ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ. Διαμορφωτική μελέτη αντιυπερτασικών φαρμάκων και αλληλεπιδράσεις τους με λιποειδείς διπλοστιβάδες με χρήση φυσικοχημικών μεθόδων.

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Διαμορφωτική μελέτη αντιυπερτασικών φαρμάκων και αλληλεπιδράσεις τους με λιποειδείς διπλοστιβάδες με χρήση φυσικοχημικών μεθόδων. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΝΤΟΥΝΤΑΝΙΩΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΠΑΤΡΑ 2012

UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF CHEMISTRY Conformational study of antihypertensive drugs and their interactions with lipid bilayers using physicochemical methodologies. Ph. D. THESIS NTOUNTANIOTIS DIMITRIOS PATRAS 2012

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Διαμορφωτική μελέτη αντιυπερτασικών φαρμάκων και αλληλεπιδράσεις τους με λιποειδείς διπλοστιβάδες με χρήση φυσικοχημικών μεθόδων. ΝΤΟΥΝΤΑΝΙΩΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡIΟΣ Η υπέρταση είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που αυξάνει τα καρδιαγγειακά επεισόδια τα οποία ευθύνονται περίπου για το ήμισυ των θανατηφόρων επεισοδίων στους ενήλικους. To σύστημα ρενίνης-αγγειοτασίνηςαλδοστερόνης (ΣΡΑΑ) διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παθοφυσιολογία των καρδιαγγειακών νόσων. Η αναστολή του ΣΡΑΑ σε παθολογικές καταστάσεις μπορεί να πραγματοποιηθεί με αναστολή του ενζύμου της ρενίνης ή παρεμπόδιση της σύνδεσης της ΑΙΙ με τους υποδοχείς ΑΤ 1. Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι τα αμφοτερικά μόρια για να αλληλεπιδράσουν με τον υποδοχέα θα πρέπει πρώτα να εισδύσουν σε κατάλληλη τοπογραφική θέση στις βιολογικές μεμβράνες και μετά με διάχυση να προσεγγίσουν το ενεργό κέντρο όπου όταν προσδεθούν με μία σειρά αντιδράσεων θα εξασκήσουν τη βιολογική τους δράση. Για την κατανόηση του ρόλου των μεμβρανών στο σύστημα ΣΡΑΑ μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις της αλισκιρένης (αναστολέας ρενίνης) και ολμεσαρτάνης (ανταγωνιστής αγγειοτασίνης ΙΙ) σε μοντέλα διπλοστιβάδων διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης με ή χωρίς χοληστερόλη. Οι μελέτες διεξήχθησαν κάνοντας χρήση Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (υγρής και στερεής κατάστασης), Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης, Φασματοσκοπίας Raman και Περίθλασης Ακτίνων-Χ. Σύγκριση των πειραματικών αποτελεσμάτων με άλλες σαρτάνες που μελετήθηκαν κάνοντας χρήση τις ίδιες τεχνικές απόδειξαν ότι όλα τα φάρμακα του ΣΡΑΑ εντοπίζονται στην ενδιάμεση φάση όπου εξασκούν διαφορετικές υδρόφιλες και λιπόφιλες αλληλεπιδράσεις. Επομένως το κάθε φάρμακο αποτυπώνει τη δική του σφραγίδα μέσα στις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Αυτή η μοναδικότητα στις αλληλεπιδράσεις κάθε φαρμάκου με τις λιπιδικές διπλοστιβάδες ίσως να σχετίζεται και με τη μοναδικότητα του στο φαρμακευτικό του προφίλ. Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα που προέκυψε από τις μελέτες είναι ότι η ολμεσαρτάνη σε μεθανολικό διάλυμα τόσο σε χαμηλή θερμοκρασία όσο και σε θερμοκρασία δωματίου δεν είναι σταθερή και μετατρέπεται στο αιθερικό της παράγωγο το οποίο ταυτοποιήθηκε φασματοσκοπικά. Στις ίδιες συνθήκες δεν παρατηρήθηκε εστεροποίηση. ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: ολμεσαρτάνη, αλισκιρένη, διπλοστιβάδες διπαλμιτκής φωσφατιδυλοχολίνης, Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης, Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός στερεής κατάστασης, φασματοσκοπία Raman, περίθλαση ακτίνων-x, μεθυλαιθέρας της ολμεσαρτάνης

ABSTACT Conformational study of antihypertensive drugs and their interactions with lipid bilayers using physicochemical methodologies. NTOUNTANIOTIS DIMITRIOS Hypertension is one of the major risk factors responsible for the increase of half of the cardiovascular episodes in the adults. The system of Renin-Angiotensin-Aldosterone (RAAS) plays a determinative role in the pathophysiology of cardiovascular diseases. In a pathological state the aim is to block the generation of Angiotensin II through inhibition of rennin or angiotensin converting enzymes or its action on AT 1 receptor. It has been hypothesized that amphiphilic molecules in order to exert their action on the receptor site, they have first to enter into the lipidic core of the lipid bilayers and then diffuse towards the active site. Thus, if this mechanism is applied, the lipidic part of the membrane bilayers appears to play an important role in the membrane action. To comprehend on the membrane:drug interactions we have studied the effects of olmesartan and aliskiren using dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers with or without cholesterol. Various physical chemical methodologies such as liquid and solid state NMR, x-ray diffraction, Raman spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry have been applied. The comparative results with other SARTANs showed that all drugs of the RAAS system act on the polar group and upper part of the alkyl chain, but exert different interactions. Thus, each drug is characterized by its own fingerprint in terms of its interactions and this may explain its unique pharmacological profile. Another, intriguing result derived from this thesis dissertation is the observation that olmesartan in methanolic solution is converted to its ether analogue. This isolated product was unambiguously structurally elucidated using a combination of LC-MS and 2D NMR spectroscopy. KEY WORDS: olmesartan, aliskiren, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) bilayers, Differential Scanning Calorimetry, solid state NMR, Raman spectroscopy, x-ray diffraction, methylated ether of olmesartan

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή: Ιωάννης Ματσούκας, Καθηγητής 1 (Επιβλέπων) Θωμάς Μαυρομούστακος, Αναπληρωτής Καθηγητής 2 Γεώργιος Σπυρούλιας, Αναπληρωτής Καθηγητής 3 Επταμελής εξεταστική επιτροπή: Ιωάννης Ματσούκας, Καθηγητής 1 Θωμάς Μαυρομούστακος, Αναπληρωτής Καθηγητής 2 Γεώργιος Σπυρούλιας, Αναπληρωτής Καθηγητής 3 Αλέξιος-Λέανδρος Σκαλτσούνης, Καθηγητής 4 Θεόδωρος Τσέλιος, Επίκουρος Καθηγητής 1 Γεράσιμος Τσιβγούλης, Επίκουρος Καθηγητής 1 Μάνθος Παπαδόπουλος, Ερευνητής Α 5 1 Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 2 Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 3 Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 4 Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 5 Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών

UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF CHEMISTRY Advisory Committee: John Matsoukas, Professor 1 (Supervisor) Thomas Mavromoustakos, Associate Professor 2 George Spyroulias, Associate Professor 3 Examination Committee: John Matsoukas, Professor 1 (Supervisor) Thomas Mavromoustakos, Associate Professor 2 George Spyroulias, Associate Professor 3 Alexios-Leandros Skaltsounis, Professor 4 Theodore Tselios, Assistant Professor 1 Gerasimos Tsivgoulis, Assistant Professor 1 Manthos Papadopoulos, Researcher A 5 1 Department of Chemistry, University of Patras 2 Department of Chemistry, National and Kapodistrian University of Athens 3 Department of Pharmacy, University of Patras 4 Faculty of Pharmacy, National and Kapodistrian University of Athens 5 Institute of Biology, Pharmaceutical Chemistry and Biotechnology, National Hellenic Research Foundation

Στους γονείς μου Χρήστο και Ελένη και στην αδερφή μου Μαρία

Ευχαριστίες Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες σε όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της διδακτορικής μου διατριβής. Στον Καθηγητή κ. Ιωάννη Ματσούκα που αποδέχθηκε να είναι επιβλέπων μου, ώστε να είμαι υποψήφιος διδάκτορας στο Τμήμα Χημείας Πάτρας. Η προθυμία του να δώσει λύσεις σε προβλήματα που προέκυπταν και η συγκατάθεσή του να μου επιτρέψει να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή στο Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών και Πανεπιστήμιο Αθηνών έπαιξαν καταλυτικό ρόλο στην ολοκλήρωση της εργασίας μου. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θωμά Μαυρομούστακο για την καθοδήγησή του συνολικά, την καθημερινή του συμπαράσταση και την υπομονή του στο εκτενές ωράριο μου. Τον ευχαριστώ θερμά για την τεχνογνωσία που μου προσέφερε και τις ευκαιρίες που μου έδωσε για την εκπόνηση της διατριβής μου στο Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, στο Πανεπιστήμιο Αθηνών και σε ερευνητικά κέντρα αριστείας του εξωτερικού. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια, ο οποίος ως μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ήταν πάντοτε πρόθυμος να βοηθήσει και να ενημερώνεται για την πρόοδο της εργασίας μου. Στον Καθηγητή κ. Αλέξιο-Λέανδρο Σκαλτσούνη που δέχτηκε να μελετήσει και να κρίνει την εργασία μου, καθώς και για την ευκαιρία που μου έδωσε να πραγματοποιήσω πειράματα στο εργαστήριο του Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής Αθήνας. Στον Επίκουρο καθηγητή κ. Θεόδωρο Τσέλιο, που δέχτηκε να μελετήσει και να κρίνει την εργασία μου και κυρίως για τη διαρκή βοήθειά του σε όλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Επίσης τον ευχαριστώ για τις εύστοχες παρατηρήσεις του στις εργασίες των μαθημάτων του διδακτορικού και για την βοήθειά του κατά την απομόνωση του μεθυλαιθέρα της ολμεσαρτάνης. Στον Επίκουρο καθηγητή κ. Γεράσιμο Τσιβγούλη που δέχτηκε να μελετήσει και να κρίνει την εργασία μου. Στον Διευθυντή Ερευνών Δρ Μάνθο Παπαδόπουλο που δέχτηκε να μελετήσει και να κρίνει την εργασία μου. Στη Δρ Μαρία Χαλαμπαλάκη και στο Δρ Κώστα Ποταμίτη για την πολύτιμη και διαρκή βοήθειά τους, τη συμπαράσταση και τις συμβουλές κατά τη διάρκεια της εργασίας μου. Στη Msc Ελένη Σιάπη που ανήκει στο επιστημονικό προσωπικό του Ινστιτούτου Οργανικής και Φαρμακευτικής Χημείας για τη βοήθειά της σε πειράματα DSC και για τη διαρκή και άμεση ανταπόκρισή της.

