Χημικός χαρακτηρισμός των προϊόντων οξείδωσης του σκουαλενίου και εκτίμηση της προ-οξειδωτικής τους δράσης σε κλάσμα τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου Ελένη Ναζίρη, Μαρία Ζ. Τσιμίδου Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Τμήμα Χημείας, Α.Π.Θ. 6 ο Πανελλήνιο Επιστημονικό Συνέδριο ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Αθήνα 11 και 12 Ιουνίου 2015, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών
Εισαγωγικά στοιχεία 1 Σκουαλένιο (C 30 H 50 ): all-trans τριτερπενοειδής πολυακόρεστος αλειφατικός υδρογονάνθρακας με έξι μεμονωμένους διπλούς δεσμούς. Ανακαλύφθηκε στις αρχές του 20ου αιώνα από τον Ιάπωνα χημικό Mitsumaru Tsujimoto στο ηπατέλαιο των καρχαριών των βαθέων υδάτων (Squalus spp). 2
Εισαγωγικά στοιχεία 2...ένα μόριο με ιδιαίτερο ενδιαφέρον για όλους τους οργανισμούς και τον άνθρωπο. Πρόδρομη ένωση της βιοσύνθεσης των στερολών (π.χ. χοληστερόλη, εργοστερόλη, στιγμαστερόλη) και των τερπενίων (π.χ. ουβικινόνες, αίμη Α, δολιχόλη). 3
Φυσική παρουσία και σημασία σκουαλενίου Ήπαρ καρχαριών βαθέων υδάτων: 30-82% ικανότητα επίπλευσης Λιπίδια ανθρώπινης επιδερμίδας: 10% αντιμυκητιακή και αντιβακτηριδιακή δράση αποσβέστης της φωτοοξείδωσης των λιπιδίων 4
Θετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου Προληπτικές ιδιότητες έναντι της εμφάνισης διαφόρων μορφών καρκίνου Προστασία έναντι της στεφανιαίας νόσου Φαρμακευτικά σκευάσματα Συμπληρώματα διατροφής Μαλακτική και ενυδατική δράση Προστασία έναντι εγκαυμάτων και δερματικών παθήσεων Κοσμητική Δερματολογία 5
Κύρια διατροφική πηγή σκουαλενίου Σκουαλένιο (g/kg ελαίου) Παρθένο ελαιόλαδο: ~ 5000 mg/kg Σύστημα προσδιορισμού Προέλευση/Ποικιλία 5012-6503 1 GC Ισπανία/Picual 2363-6048 2 RP-HPLC Τυνησία/ Fakhari Douirat, Dhokar Douirat, Zarrazi Douirat, ChemlaliTataouine 2000-5100 3 RP-HPLC Ελλάδα/Διάφορες ποικιλίες 3882-5858 4 RP-HPLC Ελλάδα/Διάφορες ποικιλίες ~2900 5 GC Ιταλία/Εμπορικά δείγματα 1 Samaniego-Sanchez et. al., 2010; 2 Oueslati et al., 2009; 3 Grigoriadou et. al., 2007; 4 Psomiadou and Tsimidou, 2002; 5 Owen et al., 2000 6
Οξειδωτική σταθερότητα σκουαλενίου 1 Οι πληροφορίες σχετικά με την οξειδωτική σταθερότητα του σκουαλενίου είναι αρκετά περιορισμένες συγκριτικά με αυτές άλλων ολεφινών και αφορούν κυρίως εργασίες της περιόδου 1940-1980. Συγκεκριμένα, λόγω του υψηλού βαθμού ακορεστότητας σε συνδυασμό με το ότι είναι ένα 1,5-διένιο είχε χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο προσομοίωσης του φυσικού καουτσούκ, που είναι πλούσιο σε 1,4-διένια για τη διερεύνηση της οξειδωτικής σταθερότητας των πολυμερών λόγω της μεγάλης τεχνολογικής τους ανάπτυξης την παραπάνω περίοδο. 7
Οξειδωτική σταθερότητα σκουαλενίου 2 Bolland & Huges, 1949 Psomiadou, E., Tsimidou, M. Stability of virgin olive oil. I. Autoxidation studies. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 716-721. 8
Συμβολή του σκουαλενίου στην οξειδωτική σταθερότητα εδώδιμων λιπαρών υλών Αυτοξείδωση Φωτοξείδωση Θερμοκρασίες τηγανίσματος Φαινόμενα ανταγωνιστικής οξείδωσης Μικρή αντιοξειδωτική δράση Η αποτελεσματικότητά του σε υψηλότερες θερμοκρασίες δεν έχει τεκμηριωθεί μηχανιστικά H προσθήκη μικρής συγκέντρωσης ενός περισσότερο ευοξείδωτου συστατικού σε ένα λιγότερο ευοξείδωτο, επιβραδύνει την ταχύτητα της οξείδωσης 9
