнп, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа плпдпва Мрка пегавпст впде) 0,05-0,06% (5-6 ml у 10 l Ппсле бербе плпдпва 2; ОВП 19

Теоријски део впде ) Табела 1. Фунгициди регистрпвани у Србији кпји се кпристе у заштити вишое (Пестициди у прпмету у Србији 2013, Секулић и Јеличић, 2013).-наставак Препарат (фпрмулација, активна супстанца и прпизвпђач) Бплести кпје сузбија Кпличина примене Време примене Брпј третираоа и каренца Сушеое цветпва и гранчица и мрка 0,05% (5 ml у 10 l Превентивнп, пд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа LENTOS 400 (EC; prohloraz 400 g/l; Nufarm) трулеж плпдпва впде) 0,05-0,06% 2; ОВП Мрка пегавпст (5-6 ml у 10 l Ппсле бербе плпдпва впде ) MIRAGE 45-EC (EC; prohloraz 450 g/l; Irvita Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,5 l/ha (5 ml na 100 m²) Oд ппчетка цветаоа дп прецветаваоа, превентивнп, пре пствариваоа услпва за заразу 2; ОВП BRAVO 720-SC (SC; hlorotalonil 720 g/l; Syngenta) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж Шупљикавпст лишћа 1,5-2 l/ha (15-20 ml na 100 m²) Од цветнпг балпна дп краја цветаоа (59-67 BBCH) Од прецветаваоа дп истека каренце(пд 69 BBCH 3-4 ОВП 3-4; 14 дана FENIKS (SC; smesa primarnog i sekundarnog kalijum fosfita + hlorotalonil 583 + 250 Пегавпст лишћа 3-4 л/ха (30-40 ml na 100 m²) Ппсле бербе плпдпва (91 BBCH) Није пграничен (пп пптеби) ОВП g/l;luxenbourg) MANKOGAL-80 (WP; mankozeb 800 g/kg; Galenika) BEVESAN 45-M (WP; mankozeb 800 g/kg; CNCCJC) DITHANE M-45 (WP; mankozeb 800 g/kg; Dow) Мрка пегавпст 0,2-0,25% (20-25 g у 10 l впде Превентивнп пп ппјави првих листпва (11 BBCH), и пп Прецветаваоу (69/71 BBCH) 3; 21 дан CHROMODIN S-65 (WP; dodin 650 g/kg; Agriphar) AGRODIN 65 WP (WP; dodin 650 g/kg; Agriphar) Мрка Пегавпст лишћа 0,1% (10g у 10 l впде) Од прецветаваоа (69 BBCH) 3; 21 дан BEVEDODIN (WP; dodin 650 g/kg; CNCCJC) GALOFUNGIN (WP; karbendazim 500 g/l; Galenika Мрка пегавпст Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,08-0,1% (8-10 g у 10 l впде) 0,05% (5 g у 10 l впде) Од прецветаваоа дп када Су плпдпви пкп пплпвине Крајое величине (65-75 BBCH) Од ппчетка цветаоа дп пунпг цветаоа (59-67 BBCH) 3; 21 дан 1; ОВП SIGNUM (WG;boskalid+ piraklostrobin 267+67 g/kg; BASF SE) Сушеое цветпва и гранчица и мрка трулеж плпдпва 0,562-0,75 Kg/ha (5,62-7,5g na 100 m²) Првп: пред цветаое (61 BBCH) Другп: у прецветаваоу ( 67 BBCH) 2; 14 дана 20

Теоријски део 2.3 Фунгициди дикарбоксимиди Дикарбоксимиди су фунгициди чији се механизам деловања заснива на инхибицији преноса сигнала, односно трансдукције сигнала (FRAC, 2015). Фунгициди из ове групе у земљишту прелазе брзо у 3,5-дихлоранилин. Aктивно коришћење дикарбоксимида у току више година смањило је њихову ефикасност. Резистентност се развила у многим проузроковачима обољења на многим биљним врстама укључујући јагоде и остале заштићиване биљке па се препоручује да се користи у комбинацији са другим фунгицидима. Резистентност на дикарбоксимиде је прво пронађена на Новом Зеланду (Elmer and Gaunt, 1994). Дикарбоксимидe је први спомињао Fujinami et al, (1971). У овој групи се налазе активне материје: ипродион који је пронашао Lacroix et al, (1974), винклозолин (Pommer and Mangold, 1975) и просимидон (Hisada et al, 1977), који је писао и о неким аспектима локал системичности. Овај историјат је описао Morton and Stoub, (2008) у свом делу: A short History of Fungicides. Значајајан спектар деловања дикарбоксимида je на проузроковаче: Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium spp., Monilia spp., Alternaria spp., Phoma solanicola, Didimela, Rhizoctonia solani, Helmintosporium и др, од којих су код нас најзначајнији проузроковачи Monilia и Botrytis (Милетић и Тамаш, 2011). 2.3.1 Ипродион Ипродион 3 (3,5-дихлорфенил) Н изопропил - 2,4 диоксо имидазолидин 1 карбоксамид (IUPAC) припада групи дикарбоксимида. То је несистемични фунгицид са кантактним, протективним и куративним дејством на споре и мицелије великог броја паразитних гљива на орашастом као и на коштичавом и јабучастом воћу, у виновој лози, поврћу, житарицама, уљаној репици, памуку, и украсном биљу, као што су Alternaria spp., Botrytis spp., Corticium, Fusarium spp., Helminthosporium spp., Monilinia spp., Phoma spp., 21

Теоријски део Pleiochaeta spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp. итд.. Користи се као селективни, контактни фунгицид за заштиту раличитих врста воћа, поврћа, житарица, уљане репице, сунцокрета, трава и украсног биља, као и фунгицид за третирање семена. Ово је прво једињење из групе дикарбоксимида које је развијено 70-тих година, а затим су откривени винклозолин и просимидон. Ипродион је антиспорни фунгицид са куративним ефектима и налази се у III класи отрова. Употреба хемијских средстава за заштиту биља за последицу може имати присутне остатке у трешњама и вишњама, који касније могу прећи у продукте прераде у зависности од технолошког процеса. Методе анализе остатака ипродиона у храни биљног порекла су: гасна хроматографија са детектором електронског захвата (GC-ECD), којом се одређују резидуе ипродиона у узорцима са високим садржајем воде, високом киселости, великом садржају масти, сувим узорцима, са LOQ од 0,01 mg/kg, као и GC-MS за одређивање ипродиона у узорцима са високим садржајем воде (парадајз) и киселим узорцима (грожђе) (France, 1996; France 2013). Такође, валидован је и метод HPLC-MS/MS за одређивање ипродиона у биљном матриксу са високим процентом воде (парадајз, краставац, лубенице, тикве) са LOQ од 0,01 mg/kg (France, 2009), www. ec.europa.eu/food/plant/pesticides/index_en.htm. Табела 2: Физичко-хемијске карактеристике ипродиона Име Ипродион (Iprodione) Молекулска формула C 13 H 13 Cl 2 N 3 O 3 Хемијска група Дикарбоксимиди Хемијско име (IUPAC) Ипродион 3 (3,5-дихлорфенил) Н изопропил - 2,4 диоксо имидазолидин 1 карбоксамид CASRN 36734-19-7 Молекулска тежина 330,2 Хемијска структура Растворљивост у води 12 mg/l (20 C) K os 975-1200 22