Στη Dr Simona Golic Grdadolnik του Εργαστηρίου Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού του Εθνικού Ινστιτούτου Χημείας της Σλοβενίας για τη σημαντική βοήθειά της στα πειράματα NMR υγρής κατάστασης που διεξήχθησαν στη Λουμπλιάνα. Στo Dr. Gregor Mali του Εργαστηρίου Ανόργανης Χημείας και Τεχνολογίας του Εθνικού Ινστιτούτου Χημείας της Σλοβενίας για τη σημαντική βοήθειά του στα πειράματα NMR στερεής κατάστασης που διεξήχθησαν στη Λουμπλιάνα. Στoν καθηγητή Dr. Clemens Glaubitz και τη Dr Johanna Baldus για τη σημαντική βοήθειά τους σε πειράματα NMR στερεής κατάστασης που διεξήχθησαν στο Εργαστήριο Βιοφυσικής στην Φρανκφούρτη. Στo Dr Michael Rappolt για το χρόνο που διέθεσε στο εργαστήριο ΙΒΝR της Αυστριακής Ακαδημίας Επιστημών για τη διεξαγωγή πειραμάτων περίθλασης ακτίνων-χ. Στο Δρ. Γιώργο Αγγελή και στη Δρ. Αμαλία Ρεσβάνη για τη βοήθειά τους στη διεξαγωγή πειραμάτων και για τις εποικοδομητικές συζητήσεις μαζί τους που βοήθησαν στην επιβεβαίωση τμήματος των αποτελεσμάτων και στη διεξαγωγή ορθών συμπερασμάτων της διδακτορικής διατριβής. Στον υποψήφιο διδάκτορα Πέτρο Χατζηγεωργίου για τη βοήθειά του σε πειράματα Raman Στο Δρ Σαράντο Κωστίδη για την πολύτιμη βοήθειά του στη λήψη πειραμάτων ΝΜR στον τομέα Φαρμακογνωσίας. Στους ερευνητές Δρ Ζερβού Μαρία, Δρ Ζουμπουλάκη Παναγιώτη, ΜSc Σιάπη Ελένη, Δρ Ποταμίτη Κώστα και τους Δρ Πολίτη Αγγελική, ΜSc Φωτάκη Χαράλαμπο και ΜSc Κόκκοτου Κατερίνα για τη συνεργασία, τις συμβουλές και το οικείο κλίμα που δημιούργησαν στο Εργαστήριο Μοριακής Ανάλυσης του Ινστιτούτου Οργανικής και Φαρμακευτικής Χημείας που ανήκει στο Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών. Στη Δρ Αικατερίνη Κουκουλίτσα για τη συναδελφικότητά στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών όπου ολοκλήρωσα τμήμα της διδακτορικής μου διατριβής. Στον παιδικό μου φίλο Μυλωνά Φώτη για τη βοήθεια του στη χρήση επιστημονικών οργάνων του Τμήματος Γεωλογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών. Στην οικογένειά μου για τη συνολική υποστήριξη, ηθική και υλική, σε όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Θα ήθελα να αναφέρω ότι τα πειράματα που διεξήγαγα στο εξωτερικό (Σλοβενία και Γερμανία) επιχορηγήθηκαν από το ευρωπαϊκό πρόγραμμα EAST- NMR. Ευχαριστώ θερμά τους εθνικούς αντιπροσώπους του Προγράμματος τόσο της

Σλοβενίας και της Γερμανίας που ενέκριναν προς επιχορήγηση τα υποβαλλόμενα προγράμματα. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την εταιρία Daiichi Sankyo Pro Pharma (Ιαπωνία) η οποία χορήγησε τη φαρμακευτική ουσία ολμεσαρτάνη και την εταιρία Novartis η οποία χορήγησε τη φαρμακευτική ουσία αλισκιρένη.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... σελ. 01 Συντμήσεις στα Αγγλικά... σελ. 11 Συντμήσεις στα Ελληνικά... σελ. 12 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ... σελ. 13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1-ΥΠΕΡΤΑΣΗ... σελ. 15 1.1 Ορισμός της συστολικής και διαστολικής πίεσης... σελ. 17 1.2 Η σημασία της υπέρτασης... σελ. 17 1.3 Παράγοντες πρόκλησης της υπέρτασης... σελ. 19 1.4 Ταξινόμηση της αρτηριακής πίεσης σε κατηγορίες... σελ. 20 1.5 Φαρμακευτική θεραπεία και ρύθμιση της υπέρτασης... σελ. 20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2- ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΡΕΝΙΝΗΣ-ΑΓΓΕΙΟΤΑΣΙΝΗΣ ΑΛΔΟΣΤΕΡΟΝΗΣ... σελ. 23 2.1 Περιγραφή του σύστηματος Ρενίνης-Αγγειοτασίνης-Αλδοστερόνης... σελ. 25 2.2 Υποδοχείς της αγγειοτασίνης ΙΙ... σελ. 26 1

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3- ΔΡΑΣΗ ΑΤ 1 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΩΝ... σελ. 29 3.1 Τρόποι αναστολής του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνηςαλδοστερόνης... σελ. 31 3.2 Εισαγωγή στους ανταγωνιστές των ΑΤ 1 υποδοχέων της αγγειοτασίνης ΙΙ... σελ. 32 3.3 Συγχορήγηση ΑΤ 1 ανταγωνιστών με άλλα φάρμακα και φαρμακολογικά αποτελέσματά τους... σελ. 34 3.4 Ολμεσαρτάνη... σελ. 35 3.5 Φυσικές ιδιοτήτες του προφάρμακου μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης και του δραστικού μεταβολίτη ολμεσαρτάνης... σελ. 37 3.6 Είδη αγωνιστών και ανταγωνιστών. Αποτελεσματικότητα ενός αγωνιστή... σελ. 39 3.7 Η κατάταξη της ολμεσαρτάνης στους αντίστροφους αγωνιστές... σελ. 43 3.8 Αλληλεπίδραση ολμεσαρτάνης με τον ΑΤ 1 υποδοχέα... σελ. 44 3.9 Συγκριση σαρτανών ως προς την παρεμπόδιση της αύξησης της αρτηριακής πίεσης... σελ. 46 3.10 Συγκριτικές κλινικές και φαρμακολογικές μελέτες μεταξύ ΑΤ 1 ανταγωνιστών... σελ. 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4-ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΡΕΝΙΝΗΣ... σελ. 49 4.1 Εισαγωγή στους αναστολείς ρενίνης... σελ. 51 2

4.2 Ενεργοποίηση της προρενίνης- Ρενίνη... σελ. 51 4.3 Σύντομη ιστορική αναδρομή στην έρευνα και ανάπτυξη των αναστολέων ρενίνης... σελ. 53 4.4 Αλισκιρένη: Ο κύριος εκπρόσωπος των αναστολέων ρενίνης... σελ. 59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5-ΛΙΠΙΔΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ. σελ. 63 5.1 Εισαγωγή στις βιολογικές μεμβράνες και φαρμακευτική έρευνα... σελ. 65 5.2 Δομή μεμβρανών και μοντέλα που χρησιμοποιούνται για τις μελέτες αλληλεπιδράσεων τους με φαρμακευτικά μόρια... σελ. 67 5.3 Παραδείγματα χρήσεων φυσικοχημικών μεθόδων σε μελέτες φαρμακευτικών μορίων με μεμβράνες... σελ. 71 5.4 Μελέτη των αλληλεπιδράσεων φαρμακευτικών μορίων με τις μεμβράνες και η σχέση τους με τη φαρμακευτική Χημεία... σελ. 72 5.5 Μοριακή βάση πρόσδεσης φαρμάκων σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς. σελ. 74 5.6 Ανάπτυξη συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων... σελ. 77 5.7 Η κατανόηση θεραπευτικών και τοξικών δράσεων των φαρμάκων... σελ. 77 5.8 Ο σημαίνων ρόλος της χοληστερόλης... σελ. 80 3

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6-ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΥΓΡΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ... σελ. 85 6.1 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού... σελ. 87 6.2 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού πρωτονίου ( 1 Η-NMR)... σελ. 87 6.3 Φασματοσκοπία ( 13 C-NMR)... σελ. 88 6.4 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού δύο διαστάσεων... σελ. 88 6.4.1. Ομοπυρηνικό πείραμα 2D COSY (COrrelation SpectroscopY)... σελ. 89 6.4.2 Ομοπυρηνικό πείραμα 2D TOCSY (TΟtal Correlation SpectroscopY)σελ. 90 6.4.3 Ομοπυρηνικό πείραμα 2D NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)... σελ. 90 6.4.4 Ετεροπυρηνικό πείραμα 2D HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)... σελ. 91 6.4.5 Ετεροπυρηνικό πείραμα 2D HMBC (Heteronuclear Multi-Bond Connectivity)... σελ. 92 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7-ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΣΤΕΡΕΑΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ... σελ. 95 7.1 Εισαγωγή στη φασματοσκοπία NMR στερεάς κατάστασης... σελ. 97 7.2 Ερμηνεία του αυξημένου εύρους των κορυφών σε φάσματα NMR στερεής κατάστασης... σελ. 98 4

7.2.1 Ανισοτροπία χημικής μετατόπισης... σελ. 98 7.2.2 Αλληλεπίδραση διπόλου-διπόλου... σελ. 101 7.2.3 Μεγάλοι χρόνοι αποδιέγερσης... σελ. 102 7.3 Διπολική σχάση σε φάσματα NMR μονοκρυσταλλικών στερεών... σελ. 103 7.4 Διπολική διεύρυνση (λόγω διπολικών αλληλεπιδράσεων με τον πυρήνα)... σελ. 103 7.5 Διπολική αποσύζευξη... σελ. 103 7.6 Περιστροφή του δείγματος υπό μαγική γωνία (MAS-Magic Angle Spinning)... σελ. 104 7.7 Διασταυρούμενη πόλωση (Cross polarization)... σελ. 106 7.8 Τετραπολική ροπή... σελ. 108 7.9 Πεδία εφαρμογών πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού... σελ. 115 7.10 Ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων... σελ. 115 7.11 Βελτιστοποίηση μίας ένωσης-οδηγού... σελ. 116 7.12 Φασματοσκοπία 2 Η-ΝΜR σε στερεή κατάσταση... σελ. 117 7.13 Φασματοσκοπία 31 P και 13 C ΝΜR... σελ. 118 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8-ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΔΟΜΕΤΡΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ (DSC)... σελ. 121 8.1 Γενικά για τη Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης... σελ. 123 5

8.2 Χρήσιμες παράμετροι στη Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης... σελ. 124 8.3 Μεταβάσεις φάσης λιπιδικής διπλοστιβάδας... σελ. 125 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9-ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN... σελ. 127 9.1 Σκέδαση Raman... σελ. 129 9.2 Γραμμές Stokes και γραμμές anti-stokes... σελ. 129 9.3 FT (Fourier Transform) Raman... σελ. 130 9.4 Οργανολογία Raman... σελ. 131 9.5 Εφαρμογές της φασματοσκοπίας Raman στις λιποειδείς διπλοστιβάδες... σελ. 132 9.5.1 Περιοχή 2800-3100 cm -1... σελ. 134 9.5.2 Περιοχή 1000-1200 cm -1... σελ. 135 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10-ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΑΚΤΙΝΩΝ-Χ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ... σελ. 137 10.1 Περίθλαση ακτίνων-x... σελ. 139 10.2 Σύγχροτρον Αυστριακής Ακαδημίας... σελ. 145 6

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11-ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ. ΛΕΞΙΚΟ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΟΡΩΝ.. σελ. 147 Αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια (ΑΕΕ)... σελ. 149 Αθηροσκλήρωση Στεφανιαία νόσος... σελ. 150 Αμφιβληστροειδοπάθεια... σελ. 153 Εκλαμψία... σελ. 154 Διαβητική νεφροπάθεια... σελ. 154 Καρδιά... σελ. 154 Καρδιακή ανεπάρκεια... σελ. 155 Μικρολευκωματινουρία... σελ. 156 Οίδημα σφυρών... σελ. 156 Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου... σελ. 156 Σακχαρώδης διαβήτης... σελ. 157 Στεφανιαία νόσος... σελ. 158 Υπερτροφία αριστερής κοιλίας... σελ. 159 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... σελ. 161 ΣΤΟΧΟΙ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ... σελ. 163 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12-ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... σελ. 165 12.1 Υλικά... σελ. 167 7