Για την εκτίμηση της προ-οξειδωτικής δράσης των προϊόντων οξείδωσης του σκουαλενίου σε κλάσμα τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου παρουσία/απουσία πρωτοταγών αντιοξειδωτικών απαιτήθηκε (α) Οξείδωση του σκουαλενίου κάτω από διαφορετικές συνθήκες οξείδωσης και χαρακτηρισμός των προϊόντων οξείδωσης με φασματοσκοπικές τεχνικές, (β) Προθήκη του οξειδωμένου σκουαλενίου σε υπόστρωμα τριακυλογλυκερολών ελαιολάδου, απαλλαγμένο από αντιοξειδωτικούς και προοξειδωτικούς παράγοντες και παρακολούθηση της δράσης τους σε συνθήκες αυτοξείδωσης (40 o C, σκοτάδι) 10
Πειραματικό μέρος 1 Συνθήκες αυτοξείδωσης σκουαλενίου (SQ) Δοκιμή Θερμοκρασία ( o C) Συνθήκες Rancimat 120 20 L/h Πυριατήριο 100 Ανοικτά (0,5 mm i.d.) Διάρκεια αυτοξείδωσης 0, 62, 80, 120, 180 (min) 0, 3, 5, 9, 12 (ημέρες) Πυριατήριο 62 Ανοικτά (0,5 mm i.d.) 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 30 (ημέρες) Πυριατήριο 62 Κλειστά Χωρίς εσωτερικό διάκενο (0,5 mm i.d.) 18, 30 (ημέρες) Σε όλες τις περιπτώσεις, ως ένωση αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το σκουαλάνιο (SQA) δηλ. το πλήρως υδρογονωμένο ανάλογο του SQ. 11
Πειραματικό μέρος 2 Παρακολούθηση της πορείας της οξείδωσης: Φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά στο υπεριώδες. Τεχνική της φασματοσκοπίας FT-MID-IR (4000 400 cm -1 ). Τεχνική της αέριας χρωματογραφίας με ανιχνευτή μαζών (GC/MS). 12
Προετοιμασία υποστρώματος: Πειραματικό μέρος 3 Καθαρισμός ραφινέ ελαιολάδου (ΕΛΑΙΣ Α.Ε.) από τα υπεροξείδια με τη βοήθεια τριοξειδίου του αργιλίου. Εκτίμηση ποιοτικών χαρακτηριστικών του υποστρώματος: Αριθμός υπεροξειδίων. Φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά υποστρωμάτων στο υπεριώδες (Κ 232 και Κ 270 ). Έλεγχος της χημικής σύστασης του υποστρώματος: Περιεχόμενο σε ολικές πολικές φαινόλες (μέθοδος Folin-Ciocalteu), καροτενοειδή και χλωροφύλλες (Ψωμιάδου, 2000). Υγροχρωματογραφικός προσδιορισμός του σκουαλενίου και της α-τοκοφερόλης (Grigoriadou et al., 2007). 13
Πειραματικό μέρος 4 Δοκιμή πυριατηρίου στους 40 o C Σε κωνικές φιάλες των 5 ml μεταφέρθηκε ορισμένη ποσότητα καθαρισμένου ελαιολάδου (0,5 g) στην οποία προστέθηκε διάλυμα SQ ορισμένης συγκέντρωσης ή SQA ή οξειδωμένων δειγμάτων τους. Ποσότητα 0,5 ml από κάθε ένα από τα παραπάνω δείγματα μεταφέρθηκε σε σειρά σε γυάλινα φιαλίδια (18 mm i.d.) και αποθηκεύτηκαν ανοικτά. 14
Περιγραφή δείγματος Συγκέντρωση συστατικών Δείγμα αναφοράς 2500 mg SQ/kg ελαίου + 12000 mg/kg SQ 14500 mg SQ /kg ελαίου + Οξειδωμένο SQ 2160 mg προϊόντων οξείδωσης SQ/kg ελαίου (SQ ox, t=18) 12340 mg SQ /kg ελαίου 4200 mg προϊόντων οξείδωσης SQ /kg + Οξειδωμένο SQ ελαίου (SQ ox, t=30) 10300 mg SQ /kg ελαίου + Οξειδωμένο SQΑ (SQ ox, t=18) + Οξειδωμένο SQΑ (SQ ox, t=30) 12000 mg SQΑ/kg ελαίου 2500 mg SQ/kg ελαίου 12000 mg SQΑ/kg ελαίου 2500 mg SQ/kg ελαίου 15
Πειραματικό μέρος 5 Η πορεία της οξείδωσης παρακολουθήθηκε με καταγραφή των φασμάτων στο υπεριώδες και εκτίμηση της συγκέντρωσης των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης (Κ 232, συζυγή διένια). 16
Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την καταγραφή των φασμάτων στο υπεριώδες και κυρίως στην περιοχή μεταξύ 230 και 270 nm έδωσαν μια πρώτη εικόνα για το πιθανό σχηματισμό συζυγών διενίων, α,β-ακόρεστων κετονών ή/και αλκαδιενολών. Φάσματα μηδενικής τάξης και πρώτη παράγωγος αυτών (α, β, γ, αντίστοιχα) του σκουαλενίου που οξειδώθηκε (α) στη συσκευή Rancimat (β) στο πυριατήριο στους 100 o C και (γ) στο πυριατήριο στους 62 o C. 17