Теоријски део Притисак паре 5 x 10-7 Pa (25 C) Log Kow 3,0 (ph 3 и 5) pki Не јонизује Код нас je максимално дозвољена количина (МДК) остатака ипродиона у трeшњама и вишњама прописана Правилником у износу од 3 mg/kg (Службени гласник РС, број 25/2010, EC регулатива 396/2005). Вредности токсиколошких параметара за ипродион (Јањић и Елезовић, 2010) Акутна орална LD50 (у mg/kg): пацов 3500; миш 4000. Пас> 2000, Акутна дермална LD50 (у mg/kg): пацов >2500; кунић >1.000, Акутна инхалациона LC50 (4 h, у mg/l): пацов>3,3. Вредности екотоксиколошких параметара за ипродион (Јањић и Елезовић, 2010) Oрганизме у води (у mg/l): дафније (LC50 48 h) 0,25; остриге (EC50 96 h) 0,95; рачићи (EC50 96 h) 0,77; рибе (LC50 96 h) калифорнијска пастрмка 4,1; плавошкрга сунчаница 3,7; херлекин 2,8; амерички шаран 1,2, птице (орална LD50, у mg/kg): дивља патка >400; белорепа препелица 930, пчелу (LD50, у µг/пчели): контактна >400. Деградација ипродиона (DT 50) у земљишту је 20-160 дана. Ипродион је веома отрован за дафније, отрован је за рибе, а практично неотрован за пчеле. Штетан је за птице. Каренца (у данима) за ипродион: 42 сунцокрет, уљана репица,7- вишња; ОВПсеменски кромпир (Јањић и Елезовић, 2010). 2.4 Хроматографија Хроматографија има широку примену у аналитици и значајну улогу у новим открићима у хемији, биологији, медицини, фармацији, клиничкој хемији и екологији. Елементи који чине основу хроматографског система су непокретна и покретна фаза и испитивана супстанца. Хроматографија се заснива на раздвајању супстанци из смеше између две фазе чија је површина додира велика. Ова расподела је последица различитих брзина кретања растворка у хроматографском систему, а која зависи од интеракције молекула растворка са молекулима обе фазе, као и од хемијске структуре растворка (Лончар, 2010). 23

Теоријски део Под анализом узорака се раније сматрало само раздвајање смеше на њене компоненте, али је увођење најсавременијих типова детектора проширило основно значење хроматографије. Хроматографске методе данас служе, осим за пречишћавање сложених узорака, и за анализу раздвојених компонената смеше. Покретна фаза може бити инертни гас или течност а непокретна фаза чврста, порозна или течна, тј. танак течни филм нанет на одговарајући чврсти материјал (механички или хемијски везана фаза). Хроматографски сепарациони системи се деле према природи покретне и непокретне фазе. На основу горе наведеног дата је подела типова хроматографије на Слици 7. 2.4.1 Течна хроматографија У колонској течној хроматографији, раздвајање се врши у колони где је смештена непокретна фаза, а покретна фаза се креће кроз колону под утицајем гравитације или притиска. Крајњи циљ је да се добију одвојене зоне у којима се налазе чисте супстанце. У танкослојној (планарној, ламинарној) хроматографији, покретна фаза се креће кроз слој непокретне фазе под дејством капиларних сила и није потребан притисак за изазивање тока покретне фазе. Раздвајање се изводи на танком слоју неког чврстог носача где се добијају одвојене зоне чистих супстанци из смеше. 24

Теоријски део Слика 7. Подела хроматографије 2.4.2 HPLC са DAD детектором Високоперформантна течна хроматографија (HPLC) je врста хроматографске методе која има одличну способност раздвајања и одређивања неиспарљивих, термонестабилних и поларних органских једињења из сложених смеша. HPLC има улогу да раздвоји компоненте из сложених смеша. Мала количина узорка (аналита) ињектира се у систем, а затим се уводи у погодан растварач, односно мобилну фазу коју чине растварачи или њихове смеше (нпр.вода, органски растварачи метанол, ацетонитрил и др). Вода може да садржи соли, пуфере или неке друге супстанце како би се 25

Теоријски део побољшало раздвајање. Могуће је користити и градијентно елуирање, што подразумева промену односа компонената мобилне фазе у току анализе. Ток покретне фазе улази у колону у којој се налази одговарајућа стационарна фаза (паковање ситних честица различитих облика и великих површина или порозни монолити, микроскопски слој). Сам процес раздвајања и задржавања компоненти у колони врло је сложен и зависи од низа фактора (Богојевић 2012). Пример шеме HPLC система спрегнутог са масеним спектрометром (MS) дат је на Слици 10. Детектор служи за превођење сигнала масе (концентрације) у електрични сигнал, који се затим појачава, модулише и мери (региструје). Најважнија особина детектора је његова осетљивост. Међутим, веома важну практичну вредност, нарочито у квантитативним одређивањима, имају: универзалност (специфичност), линеарност одзива, шум, брзина одзива, мртва запремина и др. Може се рећи да су најпримењенији тзв. UV-детектори, односно детектори засновани на апсорпцији зрачења из UV и видљиве области електромагнетног спектра (преко 70%), а у мањој примени су детектори на бази мерења флуоресценције (~15%) детектори на бази мерења индекса рефракције (~5%), електрохемијски (~5%) и сви остали детектори (<5%) (Слика 8, Error! Reference source not found.). Најновије конструкције овог детектора омогућавају непрекидно мерење (снимање) апсорпционог спектра супстанце (diode array - DAD) што ове детекторе чини изузетно погодним за квалитативну, а посебно за квантитативну анализу (Марјановић, 2001). Низ фотодиода се користи тако што се помоћу великог спектра таласа различитих дужина обавља прецизно мерење на излазу из HPLC. Овај детектор даје могућност идентификације компоненте упоређивањем спектара. Слика 8. Илустрација DAD оптичког система (http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/course7.html/) 26

Теоријски део Слика 9. Алгоритам за избор детектора (http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/course8.html) Слика 10. Шема HPLC-MS система Као детектор може да се користи масени спектрометар (МS), који има одличну моћ идентификације сваке компоненте и пружа детаљне структурне информације за већину једињења али без могућности њиховог лаког раздвајања. МS служи као детектор HPLC, тако да су ова два инструмента повезана у јединствен систем. Општа примена овог сложеног 27