12.2 Παρασκευή δειγμάτων για την εκτέλεση πειραμάτων Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης... σελ. 167 12.3 Παρασκευή δείγματων και παράμετροι λήψης φασμάτων Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού στερεής κατάστασης... σελ. 168 12.4 Παρασκευή δειγμάτων και παράμετροι λήψης φασμάτων Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού υγρής κατάστασης... σελ. 168 12.5 Παρασκευή δείγματος και παράμετροι λήψης φασμάτων Raman... σελ. 169 12.6 Περίθλαση ακτίνων-χ... σελ. 169 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13-ΔΟΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΔΥΝΑΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΟΛΜΕΣΑΡΤΑΝΗΣ... σελ. 173 13.1 Η σημασία των μελετών σταθερότητας σε ένα φαρμακευτικό μόριο. σελ. 175 13.2 Ταυτοποίηση της ολμεσαρτάνης με NMR υγρής κατάστασης... σελ. 175 13.2 Η παραγωγή ενός νέου προϊόντος κατά την παραμονή ολμεσαρτάνης σε μεθανόλη... σελ. 187 13.2.1 Εξέταση της 1 ης υπόθεσης: Ύπαρξη διακριτών διαμόρφωσεων της ολμεσαρτάνης... σελ. 188 13.2.2 Εξέταση της 2 ης υπόθεσης : Δημιουργία διμερούς της ολμεσαρτά- νης... σελ. 188 13.2.3 Εξέταση της 3 ης υπόθεσης για το νέο προϊόν: Ενδομοριακή αντίδραση που δίνει σταδιακά νέο προϊόν... σελ. 190 8

13.2.4 Εξέταση της 4 ης υπόθεσης για το νέο προϊόν: Αντίδραση με διαλύτη (π.χ. εστεροποίηση της καρβοξυλομάδας ή μεθυλίωση της τριτοταγούς αλκοόλης)... σελ. 192 13.3 Πειράματα προς εύρεση δεδομένων σχετικά με την κίνητική της αντίδρασης ολμεσαρτάνης και μεθανόλης... σελ. 192 13.4 Έλεγχος της αντίδρασης παραγωγής του παραγώγου σε μεθανόλη σελ. 203 13.5 Επιλογή νέου δευτεριωμένου διαλύτη για μελέτη του παραγώγου... σελ. 204 13.6 Απομόνωση του προϊόντος της αντίδρασης της ολμεσαρτάνης με μεθανόλη... σελ. 207 13.7 Μέτρηση ph ολμεσαρτάνης και παραγώγου... σελ. 208 13.8 Ταυτοποίηση του παραγώγου με NMR υγρής κατάστασης... σελ. 208 13.9 Ταυτοποίηση του παραγώγου σε CD 3 OD Σύγκριση των φασματοσκοπικών δεδομένων με τα αντίστοιχα της ολμεσαρτάνης.. σελ. 217 13.10 Μηχανισμός της αντίδρασης ολμεσαρτάνης με μεθανόλη... σελ. 229 13.11 Θερμοκρασιακή μέλέτη των φασμάτων 1 H NMR της ολμεσαρτάνης και του παραγώγου της σε CD 3 OD... σελ. 232 13.12 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης. σελ. 240 13.13 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με φασματοσκοπία ΝΜR στερεής κατάστασης... σελ. 242 13.13.1 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με 13 C ΜΑS και 13 C CP-MAS... σελ. 243 13.13.2 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με φασματοσκοπία στατικής κατάστασης 31 P... σελ. 259 13.13.3 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με στατική φασματοσκοπία 2 H NMR. σελ. 261 9

13.14 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με φασματοσκοπία Raman... σελ. 268 13.15 Μελέτη της ολμεσαρτάνης με περίθλαση ακτίνων-x... σελ. 278 13.16 Συμπεράσματα από τη μελέτη της ολμεσαρτάνης με τεχνικές στερεής κατάστασης... σελ. 282 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14-ΔΟΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΔΥΝΑΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΑΛΙΣΚΙΡΕΝΗΣ... σελ. 287 14.1 Ταυτοποίηση της ημιφουμαρικής αλισκιρένης με NMR υγρής κατάστασης... σελ. 289 14.2 Μελέτη της ημιφουμαρικής αλισκιρένης με διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης... σελ. 301 14.3 Μελέτη της ημιφουμαρικής αλισκιρένης με φασματοσκοπία ΝΜR στερεής κατάστασης... σελ. 305 14.4 Μελέτη της ημιφουμαρικής αλισκιρένης φασματοσκοπία Raman... σελ. 315 ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ σελ. 317 Πηγές... σελ. 319 10

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΑΓΓΛΙΚΑ Σύντμηση Πλήρης αγγλικός όρος Ελληνικός όρος ACE Angiotensin Converting Enzyme Μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτασίνης AII Angiotensin II Αγγειοτασίνη ΙΙ ARBs Angiotenin Receptor Blockers Ανταγωνιστές των υποδοχέων της αγγειοτασίνης ΑΤ 1 Angiotensin II receptor 1 Υποδοχέας 1 της αγγειοτασίνης ΙΙ CP Cross polarization Διασταυρούμενη πόλωση CSA Chemical shift anisotropy Aνισοτροπία χημικής μετατόπισης DIAD Diisopropyl azodicarboxylate Διισοπροπυλοαζωδικαρβοξυλικό οξύ DMPC Dimyristoylphosphatidylcholine Διμυριστοϋλ-φωσφατιδυλοχολίνη DMSO Dimethyl sulfoxide Διμεθυλοσουλφοξείδιο DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholine Διπαλμιτική φωσφατιδυλοχολίνη DSC Differential Scanning Calorimetry Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης FDA The Food and Drug Administration Οργανισμός Διαχείρισης Τροφίμων και Φαρμάκων GDP Guanosine Diphosphate Διφωσφορική γουανοσίνη GPCR G Protein Coupled Receptor G-πρωτεϊνικός υποδοχέας GTP Guanosine triphospate Τριφωσφορική γουανoσίνη HPLC High Performance Liquid Chromatography Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ΙΒΝR Institute of Biophysics and Nanosystem Research Ερευνητικό Ινστιτούτο Βιοφυσικής και Νανοσυστημάτων MAS Magic Angle Spinning Περιστροφή υπό μαγική γωνία MS Mass Spectroscopy Φασματοσκοπία μάζας ΝΜR Nuclear Magnetic Resonance Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός RAAS Renin-Angiotensin-Aldosterone System Συστήμα ρενίνης-αγγειοτασίνηςαλδοστερόνης SAX Small angle x-ray diffraction Περίθλαση ακτίνων-χ μικρής γωνίας TFA Trifluoroacetic acid Τριφθοροξικό οξύ THF Tetrahydrofuran Τετραϋδροφουράνιο ΤΜ Transmembrane Διαμεμβρανικός 11

WAX Wide angle x-ray diffraction Περίθλαση ακτίνων-χ ευρείας γωνίας Σύντμηση ΑΕΕ ΑΠ ΑΜΕΑ ΑΥΑ ΔΠ EE ΙΕΕ ΚΝΣ ΜΕΑ ΜΛ ΠΜΣ ΣΝΣ ΣΡΑΑ ΣΠ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΕΛΛΗΝΙΚΑ Πλήρης ελληνικός όρος Aγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο Αρτηριακή πίεση Αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Αποκλειστές των υποδοχέων ΑΤ 1 της αγγειοτασίνης Διαστολική πίεση Ευρωπαϊκή Ένωση Iσχαιμικά εγκεφαλικά επεισόδια Κεντρικό νευρικό σύστημα Μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτασίνης Mικρολευκωματινουρία Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός Συμπαθητικό Νευρικό Σύστημα Συστήμα ρενίνης-αγγειοτασίνης-αλδοστερόνης Συστολική πίεση 12

Ι. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ 13

14

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΥΠΕΡΤΑΣΗ 15

16

1.1 Ορισμός της συστολικής και διαστολικής πίεσης Η αρτηριακή πίεση δηλώνεται με δύο αριθμούς. Ο μεγαλύτερος αριθμός είναι η συστολική πίεση (Σ.Π.) που είναι γνωστή ως «μεγάλη» και ο μικρότερος αριθμός είναι η διαστολική πίεση (Δ.Π.), γνωστή ως μικρή. Η συστολική πίεση δηλώνει την πίεση που ασκείται όταν η καρδιά συσπάται για να προωθήσει το αίμα μέσω των αρτηριών της στα όργανα του σώματος. Η διαστολική πίεση δηλώνει αντίστοιχα τη χαλάρωση της καρδιάς όταν δέχεται νέο αίμα. 1 Για παράδειγμα οι αριθμοί 160/90 δηλώνουν ότι η συστολική πίεση είναι 160 mm Hg και η διαστολική 90 mm Hg. 1.2 Η σημασία της υπέρτασης Τις τελευταίες δεκαετίες στις αναπτυγμένες χώρες τα λεγόμενα καρδιαγγειακά επεισόδια (και κυρίως τα εμφράγματα και τα εγκεφαλικά επεισόδια), ευθύνονται περίπου για το ήμισυ των θανατηφόρων επεισοδίων στους ενήλικους. Ειδικά, για όσα άτομα είναι άνω των 40 ετών, το έμφραγμα και το εγκεφαλικό επεισόδιο είναι τα συχνότερα αίτια σοβαρής αναπηρίας. Η υπέρταση (αυξημένη διαστολική και συστολική πίεση συγκριτικά με τις φυσιολογικές τιμές) είναι ένας από τους σημαντικότερους και συχνότερους παράγοντες που αυξάνουν τον κίνδυνο για εγκεφαλικό επεισόδιο και έμφραγμα. Επιπρόσθετα, η υπέρταση αυξάνει τον κίνδυνο για καρδιακή ανεπάρκεια, ξαφνικό θάνατο, νεφρική βλάβη και απόφραξη των αρτηριών των ποδιών. 1 Στην Ευρώπη, τα καρδιαγγειακά νοσήματα προκαλούν ετησίως 4 εκατομμύρια θανάτους, από τους οποίους άνω των 1,5 εκατομμυρίων αντιστοιχούν στις χώρες-μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης (E.E.). Αυτό ισοδυναμεί με το ήμισυ περίπου όλων των θανάτων στην Ευρώπη (48%) και στην Ε.Ε. (41%). 2 Χαρακτηριστικός είναι ένας νέος ορισμός της υπέρτασης που δόθηκε στο διεθνούς κύρους επιστημονικό περιοδικό Journal of Clinical Hypertension το 2005 [Volume 7, Issue 9 (p 505-512)] σύμφωνα με τον οποίο η υπέρταση είναι «εξελικτικό καρδιαγγειακό σύνδρομο προερχόμενο από περίπλοκες και αλληλένδετες αιτιολογίες. Πρώιμοι δείκτες του συνδρόμου προηγούνται προτού παρατηρηθεί αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Η εξέλιξη σχετίζεται ισχυρά με λειτουργικές και οργανικές, καρδιακές και αγγειακές ανωμαλίες, οι οποίες προσβάλλουν την καρδιά, τους νεφρούς, τον εγκέφαλο, τα αγγεία και άλλα όργανα και οδηγούν σε πρώιμη νοσηρότητα και θάνατο». 3 Το μεγαλύτερο πρόβλημα που αντιμετωπίζουν τα υπερτασικά άτομα είναι ότι δεν μπορεί να επιτευχθεί ρύθμιση της πίεσής τους. Τόσο στην Ελλάδα όσο και στο εξωτερικό το ποσοστό των υπερτασικών ατόμων που έχουν ρυθμίσει 17

