ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες «Μοριακή Βιολογία και Κυτταρογενετική» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός των γονιδίων C8α και C8γ του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus)» Αναστάσιος Παπαναστασίου Φαρμακοποιός Επιβλέπων: Ιωάννης Κ. Ζαρκάδης ΠΑΤΡΑ 2006

2

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες, με κατεύθυνση: Μοριακή Βιολογία Κυτταρογεννετική, υπο την επίβλεψη του Επίκουρου καθηγητή Ι.Κ. Ζαρκάδη, κατά τα έτη 2004 2006 και αποτελεί ένα τμήμα της έρευνας που πραγματοποιείται στο χώρο αυτό. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες στον επιβλέποντά μου, Επίκουρο καθηγητή Ιωάννη Ζαρκάδη. Τον γνώρισα το Νοέμβριο του 2002, ως προπτυχιακός φοιτητής του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, ενώ η συνεργασία μας σε ερευνητικό επίπεδο ξεκίνησε τον Απρίλιο του 2003 και έκτοτε δεν διέκοπη! Από την πρώτη στιγμή, μου έδειξε απεριόριστη εμπιστοσύνη, στηρίζοντας κάθε νέα μου προσπάθεια. Όλο αυτό το χρονικό διάστημα ήταν πάντα διαθέσιμος, να ακούσει, να λύσει, αλλά κυρίως να συζητήσει όλα τα εμπόδια και προβλήματα που συνάντησα στον ερευνητικό μας χώρο και όχι μονο. Τα παραπάνω, αλλά και πολλά ακομά που δεν έχουν γραφεί, με κάνουν να προσδοκώ την συνέχεια της συνεργασίας μας και στο μέλλον. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, γιατί από την πρώτη στιγμή με έκαναν να αισθανθώ καλοδεχούμενος στο χώρο ενω παράλληλα διευκόλυναν με κάθε τρόπο την ενσωμάτωση μου στο έμψυχο δυναμικό του εργαστηρίου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιάκους φοιτητές του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, για τη συνεργασία τους, την συμπαράστασή τους αλλά κυρίως την εμπιστοσύνη και εκτίμηση που έδειξαν στο πρόσωπό μου. Ιδιαίτερα ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Ελευθερία Γεωργάκα, στη Μαρία Χονδρού, στη Μάντω Λόντου και στον Πέτρο Κόκκινο. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 1.Α. Ανοσία. 7 1.Β. Το σύστημα του συμπληρώματος 10 1.Γ. Γονίδια συμπληρώματος και βιοσύνθεση 22 1.Δ. Το όγδοο συστατικό του συμπληρώματος (C8).. 24 1.Ε. Συμπλήρωμα και εξέλιξη... 29 1.ΣΤ. Ιριδίzουσα πέστροφα (Οncorhynchus mykiss irideus).. 34 Στόχος της εργασίας... 35 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 36 2.1 Διαλύματα. 37 2.2 Θρεπτικά Υλικά 40 2.3 Ειδικά Διαλύματα. 41 2. 4 Μέθοδοι. 42 2.4.1 Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων.. 42 2.4.2 Ποσοτικός προσδιορισμός νουκλεϊκών οξέων 47 2.4.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 48 2.4.4 Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) 49 2.4.5 Αντίδραση συνδετάσης (ligation). 51 2.4.6 Κατάτμηση του DNA με ένζυμα περιορισμού. 52 2.4.7 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης 53 2.4.8 Διαλογή βιβλιοθήκης cdna... 57 2.4.9 Υβριδοποίηση νουκλεΐκών οξέων 60 2.4.10 Παρασκευή βακτηρίων επιδεκτικών σε μετασχηματισμό (Competent cells) 63 2.4.11 Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων E.coli με πλασμιδικό DNA.. 65 2.4.12 Προσδιορισμός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA (Sequencing).. 65 2.4.13 Χρήση λογισμικών προγραμμάτων ανάλυσης νουκλεοτιδικής-αμινοξικής αλληλουχίας... 66 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 70 3.1 Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του γονιδιου C8α στην ιριδιζουσα πεστροφα... 71 4

3.1.1 Κλωνοποίηση του cdna του γονιδίου C8α στην ιριδίζουσα πέστροφα. 71 3.1.2 Δομική μελέτη της συναγόμενης αμινοξικής αλληλουχίας του cdna του γονιδίου C8α της ιριδίζουσας πέστροφας.. 77 3.1.3 Φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών C6, C7, C8α, C8β και C9, του συμπλόκου MAC του συμπληρώματος. 81 3.1.4 Μελέτη του γονιδίου C8α στο επίπεδο του γονιδιώματος της ιριδίζουσας πέστροφας (Ανάλυση κατά Southern) 83 3.1.5 Μελέτη της ιστικής έκφρασης του γονιδίου C8α της ιριδίζουσας πέστροφας, σε επίπεδο mrna. Ανάλυση με τη μέθοδο RT-PCR. 84 3.1.6 Συγκριτική μελέτη της αμινοξικής αλληλουχίας του C8α με τα αντίστοιχα μόρια άλλων οργανισμών.. 85 3.2 Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του γονιδιου C8γ στην ιριδιζουσα πεστροφα. 87 3.2.1 Κλωνοποίηση του cdna του γονιδίου C8γ στην ιριδίζουσα πέστροφα.. 87 3.2.2 Δομική μελέτη της συναγόμενης αμινοξικής αλληλουχίας του cdna του γονιδίου C8γ της ιριδίζουσας πέστροφας 93 3.2.3 Φυλογενετική ανάλυση του C8γ στην ιριδίζουσα πέστροφα σε σχέση με τις πρωτεΐνες της οικογένειας των λιποκαλινών 96 3.2.4 Μελέτη του γονιδίου C8γ στο επίπεδο του γονιδιώματος της ιριδίζουσας πέστροφας (Ανάλυση κατά Southern)... 98 3.2.5 Μελέτη της ιστικής έκφρασης του γονιδίου C8γ της ιριδίζουσας πέστροφας, σε επίπεδο mrna. Ανάλυση με τη μέθοδο RT-PCR 99 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 101 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 106 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 109 5

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

1. Α. ΑΝΟΣΙΑ Το ανοσοποιητικό σύστημα συγκροτείται από εξειδικευμένα κύτταρα, μόρια και όργανα, τα οποία συνεργάζονται προκειμένου ο οργανισμός να αμυνθεί έναντι ενός ευρέως φάσματος παθογόνων (βακτήρια, ιοί και μύκητες), που δύναται να προκαλέσουν βλάβες. Επομένως, η διατήρηση της καλής κατάστασης του οργανισμού εξαρτάται από την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να αναγνωρίζει, να απωθεί και να καταστρέφει τους επικίνδυνους εισβολείς. Οι περισσότεροι ζωικοί οργανισμοί έχουν μηχανισμούς αντίστασης έναντι των παθογόνων. Η αντίσταση που παρέχεται μέσω των μηχανισμών αυτών ονομάζεται ανοσία. Υπάρχουν δύο βασικοί βραχίονες ανοσίας: Η φυσική ή μη-ειδική ή έμφυτη και η προσαρμοστική ή ειδική ή επίκτητη. Η φυσική ανοσία απορρέει από φυσικούς φραγμούς όπως το δέρμα και οι επιθηλιακές μεμβράνες, τα δάκρυα, το σίελο και η φλεγμονώδης διεργασία. Οι μηχανισμοί αυτοί παρεμποδίζουν τόσο την είσοδο, όσο και τη διάδοση των παθογόνων, ωστόσο αδυνατούν να περιορίσουν εξολοκλήρου την προκαλούμενη βλάβη. Αμυγδαλές και αδενοειδή Λεμφαγγεία Μυελός των οστών Λεμφικός ιστός Θύμος αδένας Σπλήνας Πλάκες του Payer Εικόνα 1.1 : Οι «περιοχές-κλειδιά» της φυσικής ανοσίας Παρόλ αυτά, εάν κάποιος μικροοργανισμός καταφέρει να ξεπεράσει τους φραγμούς της φυσικής ανοσίας, τότε οι ανώτεροι ζωικοί οργανισμοί έχουν την ικανότητα να επιστρατεύσουν πιο αποτελεσματικούς μηχανισμούς ανοσίας, οι οποίοι διακρίνονται από την ικανότητα της ανοσολογικής μνήμης. Αυτό σημαίνει ότι μπορούν να «θυμούνται» 7