Теоријски део инструмента обухвата идентификацију, квалитативну и квантитативну анализу органских једињења из сложених смеша. У ове поступке спада одређивање молекулске масе и формуле, одређивање елементарног састава непознатих органских једињења, структурна анализа (одређивање функционалних група и сл), одређивање степена чистоће једињења (присуство контаминирајућих супстанци), као и процес изолације и пречишћавања супстанци препаратима HPLC (Богојевић, 2012). Ретенционо време, тј. време задржавања компоненти у колони карактеристично је за одређену супстанцу. Коришћење високог притиска на уласку у колону повећава линеарну брзину и даје компонентама мање времена за задржавање, што побољшава резолуцију хроматограма. 2.5 Методе анализе пестицида Методе за припрему узорака зависе од низа параметара као што су врста узорка (испитиваног аналита), количине аналита, присутних нечистоћа и врсте контаминирајућих супстанци у узорку, продуката који настају током разградње узорка итд. Током припреме мора се узети у обзир и агрегатно стање узорка, његова количина као и оптимизација, лакоћа и економски еспект методе припреме узорка итд. Припрема узорка може бити врло једноставна, може подразумевати обично растварање у одговарајућем растварачу, а може изискивати и употребу других техника и метода. Овај корак у анализи може бити најсложенији корак, посебно ако се ради о разради нове методе за анализу неког узорка. QuEChERS метода екстракције и пречишћавања Припрема узорака на конвенционалан начин а посебно течно-течна екстракција захтева много времена и лабораторијског материјала, употребу хлорованих растварача. Steven J. Lehohotay, хемичар из Центра за микробиолошко-биохемијско и хемијско истраживање остатака пестицида и научник Michelangelo Anastassiades из Штутгарта, развили су QuЕChЕRS методу. QuЕChЕRS представља скраћеницу за: Брза (Quick) 8 узорака може да се уради за свега 30 минута; Једноставна (Easy) није компликована за руковање; 28

Теоријски део Јефтина (Cheap) користи се мање материјала и потребно је мање времена за обраду узорака; Ефикасна (Effective) даје тачне податке за низ различитих типова једињења; Робустна (Rugged)- поузданост у току употребе Сигурна (Safe) не захтева коришћење хлорисаних растварача. Екстракција се обично врши ацетонитрилом. QuEChERS стандардни протокол подразумева: хомогенизацију 10g узорка са 10ml ацетонитрила што траје 1 минут, па се додаје стандард и после тога се меша са 4g MgSO 4 + 1g NaCl (1 мин) и центрифугира. Даље се меша 1 ml супернатанта sa 25 mg Chromabonda Diamino+ 150 mg MgSO 4, мућка се (30 s) и затим центрифугира. После тога следи анализа (GC-MS или LC-MS). 2.6 Методе анализе пестицида у трешњама и вишњама Подаци доступни у литератури описују многобројне експерименталне услове одређивања остатака пестицида у различитим матриксима воћа. Cho и сарадници (2008) су поредили приносе екстракција одређивања остатака пестицида у воћу користећи убрзану екстракцију помоћу растварача (ASE), суперкритичну флуидну екстракцију (SFE) и течнотечну екстракцију (LLE). Приноси поменутих екстракција су се кретали у интервалу од 75,6-127,1% и били су приближних вредности независно од типа екстракције. Узимајући у обзир да се ASE екстракцијом, при којој се користе растварачи на повишеним температурама и притисцима, постиже бржи процес екстракције и смањује потрошња растварача за 95%, аутори су препоручили овај вид екстракције при одређивању остатака пестицида у воћу гасном хроматографијом са масеном спектрометријом (GC-MSD). Lehotay еt al, (2005) су испитивали остатке 229 пестицида, укључујући и ипродион у салати и наранџи, коришћењем брзе, једноставне, јефтине, ефикасне, робусне и безбедне методе (QuEChERS). Поступак подразумева eкстракцију (15 g узорка) са 15 ml ацетонитрила, након чега следи додавање 6 g анхидрованог MgSO 4 и 1,5 g NaCl. После центрифугирања, екстракт се декантује у епрувету, која садржи 300 mg примарног секундарног амина (PSA), 1,8 g анхидрованиог MgSO 4, што представља поступак пречишћавања. После другог мућкањa и центрифугирања, ацетонитрилни екстракт је пребачен у аутосемплер бочице за 29

Теоријски део истовремену анализу гасном хроматографијом / масеном спектрометријом и течном хроматографијом / тандем масеном спектрометријом. У раду Ковачевић и сар, (2005), приказани су резултати анализе 24 узорка вишања са локалног тржишта на остатке пестицида. У узорцима су одређивани фунгициди: ипродион, просимидон и винклозолин који припадају хемијској групи дикарбоксимида. За одређивање остатака ових фунгицида коришћена је реверзно - фазна течна хроматографија високог притиска уз употребу детектора са низом диода (DAD). Коришћена је мобилна фаза ацетонитрил и вода уз проток 1ml/min на Zorbax Eclipse XDB-C8 колони. Детекција је вршена на 224nm (λ=450/100nm) i 208nm (λ=450/100nm). Референтни раствори ипродиона, просимидона и винклозолина припремљени су у опсегу концентрација од 0,1-10 µg/ml и хроматографисани на описани начин. За ипродион је добијена једначина регресионе праве y=85.9144x+11.1997 (корелациони коефицијент r=0.9994), за просимидон y=75,1939x-9,7022 (корелациони коефицијент r=0.9999) и винклозолин y=57.8692x-10.0153 (корелациони коефицијент r=0.9998). При одређивању поновљивости за шест одређивања у истом узорку утврђено је да RSD % износи од 11 до 14. Ефикасност је рађена на три нивоа концентрација (0.5, 1 и 5 mg/kg) и за сва три испитивана једињења је износила од 75 до 87%. Узорци су припремани на следећи начин: одмерена количина вишања се екстрахује метанолом у хомогенизатору при максималној брзини обртаја у трајању од 2 минута. После екстракције хомогенизат се центрифугира 15 минута на 10.000 обртаја. Супернатант се декантује, узме аликвот и разблажи 8 пута водом. Та количина раствора се пропусти кроз унапред припремљену SPE колону са C8 носачем (500mg/6 ml), након пропуштања, колона се испере са 15 ml воде и осуши. Резидуе фунгицида се елуирају са колоне метилен-хлоридом и елуат се упари у струји азота до сува. Остатак се раствори у 0,50 ml ацетонитрила, профилтрира кроз микрофилтер и хроматографише. У испитиваним узорцима ипродион и винклозолин нису детектовани, само је у једном узораку доказано присуство просимидона (0,28 mg/kg) што је испод МДК. У раду Stojanović et al, (2005), Испитивано је присуство карбендазима у 65 узорака вишања са локалног тржишта у току 2004. године. За одређивање карбендазима је коришћена реверзно фазна високоперформантна течна хроматографија. Остаци су екстраховани етил ацетатом. Фунгициди су раздвојени на RP колони, уз мобилну фазу ацетонитрил и вода (40:60) и коначно одређени на UV детектору. За квантитативно одређивање коришћен је метод стандардног додатка. Метода је валидована и добијени су следећи резултати: лимит детекције (UV-Vis detection λ = 285 nm) је износио 0,03 mg/kg, релативна стандардна 30