ικανοποιητικά την πίεσή τους δεν ξεπερνά το 25%. Τα ποσοστά διάγνωσης, ρύθμισης και θεραπείας της υπέρτασης παρουσιάζονται στο πιο κάτω σχήμα. Σχήμα 1.1.Ποσοστά διάγνωσης, ρύθμισης και θεραπείας της υπέρτασης στην Ελλάδα. Τα στατιστικά δεδομένα έχουν ληφθεί από την Ελληνική Εταιρία Μελέτης της Υπέρτασης Από το παραπάνω σχήμα παρατηρείται ότι υπάρχουν πολύ μεγάλα περιθώρια βελτίωσης για την αποτελεσματική αντιμετώπιση της υπέρτασης, αλλά και ενημέρωσης του κοινού σχετικά με αυτόν το σοβαρό παράγοντα κινδύνου. Ο τελικός στόχος είναι η προστασία από τα καρδιαγγειακά επεισόδια. Οι παράγοντες που αυξάνουν τον κίνδυνο για πρόκληση καρδιαγγειακών παθήσεων είναι εκτός από την υπέρταση, η υπερχολιστεριναιμία, η δυσλιπιδαιμία, ο σακχαρώδης διαβήτης, το κάπνισμα, η παχυσαρκία, το οικογενειακό ιστορικό πρόωρης στεφανιαίας νόσου (πριν τα 55 έτη για άνδρες και πριν τα 65 έτη για τις γυναίκες), η ηλικία, η μικροαλβουμινουρία και το ανδρικό φύλο. Για παράδειγμα, άτομα με διαβήτη και υπέρταση έχουν διπλάσιο κατά προσέγγιση κίνδυνο για εμφάνιση κάποιας καρδιαγγειακής νόσου από τα υπερτασικά άτομα χωρίς διαβήτη. Όταν έχει εκδηλωθεί προσβολή του καρδιαγγειακού ως αγγειακή βλάβη, μπορεί η σοβαρότητα της βλάβης αυτής να κυμαίνεται από ενδοθηλιακή δυσλειτουργία ως φανερή αθηροσκλήρωση ή υπερτροφία της αριστερής κοιλίας. Στη συνέχεια οι παραπάνω βλάβες όπως έχει ήδη αναφερθεί είναι δυνατό να οδηγήσουν σε διάφορα είδη καρδιαγγειακών επεισοδίων, όπως αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, αρρυθμία, στηθάγχη και έμφραγμα του μυοκαρδίου και να εξελιχθεί περαιτέρω και να καταλήξει σε καταστάσεις όπως συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, νέο έμφραγμα, αιφνίδιο θάνατο και χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. 4,5 18

Όπως έχει επίσης αναφερθεί ο όρος υπέρταση σημαίνει ότι η αρτηριακή πίεση είναι αυξημένη πάνω από τα φυσιολογικά όρια. Έρευνες σε αναπτυγμένες χώρες έχουν δείξει ότι περίπου ένας στους τέσσερις ενήλικους εμφανίζει υπέρταση. Μάλιστα η πιθανότητα εμφάνισής της αυξάνεται με την ηλικία. Χαρακτηριστικό είναι ότι άνω των 65 ετών, ένα στα δύο άτομα είναι υπερτασικό. Στους νέους υπερτασικούς είναι συνήθως ισχυρότερη η δύναμη ώθησης του αίματος από την καρδιά, ενώ στους μεγαλύτερους είναι αυξημένη η αντίσταση των αρτηριών στη ροή του αίματος. Στους ηλικιωμένους υπάρχει συχνά αυξημένη συστολική πίεση με φυσιολογική ή χαμηλή τη διαστολική. Η αυξημένη αρτηριακή πίεση αρχικά δε γίνεται αντιληπτή, γιατί δεν προκαλεί κανένα ενόχλημα. Όταν εμφανίζονται ενοχλήματα, οφείλονται στις επιπλοκές της. Τα ενοχλήματα αυτά μπορεί να εμφανιστούν αρκετά χρόνια αργότερα από την αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Για το λόγο αυτό στην Αμερική η υπέρταση είναι γνωστή ως σιωπηλός δολοφόνος (silent killer). 1.3 Παράγοντες πρόκλησης της υπέρτασης Το 95% των υπερτασικών εμφανίζουν ιδιοπαθή υπέρταση. Με τον όρο αυτό χαρακτηρίζεται η υπέρταση άγνωστης ουσιαστικά αιτίας που σχετίζεται κυρίως με την κληρονομικότητα, αλλά και με παράγοντες όπως είναι η παχυσαρκία, η μακροχρόνια πρόσληψη αλατιού και η καθιστική ζωή. Η υπέρταση εμφανίζεται συνήθως σε άτομα με ηλικία μεγαλύτερη των 30 ετών. Σε παιδιά και εφήβους εμφανίζεται μόνο σε ποσοστό 1-2%, αν και τα τελευταία χρόνια τείνει να αυξηθεί κυρίως λόγω της αυξανόμενης παχυσαρκίας. Ο παράγοντας της κληρονομικότητας είναι πολύ καθοριστικός. Πιο συγκεκριμένα, η πιθανότητα εμφάνισης υπέρτασης σε άτομα με υπερτασικούς και τους δύο γονείς ξεπερνά το 70%. Σε άτομα με έναν υπερτασικό γονεά η πιθανότητα είναι περίπου 30% και για όσους δεν έχουν κανένα υπερτασικό γονέα η πιθανότητα είναι 15%. Σχετικά σπάνια (σε ποσοστό 5%) η υπέρταση οφείλεται σε κάποιο άλλο νόσημα. Τότε χρησιμοποιείται ο όρος «δευτεροπαθής» υπέρταση. Τα συχνότερα νοσήματα τα οποία είναι υπεύθυνα για τη δευτεροπαθή υπέρταση είναι η χρόνια νεφροπάθεια, η άπνοια κατά τον ύπνο και ή στένωση των νεφρικών αρτηριών. Πιο σπάνια υπεύθυνα αίτια είναι ο αλδοστερονισμός, το φαιοχρωμοκύττωμα, το σύνδρομο Cushing κ.α. 1 19

1.4 Ταξινόμηση της αρτηριακής πίεσης σε κατηγορίες Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Εταιρία Υπέρτασης (2003) και την Ελληνική Εταιρία Μελέτης της Υπέρτασης (2005), η πίεση ταξινομείται στις ακόλουθες κατηγορίες των οποίων περιγράφονται τα ανώτατα και τα κατώτατα όρια στον πιο κάτω πίνακα. Ιδανική πίεση Φυσιολογική πίεση Οριακή υπέρταση Υπέρταση Μεμονωμένη συστολική υπέρταση Σ.Π. <120 mm Hg Δ.Π. <80 mm Hg Σ.Π.: 120-129 mm Hg Δ.Π.: 80-84 mm Hg Σ.Π.: 130-139 mm Hg ή Δ.Π.: 85-89 mm Hg ή συμβαίνουν συγχρόνως και τα δύο Σ.Π. 140 mm Hg ή Δ.Π. 90 mm Hg ή συμβαίνουν συγχρόνως και τα δύο Σ.Π. 140 mm Hg και Δ.Π. 90 mm Hg Σχήμα 1.2: Ταξινόμηση της αρτηριακής πίεσης Συμπερασματικά, με βάση τον παραπάνω πίνακα, για να χαρακτηριστεί λοιπόν ένα άτομο υπερτασικό πρέπει να εμφανίζει κατώτατα όρια διαστολικής και συστολικής πίεσης αντίστοιχα 140/90 mm Hg σε επανειλημμένες μετρήσεις. 1.5 Φαρμακευτική θεραπεία και ρύθμιση της υπέρτασης Η ελάττωση της υπέρτασης στα φυσιολογικά επίπεδα μπορεί να επιτευχθεί με τακτική λήψη αντιυπερτασικών φαρμάκων και με άλλα βοηθητικά μέσα (π.χ. μείωση του σωματικού βάρους, μείωση του αλατιού στο φαγητό, σωστή διατροφή, περιορισμό της κατανάλωσης οινοπνευματωδών ποτών, σωματική άσκηση). Συχνά, η απώλεια βάρους βοηθάει και στη βελτίωση και άλλων παραγόντων που οδηγούν σε καρδιαγγειακό επεισόδιο, όπως η χοληστερίνη και το σάκχαρο. 5 Το κάπνισμα επηρεάζει σε πολύ μικρό βαθμό την αρτηριακή πίεση. Όμως οι υπερτασικοί καπνιστές πρέπει να διακόψουν τη συνήθεια αυτή γιατί η συνέχισή της μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο, έμφραγμα, εγκεφαλικό επεισόδιο κλπ. Γενικά, επισημαίνεται ότι η διάγνωση και θεραπεία της αρτηριακής πίεσης πρέπει να γίνεται με την ποσοτικοποίηση του ολικού καρδιαγγειακού κινδύνου. Αυτό 20

σημαίνει ότι πρέπει να συνυπολογίζεται το γεγονός ότι σπάνια κάποιος έχει απλά αυξημένη αρτηριακή πίεση, αλλά αντίθετα το μεγαλύτερο μέρος του αντιυπερτασικού πληθυσμού είναι εκτεθειμένο σε συνοδούς καρδιαγγειακούς παράγοντες που συνεισφέρουν στην αύξηση της αρτηριακής πίεσης και τις μεταβολές της γλυκόζης και του μεταβολισμού των λιπιδίων. Επιπλέον, όταν συνυπάρχουν η υπέρταση και οι μεταβολικοί παράγοντες που αναφέρθηκαν, αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και ισχυροποιούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να οδηγούν σε αυξημένο συνολικό καρδιαγγειακό κίνδυνο. 6 Με τη ρύθμιση της πίεσης είναι δυνατόν να εξαλειφθεί τελείως ο κίνδυνος για εγκεφαλικό, να μειωθεί αισθητά ο κίνδυνος για έμφραγμα και ο κίνδυνος για τις υπόλοιπες επιπλοκές που αναφέρθηκαν στην παράγραφο 1.1. Άριστη ρύθμιση της πίεσης με ένα μόνο αντιυπερτασικό επιτυγχάνεται σε λιγότερο από τους μισούς ασθενείς. Τις περισσότερες φορές για να επιτευχθεί η πίεση-στόχος που ορίζει ο γιατρός, απαιτούνται δύο ή και παραπάνω φάρμακα. 1 Κατά κανόνα η αντιυπερτασική θεραπεία χορηγείται για όλη τη ζωή. Αν η χορήγηση των αντιυπερτασικών φαρμάκων διακοπεί, η υπέρταση επανεμφανίζεται, συνήθως μέσα σε ένα χρονικό διάστημα μερικών ημερών ή εβδομάδων. Τα αντιυπερτασικά φάρμακα αποτελούν μία από τις πιο μελετημένες κατηγορίες φαρμάκων στην ιατρική. Πολλές κλινικές μελέτες έως σήμερα περιλάμβανουν δεδομένα από χιλιάδες άτομα. Αυτό ήταν εφικτό λόγω της ευρείας διάδοσης της υπέρτασης. Αρκετές φορές οι μελέτες είχαν διάρκεια ετών. Η συσσώρευση των σημαντικών αυτών δεδομένων και η αξιολόγησή τους οδήγησε στην αύξηση των γνώσεων σε θέματα σχετικά με την υπέρταση και οδηγήσε σε σύνθεση αποτελεσματικών αντιυπερτασικών φαρμάκων. 21

22

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΡΕΝΙΝΗΣ- ΑΓΓΕΙΟΤΑΣΙΝΗΣ-ΑΛΔΟΣΤΕΡΟΝΗΣ Μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτασίνης Ρενίνη 23