τους εισβολείς και να ανταποκρίνονται ταχύτερα και αποτελεσματικότερα στο μέλλον. Το σύνολο των μηχανισμών αυτών συγκροτεί την ειδική ή αλλιώς προσαρμοστική ανοσία. 1.Α.1 ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Τα χαρακτηριστικά της φυσικής ανοσίας είναι τα εξής: Είναι έμφυτη, δηλαδή οι μηχανισμοί της είναι παρόντες από τη γέννηση. Είναι μη ειδική, καθώς δρα έναντι ενός ευρέως φάσματος των παθογόνων. Η αποτελεσματικότητά της δε βελτιώνεται με συνεχή έκθεση του οργανισμού στο συγκεκριμένο παθογόνο. Αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των μικροοργανισμών. Εμφανίστηκε πρώτη εξελικτικά και εκτιμάται ότι υπάρχει από τον καιρό των πρωτοστομίων. Βασική μέριμνα της φυσικής ανοσίας είναι να παρεμποδίζει την είσοδο των «πανταχού παρόντων» παθογόνων μικροοργανισμών. Αν αυτό δεν επιτευχθεί, επόμενος στόχος είναι ο περιορισμός της εξάπλωσής τους. Η πρόληψη της εισόδου των μικροοργανισμών απορρέει από φυσικές διαδικασίες, όπως: Στις σωματικές επιφάνειες παρέχονται μηχανικοί φραγμοί από το δέρμα και τους διαφόρους βλεννογόνους. Εκκρίσεις και σωματικά υγρά με αντιβακτηριδιακές ιδιότητες, όπως η λυσοζύμη του σιέλου και το χαμηλό ph του στομαχικού περιεχομένου. Η συνεχής ροή των σωματικών υγρών διευκολύνει την απόρριψη πολλών παθογόνων. Η ροή αυτή συνοψίζεται στις εξής κινήσεις: Οι περισταλτικές κινήσεις του εντέρου, η διούρηση και οι ανερχόμενες κινήσεις των σωματικών υγρών. Οι βλεφαριδωτές κινήσεις της αναπνευστικής αλλά και της πεπτικής οδού. Ο βήχας. Ο έμετος. Στην περίπτωση που οι φυσικοί φραγμοί δε σταθούν ικανοί να εμποδίσουν την είσοδο των μικροοργανισμών, τότε κινητοποιούνται άλλοι μηχανισμοί, που έχουν ως στόχο των περιορισμό και την εξουδετέρωση των παθογόνων. Αυτό, επιτυγχάνεται με διαδικασίες, όπως: 1. Φαγοκύτωση : πρόκειται για μια διαδικασία, που περιλαμβάνει την απορρόφηση και την εξουδετέρωση των μικροοργανισμών από εξειδικευμένα κύτταρα, τα φαγοκύτταρα. 8

Ως φαγοκύτταρα δρουν τόσο κάποια πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα του αίματος (ουδετερόφιλα), όσο και τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα (μονοκύτταρα, μακροφάγα). 2. Οψωνοποίηση : με το μηχανισμό αυτό επιτυγχάνεται η επιφανειακή κάλυψη των μικροοργανισμών με κάποιες από τις πρωτεΐνες του πλάσματος, οι οποίες έτσι καθιστούν το παθογόνο πιο δεκτικό στη φαγοκυττάρωση. Οι πρωτεΐνες, που συμμετέχουν ονομάζονται οψωνίνες και προσδένονται στα βακτήρια. Η πρόσδεση αυτή προάγει τη συγκόλληση των βακτηρίων στα φαγοκύτταρα, με την οψωνίνη να διαμεσολαβεί και να δρα ως φυσικός συνδέτης των υποδοχέων, που υπάρχουν στα φαγοκύτταρα. Χαρακτηριστικές οψωνίνες αποτελούν πολλά από τα κλάσματα των συστατικών του συμπληρώματος και μετέχουν δραστικά σε μια άλλη σημαντική διεργασία, τη φλεγμονή. 3. Φλεγμονώδης διεργασία : κατά τη φλεγμονώδη διεργασία παρατηρείται συσσώρευση πρωτεϊνών του πλάσματος, οι οποίες προσελκύουν χημειοτακτικά λευκά αιμοσφαίρια και φαγοκύτταρα, στην περιοχή της φλεγμονής. Εκτός από τις οψωνίνες, σημαντικά χημειοτακτικά μόρια αποτελούν χημικές ουσίες, όπως η ισταμίνη, η οποία απελευθερώνεται από τα βασεόφιλα και τα κύτταρα MAST. 4. Λύση των παθογόνων : Πρόκειται για ένα μηχανισμό, που χρησιμοποιείται από τη φυσική ανοσία και έχει σαν αποτέλεσμα την άμεση εξουδετέρωση ενός ευρέως φάσματος παθογόνων. Επιτυγχάνεται με τη βοήθεια του συστήματος του συμπληρώματος και πιο συγκεκριμένα με το σχηματισμό ενός πρωτεϊνικού πόρου, ο οποίος διαπερνά και καταστρέφει την κυτταρική μεμβράνη του μικροοργανισμού, με αποτέλεσμα τη λύση και καταστροφή του. 1.Α.2 ΕΙΔΙΚΗ Ή ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Ο τύπος αυτός της ανοσίας αποκτάται και αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου, είναι δηλαδή «επίκτητος». Βασική του ιδιότητα είναι ότι αναγνωρίζει και θυμάται κάθε παθογόνο που έχει στο παρελθόν προσβάλλει τον οργανισμό, με αποτέλεσμα η απόκρισή του να είναι κάθε φορά ταχύτερη και αποτελεσματικότερη. Η προσαρμοστική ανοσία διαμεσολαβείται κύρια : 9

Μέσω των ενεργοποιημένων αντισωμάτων, οπότε και ονομάζεται χυμική, Μέσω ενεργών Τ-κυττάρων, οπότε και ονομάζεται κυτταρική. Τα χαρακτηριστικά της προσαρμοστικής ανοσίας είναι τα εξής: Αποτελεί επίκτητο μηχανισμό ανοσίας. Πρόκειται για ειδική και καλά στοχευμένη απόκριση του οργανισμού. Αποτελεί τη δεύτερη γραμμή άμυνας, μετά την ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας. Διακρίνεται από την ιδιότητα της ανοσολογικής μνήμης. Είναι πρόσφατος εξελικτικά μηχανισμός. Η εμφάνισή του εκτιμάται ότι έγινε πριν από 450 εκ. χρόνια περίπου, μαζί με τους χονδριχθύες. 1.Β. ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Εισαγωγή Το σύστημα του συμπληρώματος οφείλει την ονομασία του στον Ehrlich, ο οποίος προσπάθησε με αυτόν τον τρόπο να αποδώσει την ενεργότητα του ορού, η οποία «συμπλήρωνε» την ικανότητα των ειδικών αντισωμάτων, να προκαλούν λύση των βακτηρίων. Αποτελεί πανάρχαιο και εξαιρετικά συντηρημένο μηχανισμό άμυνας [1] και εκτιμάται ότι η εμφάνισή του συνέπεσε με αυτή των δευτεροστομίων, πριν 800 εκατ. χρόνια περίπου [2]. Το σύστημα του συμπληρώματος αποτελεί το κύριο μέτωπο άμυνας της φυσικής ανοσίας, ενώ ταυτόχρονα υποβοηθά και καθοδηγεί το δεύτερο βραχίονα της ανοσίας, που διαμεσολαβείται από αντισώματα (ειδική ή προσαρμοστική ανοσία). Οι βασικές του λειτουργίες συνοψίζονται στα εξής : Άμυνα εναντίον των λοιμώξεων: α) μέσω οψωνοποίησης, β) μέσω χημειοτακτισμού και ενεργοποίησης των λευκοκυττάρων, γ) μέσω λύσεως βακτηρίων και κυττάρων. Γεφύρωση φυσικής και προσαρμοστικής ανοσίας: α) μέσω της ενίσχυσης της απόκρισης μέσω αντισωμάτων, β) μέσω ενίσχυσης της ανοσολογικής μνήμης. Εναπόθεση άχρηστου υλικού: α) μέσω εκκαθάρισης ανοσοσυμπλεγμάτων, β) μέσω εκκαθάρισης αποπτωτικών κυττάρων. 10

Τελευταία έχουν τεκμηριωθεί και άλλες εναλλακτικές λειτουργίες του συμπληρώματος, οι οποίες ξεφεύγουν από τον παραδοσιακό του ρόλο στη φλεγμονώδη διεργασία. Οι λειτουργίες αυτές εντοπίζονται στη συμμετοχή του συστήματος σε μονοπάτια κυτταρικής ρύθμισης, τα οποία είναι απαραίτητα στην πρώιμη ανάπτυξη, στη διαφοροποίηση των αρχέγονων κυττάρων, στην αναπαραγωγή και στην αναγέννηση ιστών και οργάνων [3]. Σήμερα είναι γνωστό ότι το συμπλήρωμα αποτελείται από 35 διαφορετικές πρωτεΐνες, οι οποίες εντοπίζονται τόσο στο κλάσμα, όσο και στις επιφάνειες των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες αυτές, στην πλειοψηφία τους, αποτελούν ζυμογόνα, δηλαδή ανενεργά προένζυμα, τα οποία ενεργοποιούνται με πρωτεόλυση, με αποτέλεσμα να προκύπτει μια εξαιρετικά ενισχυμένη απόκριση (καταρράκτης αντιδράσεων). Υπάρχουν τρεις βασικές οδοί ενεργοποίησης του συμπληρώματος : η κλασσική, η εναλλακτική και η λεκτινική οδός, ενεργοποίησης, των οποίων το εναρκτήριο ερέθισμα διαφέρει (Εικ. 1.2) [4]. Εικόνα 1.2 : Η ενεργοποίηση, η πορεία και η κατάληξη των τριών οδών του συμπληρώματος. Πιο συγκεκριμένα, η κλασσική οδός αποτελεί έναν αντισωμοκατευθυνόμενο μηχανισμό, δηλαδή προκειμένου να ενεργοποιηθεί απαιτεί την ύπαρξη συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος. Η εναλλακτική οδός ενεργοποιείται αυθόρμητα από τη σύνδεση ενός 11