Теоријски део девијација 0,35 и 1,08 % и "recovery" je био између 73,6 и 88,4% на 0,20, 0,80 и 2,00 mg/kg фортификационом нивоу. Само у 4 узорка вишања су нађени остаци карбендазима изнад МДК. У раду Вуковић и сар, (2005) коришћена је реверзно фазна високо ефикасна метода течне хроматографије за одређивање ипродиона, просимидона и винклозолина у 65 узорака вишања са локалног тржишта, узетих током 2004 године. Остаци су екстраховани етил ацетатом и ацетонитрилом. Фунгициди су раздвојени на Zorbac Eclipse SDB колони, коришћењем мобилне фазе ацетонитрил-вода. За одређивање је коришћен DAD детектор (таласна дужина 222 nm). За квантитативну анализу је коришћен метод стандардног додатка. Границе детекције методе износиле су 0,01mg/kg; 0,01/mg/kg и 0,05 mg/kg за ипродион, просимидон и винклозолин респективно. Релативне стандардне девијације биле су 0,73 и 3,61% а постигнут је принос екстракције од 83,7 до 93,2% на нивоу обогаћења од 0,10; 0,50 и 1,00 mg/kg. Поредак концентрација је био oд 0,01 до 0,35 mg/kg. Установљено је да поједини узорци за ипродион и просимидон прелазе 10 mg/kg, а за винклозолин 5 mg/kg. 31

Задатак и циљ рада 3. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА Задатак рада је оптимизација методе одређивања остатака ипродиона у трешњама и вишњама, високоперформантном течном хроматографијом уз DAD детектор, дефинисањем параметара екстракције и пречишћавања, као и основних валидационих параметара (лимита детекције, лимита квантификације, поновљивости, приноса екстракције и линеарности одзива детектора) у складу са захтевима стандарда SANCO/12571/2013. Постављање огледа на средње раној сорти трешње и средње касној сорти вишње, на локалитету Книћанин, уз третирање препаратом Dional 500 SC (500 g/l ипродиона) у концентрацији од 0,15% (15 g у 10 l воде). Пратиће се садржај остатака ипродиона у узорцима трешње и вишње узетим одмах након третирања по сушењу депозита, као и након 2, 4, 6, 8, 10 дана од примене препарата. Циљ истраживања је одређивање остатака фунгицида ипродиона применом валидоване методе у узорцима средње ране сорте трешње и средње касне сорте вишње. Одредиће се полувек разградње ипродиона у плодовима трешње и вишње и провериће се исправност постављене каренце за овај фунгицид, након његове примене у количини препорученој за заштиту од проузроковача сушења цветова и гранчица и мрке трулежи плодова. Резултати анализа ће показати да ли су детектоване вредности остатака ипродиона биле испод максимално дозвољених количина прописаних нашим и Правилником Европске Уније. 32

Материјал и методе рада 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА Спроведено истраживање обухватило је четири фазе. Прва фаза садржи следеће кораке: Постављање огледа у воћњаку. Третирање вишања и трешања препаратом Дионал 500 SC (500 g/l ипродиона) у количини од 0.15% ili 1,5 L/ha; узорковање плодова вишње и трешње непосредно након третирања по сушењу депозита, након 2, 4, 6, 8, 10, дана; припрема просечних узорака масе 500 g; припрема просечних лабораторијских узорака масе 100 g који се чувају у замрзивачу до момента анализе. У првој фази истраживања постављен је оглед 21. маја, третирањем вишањe и трешњe (средње ране и средње касна сорте) препаратом Дионал 500 SC (500 g/l ипродиона) на локалитету Книћанин, у концентрацији 0,15%. Трешња је третирана у фази 85 BBCH, а вишња у фази 83 BBCH. Узорковани су плодови вишње и трешње и припремљени просечни узорци масе 500 g, који су се у пластичним врећицама транспортовали до лабораторије. У лабораторији су припремљени просечни лабораторијски узорци масе 100 g, који су се чували до момента анализе на температури -20 C. Узорковање вишања и трешања обављено је одмах након третирања, односно по сушењу депозита (нулти дан), након 2, 4, 6, 8, 10, дана. Узети су и узорци нетретираних вишања и трешања, гајених под истим условима, за спровођење валидације методе. Друга фаза подразумевала је валидацију методе одређивања ипродиона у вишњама и трешњама у складу са захтевима стандарда SANCO/12571/2013. У овој фази одређивањем параметара - лимита детекције, лимита квантификације, прецизности методе, поновљивости ињектовања, приноса екстракције, линеарности одзива детектора и матрикс ефекта, валидује се метода за одређивање остатака ипродиона. 33

Материјал и методе рада Трећа фаза обухватала је анализу остатака ипродиона у узорцима вишње и трешње применом валидоване методе. Четврта фаза обухватала је обраду података добијених хроматографском анализом и одређивање DT50. Експериментални део испитивања обављен је у "Лабораторији за биолошка испитивања и пестициде", Департмана за фитомедицину у заштиту животне средине, Пољопривредног факултета у Новом Саду, током априла 2015. године. За испитивање су коришћени следећа опрема и хемикалије: 4.1 Опрема Tечни хроматограф Agilent technologies, 1100 Serie, Колона Zorbax SB C18 (250 mm 3 mm, 5 μm), Agilent Technologies, Филтери за мобилну фазу Hewlett Packard, Nylon Filter Membranes 9301-0895; 47 mm, pore size 0.45 µm, Аналитичка вага Shimadzu A 200, USK 1 ултразвучна када, Sonic SR, Гаџин Хан. Филтери Vortex 4.2 Хемикалије Ипродион аналитички стандард 99,5% (Dr Ehrenstorfer, Germany), Ацетонитрил, HPLC чистоће (''J.T.Baker'', Darmstadt, Germany), QuECheRS Extract Pouches, EN Method Cat. No. 5982/5650. QuECheRS Dispersive SPE Kit, Cat. No. 5982/5056. QuECheRS Dispersive SPE Kit, High Pigment, Cat. No. 5982/5356. 34

Материјал и методе рада 4.3 Дефинисање хроматографских услова За одређивање остатака ипродиона у узорцима вишања и трешања примењена је течна хроматографија (HPLC) са детектором са низом диода (DAD). Основни раствор. На аналитичкој ваги је у нормалном суду од 100 ml одмерено 10 mg аналитичког стандарда ипродиона чистоће 99,5%. Стандард је растворен у ацетонитрилу и чуван у фрижидеру. Концентрација основног раствора била је 100 µg /ml. Радни раствори. Разблажењем основног раствора стандарда у ацетонитрилу припремљена је серија раствора концентрације 0,06 0,5 µg/ml (SSC раствори). Ове концентрације употребљене су за испитивање приноса екстракције и дефинисање хроматографских услова коришћењем следећих параметара: линеарност одговора детектора, лимит детекције (LOD), лимит квантификације (LOQ), поновљивост, тачност Линеарност одзива детектора се дефинише као могућност да се у датом опсегу детектује сигнал који је директно пропорционалан концентрацији или количини аналита. Опсег линеарности зависи од природе аналита и типа детектора. У линеарном опсегу регресиони коефицијент р треба да буде r>0,999 (Ndlovu, 2005), а одсечак на ординати y 0 не треба значајно да одступа од нуле. Параметар r представља степен расипања тачака око идеалне праве линије r>1,000, док y 0 вредност представља индикатор постојања проблема утицаја матрикса или губитка аналита адсорпцијом на зидовима судова или деградацијом (Onjia i сар., 2002). Линеарност се утврђује кроз опсег аналитичког поступка и представља се регресионом једначином. Линеарност је проверена ињектовањем раствора стандарда ипродиона концентрације 0,06 0,5 µg/ml. Израчунавањем нагиба праве приказана је линеарност зависности површине пика од концентрације аналита. Лимит детекције (LOD) је најнижа концентрација неког аналита која се може детектовати, али не неопходно и квантитативно одредити. Лимит квантификације (LOQ) је најмања вредност аналита у узорку која може бити квантитативно одређена са одговарајућом прецизношћу и тачношћу (Onjia и сар., 2002). LOD и LOQ су одређени ињектовањем стандарда ипродиона концентрације 0,1 µg/ml десет пута. 35