24

2.1 Περιγραφή του σύστηματος Ρενίνης-Αγγειοτασίνης-Αλδοστερόνης Εκτεταμένες πειραματικές μελέτες αλλά και ένας αυξανόμενος αριθμός κλινικών μελετών στον άνθρωπο, έχουν αποδείξει τον κεντρικό ρόλο του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνης-αλδοστερόνης (ΣΡΑΑ ή Renin-Angiotensin-Aldosterone System RAAS) στην παθοφυσιολογία των καρδιαγγειακών νόσων. Το ΣΡΑΑ αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα συστήματα ομοιοστασίας του οργανισμού και συμμετέχει σε πολλές λειτουργίες. Αρχικά το τετραδεκαπεπτίδιο αγγειοτασινογόνο (Asp 1 -Arg 2 -Val 3 -Tyr 4 -Ile 5 -His 6 -Pro 7 -Phe 8 -His 9 -Leu 10 -Leu 11 -Val 12 -Tyr 13 -Ser 14 ) παράγεται από το ήπαρ και λειτουργεί ως υπόστρωμα, πάνω στο οποίο δρα το ένζυμο ρενίνη (η ρενίνη παράγεται και απελευθερώνεται από τα κύτταρα του παρασπειραματικού σχηματισμού, ο οποίος βρίσκεται στο τοίχωμα του προσαγωγού αρτηριδίου του νεφρού σε συνάφεια με την πυκνή κηλίδα του σύστοιχου νεφρώνα). Με τη δράση της ρενίνης πραγματοποιείται ενζυμική διάσπαση, από την οποία προκύπτει η αγγειοτασίνη Ι (Asp 1 -Arg 2 -Val 3 -Tyr 4 -Ile 5 -His 6 -Pro 7 -Phe 8 -His 9 -Leu 10 ), ένα αιμοδυναμικά ανενεργό δεκαπεπτίδιο. 4,7 Το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτασίνης (ΜΕΑ - Angiotensin Converting Enzyme-ACE) δρα στην αγγειοτασίνη Ι, αφαιρώντας ένα διπεπτίδιο, οπότε προκύπτει η αγγειοτασίνη ΙΙ (AII), ένα πολύ ενεργό οκταπεπτίδιο (Asp 1 -Arg 2 -Val 3 -Tyr 4 -Ile 5 - His 6 -Pro 7 -Phe 8 ). Υπάρχουν δύο μορφές ΜΕΑ, η κυκλοφορούσα στο πλάσμα μορφή (που αυξάνεται σε καταστάσεις υπότασης) και το ιστικό ΜΕΑ, που εντοπίζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, ασκώντας χρόνιες επιδράσεις στην καρδιαγγειακή λειτουργία. Οι ευεργετικές δράσεις των αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης (ΑΜΕΑ) προκύπτουν κυρίως μέσω της αναστολής του ιστικού ΜΕΑ. Επικρατεί η άποψη ότι τα επίπεδα του ΜΕΑ στο πλάσμα είναι γενετικά προκαθορισμένα και υπάρχουν τρεις γονότυποι (DD, II, ID). Ο γονότυπος DD έχει σχετισθεί με περιπτώσεις μικρολευκωματινουρίας, αμφιβληστροειδοπάθειας καθώς και με αριστερή καρδιακή κοιλιακή υπερτροφία (Left Ventricular Hypertrophy - LVH). Τα σημαντικότερα ερεθίσματα για την παραγωγή της ορμόνης αγγειοτασίνης ΙΙ (ΑΙΙ), κυρίως μέσω δράσης ΜΕΑ, είναι η πτώση της αρτηριακής πίεσης, η συμπαθητική διέγερση, η υποογκαιμία και η υπονατριαιμία-νατριοπενία. Η ΑΙΙ όμως μπορεί να παραχθεί και από άλλους ενζυμικούς μηχανισμούς. Παραδείγματα αποτελούν οι καθεψίνες, η τονίνη και οι χυμάσες. 7 25

2.2 Υποδοχείς της αγγειοτασίνης ΙΙ Έχουν περιγραφεί αρκετοί υποδοχείς της ΑΙΙ. Οι πιο γνωστοί είναι ο ΑΤ 1, ο ΑΤ 2 και ο ΑΤ 4. Οι υποδοχείς ΑΤ 1 βρίσκονται στα αγγεία, στον εγκέφαλο, στην καρδιά, στους νεφρούς, στα επινεφρίδια και στα περιφερικά νεύρα. Όταν η ΑΙΙ δεσμεύεται στον ΑΤ 1 υποδοχέα αυτός υφίσταται μικρές διαμορφωτικές μεταβολές με αποτέλεσμα από την ανενεργή κατάσταση να μεταβαίνει στην ενεργή. Ο ενεργοποιημένος ΑΤ 1 υποδοχέας δεσμεύεται σε μία πρωτεΐνη της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) στην έσω επιφάνεια της μεμβράνης. Η σύνδεση αυτή προκαλεί μία αλυσίδα φωσφορυλιώσεων αποφωσφορυλιώσεων, που οδηγεί στις διάφορες λειτουργικές επιδράσεις των διεγερμένων ΑΤ 1 υποδοχέων. Με αυτόν τον τρόπο ασκούνται οι περισσότερες από τις αγγειακές δράσεις της ΑΙΙ, που περιλαμβάνουν αγγειοσύσπαση, κυτταρική αύξηση, κατακράτηση Na + και ύδατος, διέγερση και έκκριση αλδοστερόνης και κατεχολαμινών, αύξηση της συμπαθητικής δραστηριότητας, αύξηση της έκκρισης της αντιδιουρητικής ορμόνης και απελευθέρωση βαζοπρεσίνης. 7 Οι ανταγωνιστές των υποδοχέων της αγγειοτασίνης (Angiotenin Receptor Blockers-ARBs) δεσμεύουν εκλεκτικά την αγωνιστική επίδραση της ΑΙΙ στους ΑΤ 1 υποδοχείς και έτσι την παρεμποδίζουν να εξασκήσει την επιβλαβή της δράση σε καταστάσεις που το σύστημα δε λειτουργεί φυσιολογικά (σχήμα 2.1). Σχήμα 2.1: Υποδοχείς της ΑΙΙ και επιδράσεις των διεγερμένων ΑΤ 1 υποδοχέων 7 PAI-1: (Plasminogen activator inhibitor-1) Αναστολέας ιστικού πλασμινογόνου, EDHF: Παραγόμενος στο ενδοθήλιο παράγοντας υπερπολωσιμότητας (Endothelialderived hyperpolarized factor) ΚΝΣ: Κεντρικό νευρικό σύστημα 26

Ο ΑΤ 1 υποδοχέας είναι όπως αναφέρθηκε συζευγμένος με G-πρωτεΐνη. Επομένως κύριο χαρακτηριστικό του είναι η ύπαρξη επτά διαμεμβρανικών ελικών ΤΜ1-ΤΜ7 (transmembrane helices-tm). Ο ίδιος υποδοχέας περιλαμβάνει επίσης αμινοξέα τα οποία δημιουργούν θηλιές (loops) στον εξωκυττάριο και ενδοκυττάριο χώρο. Η πεπτιδορμόνη ΑΙΙ δεσμεύεται στον εξωκυττάριο χώρο (Ν-τελικό τμήμα) και μέσα στις διαμεμβρανικές έλικες ΤΜ3-ΤΜ4 (C-τελικό τμήμα) αλληλεπιδρώντας με τα αμινοξέα ασπαρτικό (D281), ασπαραγίνη (Ν111), λυσίνη (Κ199) και ιστιδίνη (Η256). 8 Οι ΑΤ 1 ανταγωνιστές σχεδιάστηκαν να μιμούνται το C-τελικό τμήμα της ΑΙΙ και επομένως προσδένονται στις διαμεμβρανικές έλικες. Το φυσικό περιβάλλον του ΑΤ 1 υποδοχέα, όπου εξασκούν τη βιολογική δράση η πεπτιδοορμόνη ΑΙΙ και οι αναστολείς της, ΑΤ 1 ανταγωνιστές παριστάνεται στο σχήμα 2.2. Σχήμα 2.2:Απεικόνιση του ανθρώπινου υποδοχέα ΑΤ 1 μέσα σε λιπιδικές διπλοστιβάδες διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης (DPPC).Ο υποδοχέας περιβάλλεται από 128 μόρια DPPC και 3655 μόρια νερού. (Tieleman et al) 9 27

28

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΑΤ 1 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΩΝ 29

30

3.1 Τρόποι αναστολής του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνης-αλδοστερόνης Ο σχεδιασμός ενός καινοτόμου φαρμάκου βασίζεται σε κάποιους γενικότερους στόχους. Για την περίπτωση των αντιυπερτασικών φαρμάκων οι σημαντικότεροι στόχοι 10 παρουσιάζονται στο πιο κάτω σχήμα: Σχήμα 3.1. Οι σημαντικότεροι στόχοι κατά το σχεδιασμό ενός καινοτόμου αντιυπερτασικού φαρμάκου Από το σύνολο των προσεγγίσεων που έχουν χρησιμοποιηθεί για να ρυθμιστεί η πίεση μέσω του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνης-αλδοστερόνης, τρεις διαφορετικοί τρόποι έχουν ξεχωρίσει. Ο πρώτος τρόπος είναι να εμποδιστεί ο σχηματισμός της αγγειοτασίνης Ι από το αγγειοτασινογόνο. Σε αυτήν την περίπτωση αναστέλλεται το ενζύμο της ρενίνης (χρήση αναστολέων ρενίνης). Ένας δεύτερος τρόπος είναι η αναστολή του σχηματισμού της αγγειοτασίνης ΙΙ (χρήση αναστολεων μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης). Τέλος ένας τρίτος τρόπος είναι η παρεμπόδιση της σύνδεσης της αγγειοτασίνης ΙΙ με τους ΑΤ 1 υποδοχείς (χρήση ΑΤ 1 ανταγωνιστών). Τα παραπάνω παρουσιάζονται στο σχήμα 3.2. 31

Σχήμα 3.2: Οι βασικότεροι τρόποι αναστολής του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνηςαλδοστερόνης 3.2 Εισαγωγή στους ανταγωνιστές των ΑΤ 1 υποδοχέων της αγγειοτασίνης ΙΙ Οι ανταγωνιστές των ΑΤ 1 υποδοχέων της αγγειοτασίνης ΙΙ, επίσης γνωστοί ως αποκλειστές των υποδοχέων της αγγειοτασίνης (ΑΥΑ ή ΑRBs Angiotensin Receptor Blockers) ανακαλύφθηκαν στην δεκαετία του 90 και αποτελούν μία σημαντική κατηγορία αντιυπερτασικών φαρμάκων. Αποκλείουν τους ΑΤ 1 υποδοχείς της αγγειοτασίνης ΙΙ, που παράγεται σε αυξημένα επίπεδα από αλυσιδωτές αντιδράσεις που συνιστούν το βιοχημικό καταρράκτη του συστήματος ρενίνηςαγγειοτασίνης-αλδοστερόνης. Αποτέλεσμα της διεργασίας αυτής (δηλαδή του αποκλεισμού των ΑΤ 1 υποδοχεών) είναι να διεγείρονται οι ΑΤ 2 υποδοχείς της ΑΙΙ από την περίσσεια της ελεύθερης αγγειοτασίνης ΙΙ. Επιπρόσθετα, οι ARBs μειώνουν τη συμπαθητική δραστηριότητα, δρώντας τόσο στον μυελό των επινεφριδίων, όσο και στους ΑΤ 1 υποδοχείς των συμπαθητικών ινών προσυναπτικά, εμποδίζοντας την έκλυση νοραδρεναλίνης από τους αδρενεργικούς νευρώνες του ΣΝΣ. 11 Μέχρι σήμερα κυκλοφορούν οκτώ ΑΥΑ. Η λοσαρτάνη είναι ο πρώτος ΑΤ 1 ανταγωνιστής που ανακαλύφθηκε, ενώ η αζιλσαρτάνη ο τελευταίος. Η ολμεσαρτάνη είναι ένας ARB με 24ωρη ρύθμιση της ΑΠ, που διαθέτει αποδεδειγμένα 32