συστατικού του συμπληρώματος στην επιφάνεια του εκάστοτε παθογόνου, ενώ η λεκτινική οδός ενεργοποίησης εκκινεί με τη σύνδεση μιας λεκτίνης του ορού με πρωτεΐνες της επιφάνειας ιών και βακτηρίων που περιέχουν μαννόζη. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι και τα τρία αυτά μονοπάτια καταλήγουν σε ένα ενιαίο, τη λυτική οδό, οποία ευθύνεται για τη λύση των παθογόνων μικροοργανισμών [5]. 1.Β.1 ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Οι πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες συνιστούν το σύστημα του συμπληρώματος συντίθενται κυρίως στα ηπατοκύτταρα, αν και σημαντικά ποσά συντίθενται στα μονοκύτταρα, ιστικά μακροφάγα και επιθηλιακά κύτταρα του γαστρεντερικού και ουροποιητικού συστήματος. Τα παραπάνω συστατικά αποτελούν το 15% του κλάσματος των σφαιρινών και κυκλοφορούν στον ορό σε μη ενεργές μορφές, στην πλειονότητα ως προένζυμα, στα οποία η ενζυματική περιοχή είναι συγκαλυμμένη. Η ενεργοποίηση του προενζύμου κατατέμνει το μόριο, απομακρύνοντας ένα ανασταλτικό τμήμα και αποκαλύπτοντας την ενεργό περιοχή. Συνολικά, η ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος περιλαμβάνει έναν ενζυμικό καταρράκτη, στον οποίο το προϊόν του προενζύμου ενός βήματος αποτελεί καταλύτη για τη διεκπεραίωση του επόμενου σταδίου [6]. Κάθε ενεργοποιημένο συστατικό έχει μικρό χρόνο ημιζωής προτού απενεργοποιηθεί. Κάθε συστατικό χαρακτηρίζεται από έναν αριθμό (C1-C9) ή από ένα όνομα καταχρηστικό (π.χ DAF : Decay Accelerating Factor). Μετά την ενεργοποίηση ενός συστατικού, τα πεπτιδικά κομμάτια ονομάζονται με μικρά γράμματα: a για τα μικρότερα κλάσματα και b για τα μεγαλύτερα. Τα μεγαλύτερα θραύσματα συνδέονται με το στόχο κοντά στην περιοχή ενεργοποίησης, ενώ τα μικρότερα διαχέονται και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη της φλεγμονώδους διεργασίας. Τέλος, τα θραύσματα αλληλεπιδρούν προκειμένου να σχηματιστούν συμπλέγματα, τα οποία θα έχουν ενζυματική δράση. 12

1.Β.2 ΟΙ ΟΔΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ 1.Β.2.1 Η ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΟΔΟΣ Όπως ειπώθηκε και εισαγωγικά, η κλασσική οδός είναι ο κύριος, κατευθυνόμενος από αντισώματα, μηχανισμός ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Αυτό σημαίνει ότι προκειμένου να ενεργοποιηθεί ο συγκεκριμένος καταρράκτης αντιδράσεων απαιτείται η ύπαρξη συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος, το οποίο μπορεί να είναι είτε διαλυτό, είτε προσδεδεμένο πάνω σε κύτταρο στόχο. Η ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΟΔΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Α Ag - Ab C3 κομβερτάση Β C5 κομβερτάση Εικόνα 1.3 : Α. Η κλασσική οδός ενεργοποίησης Β. Δομική αναπαράσταση του συστατικού C1. Τα IgM όπως και ορισμένες κατηγορίες IgG (IgG1, IgG2, IgG3) δύναται να ενεργοποιήσουν την κλασσική οδό. Τα αρχικά στάδια ενεργοποιήσεως διαμεσολαβούνται από τα συστατικά C1, C2, C3 και C4, τα οποία είναι παρόντα στο πλάσμα ως ζυμογόνα. Η συμπλοκοποίηση αντιγόνου-αντισώματος επάγει αλλαγές στη 13

διαμόρφωση του Fc τμήματος του αντισώματος, με αποτέλεσμα την έκθεση μιας περιοχής πρόσδεσης του C1 συστατικού του συμπληρώματος. Το συστατικό C1 [7] υπάρχει στον ορό ως μακρομοριακό σύμπλεγμα, αποτελούμενο από τις εξής 3 υπομονάδες: τη C1q (1 μόριο), τη C1r (2 μόρια) και τη C1s (2 μόρια), που σταθεροποιούνται με την παρουσία ιόντων Ca++. Αποτελείται, δε, από 18 πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οι οποίες αλληλεπιδρούν προκειμένου να σχηματιστούν 6 collagen-like τριπλοί βραχίονες έλικας, οι άκρες των οποίων συνδέονται στις περιοχές πρόσδεσης CH 2 του αντισώματος. Το σύμπλοκο C1r 2 s 2 [8] έχει μια S-μορφή όταν δε συνδέεται με το C1q. Η σύνδεσή του με το Fc τμήμα του αντισώματος οδηγεί σε αλλαγή διαμόρφωσης του C1r, που αυτοκαταλυτικά μετατρέπει το C1r σε ενεργό σερινική πρωτεάση. Η ενεργός C1r κατατέμνει τη C1s ομοίως σε ενεργό ένζυμο. Η C1s έχει δύο υποστρώματα: το C4 και το C2. Το C4 (αλυσίδες α, β, γ) ενεργοποιείται όταν το C1s υδρολύει ένα μικρό θραύσμα από την αμινοτελική άκρη του C4, εκθέτοντας μια περιοχή πρόσδεσης στο μεγαλύτερο τμήμα C4b. Το θραύσμα αυτό ενώνεται με την επιφάνεια-στόχο κοντά στο C1. Κατόπιν, το προένζυμο C2 προσδένεται στην επιφάνεια του C4b, όπου κατατέμνεται από το γειτονικό C1s και το μικρότερο θραύσμα διαχέεται. Το σχηματισθέν σύμπλοκο C4b2a ονομάζεται C3 κομβερτάση, προσδιορίζοντας, έτσι, το ρόλο του στη μετατροπή του συστατικού C3 (αλυσίδες α και β) σε ενεργό μορφή. Η υδρόλυση ενός μικρού θραύσματος από το αμινοτελικό άκρο της α αλυσίδας από τη C3 κομβερτάση δημιουργεί το C3b, ενώ το κλάσμα C3a περικλείει τα ανοσοσυμπλέγματα και τα αντιγόνα, δρώντας ως οψωνίνη. Ένα και μοναδικό μόριο C3 κομβερτάσης μπορεί να δημιουργήσει πάνω από 200 μόρια C3b, οδηγώντας έτσι σε τρομακτική ενίσχυση στο συγκεκριμένο βήμα του καταρράκτη. Ένα μέρος από το C3b συνδέεται με το C4b2a, προκειμένου να σχηματιστεί ένα σύμπλοκο, που ονομάζεται C5 κομβερτάση (αντιθέτως, το C3α δε συνδέεται με το C4b2a, δρώντας σαν οψωνίνη [9,10]). Κατόπιν, το σύμπλοκο της C5 κομβερτάσης κατατέμνει το συστατικό C5 σε C5a που διαχέεται και παρουσιάζει ισχυρή αναφυλακτική δράση και σε C5b που συνδέεται στην αντιγονική επιφάνεια. Τέλος, το προσδεδεμένο C5b πυροδοτεί το σχηματισμό του συμπλόκου λύσεως (MAC: Membrane Attack Complex). 14

1.Β.2.2 Η ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΗ ΟΔΟΣ Σε αντίθεση με το κλασσικό μονοπάτι, το οποίο απαιτεί την ύπαρξη συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος προκειμένου να ενεργοποιηθεί, η εναλλακτική οδός πυροδοτείται αυθόρμητα, από συστατικά της επιφάνειας του ξενιστή. Αποτελείται από τέσσερεις πρωτεϊνες : C3, παράγοντας Β, παράγοντας D και προπερδίνη [11,12,13]. Εκκινεί, δε, από την ενεργοποίηση του τρίτου συστατικού του συμπληρώματος. Το C3, που περιέχει έναν ασταθή θειοεστερικό δεσμό, υπόκειται σε αργή αυτόματη υδρόλυση στα κλάσματα C3a και C3b [14,15,16,17,18]. Το C3b έχει την ικανότητα να προσδένεται σε ξένες αντιγονικές επιφάνειες (σε βακτηριακά κύτταρα και ιϊκά μόρια) ή ακόμη και στα κύτταρα του ίδιου του ξενιστή. Ωστόσο, οι κυτταρικές μεμβράνες των περισσότερων θηλαστικών περιέχουν υψηλά επίπεδα σιαλικού οξέος, κάτι το οποίο έχει σαν αποτέλεσμα την έγκαιρη απενεργοποίηση του C3b στα κύτταρα του ξενιστή. ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΗ ΟΔΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Ενεργοποίηση + πρωτεόλυση C3 κομβερτάση C5 κομβερτάση Εικόνα 1.4 : Η εναλλακτική οδός ενεργοποίησης του συμπληρώματος Αντίθετα, οι ξένες αντιγονικές επιφάνειες (κυτταρικό τοίχωμα βακτηρίων, κυτταρικό τοίχωμα μυκήτων και κάποιοι ιϊκοί φάκελοι) περιέχουν χαμηλά επίπεδα σιαλικού οξέος, με αποτέλεσμα το προσδεδεμένο C3b να παραμένει ενεργό για μεγάλο χρονικό διάστημα. Κατόπιν, στο C3b συνδέεται μια άλλη πρωτεΐνη του ορού, ο παράγοντας Β, με 15