Материјал и методе рада Прецизност аналитичке методе изражава близину слагања (степен расипања) измеду вредности низа мерења добијених из вишеструких узорковања истог хомогеног узорка под прописаним условима. Прецизност се најчешће изражава као стандардна девијација или коефицијент варијације. За одређивање прецизности треба урадити најмање пет анализа. Код инструменталних хроматографских метода препоручују се RSD вредности 2% (Onjia и сар., 2002). Прецизност може да се разматра на три нивоа: поновљивост, средња прецизност и репродуктивност. У овом раду проверена је поновљивост одређивања раствора стандарда ипродиона у матриксу вишања и трешања. Поновљивост је одређена ињектовањем стандарда ипродиона концентрације 0,125 µg/ml пет пута и проверена израчунавањем релативне стандардне девијације. Тачност је одређена као проценат аналитичког поступка recovery за познату додату количину аналита у нетретиране узорке вишања и трешања. Табела 3: Услови рада HPLC/DAD Мобилна фаза A ACN B вода Однос мобилних фаза 55/45 Температура колоне 25 C Проток кроз колону 0,900 ml/min Таласна дужина DAD 250 nm Инјектована запремина 10 µl Ретенционо време ипродиона 5,941 min 36

Материјал и методе рада 4.4 Провера приноса екстракције ипродиона из вишања и трешања QuEChERS методом Екстракција ипродиона из вишања и трешања изведена је QuEChERS методом. Нетретирани плодови вишње и трешње-контрола, након што су очишћени од коштице, хомогенизовани су помоћу ручног блендера. На ваги је одмерено 10 g узорка и додато је 10 ml ацетонитрила и снажно мућкано 1 min. Након тога је додата пуферска смеша соли (1000 mg натријум-цитрат, 500 mg натријумхидрогенцитрат-сесквихидрат, 4000 mg магнезијумсулфат и 1000 mg натријум-хлорид) и интензивно је мућкано 1 min, на Vortex-у 1 min и центрифугирано 5 min на 3000 обртаја. 6 ml из ACN фазе је пренесено у кивету са смешом 150 mg PSA и 900 mg MgSO 4 (QuECheRS Dispersive SPE Kit, Cat. No. 5982/5356), односно 150 mg PSA, 855 mg MgSO 4 и 45 mg GCB (QuECheRS Dispersive SPE Kit, Cat. No. 5982/5356) за вишње. Након тога је интезивно је мућкано 1 min, на Vortex-у 1 min и центрифугирано 5 min на 3000 обртаја. На крају, аликвот добијеног горњег слоја је упараван под струјом азота, растворен у 1 мл ацетонитрила, филтриран кроз мембрански филтер од 0.45 µm и пребачен у виал за HPLC анализу. 37

Резултати и дискусија 5. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 5.1 Одређивање ипродиона применом HPLC/DAD Остаци ипродиона у вишњама и трешњама анализирани су применом HPLC/DAD под условима датим у табели 3. Квалитативна HPLC анализа присуства неког једињења изводи се на основу ретенционих времена уз потврду присуства - поређењем UV спектара пика стандардне супстанце и пика у узорку, док се квантитативна заснива на величини аналитичког сигнала. На y- оси дијаграма налази се вредност струјног сигнала детектора израженог у његовим интерним јединицама (mau), а на x-оси ретенционо време (min). Анализом раствора аналитичког стандарда ипродиона утврђен је максимум пика на 6,023 min. Хроматографисањем екстракта вишње и трешње са додатим стандардом ипродиона под истим условима, максимум добијеног пика био је на 5,941 min, односно 5,945 min. На сликама 8, 10 и 11. приказани су хроматограми стандарда ипродиона у ацетонитрилу и у матриксу вишања и трешања, док је на сликама 9, 12 и 13. дат спектар ипродиона такође у ACN и у матриксима вишања и трешања. Слика 8. Хроматограм стандардног раствора ипродиона у ацетонитрилу 0,50 µg/ml 38

Резултати и дискусија mau 2 DAD1, 5.935 (2.1 mau, - ) of IPRO0029.D 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm Слика 9. Спектар ипродиона у раствору ацетонитрила Слика 10. Хроматограм стандардног раствора ипродиона у матриксу вишања 0,5 µg/ml 39

Резултати и дискусија Слика 11. Хроматограм стандардног раствора ипродиона у матриксу трешања 0,5 µg/ml mau DAD1, 5.888 (4.0 mau, - ) of IPRO0030.D 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm Слика 12. Спектар ипродиона у матриксу вишања 0,5 µg/ml 40

Резултати и дискусија mau DAD1, 6.005 (4.0 mau, - ) of IPRO0031.D 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm Слика 13. Спектар ипродиона у матриксу трешања 0,5 µg/ml 5.2 Параметри валидације Хроматографски услови су проверени испитивањем линеарности одзива детектора, прецизности и тачности методе, матрикс ефекта, одређивањем лимита детекције и квантификације, као и одређивањем зависности површине пика од ињектоване запремине. 5.2.1 Линеарност одзива детектора Линеарност одзива детектора одређена је на пет нивоа концентрација, ињектовањем 10 µl стандардног раствора ипродиона у опсегу масених концентрација 0,06 0,5 µg/ml. Калибрациони стандарди припремљени су у ацетонитрилу. Зависност величине аналитичког сигнала (површине пика) од масене концентрације стандардног раствора за вишње приказана је на Графику 1. Калибрациона крива је дефинисана као зависност површине пика од концентрације и изражена једначином регресије (y=a*x-b) са коефицијентом корелације (R 2 ). Аналитички и статистички подаци добијени методом линеарне регресије у компјутерском програму Microsoft Office Excel 2007, дати су у Табели 4. У опсегу испитиваних масених концентрација ипродиона постигнута је добра линеарност детектора. Добијене вредности указују да повећање садржаја унетог једињења линеарно прати повећање површине пика. За регресиону једначину, коефицијент корелације праволинијске зависности износио је 0,998, док је осетљивост мерења (одзив) изражена као 41

Резултати и дискусија коефицијент правца износила 2,516, што указује на велику осетљивост одређивања ипродиона овом методом. График 1. Линеарност одговора детектора Табела 4: Аналитичке и статистичке карактеристике калибрационе криве за одређивање ипродиона применом HPLC/DAD Параметри Опсег линеарности µg/ml 0,06 0,5 Једначина калибрационе криве y=113,6x 2,516 Нагиб 113,6 Одсечак 2,516 Коефицијент корелације 0,998 5.2.2 Лимит детекције (LOD) и лимит квантификације (LOQ) У овом раду лимит детекције је одређен на основу односа сигнал/шум базне линије (S/N). S/N је одређен мерењем сигнала аналита који се налази у ниској концентрацији и узорка без аналита, при чему је утврђена најнижа концентрација аналита коју је могуће 42