πλεονεκτήματα αναφορικά με την αποτελεσματική ρύθμιση της ΑΠ έναντι αντιυπερτασικών άλλων κατηγοριών με τα οποία συγκρίθηκε, όπως την αμλοδιπίνη (amlodipine), φελοδιπίνη (felodipine), ατενολόλη (atenolol) και καπτοπρίλη (captopril). 11 Στις παρενθέσεις δίπλα στα φάρμακα που κυκλοφορούν στην αγορά, αναφέρονται οι εμπορικές επωνυμίες καθώς και οι εταιρίες που αρχικά τις διέθεσαν στο εμπόριο): Λοσαρτάνη ή losartan (Cozaar από τη Merck) Βαλσαρτάνη ή valsartan (Diovan από τη Novartis) Ιρμπεσαρτάνη ή irbesartan (Avapro από την Bristol-Myers Squibb) Καντεσαρτάνη ή candesartan (Atacand από την AstraZeneca) Τελμισαρτάνη ή telmisartan (Micardis από την Boehringer Ingelheim) Επροσαρτάνη ή eprosartan (Teveten από τη Solvay) Ολμεσαρτάνη ή olmesartan (Benicar από την Daiichi Sankyo) Αζιλσαρτάνη ή azilsartan (Edarbi από την Takeda) Στο σχήμα 3.3 απεικονίζονται οι δομές των διαθέσιμων εμπορικά φαρμακευτικών ΑΥΑ. Σχήμα 3.3: Εμπορικά διαθέσιμοι ΑΥΑ Τα κοινά δομικά χαρακτηριστικά των μορίων του σχήματος 3.3 είναι ο διφαινυλικός δακτύλιος, μία όξινη ομάδα (καρβοξυλομάδα, τετράζολιο, οξαδιαζολόνη), μια αλκυλική αλυσίδα με μήκος τριών ή τεσσάρων ατόμων άνθρακα καθώς και μία μεθυλενική γέφυρα που ενώνει τη διφαίνυλο ομάδα με ένα 33

ετεροκυκλικό σύστημα. Τα φαρμακοφόρα τμήματα των ΑΤ1 ανταγωνιστών συνδέονται στο υπόστρωμα διφαινυλίου. Η αλκυλική αλυσίδα, συνδέεται στον ετεροκυκλικό αζωτούχο δακτύλιο και αυξάνει τη λιποφιλικότητα των μορίων. 3.3 Συγχορήγηση ΑΤ 1 ανταγωνιστών με άλλα φάρμακα και φαρμακολογικά αποτελέσματά τους Από τις περισσότερες μελέτες σε υπερτασικούς, παρατηρήθηκε ότι για τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, συνήθως απαιτείται συνδυασμός τουλάχιστον δύο ουσιών. Η συγχορήγηση αντιϋπερτασικών, ελαττώνει την αρτηριακή πίεση σε μεγαλύτερο βαθμό απ ότι το κάθε φάρμακο μόνο του, αυξάνει το ποσοστό της 24ωρης ρύθμισης και επιτρέπει τη χρήση μικρότερων δόσεων, με αποτέλεσμα τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών. Ο πιο διαδεδομένος σταθερός συνδυασμός είναι αυτός των ΑΥΑ με διουρητικό. Η συγχορήγηση στηρίζεται στο γεγονός ότι τα διουρητικά μειώνοντας το Νa και τον ενδοαγγειακό όγκο, ενεργοποιούν το ΣΡΑΑ, παρέχοντας υπόστρωμα για αποτελεσματικότερη δράση των ΑΥΑ, ενισχύοντας έτσι το υποτασικό τους αποτέλεσμα. Επιπλέον, οι μεταβολικές παρενέργειες των διουρητικών (υπερουριχαιμία, δυσμενής επίδραση στο λιπιδαιμικό προφίλ, αντίσταση στην ινσουλίνη, υποκαλιαιμία) και των ΑΥΑ (υπερκαλιαιμία) μπορούν να αντισταθμιστούν από το συνδυασμό των δύο. Άλλος ευνοϊκός συνδυασμός, λόγω των συνεργικών τους δράσεων, είναι αυτός μεταξύ ARB και ανταγωνιστή διαύλων ασβεστίου, που έχει ως αποτέλεσμα την αθροιστική μείωση των περιφερικών αντιστάσεων (αρτηριακή και φλεβική αγγειοδιαστολή), τη νατριούρηση, την αυξημένη δράση των ΑΥΑ λόγω διέγερσης του ΣΡΑΑ (υποογκαιμία λόγω νατριούρησης), την αποτελεσματικότητα σε αρτηριακή υπέρταση υψηλής και χαμηλής ρενίνης, τη νεφροπροστασία (λόγω αγγειοδιαστολής του απαγωγού και του προσαγωγού αρτηριδίου) και το ευεργετικό μεταβολικό προφίλ (σε γλυκόζη, λιπίδια και ουρικό οξύ). Στο εμπόριο κυκλοφόρησε ένας σταθερός συνδυασμός αμλοδιπίνης και βαλσαρτάνης (Exforce 5/80 και Copalia 5/160 ή 10/160). Ο αποκλεισμός του Μετατρεπτικού Ενζύμου της αγγειοτασίνης έχει ως συνέπεια και την επιβράδυνση της αποδόμησης της βραδυκινίνης και επομένως την αύξηση της συγκεντρώσεως αυτής στον οργανισμό. Αυτό όμως έχει ως αποτέλεσμα σε αρκετούς ασθενείς να προκαλείται βήχας. Οι αποκλειστές των υποδοχέων της αγγειοτασίνης παρακάμπτουν το εμπόδιο αυτό διότι δρουν κατευθείαν στους υποδοχείς της αγγειοτασίνης ΙΙ και δεν προκαλούν τη σοβαρή αυτή παρενέργεια. 34

Οι ΑΥΑ δεν ασκούν μόνο υποτασική δράση αλλά εμφανίζονται ότι έχουν και κάποιο ευεργετικό αποτέλεσμα στους άλλους παράγοντες κινδύνου καρδιαγγειακής νόσου. Σημαντική είναι η επίδραση τους στον σακχαρώδη διαβήτη, όπου σε αρκετές μελέτες (ενδεικτικά αναφέρουμε τη LIFE και τη VALUE), παρατηρήθηκε μείωση του νεοεμφανιζόμενου διαβήτη. Όσο αφορά το λιπιδαιμικό προφίλ, ενώ άλλα αντιυπερτασικά έχουν ενοχοποιηθεί για αρνητική δράση, οι ΑΥΑ δεν ασκούν αρνητικό αποτέλεσμα, αλλά αντιθέτως βελτιώνουν και την ευαισθησία στην ινσουλίνη. Η υπερτροφία της αριστεράς κοιλίας που θεωρείται ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου υποστρέφεται σύμφωνα με τις μελέτες LIFE, Val-HEFT κ.α. Στις βλάβες των οργάνων στόχων της υπέρτασης οι ΑΥΑ ασκούν ευεργετική δράση. Περισσότερο εμφανή είναι τα αποτελέσματα στην πρόληψη της νεφρικής βλάβης όταν ο υπερτασικός εμφανίζει μικρολευκωματινουρία και στην καθυστέρηση της νεφροπάθειας όταν πλέον ο υπερτασικός εμφανίζει πρωτεϊνουρία. 10 Ως προς την καρδιακή ανεπάρκεια οι ισχυρότερες ενδείξεις για το ρόλο του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνης-αλδοστερόνης προέρχονται από πειραματικές και κλινικές μελέτες, που δείχνουν ότι η αναστολή της ενεργοποίησης του συστήματος αυτού οδηγεί σε ευεργετικά αποτελέσματα που περιλαμβάνουν ακόμη και παράταση της επιβίωσης των ασθενών (με καρδιακή ανεπάρκεια). 3.4 Ολμεσαρτάνη Η ολμεσαρτάνη (σχήμα 3.4) ονομάζεται κατά IUPAC 5-(2- hydroxypropan-2-yl)-2-propyl-3-[[4-[2-(2h-tetrazol-5-yl) phenyl] phenyl] methyl] imidazole-4-carboxylic acid). Είναι ένα φάρμακο που ανήκει όπως ήδη αναφέρθηκε στους ΑΥΑ. Τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα του φαρμάκου αυτού είναι ότι για τη δοσολογία του, αρκεί μία ημερήσια λήψη, δεν υπάρχουν σημαντικές ανεπιθύμητες δράσεις στους ασθενείς, έχει πολύ ικανοποιητικό προφίλ ως προς πιθανές παρενέργειες και τέλος η τιμή του (λαμβάνοντας υπόψη και την αποτελεσματικότητα του) είναι ιδιαίτερα προσιτή. 12 Τον Απρίλιο του 2002 δόθηκε από τον FDA (The Food and Drug Administration) η έγκριση του προφαρμάκου μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης (olmesartan medoxomil σχήμα 3.4) της ολμεσαρτάνης για τη θεραπεία της υπέρτασης υπό την εμπορική ονομασία Benicar και παραγωγό εταιρία τη Sankyo Pharma. 13 Η μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης είναι ένας εστέρας του ενεργού μεταβολίτη (ολμεσαρτάνη), ο οποίος υδρολύεται στο γαστρεντερικό σωλήνα. 14,15 35

OH O OH N O O O N O N O N OH N N N N N N N N H H Olmesartan medoxomil Olmesartan Σχήμα 3.4: Χημικές δομές της μιντοξομίλης της ολμεσαρτάνης (αριστερά) και της ολμεσαρτάνης (δεξιά) Ο εστέρας της ολμεσαρτάνης αναπτύχθηκε εμπορικά και προτίμηθηκε από την ενεργό ένωση ολμεσαρτάνη, επειδή η βιοδιαθεσιμότητα του τελευταίου είναι χαμηλή (4,5%) και αυξάνεται κατακόρυφα σε 25,6% στην περίπτωση της εστεροποίησης του ως μιντοξομίλη. 16,17 Προφάρμακα τα οποία είναι εστέρες, υδρολύονται στους φαρμακολογικά δραστικούς τους μεταβολίτες μετά την απορρόφηση. Εστεράσες που υπάρχουν στο λεπτό έντερο, στο πλάσμα και στο συκώτι εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι εντερικές εστεράσες χρησιμεύουν ως τα κύρια ένζυμα στην ενεργοποίηση προφαρμάκων που συμβαίνει με το πρώτο πέρασμα τους μέσα από το έντερο μετά την απορρόφηση. Ωστόσο, προφάρμακα τα οποία είναι σχετικά ανθεκτικά στην υδρόλυση από τις εντερικές εστεράσες, εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος και ενεργοποιούνται από εστεράσες του ορού (πλάσμα) και του ήπατος. Τα κύρια ένζυμα που υδρολύουν στον ορό είναι η χολινεστεράση, η αρυλεστεράση, η καρβοξυλεστεράση, και η λευκωματίνη. Η σχετική σημασία κάθε εστεράσης του ορού στην ενεργοποίηση ενός προφάρμακου ποικίλλει μεταξύ των διαφόρών ειδών ζώων και των προφαρμάκων. 18 H υδρόλυση της μιντοξομίλης της ολμεσαρτάνης στον ορό έχει παρατηρηθεί σε αρκετά είδη, και η σύγκριση μεταξύ πέντε ειδών, απέδειξε ότι η υδρολυτική δραστικότητα είναι υψηλότερη στα κουνέλια και ακολουθείται από αυτήν στα σκυλιά, στα ποντίκια, στους αρουραίους και στους ανθρώπους (Ikeda,2000). 19 Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι 36