την παρεμβολή ιόντων Mg ++. Η σύνδεση αυτή επιφέρει αλλαγή στη στερεοδιάταξη του παράγοντα Β [19] και εκτίθεται με αυτόν τον τρόπο, μια θέση - υπόστρωμα για μια ενζυμικά δραστική πρωτεΐνη, η οποία ονομάζεται παράγοντας D [20]. Ο παράγοντας D κατατέμνει τον παράγοντα Β, οδηγώντας στο σχηματισμό του C3bBb, με δράση κομβερτάσης C3, κατ αντιστοιχία με το σύμπλοκο C4b2a της κλασσικής οδού. Η κομβερτάση αυτή έχει χρόνο ημιζωής 5 min, ενώ η δράση της επεκτείνεται στα 30, στην περίπτωση που το σύμπλοκο σταθεροποιηθεί από τη σύνδεση της ρυθμιστικής πρωτεΐνης προπερδίνης [21,22,23,24]. Σε κάθε περίπτωση η κομβερτάση αυτή διασπά το συστατικό C3 και από τα παραγόμενα κλάσματα το C3b θα προσδεθεί στο ήδη υπάρχον σύμπλοκο. Έτσι, αφενός το νεοσχηματιζόμενο C3Bb3b αποκτά ιδιότητα C5 κομβερτάσης και επιτελεί τη διάσπαση του C5 σε C5a και C5b [25], αφετέρου τα ελεύθερα κλάσματα C3b πυροδοτούν την επανάληψη και ενίσχυση των αρχικών βημάτων, ώστε όλες οι αντιγονικές επιφάνειες να κορεστούν από C3b μόρια σε λιγότερο από 5 min (Εικ. 1.4). 1.Β.2.3 Η ΛΕΚΤΙΝΙΚΗ ΟΔΟΣ Η λεκτινική οδός ενεργοποίησης εκκινεί μέσω της σύνδεσης της πρωτεΐνης MBL (λεκτίνη, που συνδέει μαννόζες ή Mannose Binding Lectin) με υδατάνθρακες της κυτταρικής επιφάνειας παθογόνων μικροοργανισμών [26,27]. Η πρωτεΐνη MBL (γνωστή και ως MBP: Mannose Binding Protein) δεσμεύεται σε μαννόζες ή Ν- ακετυλογλυκοζαμίνες (GlcNAc) [28]. Η πρωτεΐνη ΜΒL είναι ένα ολιγομερές, το οποίο αποτελείται από πανομοιότυπες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Η κάθε αλυσίδα φέρει: μία περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες, μία περιοχή ομοιάζουσα με κολλαγόνο, την περιοχή του «λαιμού» και την περιοχή αναγνώρισης των υδατανθράκων [29,30]. Η έναρξη της οδού λεκτίνης πυροδοτείται από τη δέσμευση της πρωτεΐνης MBL πάνω στο παθογόνο. Ακολουθεί η πρωτεολυτική κατάτμηση των μορίων C4 και C2 και η συγκρότηση της κομβερτάσης C3 (C4b2a) [31,32,33]. 16

ΛΕΚΤΙΝΙΚΗ ΟΔΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Μαννόζες MBL C3 κομβερτάση MASP 1+2 C5 κομβερτάση Εικόνα 1.5 : Η λεκτινική οδός ενεργοποίησης του συμπληρώματος Στη λεκτινική οδό η κομβερτάση C3 υπόκειται σε άμεση πρωτεολυτική διάσπαση από μια σερινοπρωτεάση, την MASP (MBL associated serine protease), η οποία δεσμεύεται στην πρωτεΐνη MBL. Τέλος, η C3 κομβερτάση καταλύει τη διάσπαση του συστατικού C3 και το κλάσμα C3b προσδένεται στο σύμπλοκο C4b2a, με αποτέλεσμα το σχηματισμό της κομβερτάσης C5 (Εικ. 1.5). 1.Β.2.4 ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΛΥΣΗΣ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (ΣΛΜ ή MAC) Και οι τρεις οδοί ενεργοποίησης του συμπληρώματος καταλήγουν, μέσω σχηματισμού της εκάστοτε κομβερτάσης C5, σε ένα κοινό μονοπάτι, στο τέλος της οποίας σχηματίζεται το σύμπλοκο λύσεως της κυτταρικής μεμβράνης. Η οδός αυτή ονομάζεται λυτική (Εικόνα 1.6) και έχει σαν αποτέλεσμα την καταστροφή των κυττάρων εισβολέων. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα Gram αρνητικά βακτήρια είναι πιο ευπαθή στη λύση από τα Gram θετικά και τα τοξικά Gram αρνητικά βακτήρια. Το μειονέκτημα αυτό οφείλεται στην απουσία συγκεκριμένων συστατικών από τη μεμβράνη των βακτηρίων αυτών. Για παράδειγμα, η παρουσία υψηλών ποσών σιαλικού οξέος στην επιφάνεια των Gram 17

θετικών βακτηρίων έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των μορίων αυτών ως ίδιων, προστατεύοντάς τα από τη λύση [32]. C5 κομβερτάση Κυτόλυση Εικόνα 1.6 : Αναπαράσταση της Λυτικής οδού. Η διαδικασία λύσεως ξεκινά με την κατάτμηση του συστατικού C5 (190 KDa) από μία κομβερτάση C5. Από τα παραγόμενα θραύσματα το μικρότερο C5a (11 KDa) διαχέεται δρώντας ως αναφυλατοξίνη, ενώ το μεγαλύτερο C5b (180 KDa) παραμένει συνδεδεμένο στην κυτταρική επιφάνεια. Εικόνα 1.7 : Η συγκρότηση του συμπλόκου MAC Το κλάσμα C5b φέρει μια περιοχή πρόσδεσης για την πρωτεϊνη C6 (128 KDa), η οποία αποτελείται από μία μόνο αλυσίδα. Το σύμπλοκο C5b-6 παραμένει χαλαρά συνδεδεμένο 18

στην κυτταρική μεμβράνη, μέχρι να προσδεθεί το συστατικό C7 (121 KDa), σχηματίζοντας το σύμπλοκο C5b67. Η πρόσδεση του C7 στο σύμπλοκο σηματοδοτεί τη μετάβαση του συμπλέγματος από την υδρόφιλη στην υδρόφοβη κατάσταση, οπότε ενσωματώνεται κατά προτίμηση σε λιπιδικές διπλοστοιβάδες. Στη συνέχεια, με το σύμπλεγμα αυτό προσδένεται το συστατικό C8 (155 KDa), ακολουθούμενο από βαθμιαία προσθήκη έως και δεκατεσσάρων μονομερών C9 (79 KDa), καταλήγοντας στο σχηματισμό ενός λυτικού «βύσματος», το οποίο διαπερνά την μεμβράνη του κυττάρου στόχου, επιφέροντας το θάνατό του, μέσω οσμωτικού σοκ (Εικόνα 1.7). Στο σημείο αυτό είναι άξιο να σημειωθεί ότι αν και μικρής έκτασης λύση παρατηρείται είτε μετά τη σύνδεση του C8 με το C5b67, είτε μετά τη μερική προσθήκη μορίων C9, το βασικό μέρος της κυτταρικής λύσης προκαλείται από τον πλήρη πολυμερισμό των συστατικών C9. Οι πόροι που σχηματίζονται από τη δράση του συμπλόκου MAC πρωτοπαρατηρήθηκαν με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο από τους Humphrey και Dourmashkin. [34] Έχουν μία διάμετρο 115 Å μέσα στη λιπιδική διπλοστοιβάδα και μία 100 Å προεκβολή πάνω από την κυτταρική επιφάνεια. Η παραπάνω δομή είναι χαρακτηριστική (Εικόνα 1.8) και ομοιάζει με αυτήν που σχηματίζεται από πρωτεΐνες που δημιουργούν πόρους, όπως η περφορίνη ή κυτολυσίνη, η οποία εμφανίζεται στα κυτταροτοξικά Τ- λεμφοκύτταρα καθώς και στα κύτταρα φυσικούς φονείς (ΝΚ cells). Οι πόροι που σχηματίζονται από το MAC επιτρέπουν την παθητική μετακίνηση μικρών διαλυτών μορίων, ιόντων και νερού, αλλά είναι πολύ μικροί ώστε να επιτρέπουν τη μετακίνηση μεγάλων συστατικών, όπως πρωτεΐνες. Αυτή η διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την είσοδο νερού στα κύτταρα, οδηγώντας τα σε οσμωτική λύση. Όπως αναφέρθηκε, μερική λύση μπορεί να προκύψει χωρίς τον πλήρη πολυμερισμό των συστατικών C9 και το σχηματισμό πόρου. Εν μέρει, αυτό μπορεί να οφείλεται σε μικρές περιοχές διαρροής, ως αποτέλεσμα της εισόδου υδροφοβικών τμημάτων του συμπλέγματος C5b-8. Επιπλέον, η εγκατάσταση των τελικών συστατικών του συμπληρώματος στη κυτταρική μεμβράνη, είναι δυνατό να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο ανεξάρτητα από οσμωτική λύση, επιτρέποντας σ ένα θανατηφόρο ποσό ασβεστίου να εισέλθει παθητικά στο κύτταρο [33,35]. 19