Резултати и дискусија детектовати. За лимит детекције узета је вредност концентрација која даје S/N=3. Лимит квантификације одређен је аналогно одређивању LOD, према S/N=10. Табела 5: Лимити детекције и квантификације одређивања ипродиона у узорцима вишања и трешања Лимит детекције LOD Лимит квантификације LOQ 0,02 mg/kg 0,06 mg/kg 5.2.3 Прецизност 5.2.3.1 Поновљивост методе Поновљивост је одређена ињектовањем 10 µl раствора стандарда ипродиона, припремљеног у матриксу вишања и трешања, концентрације 0,25 µg/ml, пет пута. Резултати у виду површина пикова приказани су у табели 6. Добијени резултати су статисички обрађени (Microsoft Office Excel 2007) и добијена вредност за RSD% је упоређена са захтевом за тражени ниво концентрација. Репродуктивност примењене хроматографске анализе потврђена је вредностима коефицијента варијације за серију поновљених мерења. Табела 6: Поновљивост површина стандарда у матриксу вишања и трешања Вишње Трешње 0,25 ug/ml 0,25 ug/ml ипродион ипродион Површина Површина 23,60 24,70 23,70 25,00 23,90 24,60 22,90 24,50 23,10 25,00 23,44 24,76 St dev 0,42 0,23 RSD% 1,80 0,93 43

Резултати и дискусија Вредности релативне стандардне девијације (RSD%) од 1,80% у матриксу вишања и 0,93% у матриксу трешања за површину пика показују да је постигнута висока репродуктивност одређивања ипродиона примењеном методом, обзиром да су прихватљиве вредности RSD 20%, у складу са SANCO/12571/2013. 5.2.4 Тачност одређивања ипродиона у узорцима вишања Као параметар тачности методе испитиван је принос екстракције (Rec, %) за пет нивоа обогаћења. Уобичајено се провера приноса екстракције ради на три нова, и то на нивоу MDK, 0,1 пута мањој и 1,5 пута већој концентрацији (SANCO/12571/2013). Обзиром да MRL за ипродион у вишњама према EU правилнику износи 3 mg/kg, док је према Правилнику Републике Србије МДК такође 3 mg/kg, принос екстракције је проверен на пет нивоа концентрација, од 0,06, 0,6, 1,5, 3,0 и 4,5 mg/kg. Провери приноса екстракције претходила је провера присуства ипродиона у узорцима вишања који су коришћени као нетретирана контрола. Просечна вредност приноса екстракције ипродиона из вишања постигнута овом методом је 71,5-99,5%, што у потпуности задовољава критеријуме одређивања остатака пестицида у храни (70-120%), сходно SANCO/12571/2013. 5.2.5 Тачност одређивања ипродиона у узорцима трешања За одређивање тачности методе и у узорцима трешања је испитиван принос екстракције (Rec, %) за пет нивоа обогаћења. Уобичајено се провера приноса екстракције ради на три нивоа, и то на нивоу MDK, 0,1 пута мањој и 1,5 пута већој концентрацији (SANCO/12571/2013). Обзиром да MRL за ипродион у трешњама према EU правилнику износи 3 mg/kg, док је према Правилнику Републике Србије МДК такође 3mg/kg, принос екстракције је проверен на пет нивоа концентрација, од 0,06 4,5 mg/kg. Пре провере приноса екстракције проверено је присуство ипродиона у узорцима трешања који су коришћени као нетретирана контрола. Просечна вредност приноса екстракције ипродиона из трешања постигнута овом методом је 77,9-108,1%, што у потпуности задовољава критеријуме одређивања остатака пестицида у храни (70-120%), сходно SANCO/12571/2013. 44

Резултати и дискусија 5.2.6 Зависност површине пика ипродиона од ињектоване запремине У раду је испитана и зависност површине пика ипродиона од ињектоване запремине. Коришћен је стандардни раствор ипродиона у матриксу трешања и вишања, концентрација 0,125 mg/ml. Резултати су приказани на Графику 2. и Графику 3. График 2. Зависност површине пика ипродиона од ињектоване запремине у узорку вишања График 3. Зависност површине пика ипродиона од ињектоване запремине у узорку трешања Анализом је утврђено да повећање ињектоване запремине линеарно прати повећање површине пика ипродиона. 45

Резултати и дискусија 5.2.7 Матрикс ефекат Како би се окарактерисала специфичност и селективност испитиване методе, проучаван је утицај осталих компонената матрикса провером присуства матрикс ефекта. За конструкцију калибрационих крива које обухватају и утицај самог испитиваног матрикса, аналитички стандард ипродиона је растворен у матриксу вишње, односно трешње, у испитиваном линеарном опсегу 5 различитих концентрација ипродиона (0,06 до 0,5 μg/ml) (MMC раствори). Ови раствори коришћени су и током развијања HPLC-DAD методе за одређивање ипродиона из вишње и трешње, како би се утицај матрикса на аналитички принос компензовао. На основу вредности површина пикова и концентрација ипродиона конструисане су калибрационе криве, са једначинама регресије (Табела 7). Табела 7. Аналитичке и статистичке карактеристике калибрационих крива ипродиона у матриксу вишње и трешње Параметри Вишња Трешња Опсег линеарности µg/ml 0,06-0,5 0,06-0,5 Једначина калибрационе криве y=119,5x-3,140 y=109,5x-5,219 Нагиб 119,5 109,5 Одсечак 3,140 5,219 Коефицијент корелације 0,995 0,996 Поређењем вредности нагиба калибрационе криве добијених коришћењем MMC раствора и SC раствора одређене су вредности матрикс ефекта (ME%). Утицај матрикса вишње на сигнал ипродиона применом ове методе износи 105,19%, односно 96,39% је матрикс ефекат трешње. Ови резултати говоре у прилог одсуства утицаја матрикса испитиваних воћних врста на одређивање ипродиона (Слике 14 и 15). 46

Резултати и дискусија Слика 14. Хроматограм екстракта нетретираног узорка вишње Слика 15. Хроматограм екстракта нетретираног узорка трешње 47

Резултати и дискусија 5.3 Oстаци ипродиона у вишњама и трешњама Метода валидована на претходно описан начин примењена је за проверу сарджаја ипродиона у трешњама и вишњама. Препарат на бази ипродиона примењен је у концентрацији препорученој за заштиту вишње и трешње од њених најзначајнијих болести. Трешње и вишње су узорковане почев од сушења депозита (0. дан), до истека каренце, сваког другог дана, а остаци ипродиона у узорцима обе вoћне врсте приказани су на Графицима 4 и 5. Користећи остварене резултате остатака ипродиона у плодовима трешања и вишања конструисана је крива деградације, и из једначине C t =C 0 e kt, где је C 0 почетна количина остатака пестицида након апликације и к константа разградње, одређена количина остатака пестицида током времена (C t ). У плодовима вишања и трешања DT 50 за ипродион израчунат је према формули DT 50 =ln2/k где је вредности k, константа разградње а ln природни логаритам (Gupta et al. 2008). График 4. Остаци ипродиона у плодовима вишње График 4. приказује вредности остатака ипродиона испитиваног у узорцима вишње седам дана након третирања. Највећи ниво остатака је утврђен у узорцима вишње 1 сат након 48