οι διαφορές στην υδρολυτική δραστικότητητα λόγω λευκωματίνης ορού είναι μεγάλες και σχετίζονται με τη συνδυασμένη δράση όλων των συστατικών του ορού. Σχήμα 3.5:Η ενζυματική υδρόλυση της μιντοξομίλης της ολμεσαρτάνης Η μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης συνήθως συνταγογραφείται με ένα διουρητικό φάρμακο που περιέχει θειαζίδιο [γενικά υδροχλωροθειαζείδιο (HCT)] και/ή έναν ανταγωνιστή διαύλων ασβεστίου για να βελτιώσει τη δράση του 20-22. Έχει γίνει εμπορικό προϊόν ως αντιυπερτασικό στις Ηνωμένες Πολιτείες, στην Ιαπωνία και σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες. 23 Στην Ελλάδα κυκλοφόρησε στα εμπορικά διαθέσιμα σκευάσματα Olmetec και Olartan. Η πιο πρόσφατη έγκριση από τον FDA ανακοινώθηκε τον Ιούλιο του 2010 για το Tribenzor [μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης (olmesartan medoxomil), αμλοδιπίνη (amlodipine), υδροχλωροθειαζίδιο (hydrochlorothiazide)], ένα νέο συνδυαστικό, τρία σε ένα, σκεύασμα για την θεραπεία της υπέρτασης, το οποίο περιέχει έναν ARB, έναν ανταγωνιστή διαύλων ασβεστίου και ένα διουρητικό. 24 3.5 Φυσικές ιδιοτήτες του προφάρμακου μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης και του δραστικού μεταβολίτη ολμεσαρτάνης 25-31 Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται διάφορα συγκριτικά στοιχεία για την ολμεσαρτάνη και τη μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης. 37

OH OH O N O N O O O N OH N O N N Μοριακός τύπος Μοριακή μάζα Σημείο τήξεως N N Ολμεσαρτάνη N H C 24 H 26 N 6 O 3 C 29 H 30 N 6 O 6 446,50164 558,5851 186-188 C 175-180 C Μορφή Λευκή σκόνη Λευκή σκόνη Οσμή Άοσμο Άοσμο Διαλυτότητα Μεθανόλη Τετραϋδοφουράνιο Πυκνότητα 1,33 1,38 Χρόνος ημιζωής Μιντόξομίλη της ολμεσαρτάνης (CS-866) N Αδιάλυτο στο νερό. Λίγο διαλυτό σε ισχυρό οξύ. Διαλυτό σε ισχυρή βάση 4,5h Περίπου 13h Χαμηλή διαλυτότητα σε ph 4,0-6,0 Πίνακας 3.1: Σύγκριση μεταξύ ολμεσαρτάνης και μιντοξομίλης της ολμεσαρτάνης N N H Η ολμεσαρτάνη έχει κρυσταλλωθεί από αιθανόλη. 32 Η μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης βρέθηκε πρόσφατα (2011) να παρουσιάζει διάφορες κρυσταλλικές δομές. Σε κάποια δείγματα χαρακτηρίστηκε ως άμορφη ένωση και σε κάποια άλλα παρουσίασε το φαινόμενο του πολυμορφισμού. 33 Οι διαφορές αυτές των κρυσταλλικών δειγμάτων της μιντοξομίλης της ολμεσαρτάνης ενδέχεται να επηρεάσουν όχι μόνο τη διαλυτότητα και τη βιοδιαθεσιμότητα, αλλά ακόμα και τη 38

βιομηχανική παραγωγή του φαρμάκου, καθώς η συμπιεστότητα, η ρευστότητα και η σταθερότητα των πολυμορφικών δομών αναμένονται να είναι διαφορετικές. 33 3.6 Είδη αγωνιστών και ανταγωνιστών. Αποτελεσματικότητα ενός αγωνιστή Ένας αγωνιστής (agonist) είναι μια χημική ουσία που συνδέεται με έναν υποδοχέα ενός κυττάρου και προκαλεί μια απόκριση από αυτό το κύτταρο. 34 Ουσιαστικά πρόκειται για έναν προσδέτη που προκαλεί μία εγγενή επίδραση. 35 Ένας ενδογενής αγωνιστής (endogenous agonist) για ένα συγκεκριμένο υποδοχέα είναι μια ένωση που παράγεται από τον οργανισμό και δεσμεύεται και ενεργοποιεί συγκεκριμένο υποδοχέα. Για παράδειγμα, ο ενδογενής αγωνιστής για τους υποδοχείς της σεροτονίνης είναι η σεροτονίνη, και ο ενδογενής αγωνιστής για τους υποδοχείς ντοπαμίνης είναι η ντοπαμίνη. 34,36 Σχήμα 3.6: Παράδειγμα ενός αγωνιστή. Το μόριο αυτό σε πρώτο στάδιο δεσμεύεται σε ένα υποδοχέα, προκαλώντας μία διαμορφωτική αλλαγή, οπότε σε δεύτερο στάδιο προκαλείται μία απόκριση (στην περίπτωση αυτή, η απόκριση είναι η διάσπαση του συμπλόκου της G-πρωτεΐνης) 35 Ένας ανταγωνιστής (antagonist) είναι η βιοδραστική ουσία που αναστέλλει τη δράση του αγωνιστή. 34 Αυτό μπορεί να συμβεί είτε άμεσα, με ανταγωνιστική πρόσδεση στον υποδοχέα, είτε έμμεσα, αλλοστερικά, οπότε δε λαμβάνεται η κατάλληλη διαμόρφωση του υποδοχέα για την πρόσδεση. Ένας λειτουργικός ανταγωνιστής (functional antagonist) αποτρέπει την απόκριση του υποδοχέα με ένα διαφορετικό τρόπο δράσης. 39

Σχήμα 3.7:Παράδειγμα ενός ανταγωνιστή. Ο ογκώδης ανταγωνιστής του σχήματος παρεμποδίζει την πρόσβαση άλλων προσδετών (όπως π.χ. του προσδέτη του σχήματος 3.6).Με αυτό τον τρόπο αποτρέπεται κάποια απόκριση του υποδοχέα (όπως αυτή του σχήματος 3.6) 35 Σχήμα 3.8: Μερικοί τρόποι δράσης φαρμάκων 35 Ενας υπερβατός ανταγωνιστής [surmountable antagonist- επίσης γνωστός και ως competitive antagonist (δηλαδή συναγωνιστικός ανταγωνιστής)] δεσμεύεται αναστρέψιμα στους υποδοχείς στο ίδιο σημείο σύνδεσης (ενεργή περιοχή) όπως και ο ενδογενής προσδέτης ή αγωνιστής, αλλά χωρίς την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Αγωνιστές και ανταγωνιστές ανταγωνίζονται για την ίδια θέση δέσμευσης στον υποδοχέα. Μόλις δεσμεύεται, ένας ανταγωνιστής παρεμποδίζει τη δέσμευση του αγωνιστή. Το επίπεδο δράσης του υποδοχέα καθορίζεται από τη σχετική συγγένεια 40

του κάθε μορίου για το σημείο πρόσδεσης και από τις σχετικές συγκεντρώσεις τους. Οι υψηλές συγκεντρώσεις ενός συναγωνιστικού ανταγωνιστή ελαττώνουν το ποσοστό των υποδοχέων που ο αγωνιστής καταλαμβάνει, ενώ απαιτούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις του αγωνιστή για να επιτευχθεί ο μέγιστος βαθμός πρόσδεσης. 37 Ο όρος ανυπέρβατος (ανυπέρβλητος) ανταγωνιστής (non-surmountable antagonist) επίσης γνωστός και ως insurmountable (ανυπέρβλητος) ή και noncompetitive antagonist (δηλαδή μη ανταγωνιστικός) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να περιγράψει δύο ξεχωριστά φαινόμενα: πρώτο, εκείνο κατά το οποίο ο ανταγωνιστής συνδέεται με το ενεργό κέντρο του υποδοχέα, και δεύτερο εκείνο κατά το οποίο ο ανταγωνιστής δεσμεύεται σε μια αλλοστερική θέση του υποδοχέα. Αν και ο μηχανισμός του ανταγωνισμού είναι διαφορετικός στα δύο αυτά φαινόμενα και οι δύο χαρακτηρίζονται ως «μη ανταγωνιστικοί», επειδή το τελικό αποτελέσματα καθενός λειτουργικά είναι πολύ παρόμοιο. Σε αντίθεση με τους υπερβατούς ανταγωνιστές, οι οποίοι επηρεάζουν την ποσότητα του αγωνιστή που είναι αναγκαία ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη απόκριση, αλλά δεν επηρεάζουν το μέγεθος της μέγιστης απόκρισης, οι ανυπέρβλητοι αγωνιστές μειώνουν το μέγεθος της μέγιστης ανταπόκρισης που μπορεί να επιτευχθεί με οποιαδήποτε ποσότητα του αγωνιστή. 38 Αυτή η ιδιότητα τους είναι υπεύθυνη για την ονομασία τους ως «ανυπέρβλητοι», γιατί ουσιαστικά σημαίνει ότι η δράση τους δεν μπορεί να εξαλειφθεί, ανεξάρτητα από την ποσότητα του αγωνιστή που υπάρχει. Ένας ανταγωνιστής που συνδέεται με το ενεργό κέντρο ενός υποδοχέα λέγεται ότι είναι «μη ανταγωνιστικός», εάν ο δεσμός μεταξύ του ενεργού κέντρου και του ανταγωνιστή είναι μη ή σχεδόν μη αναστρέψιμος. Η δεύτερη μορφή του «μηανταγωνιστικού ανταγωνιστή» όπως έχει ήδη αναφερθεί, δρα σε ένα αλλοστερικό κέντρο. Αυτοί οι ανταγωνιστές προσδένονται σε μια σαφώς ξεχωριστή θέση δέσμευσης από τον αγωνιστή, ασκώντας τη δράση τους στους υποδοχείς μέσω των άλλων κέντρων πρόσδεσης. Δεν ανταγωνίζονται με τους αγωνιστές για την πρόσδεση στο ενεργό κέντρο. Οι δεσμευμένοι ανταγωνιστές μπορούν να αποτρέψουν τις διαμορφωτικές αλλαγές που απαιτούνται στον υποδοχέα για την ενεργοποίησή του αφού δεσμευτεί ο αγωνιστής. 38 Υπάρχει ένα τελευταίο είδος ανταγωνιστών το οποίο ονομάζεται μη συναγωνιστικοί ανταγωνιστές (uncompetitive antagonists). Αυτοί διαφέρουν από τους μη ανταγωνιστικούς ανταγωνιστές στο ότι υποδοχέα από τον αγωνιστή πριν μπορέσουν να προσδεθούν 41 απαιτούν ενεργοποίηση του σε μία ξεχωριστή αλλοστερική θέση δέσμευσης. Αυτός ο τύπος ανταγωνισμού παράγει ένα κινητικό προφίλ στο οποίο η ίδια ποσότητα ανταγωνιστή παρεμποδίζει ισχυρότερα υψηλότερες συγκεντρώσεις του αγωνιστή από χαμηλότερες συγκεντρώσεις. 39