Εικόνα 1.8 : Φωτογραφία διάτρητης κυτταρικής μεμβράνης, λόγω δράσης του συμπλόκου MAC, όπως αυτή παρατηρήθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Πρόσφατα, μελέτες αποδίδουν στο σύμπλοκο MAC ιδιότητες, οι οποίες σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό. Επίσης, αποδεικνύεται η συμμετοχή του συμπλόκου στη αναστολή της διαδικασίας της απόπτωσης των ολιγοδενδροκυττάρων, γεγονός το οποίο ενισχύει την επιβίωση των ολιγοδενδροκυττάρων σε νόσους όπως οι απομυελινωτικές του Κ.Ν.Σ. 1.Β.2.5 ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Όπως αναφέρθηκε και εισαγωγικά, το συμπλήρωμα αποτελεί ένα μηχανισμό φυσικής ανοσίας, που έκανε την εμφάνισή του με την εμφάνιση των δευτεροστομίων και συνεχίζει να υπάρχει μέχρι σήμερα. Αποτελεί, δε, εξαιρετικά συντηρημένο μηχανισμό, ο οποίος δρα έναντι ενός ευρέως φάσματος παθογόνων. Η ανάγκη αυτή της καθολικής ανοσολογικής απόκρισης είχε σαν αποτέλεσμα την απώλεια διάκρισης μεταξύ ιδίων και ξένου. Στην προκειμένη περίπτωση οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες του συμπληρώματος έρχονται να παράσχουν τις απαραίτητες δικλείδες ασφαλείας, προκειμένου να αποτρέψουν ανεπιθύμητες δράσεις του συστήματος του συμπληρώματος, έναντι αυτού του οργανισμού. 20

Εικόνα 1.9 : Κομβικά σημεία ρύθμισης του συμπληρώματος. Η γενική αρχή της ρύθμισης περιλαμβάνει την παρεμπόδιση της καταστροφής κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισμού και την ενεργοποίηση του συμπληρώματος στην υγρή φάση και συντελείται από μεμβρανικές και διαλυτές στον ορό πρωτεΐνες. Πιο ειδικά, η ρύθμιση του συμπληρώματος περιλαμβάνει την αναστολή ή αποσταθεροποίηση των ενεργών συμπλόκων ή την κινητοποίηση των διαδικασιών πρωτεολυτικής λύσης των ενεργοποιημένων συστατικών. Το σύστημα του συμπληρώματος ρυθμίζεται σε σημεία κλειδιά: στην έναρξη της ενεργοποίησης, στο σχηματισμό των κομβερτασών (amplification step) και στο σχηματισμό του συμπλόκου λύσης των μεμβρανών (Εικόνα 1.9). Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες του συμπληρώματος χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες [36]: Διαλυτές στον ορό πρωτεΐνες : C1-INH, C4bp, Factor I, Factor H, clusterin και S-protein. Μεμβρανικές πρωτεΐνες : CR1, DAF, MCP, CD59, υποδοχέας C1q. 21

1.Γ ΓΟΝΙΔΙΑ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ 1.Γ.1 Οικογένειες γονιδίων των πρωτεϊνών του συμπληρώματος Οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος ταξινομούνται σε γονιδιακές οικογένειες με βάση την ομολογία των αλληλουχιών τους [37]. Έτσι δημιουργούνται πέντε οικογένειες γονιδίων του συμπληρώματος: C3/C4/C5, Bf/C2, MASP/C1r/s, C6/C7/C8α/C8β/C9 και Factor I [38]. Άμεση συνέπεια των κοινών δομικών μοτίβων είναι η ύπαρξη παρόμοιων λειτουργικών χαρακτηριστικών. Επιπλέον, οι ομολογίες μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών του συμπληρώματος υποδηλώνουν ότι μέλη διαφορετικών οικογενειών πιθανόν να προέκυψαν από ένα αρχέγονο γονίδιο. Επακόλουθες δομικές διαφοροποιήσεις προσδίδουν μια ξεχωριστή και εξειδικευμένη λειτουργία σε κάθε πρωτεΐνη. C3/C4/C5 Οι πρωτοταγείς δομές των C3, C4, και C5 εμφανίζουν μικρή αλλά ουσιώδη ομοιότητα με τον αναστολέα πρωτεασών α-2-μακροσφαιρίνη και το CD109 ένα μόριο της κυτταρικής επιφάνειας. Επίσης, τα παραπάνω μόρια διαθέτουν μια μοναδική δομή ενδομοριακού θειοεστερικού δεσμού, ενώ το C5 φαίνεται να την έχει απωλέσει στην πορεία της εξέλιξης. Ως εκ τούτου τα μόρια αυτά συνθέτουν μια οικογένεια πρωτεϊνών οι οποίες περιέχουν στο μόριο τους θειοεστερικό δεσμό (thioester-containing protein (TEP) family). Bf/C2 Το κοινό δομικό και γενετικό χαρακτηριστικό της οικογένειας αυτής είναι τα τρία μοτίβα SCRs (Short Consensus Repeats) ή CCP (Complement Control Proteins), μια δομή παράγοντα von Willebrand τύπου Α και ένα μοτίβο πρωτεάσης σερίνης. Η δομή των δύο αυτών μορίων είναι μοναδική μεταξύ των γονιδίων των ανώτερων σπονδυλοτών. MASP/C1r/s Οι πρωτεϊνική αυτή οικογένεια προήλθε μέσω γονιδιακών διπλασιασμών, ρετρομεταθέσεων και μετατροπών της περιοχής που κωδικοποιεί για τη δομή, πρωτεάση σερίνης. 22

C6/C7/C8α/C8β/C9 Σε ότι αφορά τα τελικά συστατικά του συμπληρώματος (TCC) C6, C7, C8α, C8β και C9, αυτά περιλαμβάνουν μία περιοχή πλούσια και μία περιοχή φτωχή σε κατάλοιπα κυστεΐνων. Φυλογενετική ανάλυση των C6, C7, C8α, C8β και C9, έδειξε την κοινή τους καταγωγή από ένα αρχέγονο γονίδιο. Όσον αφορά τη σειρά των γεγονότων που οδήγησαν στη γένεση των τελικών συστατικών του συμπληρώματος, υπάρχουν δύο θεωρίες : Η πρώτη θεωρία υποστηρίζει ότι το γονίδιο της πρωτεΐνης C9 έχει προκύψει από το διπλασιασμό του κοινού προγονικού γονιδίου των περφορινών και των πρωτεϊνών του τελικού συμπλόκου λύσης. Το συμπέρασμα αυτό στηρίζεται σε παρατηρήσεις ομοιότητας μεγέθους νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και λειτουργίας μεταξύ περφορίνης και C9. Τέλος, σύμφωνα με την υπόθεση αυτή τα C8, C7 και C6 έχουν προκύψει διαδοχικά από το C9, μέσω γεγονότων γονιδιακού διπλασιασμού και ενσωμάτωσης νέων μοτίβων. Η δεύτερη θεωρία, που αναπτύχθηκε πρόσφατα, προτείνει ως προγονικό ένα μόριο C6/C7 like και προϋποθέτει ότι η εξέλιξη των πρωτεϊνών πέρασε από τη σύνθετη στην απλούστερη δομή [39]. Τα τελικά συστατικά του συμπληρώματος διακρίνονται από χαρακτηριστικά δομικά μοτίβα. Από τα μόρια TCC, την απλούστερη δομή παρουσιάζει το συστατικό C9 καθώς φέρει μία περιοχή φτωχή σε κυστεΐνες, μια περιοχή EGF (Epidermal Growth Factor), μία LDLRa (Low Density Lipoprotein Receptor type A) και μία περιοχή TSP1 (Thrombospondin). Τα συστατικά C8α και C8β φέρουν μία επιπλέον περιοχή TSP1, ενώ τα C6 και C7 έχουν μια πιο σύνθετη δομή, με δύο επιπλέον SCRs και δύο περιοχές Factor I. Επιπλέον, το C6 φέρει μία επιπλέον TSP1 περιοχή [37,38,39]. 1.Γ.2 Χρωμοσωμική εντόπιση των γονιδίων του συμπληρώματος και γενετική σύνδεση Υπάρχουν τρεις ομάδες πρωτεϊνών, οι οποίες μπορούν να προσδιοριστούν λόγω γενετικής σύνδεσης των μελών τους : 23

α) τα μέλη της οικογένειας των RCA πρωτεϊνών, που εδράζονται στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 1. β) τα μέλη του συμπλόκου MAC (C6, C7, C8 και C9), συνδέονται επίσης με μια περιοχή του χρωμοσώματος 1. γ) μία άλλη περιοχή που ερευνάται είναι η περιοχή μέσα στο MHC, όπου γειτνιάζουν τα C2, Factor B και C4 (περιοχή MHCIII) [36,40]. 1.Γ.3 Βιοσύνθεση των πρωτεϊνών του συμπληρώματος Τα ηπατοκύτταρα και τα μονοκύτταρα του αίματος αποτελούν τα βασικά σημεία σύνθεσης των πρωτεϊνών του συμπληρώματος. Πιο συγκεκριμένα, τα μεγαλύτερα ποσά των πρωτεϊνών του συμπληρώματος συντίθενται στο ήπαρ, αν και η σύνθεση από τα μονοκύτταρα μπορεί να είναι εξίσου σημαντική σε περιοχές φλεγμονής. Παρόλα αυτά, σε ιδιάζουσες περιπτώσεις υπάρχουν και άλλοι τύποι κυττάρων, που δύναται να συνθέσουν κάποιες από τις πρωτεΐνες του συμπληρώματος. Για παράδειγμα, ενδιαφέρουσα είναι η σύνθεση ενός αριθμού πρωτεϊνών της εναλλακτικής οδού, επαγόμενης από ιντερφερόνη γ, στα μακροφάγα και στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ρύθμιση της παραγωγής των πρωτεϊνών του συμπληρώματος είναι σύνθετη και όχι πλήρως χαρακτηρισμένη. Ωστόσο, η κάθε πρωτεΐνη συντίθεται ξεχωριστά και οι ώριμες πρωτεΐνες συναρμολογούνται εξωκυττάρια. 1.Δ. ΤΟ ΟΓΔΟΟ ΣΥΣΤΑΤΙΚΟ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ (C8) 1. Δ. 1 Η πρωτεΐνη C8α Το συστατικό C8α είναι υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος, το οποίο συμμετέχει στο σχηματισμό του τελικού λυτικού συμπλόκου. Το συστατικό C8α στον άνθρωπο είναι μία μονομερής πρωτεΐνη, μοριακού βάρους 64 KDa, η οποία αποτελεί υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος. Το γονίδιο της 24