Резултати и дискусија примене пестицида, односно по сушењу депозита, те је средња вредност 0,40 mg/kg. Два дана након третирања садржај ипродиона се смањио за свега 7,2% и износио 0,37 mg/kg. Међутим, четвртог и шестог дана од третмана ниво ипродиона износио је 0,23 mg/kg и 0,16 mg/kg, односно 52,3% и 20,4% од почетне количине. Даље, садржај ипродиона се до истека каренце постепено смањивао и седмог дана имао вредност 0,15 mg/kg. Резултати добијени у овом огледу показују да је ниво ипродиона у плодовима вишње био испод МДК (3,0 mg/kg) прописаног у Србији (Службени Гласник 29/2014) и Европској Унији, одмах по сушењу депозита. При одређивању полу-века разградње ипродиона у плодовима вишње одређен је коефицијент правца за једначину кинетике првог реда (R 2= 0,896). На основу параметара једначине DT 50 ипродиона у вишњама износи 3,3 дана. График 5. Остаци ипродиона у плодовима трешње График 5. приказује максималан ниво остатака ипродиона у узорцима трешања утврђен по сушењу депозита износио је 0,29 mg/kg. Имајући у виду да Европска унија и наша земља прописују максимално дозвољену количину за ипродион у трешњама од 3,0 mg/kg, највећа количина присутног ипродиона била је знатно испод МДК. У узорцима прикупљеним 2. дана од третирања просечна вредност остатака ипродиона у узоркованим трешњама износила је 0,23 mg/kg. Даљом анализом утврђено је смањење садржаја ипродиона 49

Резултати и дискусија у узоркованим трешњама, те је по истеку периода каренце количина ипродиона смањена на 0,1 mg/kg. Полу-време разградње ипродиона у плодовима трешње третираним фунгицидом на бази ове активне материје износи 3,465 дана. Велики број истраживања се бавило судбином ипродиона у различитим плодовима биљака. Wang et al. (2012) су установили да је време полураспада ипродиона у зеленим листовима дувана 5,64-8,80 дана, док је време полураспада овог фунгицида у земљишту 7,50-9,93 дана. У истраживању које су спровели Salghi et al. (2013), ниво остатака ипродиона у брескви је био у опсегу између 0,52 и 0,06 mg/kg а пре времена жетве, као и након тог времена, је био испод законски прописаних граница. Анализа остатака ипродиона у парадајзу који је гајен у условима стаклене баште, је показала да је DT 50 за ипродион које је установљено у том експерименту је било 6,8 дана (Omirou et al. 2009). 50

Закључак 6. ЗАКЉУЧАК Оптимални услови за одређивање ипродиона постигнути су применом HPLC/DAD и Zorbax SB C18 kolone (250 mm 3 mm, 5 μm), Agilent Technologies, под следећим условима мобилна фаза ACN/дејонизована вода 55/45, t колоне 25 C, проток мобилне фазе 0,9 ml/min, таласна дужина 250 nm. линеарност детектора одређена је у опсегу концентрација од 0,06-05 µg/ml и потврђена је коефицијентом корелације од 0,998. лимити детекције и квантификације за одређивање ипродиона у плодовима вишње и трешње приказаном методом износе 0,02 mg/kg и 0,06 mg/kg. прецизност аналитичке методе изражена је кроз поновљивост одређивања раствора стандарда ипродиона у матриксу вишње и трешње. Добијене вредности релативне стандардне девијације (RSD%) од 1,80% и 0,93% указују да је постигнута висока репродуктивност одређивања ипродиона примењеном методом. Утицај матрикса вишње на сигнал ипродиона износи 105,19%, односно 96,39% за трешње, што говори у прилог одсуства утицаја матрикса испитиваних воћних врста на одређивање ипродиона. Вредности приноса екстракције за ипродион у вишњама и трешњама, за пет нивоа обогаћења, износе 71,5-99,5%, однсно 77,9-108,1%, респективно. На основу изнетог, може се закључити да приказана метода у потпуности задовољава критеријуме одређивања ипродиона у плодовима вишње и трешње, што препоручује ову методу за примену на реалним узорцима. На основу спроведеног истраживања може се рећи да би каренца за ипродион у вишњама и трешњама могла бити и краћа од препоручене, јер је количина остатака ипродиона у плодовима ових воћних врста била испод пропсане вредности МДК одмах по сушењу депозита. 51

Литература ЛИТЕРАТУРА 1. Балаж Ј. (2000): Monilia spp. Као паразит воћака. Биљни лекар бр.2-3. 155-162, Нови Сад 2. Балаж, Ј., Огњанов, В., Иличић, Р., Граховац, М. (2012): Важније микозе и бактериозе трешње. Биљни лекар, вол. 40, бр. 4, стр. 316-335. Универзитет у Новом Саду. Пољопривредни факултет, Нови Сад. 3. Балаж Ф., Балаж Ј., Тошић М., Стојшин В., Баги Ф. (2010): Фитопатологија- болести ратарских и повртарских биљака. Универзитет у Новом Саду. Пољопривредни факултет, Нови Сад. 4. Благојевић, Р., Божић, В. (2012): Технологија производње трешње, Ниш. 5. Благојевић, Р., Божић, В., Станковић, М (2012): Технологија производње вишње и мареле. Ниш. 6. Богојевић, С.(2012): Течна хроматографија високе перформансе-масена спектрометрија (HPLC-MS) примена у анализи културних добара, Живопис 6 (2012) 139-158. 7. Cho, S.k., Abd, El-Aty., Jeon, H.R., Choi, J.H., Shin, H.C., Shin, J.H (2008): Comparison of different exstraction methods for the simultaneous determination of pesticide residues in kiwi fruit using gas chromatography-mass spectrometry, Biomed Chromatogr. 22(7):725-35. 8. Christensen, J.(2003): Brown Rot of Stone Fruits. Department of Plant Pathology. University of Nebraska. Linkoln Ciancio, A., Mukerji, K. G. (2008): Integrated Management of Diseases Caused by Fungi, Phytoplasma and Bacteria. Springer Science + Business Media B.V, 2008. 9. Ciancio, A., Mukerji, K. G. (2008): Integrated Management of Diseases Caused by Fungi, Phytoplasma and Bacteria. Springer Science + Business Media B.V, 2008. 10. Elmer, G. and Gaunt, E (1994).: The biological characteristics of dicarboximide-resistant isolates of Monilinia fructicola from New Zealand stone-fruit orchards. Plant Pathology, 43: 130-137, 1994 52