Παρακολούθηση της πορείας της οξείδωσης στο υπέρυθρο Φάσματα υπερύθρου (4000-400 cm -1 ) του σκουαλενίου που οξειδώθηκε στους 120 o C (20 L/h) (Η μαύρη γραμμή αντιστοιχεί σε χρόνο 0 σε όλες τις συνθήκες. Οι γραμμές κόκκινη, πράσινη, μπλε και γκρι αντιστοιχούν σε 62, 80, 120 και 180 min) 1747 cm -1 0,18 Abs 0,675 Abs 0,6 0,16 0,14 0,12 1732 cm -1 1716 cm -1 1697 cm -1 0,525 0,1 0,45 0,08 0,375 0,3 0,06 0,04 0,35 Abs 0,3 1033 cm -1 SQ 180 1A 18 7 1211 SQ 120 2A 18 7 1211 Ran SQ Total 3A1 RAN SQ IP 2A1 control A1 0,225 0,02 0,25 0,15 0,075 3600-3200 cm -1 1750 1730 1720 1690 1680 1670 1660 1650 1640 1/cm -0 0,2 0,15 1740 1710 1149 cm -1 1700 1107 cm -1 0 0,1 0,075 0,05 4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 1/cm -0 1275 1250 1225 1200 1175 1150 1125 1100 1075 1050 1025 1000 975 950 1/cm 18
Αεριοχρωματογραφικός διαχωρισμός SQ και όλων των προϊόντων της οξείδωσής του στους 120 o C με συνεχή παροχή αέρα (20 L/h) για 180 min σε σύγκριση με τον αντίστοιχο στο πυριατήριο στους 100 o C για 3 ημέρες SQ SQOP CSP 19
Αεριοχρωματογράφημα οξειδωμένου σκουαλενίου στους 120 o C με συνεχή παροχή αέρα (20 L/h) για 180 min και πιθανές δομές των SQOP ισομερή 20
Δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης του SQ χαμηλής μοριακής μάζας 21
Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων σκουαλενίου και σκουαλανίου και των αντίστοιχων οξειδωμένων δειγμάτων τους στη μεταβολή της συγκέντρωσης των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης κατά τη δοκιμή πυριατηρίου στους 40 ο C 22
23
Επίδραση διαφορετικών συστατικών των δειγμάτων Δ1 έως Δ8 στη μεταβολή της συγκέντρωσης των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης κατά τη δοκιμή πυριατηρίου στους 40 ο C 24
Κωδικός δείγματος Περιγραφή δείγματος Συγκέντρωση συστατικών Δ1 Δείγμα αναφοράς 1640 mg SQ/kg ελαίου Δ2 + 6000 mg/kg SQ 7640 mg SQ /kg ελαίου Δ3 + 12000 mg/kg SQ 13640 mg SQ /kg ελαίου Δ4 + Οξειδωμένο SQ 6330 mg προϊόντων οξείδωσης SQ/kg ελαίου 13640 mg SQ /kg ελαίου Δ5 + Οξειδωμένο SQ + α-τοκοφερόλη 6330 mg προϊόντων οξείδωσης SQ /kg ελαίου 13640 mg SQ /kg ελαίου 150 mg α-τοκοφερόλη/kg ελαίου Δ6 Δ7 Δ8 + Οξειδωμένο SQ + πολικό κλάσμα ελαιολάδου + Οξειδωμένο SQ + α-τοκοφερόλη + πολικό κλάσμα ελαιολάδου + SQ + α-τοκοφερόλη + πολικό κλάσμα ελαιολάδου 6330 mg προϊόντων οξείδωσης /kg 13640 mg SQ /kg 200 mg πολικού κλάσματος ελαιολάδου/ kg ελαίου 6330 mg προϊόντων οξείδωσης /kg 13640 mg SQ /kg 150 mg α-τοκοφερόλη/kg ελαίου 200 mg πολικού κλάσματος ελαιολάδου/ kg 13640 mg SQ /kg 150 mg α-τοκοφερόλη/kg ελαίου 200 mg πολικού 25 κλάσματος ελαιολάδου/ kg
26
Συμπεράσματα Τα προϊόντα της οξείδωσης του SQ (υδροξυ- και εποξυ-παράγωγα) φαίνεται τελικά ότι παρουσιάζουν προ-οξειδωτική δράση η οποία, στο λιπαρό υπόστρωμα που εξετάστηκε, φάνηκε να αναιρεί την αντιοξειδωτική δράση του. Η προ-οξειδωτική δράση των προϊόντων οξείδωσης του SQ, παρουσία πρωτοταγών αντιοξειδωτικών, όπως συμβαίνει στο παρθένο ελαιόλαδο δε γίνεται αντιληπτή. Το εύρημα αυτό αποκτά τεχνολογική σημασία στην περίπτωση αξιοποίησης του SQ τόσο από τη βιομηχανία τροφίμων όσο και από τη βιομηχανία φαρμάκων και καλλυντικών. 27
Ευχαριστώ το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) για την οικονομική υποστήριξη στη διάρκεια εκπόνηση διδακτορικής διατριβής 28