πρωτεϊνης C8α χαρτογραφείται στο χρωμοσώμα 1 και συγκεκριμένα στο μικρό βραχίονα, στη θέση 32 (1p32) [41]. Η πρωτεΐνη C8α (584 αα) αποτελείται από μία περιοχή με χαμηλή περιεκτικότητα σε κυστεϊνες (cysteine poor region), η οποία παρουσιάζει ομολογία με την περφορίνη και από μία περιοχή υψηλής περιεκτικότητας σε κυστεϊνες (cysteine rich region). Η τελευταία αποτελείται από χαρακτηριστικά δομικά μοτίβα, όπως τα TSP1, LDLaR και EGFR, τα οποία διαθέτουν και οι λοιπές πρωτεΐνες του συμπλόκου MAC (Εικ. 1.10). Εικόνα 1.10 : Αναπαράσταση της πρωτεϊνικής δομής του συστατικού C8α του ανθρώπου, με τη βοήθεια του λογισμικού SMART. Τέλος, η πολυπεπτιδική αλυσίδα του C8α φέρει δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης, σε ασπαραγίνες κοντά στο αμινο-τελικό αλλά και στο καρβόξυ-τελικό άκρο. Ολόκληρη η γλυκοπρωτεϊνη συγκρατείται στο χώρο με 28 δισουλφιδικούς δεσμούς [42]. Το C8α συνδέεται ομοιοπολικά με το C8γ, ενώ διαθέτει περιοχές μη ομοιοπολικής αλληλεπίδρασης για άλλα τελικά συστατικά του συμπληρώματος και ρυθμιστικές πρωτεΐνες (Εικ. 1.11) [43]. Εικόνα 1.11 : Αναπαράσταση των θέσεων πρόσδεσης του C8α με τα άλλα συστατικά του συμπληρώματος και ο σχηματισμός του τελικού λυτικού συμπλόκου. 25

1. Δ. 2 Η πρωτεΐνη C8β Το συστατικό C8β είναι υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος, το οποίο συμμετέχει στο σχηματισμό του τελικού λυτικού συμπλόκου. Το συστατικό C8β στον άνθρωπο είναι μία μονομερής πρωτεΐνη, μοριακού βάρους 64 KDa, η οποία αποτελεί υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος. Το γονίδιο της πρωτεϊνης C8β χαρτογραφείται στο χρωμοσώμα 1 και συγκεκριμένα στο μικρό βραχίονα, στη θέση 32 (1p32), πλησίον του γονιδίου C8α [41]. Η πρωτεΐνη C8β (591 αα) αποτελείται από μία περιοχή με χαμηλή περιεκτικότητα σε κυστεϊνες (cysteine poor region), η οποία παρουσιάζει ομολογία με την περφορίνη και από μία περιοχή υψηλής περιεκτικότητας σε κυστεϊνες (cysteine rich region). Η τελευταία αποτελείται από χαρακτηριστικά δομικά μοτίβα, όπως τα TSP1, LDLaR και EGFR, τα οποία διαθέτουν και οι λοιπές πρωτεΐνες του συμπλόκου MAC (Εικ. 1.12). Εικόνα 1.12 : Αναπαράσταση της πρωτεϊνικής δομής του συστατικού C8β του ανθρώπου, με τη βοήθεια του λογισμικού SMART. Τέλος, η πολυπεπτιδική αλυσίδα του C8β φέρει δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης, σε ασπαραγίνες κοντά στο αμινο-τελικό αλλά και στο καρβόξυ-τελικό άκρο. Ολόκληρη η γλυκοπρωτεϊνη συγκρατείται στο χώρο με 26 δισουλφιδικούς δεσμούς [44]. Το C8β συνδέεται μη ομοιοπολικά με το C8α, ενώ διαθέτει περιοχές μη ομοιοπολικής αλληλεπίδρασεις για άλλα τελικά συστατικά του συμπληρώματος και ρυθμιστικές πρωτεΐνες (Εικ. 1.11) [45,46]. 26

1. Δ. 3 Η πρωτεΐνη C8γ Το συστατικό C8γ είναι υπομονάδα του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος, το οποίο συμμετέχει στο σχηματισμό του τελικού λυτικού συμπλόκου. Το C8γ είναι μια μονομερής πρωτεΐνη, η μικρότερη εκ των τριών υπομονάδων (α, β, γ), με μοριακό βάρος 22 KDa. Οι τρεις υπομονάδες συντίθενται ως προϊόντα ξεχωριστών γονιδίων και εκκρίνονται στον ορό. Το γονίδιο C8γ χαρτογραφείται στο χρωμοσώμα 9 και συγκεκριμένα στο μεγάλο βραχίονα, στη θέση 34.3 (9q34.3) [47]. Το C8α και C8γ συνδέονται μεταξύ τους με ένα δισουλφιδικό δεσμό, ενώ το διμερές αυτό δεσμεύεται στο C8β μη ομοιοπολικά (Εικ. 1.11). Από τις 35 πρωτεΐνες, ένζυμα, υποδοχείς και ρυθμιστικά συστατικά του ανθρώπινου συμπληρώματος, το C8γ είναι το μοναδικό συστατικό που ανήκει στην πρωτεϊνική οικογένεια των λιποκαλινών (Εικ. 1.13) [48]. Μεταξύ των λιποκαλινών, το C8γ είναι μοναδικό διότι σχηματίζει ομοιοπολικό σύμπλεγμα με μια άλλη πρωτεΐνη, το C8α. Οι λιποκαλίνες είναι μια μεγάλη οικογένεια εκκρινόμενων πρωτεϊνών με παρόμοιο μέγεθος (~ 20 KDa) και την χαρακτηριστική ιδιότητα να δεσμεύουν μικρούς υδρόφοβους προσδέτες, π.χ. ρετινόλη, φερομόνες κα [49]. Εικόνα 1.13 : Αναπαράσταση της πρωτεϊνικής δομής του συστατικού C8γ του ανθρώπου, με τη βοήθεια του λογισμικού SMART. Η κρυσταλλική δομή αρκετών λιποκαλινών δείχνει πως, παρόλη την ποικιλότητα στην αμινοξική αλληλουχία, όλες οι λιποκαλίνες έχουν ένα κοινό πρότυπο κατά την αναδίπλωση στην τριτοταγή δομή τους. Αυτή η χαρακτηριστική τριτοταγής δομή αποτελείται από οκτώ αντιπαράλληλες β-πτυχές τοποθετημένες έτσι ώστε να σχηματίζουν μια δόμη β- κυλίνδρου με μια διακριτή εσοχή για τη δέσμευση προσδέτη (Εικ. 1.14) [50]. 27

Εικόνα 1.14 : Αναπαράσταση της χαρακτηριστικής δομής των λιποκαλινών 1. Δ. 4 Ρύθμιση της ενεργοποίησης της λυτικής οδού του συμπληρώματος Αναφέρθηκε παραπάνω ότι το σύστημα του συμπληρώματος δε διαθέτει την ικανότητα αναγνώρισης του ιδίου από το ξένο. Το γεγονός αυτό κατέστησε επιτακτική την ανάγκη ύπαρξης συγκεκριμένων πρωτεϊνών, των οποίων ρόλος είναι ο έλεγχος του εύρους ενεργοποίησης του συμπληρώματος, τόσο στην υγρή φάση, όσο και στην επιφάνεια των κυττάρων του ξενιστή. Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην υγρή φάση χρησιμεύουν στον περιορισμένο σχηματισμό των θραυσμάτων C4b και C3b. Επίσης, απενεργοποιούν τα ήδη υπάρχοντα θραύσματα, μειώνοντας έτσι την κυτταρική βλάβη. Στις πρωτεΐνες αυτές περιλαμβάνονται ο C1INH, C4bp, Factor H και Factor I. Κάποιες από τις πρωτεΐνες υγρής φάσης, όπως η κλαστερίνη και η βιτρονεκτίνη αναστέλλουν το σχηματισμό κυτολυτικού MAC. Όσα θραύσματα C4b και C3b ξεφύγουν από τον παραπάνω έλεγχο και επικαθίσουν στα κύτταρα, αδρανοποιούνται από μεμβρανικούς απενεργοποιητές, όπως DAF, MCP, CR1. Κάποιες μεμβρανικές πρωτεΐνες απενεργοποίησης (CD59, HRF) κάνουν το MAC μη κυτολυτικό, καθώς συγκροτούνται και προστατεύουν το κύτταρο ξενιστή. Για παράδειγμα, το CD59 [51] διανέμεται ευρέως μεταξύ διαφορετικών κυττάρων και εισέρχεται στη μεμβράνη μέσω δεσμών φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης. Πιθανότατα το CD59 να είναι το πιο σημαντικό ρυθμιστικό μόριο για την προστασία των γειτνιαζόντων 28