Литература 11. Fujinami, A., Ozaki, K., Yamamoto, S. (1971) Studies on biological activity of cyclic amide compounds. Part 1. Antimicrobial activity of 3-phenyloxazolidine-2,4-diones and related compounds. Agric. Biol. Chem 35, 1707 1719.Gupta, M., Shanker, A. (2008). Persistence of acetamiprid in tea and its transfer from made tea to infusion. Food Chem. 111, 805-810. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.04.046 12. Gupta, M., Shanker, A. (2008). Persistence of acetamiprid in tea and its transfer from made tea to infusion. Food Chem. 111, 805-810. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.04.046 13. Hisada, Y., Kato, T., Kawase, Y. (1977) Systemic movements in cucumber plants and control of cucumber gray mould by a new fungicide, S-7131. Netherl. J. Plant Pathol. 83, 71 78. 14. Holb, I.J., Lakatos, P.,Aboniye, F. (2010): Some aspect of disease management of cherry leaf spot (Blumerielala jaapii) with special reference to pesticide use. Centre for Agricultural Sciences and Engineering. University of Debrecen 138 Boszormenyi St., 4032 Debrecen, Hungary. International Journal of Horticultural Science 2010, 16 (1):45-49. Agroinform Publishing House, Budapest, Printed in Hungary ISSN 1585-0404 15. Хрустић Ј., Михајловић М., Граховац М., Делибашић Г., Булајић А., Крстић Б., Тановић Б. (2012): Genus Monilinia on Pome and Stone Fruit Species. Pestic. Phytomed. Belgrade 2012, 287-297. 16. Ивановић М и Ивановић Д, (2001): Микозе и псеудомикозе биљака П.П: Де-еМ-Ве Београд 17. Јањић В., Елезовић, И. (2010): Пестициди у пољопривреди и шумарству у Србији, Седамнаесто, измењено и допуњено издање, Друштво за заштиту биља Србије, Београд. 18. Joseph, M.O., Ellon, I.Z., George, W.B.,David, F.R.,Kiyoto, V., Jerry, K.U. (1995): Compendium of stone fruit deseases. APS Press, The American Phytopathological Society 19. Ковачевић Д., Вуковић Г., Стојановић З. (2005): Одређивање остатака фунгицида у вишњама реверзно-фазном течном храоматографијом високог притиска, Зборник резимеа,vii саветовање о заштити биља, Соко Бања, 15-18. новембар 2005.године, стр. 117-118. 20. Kupiec, Tom (2004): High-Performance Liquid Chromatography. Analitical Research Laboratories Oklahoma City, Oklahoma. 53

Литература 21. Lacroix, L., Bic, C., Burgaud, L., Guillot, M., Leblanc, R., Riottot, R., Sauli, M. (1974) Etude des propriétés antifongiques d'une nouvelle famille des dérivés de l'hydantoine et en particulier du 26019 R.P. Phytiatrie-Phytopharmacie 23, 165 174 22. Lehotay S. J., de Kok A., Hiemstra M., Van Bodegraven P. (2005): Validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruit and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometrics detection, Journal Association of Official Analytical Chemists, 88, 595-614. 23. Лончар, Е. (2010): Молекулска структура и ретенција у течној хроматографији. Монографија. Технолошки факултет, Универзитет у Новом Саду. 24. Милетић Н. и Тамаш Н. (2011): Заштита вишње и трешње од проузроковача биљних болести и штеточина. Пољопривредни факултет, Универзитет у Београду. Зборник радова III саветовања,,иновације у воћарству Београд 2011. 25. Marini, R. (2014): Growing Cherries in Virginia. Virginia Cooperative Extension, 1-16, https://pubs.ext.vt.edu/422/422-018/422-018.pdf,,2014. 26. Morton, V., Staub, T. (2008): A Short History of Fungicides. Online, APSnet Features. doi: 10.1094/APSnetFeature-2008-0308. Staub T, 2008. 27. Ndlovu, I. (2005): Proficiency Testing Schemes or International Benchmarking? How a Laboratory in Mozambique Compares Internationally. Test and Measurement conference. The national laboratory association of South Africa September 2005. 28. Новитовић О., Ранђић Д., Новитовић А. (2009): Заштита животне средине. Ужице 2009. 29. Оњиа, А., Васиљевић, Т., Чокеша, Ђ., Лаушевић, М. (2002): Валидација хроматографске анализе. Хемијска индустрија, 56 (2), стр. 76-79. 30. Omirou, М., Vryzas, Z., Papadopoulou-Mourkidou E., and Economou A. (2009). Dissipation rates of iprodione and thiacloprid during tomato production in greenhouse. Food Chem. 116, 499 504. doi:10.1016/j.foodchem.2009.03.007 31. Pommer, E-H., Mangold, D. (1975) Vinclozolin (BAS 352F) ein neuer Wirkstoff zur Bekämpfung von Botrytis cinerea. Meded. Fak. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent 40, 713 722. 54

Литература 32. Савић, Љ.(2014): Методе екстракције биљних материјала; Упоредна анализа циркулаторне екстракције и екстракције применом суперкритичног угљен диоксида. Лековите сировине, број 34, 93-103, 2014. 33. Salghi, R., El Mouden, O., Errami, M., Bazzi, L., Zarrouk, A., Hammouti, B. and Al-Deyab, S.S. (2013). Dissipation of carbendazim and iprodion during cultivation of peaches in the Region of Souss Massa Valley (Morocco). J. Chem. 1, 18-23. 34. Salunkhe, D. K., Bolin H.R., Reddy N.R. (eds) (1991): Storage, processing, and nutritional quality of fruits and vegetables. Volume I. Fresh Fruits and vegetables. CRC press, Boston, MA, USA. 35. Секулић, Ј. и Јеличић, С. (2013): Средства за заштиту биља у промету у Србији 2013, Биљни лекар, бр.1-2/2013. 36. Sommer N. F. (1982): Postharvest diseases and storage life of kiwifruit. Dept of pomology University of California, Davis, CA 95616 U. S. A. 37. Stojanović Z., Kovacevic D., Vukovic G. (2005): Determination of Carbendazim in Cherry Samples from Domestic Market, Book of abstracts, 4th MGPR International Symposium of Pesticides in Food and the Environment in Mediterranean Countries and MGPR Annual Meeting 2005, 17. 38. Вуковић Г., Ковачевић, Д., Стојановић, З.(2005): Одређивање ипродиона, просимидона и Винклозолина у узорцима вишања са домаћег тржишта. МГПР Међународни симпозијум пестицида у храни и окружењу у Медитеранским земљама. 11000 Београд, 29. Новембар 54а, Србија. 39. Wang. X., Xu, G., Wang, F., Sun, H., Li, Y. (2012). Iprodione residues and dissipation rates in tobacco leaves and soil. Bull Environ Contam Toxicol. 89, 877-81. doi: 10.1007/s00128-012-0783-8 40. www. ec.europa.eu/food/plant/pesticides/index_en.htm 41. www.purewellbeing.com 42. www.wikipedia.org 43. www.extension.umn.edu 44. www.agronomija.rs 45. extension.oregonstate.edu 55

Литература 46. www.fitofarmacija.rs 2014 web. Pdf 47. www.faostat.fao.org 48. www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/course7.html О АУТОРУ Здравко М. Бјелица рођен је 1958. године у Гајдобри, Војводина, Република Србија. Основне академске студије завршио је 1983. године на Пољопривредном факултету у Београду, смер ратарство. У току пословне каријере радио је као агроном, а затим као руководилац производње у пољопривредном предузећу Слога из Перлеза, са каријером дугом преко 25 година и искуством у свим фазама производње ратарских култура. Такође је био на функцији агронома саветодавца при Министарству Пољопривреде Републике Србије. Контакт адреса: bzdrav@gmail.com 56