κυττάρων από λύση, όταν το συμπλήρωμα ενεργοποιείται σε διπλανά βακτήρια ή ανοσοσυμπλέγματα. Το CD59 προσδένεται στο C8 και C9 κατά το σχηματισμό του συμπλόκου MAC και την ενσωμάτωση στη μεμβράνη των μορίων C9. Τέλος, η διείσδυση των τελικών συστατικών του συμπληρώματος αναστέλλεται και από την πρωτεΐνη S ή βιτρονεκτίνη, που δρα συνδεόμενη στο C5b-7, εμποδίζοντας το σύμπλοκο να εισέλθει στη μεμβράνη. Τέλος, η ικανότητα λύσης του MAC πιθανό να ρυθμίζεται από μια κυκλοφορούσα πρωτεΐνη, την SP40, ένα ετεροδιμερές που έχει απομονωθεί από συμπλέγματα C5-9. Ο μηχανισμός δράσης δεν είναι γνωστός. Κατά συνέπεια, οι αναστολείς υγρής φάσεως σε συνεργασία με τους μεμβρανικούς αναστολείς προστατεύουν το κύτταρο από την αυτόλογη δράση του συμπληρώματος. 1.Ε. ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΚΑΙ ΕΞΕΛΙΞΗ Εισαγωγή Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης προέκυψαν δύο βασικοί βραχίονες ανοσίας : Η φυσική ή έμφυτη και η προσαρμοστική ή ειδική ή επίκτητη ανοσία. Τα δύο αυτά συστήματα ανοσίας εξελίχθηκαν παράλληλα από ένα σημείο κι έπειτα, ωστόσο αυτό που εμφανίστηκε πρώτο είναι το σύστημα της φυσικής ανοσίας. Έτσι, η φυσική ανοσία είναι φυλογενετικά προγενέστερη και απαντάται σε κάποια μορφή σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς, σε αντίθεση με την προσαρμοστική, που είναι πιο πρόσφατη. Εκτιμάται, δε, ότι η εμφάνιση της ειδικής ανοσίας συνέπεσε με αυτήν των χονδριχθύων, πριν από 450 εκατομμύρια χρόνια και από τότε συνεχώς βελτιώνεται (Εικ. 1.15). Κατά συνέπεια, είναι παρούσα σε όλα τα σπονδυλωτά (ιχθύες, αμφίβια, ερπετά, πτηνά, θηλαστικά), πλην των αγνάθων ιχθύων. 29

Αρθρόποδα Η ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Οστεϊχθύες θηλαστικά Ουροχορδωτά ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Χονδριχθύες Μαλάκια Εχινόδερμα ΣΥΣΤΗΜΑ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Κυκλόστομοι ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ 900 my 450 my Εικόνα 1.15 : Η εξέλιξη της φυσικής ανοσίας κατά τη διάρκεια των γεωλογικών χρόνων Τα δύο συστήματα συμπληρώνουν το ένα τη δράση του άλλου, με συνέπεια μια αποτελεσματική απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος, σε οργανισμούς που και τα δύο συστήματα είναι παρόντα. Έτσι, το σύστημα του συμπληρώματος, που αποτελεί ακρογωνιαίο λίθο της φυσικής ανοσίας, στα ανώτερα σπονδυλωτά παίζει σημαντικό ρόλο ως ενεργοποιητής τόσο της φυσικής όσο και της επίκτητης ανοσίας, ενώ συμμετέχει σε πολλές ανοσορυθμιστικές διαδικασίες. Τι συμβαίνει, όμως, στα κατώτερα σπονδυλωτά, όπου η προστασία έναντι των παθογόνων παρέχεται αποκλειστικά και μόνο από τη φυσική ανοσία; Στην περίπτωση των κατώτερων σπονδυλωτών το συμπλήρωμα ενεργοποιείται δια της κλασσικής και της λεκτινικής οδού και ενέχεται πρωτίστως στην οψωνοποίηση του ξένου υλικού [52]. Έτσι, τα άγναθα, τα πιο πρωτόγονα σπονδυλωτά, κατέχουν την εναλλακτική και τη λεκτινική οδό, ενώ οι χονδριχθύες [53] είναι το πρώτο taxon όπου εμφανίζεται το κλασσικό μονοπάτι ενεργοποίησης, ακολουθώντας την εμφάνιση των ανοσοσφαιρινών. Τέλος, τα υπόλοιπα ποικιλόθερμα taxa, από τους τελεόστεους ιχθύες μέχρι και τα ερπετά, εμφανίζουν ένα αρκετά αναπτυγμένο σύστημα του συμπληρώματος, ομοιάζον με εκείνο των θηλαστικών. 30

Οι ομοιότητες που παρουσιάζουν κάποια από τα συστατικά του συμπληρώματος μεταξύ τους οδήγησε σε μια διακριτή ομαδοποίηση (C3/C4/C5, fb/c2, C1s/C1r/MASP- 1/MASP-2 και C6/C7/C8/C9), η οποία φαίνεται να οφείλεται σε διπλασιασμό αρχέγονων γονιδίων, με τελικό αποτέλεσμα τη δημιουργία διακεκριμένων μονοπατιών ενεργοποίησης. Επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι πολλοί ποικιλόθερμοι οργανισμοί (π.χ πέστροφα), έχουν πολλαπλές μορφές συστατικών του συμπληρώματος (π.χ fb, MBL, C3, C7) [54,55], σε αντίθεση με τους ομοιόθερμους. Τι μπορούν να εξυπηρετούν, όμως, οι διαφορετικές μορφές ενός συστατικού; Όσον αφορά το τρίτο συστατικό του συμπληρώματος, έχει δειχθεί ότι οι πολλαπλές μορφές του στους τελεόστεους ιχθύες προσδένονται διαφορετικά στις επιφάνειες που ενεργοποιούν το συμπλήρωμα. Αυτό έχει μεγίστη σημασία για τους οργανισμούς αυτούς, που έχουν διαρκώς να αντιμετωπίσουν ένα ευρύ φάσμα παθογόνων μικροοργανισμών, στο ευμετάβλητο υγρό στοιχείο. Οι οργανισμοί αυτοί έχουν μικρό τίτλο ανοσοσφαιρινών και άρα περιορισμένη ικανότητα προσαρμοστικής ανοσίας. Η καθυστέρηση της ανοσολογικής απόκρισης θα ήταν μοιραία. Ένας τρόπος που εξελικτικά επιλέχθηκε ως υπέρβαση του μειονεκτήματος αυτού, ήταν να επεκτείνουν τη φυσική τους ανοσία και μάλιστα με τέτοιο τρόπο, ώστε να αντιμετωπίζουν έγκαιρα και αποτελεσματικά ένα ευρύ φάσμα παθογόνων μικροοργανισμών. Έτσι, με αυτή την αξιοσημείωτη ποικιλότητα στα συστατικά του συμπληρώματος οι τελεόστεοι ιχθύες κατάφεραν να διευρύνουν τις ικανότητες ανοσοαναγνώρισης [56], που όχι μόνο ενισχύει τις ικανότητες του ανοσοποιητικού τους συστήματος, αλλά συμπληρώνει και τους περιορισμούς της προσαρμοστικής ανοσίας. Άλλο σημαντικό επιστημονικό εύρημα, που συμπληρώνει το εξελικτικό παζλ, είναι η παρουσία υποδοχέων του συμπληρώματος σε πρωτοχορδωτά και κατώτερα σπονδυλωτά. Υπάρχουν σημαντικά στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το σύστημα του συμπληρώματος είναι παρόν σε όλοι τη σειρά των δευτεροστομίων, ενώ ρυθμιστικά μόρια έχουν αναγνωριστεί σε όλα τα είδη μετά τα πρωτοχορδωτά, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι οι μηχανισμοί ενεργοποίησης και ρύθμισης του συμπληρώματος αναπτύχθηκαν εκ παραλλήλου [57]. Όλα τα διαθέσιμα στοιχεία μας οδηγούν στο συμπέρασμα, σύμφωνα με το οποίο φαίνεται να εμφανίστηκε ένα πρωτόγονο σύστημα συμπληρώματος, πρώιμα 31

στη σειρά των δευτεροστομίων, αποτελούμενο από C3, fb, MASP, έναν οψωνικό υποδοχέα και ρυθμιστικά μόρια, που σχημάτιζαν ένα μονοπάτι πρόγονο της εναλλακτικής και λεκτινικής οδού στα σπονδυλωτά. Μετά την εμφάνιση των κυκλοστομίων φαίνεται να δημιουργείται ένα πρωτόγονο λυτικό μονοπάτι, ενώ το κλασσικό μονοπάτι πιθανότατα έκανε την εμφάνισή του μετά την παρουσία των χονδριχθύων και πριν την απόκλιση των τελεόστεων ιχθύων. 1. Ε. 1 Εξέλιξη των συστατικών της λυτικής οδού Η λυτική οδός εκκινεί με την παραγωγή του θραύσματος C5b, από την πρωτεολυτική διάσπαση του C5, το οποίο θα αποτελέσει υπόστρωμα για τη δέσμευση του C6 και μέσω διαδοχικών δεσμεύσεων, θα συγκροτηθεί το σύμπλοκο λύσης της κυτταρικής μεμβράνης. Παρά την κοινή τους συμμετοχή στο MAC complex τα συστατικά του δεν ομαδοποιούνται εξελικτικά σε μία ενιαία ομάδα. Έτσι, το πέμπτο συστατικό του συμπληρώματος (C5), το οποίο έχει κλωνοποιηθεί και μελετηθεί πέρα των θηλαστικών στην πέστροφα [58], τσιπούρα και στον κυπρίνο, αποτελείται μεν από δύο αλυσίδες (α και β), που ενώνονται με δισουλφιδικό δεσμό, ωστόσο δεν περιέχουν ενεργό θειοεστερικό δεσμό, όπως συμβαίνει και με τα συστατικά C3 και C4. Τα δεδομένα αυτά συνηγορούν στην υπόθεση ότι το C5 φαίνεται να συνδέεται φυλογενετικά με τα C3 και C4. Απεναντίας, τα συστατικά της λυτικής οδού C6, C7, C8α, C8β και C9 συνδέονται φυλογενετικά μεταξύ τους και έχουν ομολογία με την περφορίνη [59], τη λυτική πρωτεΐνη, που εντοπίζεται στα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα φυσικούς δολοφόνους (NK cells). Τέλος, στα συστατικά της λυτικής οδού ανήκει και το C8γ, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των λιποκαλινών, δεν έχει καμία δομική ομολογία με τα άλλα συστατικά της λυτικής οδού και ο ρόλος του δεν είναι πλήρως κατανοητός στο σχηματισμό του συμπλόκου C5b-9. Η ομοιότητα στο μέγεθος, τη νουκλεοτιδική αλληλουχία αλλά και τη λειτουργία, που έχει παρατηρηθεί μεταξύ περφορίνης και ανθρώπινου C9 υποστηρίζει την υπόθεση ότι το C9 προέκυψε από διπλασιασμό ενός αρχέγονου γονιδίου που έδωσε γένεση στις περφορίνες και στις MAC πρωτεΐνες. Όλες αυτές οι πρωτεΐνες στον άνθρωπο έχουν 32

κοινά δομικά μοτίβα [60,61], π.χ θρομβοσπονδίνη (TSP1), υποδοχέα λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας τύπου Α (LDLRa), επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), και περιοχή MAC/περφορίνης (MACPF). Επιπλέον, τα συστατικά C6 και C7 περιέχουν SCRs περιοχές, καθώς και περιοχές FIMAC στο C τελικό άκρο (Εικ. 1.16). Εικόνα 1.16 : Δομική οργάνωση της οικογένειας των MAC πρωτεϊνών, με βάση τα δεδομένα της SWISS- PROT Protein Sequence Data Bank. Το συστατικό C8γ δεν παρουσιάζει την παραπάνω χαρακτηριστική δομική οργάνωση, αλλά συνδέεται με δισουλφιδικό δεσμό στο C8α κατά των σχηματισμό του MAC συμπλόκου. Έχει δειχθεί ότι τα τελικά συστατικά του συμπληρώματος των τελεόστεων ιχθύων, ομοιάζουν με αυτά των θηλαστικών. Τα γονίδια C6 C9 έχουν χαρακτηριστεί στον κυπρίνο, την πέστροφα, το puffer fish, το Japanese flounder. Για παράδειγμα, τα C8 του κυπρίνου και του ανθρώπου αποτελούνται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες 62, 62 και 22 KDa, ενώ το C9 του κυπρίνου είναι μεγαλύτερο κατά 20 KDa από αυτό του ανθρώπου (93 και 71 KDa αντίστοιχα). 33

1. ΣΤ. ΙΡΙΔΙZΟΥΣΑ ΠΕΣΤΡΟΦΑ (Oncorhynchus mykiss irideus) Η ιριδίζουσα πέστροφα ανήκει στους τελεόστεους οστεϊχθύες και πιο συγκεκριμένα στην οικογένεια Salmonidae, που περιλαμβάνει μεταξύ άλλων και το σολωμό. Εκπρόσωποι του είδους αυτού στα κρύα νερά και τις λίμνες της Β. Αμερικής, Ευρώπης και Ασίας. Κάτω από ευνοϊκές συνθήκες, πολλά είδη, μεταξύ αυτών και η ιριδίζουσα πέστροφα, μεταναστεύουν στη θάλασσα, αλλά απαιτούν απαραίτητα φρέσκο νερό. Η πλήρης συστηματική της ιριδίζουσας πέστροφας είναι η ακόλουθη : Φύλο : Χορδωτά Υπερκλάση : Γναθοστόματα Κλάση : Οστεϊχθύες Υποκλάση : Ακτινοπτερύγιοι Ανθυπόκλαση : Νεοπτερύγιοι Υπέρταξη : Τελεόστεοι Τάξη : Salmoniformes Οικογένεια : Salmonidae Γένος : Oncorhynchus Είδος : Oncorhynchus mykiss Υποείδος : Oncorhynchus mykiss irideus. Εικόνα 1.17 : Κλαδόγραμμα όλων των χορδωτών. Η ιριδίζουσα πέστροφα ανήκει στους οστεϊχθύες 34

ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η εμφάνιση του συστήματος του συμπληρώματος, του ακρογωνιαίου λίθου της φυσικής ανοσίας, εκτιμάται ότι συνέπεσε με την εμφάνιση της σειράς των δευτεροστομίων, μια και συστατικά του συμπληρώματος έχουν ταυτοποιηθεί και στα εχινόδερμα. Ωστόσο, οι ιχθύες είναι αυτοί που πρώτοι παρουσίασαν ένα πλήρες, δομικά και λειτουργικά, σύστημα του συμπληρώματος. Η πέστροφα, η οποία εξελικτικά τοποθετείται στους οστεϊχθύες, επικεντρώνει το ενδιαφέρον σε ό,τι αφορά τη μελέτη του συστήματος αυτού. Και αυτό γιατί η ταυτοποίηση πολλαπλών μορφών ορισμένων συστατικών του συμπληρώματος (C3, C4, C5, C7, fb), σε αντίθεση με τα θηλαστικά, διευρύνει το φάσμα δράσης του συστήματος του συμπληρώματος στους τελεόστεους ιχθύες και κατά συνέπεια στην πέστροφα. Το γεγονός αυτό ανοίγει νέους ορίζοντες στην εκμετάλλευση του συστήματος του συμπληρώματος, προκειμένου να επεκταθούν οι αντίστοιχοι μηχανισμοί ανοσίας στον άνθρωπο(π.χ κατασκευή εμβολίων, που θα περιέχουν ανοσοενισχυτικά μόρια του συστήματος του συμπληρώματος). Έχοντας υπόψη τα παραπάνω, εδώ και αρκετά χρόνια η μελέτη της εξέλιξης του Συμπληρώματος μέσω της ταυτοποίησης των συστατικών του συμπληρώματος στην ιριδίζουσα πέστροφα και η σύγκριση με τα αντίστοιχα δεδομένα στον άνθρωπο, αποτελεί τον βασικό άξονα της ερευνητικής μας ομάδας στο εργαστήριο Γενικής Βιολογίας του Τμήματος Ιατρικής. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η κλωνοποίηση και ο χαρακτηρισμός της α (άλφα) και γ (γάμμα) υπομονάδας του όγδοου συστατικού του συμπληρώματος, τα οποία αποτελούν βασικά συστατικά του συμπλόκου λύσης της κυτταρικής μεμβράνης. Πιο συγκεκριμένα, πέραν της κλωνοποίησης, ο στόχος αφορούσε τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων C8α και C8γ σε επίπεδο mrna, τον προσδιορισμό των πιθανών αντιγράφων στο γονιδίωμα καθώς επίσης και την επεξεργασία των προκυπτουσών αμινοξικών αλληλουχιών με ειδικά προγράμματα λογισμικού. Τέλος, με βάση τα δεδομένα που θα προκύψουν, θα γίνει ανάλυση της φυλογενετικής σύνδεσης των C8α και C8γ με άλλα γνωστά C8 μόρια διαφορετικών οργανισμών, εξάγοντας συμπεράσματα σχετικά με τη συντήρηση του γονιδίου κατά τη διάρκεια της φυλογενετικής εξέλιξης. 35

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 36

2.1 Διαλύματα 10X RSB 1% κ.ο. NP-40 Διάλυση Nonident-P40 σε αποστειρωμένο ddh 2 O. Το NP-40 είναι ένα μη ιονικό απορρυπαντικό. Σε τελική συγκέντρωση 0.25% προκαλεί ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών και όχι των πυρηνικών. 20% SDS Για 100ml δ/τος, προσθήκη 20g SDS σε ddh 2 O. Προκειμένου να διαλυθεί το SDS ζεσταίνουμε λίγο το διάλυμα. Ρύθμιση του ph 7,2 με σταγόνες π.hcl, αν χρειάζεται. 3M CH 3 COONa Για 200ml διαλύματος, προσθήκη 81,6g CH 3 COONa 3H 2 0 σε ddh 2 O. Ρύθμιση του ph στο 5,5 ή 7 με δ/μα οξικού οξέος. Αποστείρωση. Φαινόλη / Χλωροφόρμιο 1:1 Ίσοι όγκοι διαλυμάτων φαινόλης και χλωροφορμίου 1/1 κ.ο. 10X Τ.Ε Buffer 1Μ Tris-HCl Για 500ml διαλύματος, προσθήκη: 50ml δ/τος 1Μ Tris (τελική C 100mM), 10ml δ/τος 0,5Μ EDTA ph 8 (τελική C 10mM) σε ddh 2 O. Το ph καθορίζεται από αυτό του Tris-HCl. Αποστείρωση. Σε ddh 2 0 προσθήκη 60,55g Tris base μέχρι όγκου 500ml. H ρύθμιση του ph γίνεται με ~21ml πυκνό HCl για ph 8, ~30 ml για ph 7.6 και ~35ml για ph 7,4.Αποστείρωση. 37