Ένας αντίστροφος αγωνιστής (inverse agonist) προκαλεί μια ενέργεια αντίθετη με αυτή του αγωνιστή. 34 Ουσιαστικά ένας αντίστροφος αγωνιστής ασκεί την αντίθετη φαρμακολογική δράση από αυτή του αγωνιστή (στον υποδοχέα). 35 Ένας ουδέτερος ανταγωνιστής (neutral antagonist) δεν έχει καμία δραστηριότητα σε περίπτωση απουσίας ενός αγωνιστή ή ενός αντιστρόφου αγωνιστή, αλλά μπορεί να εμποδίσει τη δραστηριότητα των δύο αυτών αγωνιστών. Ένας φυσιολογικός αγωνιστής (physiological agonist) είναι μια ουσία που δημιουργεί η ίδια αποκρίσεις, αλλά δε δεσμεύεται στους ίδιους υποδοχείς. 40 Ένας σουπερ-αγωνιστής (superagonist) είναι μια ένωση που είναι ικανή να παράγει μια μεγαλύτερη μέγιστη ανταπόκριση από τον ενδογενή αγωνιστή για τον υποδοχέα-στόχο και έτσι έχει αποτελεσματικότητα άνω του 100%. Αυτό δε σημαίνει απαραίτητα ότι είναι πιο ισχυρός από τον ενδογενή αγωνιστή, αλλά ο όρος δίνει ένα μέτρο σύγκρισης της μέγιστης δυνατής ανταπόκρισης που μπορεί να παραχθεί στο εσωτερικό του κυττάρου μετά τη δέσμευση στους υποδοχείς. Οι πλήρεις αγωνιστές (full agonists) δεσμεύονται (παρουσιάζουν δηλαδή συγγένεια για τους υποδοχείς) και ενεργοποιούν ένα υποδοχέα, εμφανίζοντας πλήρη αποτελεσματικότητα σε αυτόν. Ένα παράδειγμα από ένα φάρμακο που δρα ως πλήρης αγωνιστής είναι η ισοπροτερενόλη (isoproterenol), η οποία μιμείται τη δράση της αδρεναλίνης στους β αδρενεργικούς υποδοχείς. Ένα άλλο παράδειγμα είναι η μορφίνη (morphine), η οποία μιμείται τις ενέργειες των ενδορφινών στους μ- οπιοειδείς υποδοχείς σε όλο το κεντρικό νευρικό σύστημα. 34 Αγωνιστής μερικής δράσης (partial agonist) όπως π.χ. η βουπρενορφίνη (buprenorphine) δεσμεύει και ενεργοποιεί ένα συγκεκριμένο υποδοχέα, αλλά έχει μόνο μερική αποτελεσματικότητα στον υποδοχέα σε σχέση με έναν πλήρη αγωνιστή. Ένα συναγωνιστής (co-agonist) συνεργάζεται με άλλους συναγωνιστές να παράγουν το επιθυμητό αποτέλεσμα από κοινού. O μη αναστρέψιμos αγωνιστής (irreversible agonist) είναι ένα είδος αγωνιστή που συνδέεται μόνιμα με έναν υποδοχέα κατά τέτοιο τρόπο ώστε ο υποδοχέας είναι μόνιμα ενεργοποιημένος, δηλαδή μη αναστρέψιμος. Είναι διαφορετικός από έναν απλό αγωνιστή στον οποίο γενικά η σύνδεση είναι αναστρέψιμη. Αυτό προκαλεί την ένωση να παράγει μια σύντομη «έκρηξη» της αγωνιστικής δράσης, ακολουθούμενη από την απευαισθητοποίηση του υποδοχέα, η οποία, με τη μακροχρόνια θεραπεία, παράγει ένα αποτέλεσμα που μοιάζει περισσότερο με εκείνη ενός ανταγωνιστή. 34 Ένας εκλεκτικός αγωνιστής (selective agonist) είναι επιλεκτικός για έναν ορισμένο τύπο υποδοχέα. Μπορεί να ανήκει σε οποιασδήποτε από τις παραπάνω κατηγορίες (π.χ. αγωνιστής μερικής δράσης, πλήρης αγωνιστής κλπ.). 42

Η αποτελεσματικότητα (efficacy) ενός πλήρoυς αγωνιστή είναι εξ ορισμού το 100%, ενός ουδέτερου αγωνιστή το 0% και ενός αντίστροφου αγωνιστή είναι <0% (δηλαδή, αρνητική αποτελεσματικότητα). Σχήμα 3.9:Αποτελεσματικότητα αγωνιστών 38 3.7 Η κατάταξη της ολμεσαρτάνης στους αντίστροφους αγωνιστές Η μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης παρουσιάζει συγγένεια για τον ΑΤ 1 υποδοχέα 12500 φορές μεγαλύτερη από ότι για τον ΑΤ 2 υποδοχέα. 12 Η σειρά για τη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης στον ΑΤ 1 σε σύγκριση με τον ΑΤ 2 υποδοχέα, είναι βαλσαρτάνη > μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης > καντεσαρτάνη > ιρμπεσαρτάνη > τελμισαρτάνη > λοσαρτάνη > επροσαρτάνη. 41-43 Η μιντοξομίλη της ολμεσαρτάνης κατατάσσεται δηλαδή δεύτερη στη σειρά αυτή. Επίσης σε μελέτη που έχει πραγματοποιηθεί για τη συγγένεια πρόσδεσης στον ΑΤ 1 υποδοχέα (σύγκριση διαφορετική από την παραπάνω, όπου ζητούμενο ήταν πόσες φορές μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης είχαν τα φάρμακα στον ΑΤ 1 σε σύγκριση με τον ΑΤ 2 υποδοχέα), στα αντιυπερτασικά φάρμακα ολμεσαρτάνη, καντεσαρτάνη, EXP3174, βαλσαρτάνη και τελμισαρτάνη, η ολμεσαρτάνη και η καντεσαρτάνη είχαν τις μεγαλύτερες τιμές. 44,45 Συγκεκριμένα η σειρά ως προς την παραπάνω σύγκριση είναι ολμεσαρτάνη=καντεσαρτάνη > τελμισαρτάνη > EXP3174 > βαλσαρτάνη. 43

Προσδέτες που αναστέλλουν τη βασικη κυτταρική δραστηριότητα του υποδοχέα με ένα τρόπο που εξαρτάται από την ποσότητά τους, ανήκουν στην ομάδα ενώσεων που ορίστηκαν ως (παράγραφος 3.6) «αντίστροφοι αγωνιστές». Υπάρχουν μελέτες που τεκμηριώνουν την ικανότητα των EXP3174, βαλσαρτάνης και ολμεσαρτάνης, να μειώνουν τη συστατική δραστηριότητα σε συγκεκριμένες περιπτώσεις υποδοχέων και έχουν συγκεντρωθεί στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η καρβοξυλικη και υδροξυλική ομάδα στον υποκατεστημένο δακτύλιο του ιμιδαζολίου της ολμεσαρτάνης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία (Miura et al., 2003, 2006, 2008). 46-48 Σύμφωνα με τα παραπάνω, τα EXP3174, βαλσαρτάνη και ολμεσαρτάνη ανήκουν στην ομάδα των αντίστροφων αγωνιστών. Το να ανήκει μία ένωση στους αντίστροφους αγωνιστές θεωρείται πολύ σημαντικό γιατί μπορεί να είναι χρήσιμη για τη θεραπεία της καρδιαγγειακής νόσου και άλλων ασθενειών που προκαλούνται από ενεργοποιημένους GPCRs. 3.8 Αλληλεπίδραση ολμεσαρτάνης με τον ΑΤ 1 υποδοχέα Στα σχήματα 3.10, 3.11 παρουσιάζονται οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις της ολμεσαρτάνης με τον ΑΤ 1 υποδοχέα. Σχήμα 3.10: Αριστερά παρουσιάζονται σχηματικά τα αποτελέσματα από Μοριακή πρόσδεση της ολμεσαρτάνης και οι θέσεις δέσμευσης στους ΑΤ 1 υποδοχείς για κάθε ARB. Τα πλαισιωμένα αμινοξέα δείχνουν τις θέσεις πρόσδεσης που είναι σημαντικές για την πρόκληση αντίστροφου αγωνισμού προς την παραγωγή φωσφωρικής ινοσιτόλης, στους ΑΤ 1 υποδοχείς. 48 Δεξιά απεικονίζονται όλες οι προτεινόμενες αλληλεπιδράσεις της ολμεσαρτάνης με τον ΑΤ 1 υποδοχέα. 44

Σχήμα 3.11: Μοριακη πρόσδεση της αλληλεπίδρασης της ολμεσαρτάνης με τον ΑΤ 1 υποδοχέα. Ο ΑΤ 1 υποδοχέας παρουσιάζεται ως κορδέλες (ribbons) και τα αμινοξέα Tyr 113, Lys 199, His 256 και Gln 257 καθώς και η ολμεσαρτάνη απεικονίζονται ως μοντέλα ράβδων (stick models). Τα χρώματα αντιστοιχούν ως εξής: ΤΜ Ι (μπλε, όπου ΤΜ= διαμεμβρανικη, transmembrane), ΤΜ ΙΙ (πράσινο), ΤΜ ΙΙΙ (ανοιχτό πράσινο), ΤΜ ΙV (κίτρινο), ΤΜ V (ανοιχτό πορτοκαλί), ΤΜ VI (πορτοκαλί) και ΤΜ VIΙ (κόκκινο). Με μωβ περιγράφονται τα άτομα C της ολμεσαρτάνης. 47 Από τις αλληλεπιδράσεις που αναπαριστάνονται (σχήματα 3.10, 3.11), αυτή μεταξύ της υδροξυλομάδας και της Tyr 113 (ΤΜ ΙΙΙ) καθώς και αυτή μεταξύ της καρβοξυλομάδας και της His 256 (ΤΜ VI) είναι σημαντικές για την ιδιότητα της ολμεσαρτάνης να ανήκει στους αντίστροφους αγωνιστές. Εικάζεται ότι οι συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις με τις δύο ΤΜ είναι ουσιώδεις για τη σταθεροποίηση των ΑΤ 1 υποδοχέων σε μία διαμόρφωση, που δεν επιτρέπει τη σύζευξη της G πρωτεΐνης. 47 Γενικότερα γνωρίζοντας ότι ο αντίστροφος αγωνισμός φαρμακευτικών μορίων ως ιδιότητα μπορεί να είναι σημαντικός για τη μακροχρόνια θεραπεία καρδιακών παθήσεων (εκτός της ωφέλιμης ιδιότητας μείωσης της αρτηριακής πίεσης), είναι σημαντική πληροφορία, η ταξινόμηση των ΑΥΑ σύμφωνα με την ικανότητά τους να τον ασκούν (τον αντίστροφο αγωνισμό). 49 45

3.9 Συγκριση σαρτανών ως προς την παρεμπόδιση της αύξησης της αρτηριακής πίεσης Στα επόμενα σχήματα συγκρίνονται οι σαρτάνες μεταξύ τους ως προς την αποτελεσματικότητά τους να παρεμποδίζουν την αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Η πρώτη σύγκριση γίνεται μετά από 24 h από τη χορήγηση των σαρτανών και η δεύτερη σύγκριση μετά από 8 βδομάδες χορήγησης των φαρμάκων. Σχήμα 3.12:Παρεμπόδιση της αύξησης της αρτηριακής πίεσης που προκαλείται από την ΑΙΙ. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν 24 h μετά τη χορήγηση κάθε σαρτάνης. Τα αποτελέσματα για τη λοσαρτάνη κυμαίνονται από αναφορές στο 25-40%. 44 Σχήμα 3.13:Μέση μείωση της συστολικής και διαστολικής πίεσης μετά από 8 βδομάδες σύγκριση τεσσάρων σαρτανών 44 Το ερώτημα που προκύπτει από τα παραπάνω σχήματα είναι γιατί η ολμεσαρτάνη παρουσιάζει τα ισχυρότερα αντιυπερτασικά αποτελέσματα. Οι πιθανές 46

απαντήσεις που προκύπτουν από τις πληροφορίες που αναλύθηκαν νωρίτερα στο παρόν κεφάλαιο είναι: Η ολμεσαρτάνη περιέχει στον ετεροκυκλικό δακτύλιο υδροξύλιο και καρβοξύλιο για πραγματοποίηση ισχυρότερης πρόσδεσης στον AT 1 υποδοχέα. Οι ισχυρές αλληλεπιδράσεις του υδροξυλίου και καρβοξυλίου στο ενεργό κέντρο σχετίζονται με τις ιδιότητες αντίστροφου αγωνισμού του μορίου. 44 3.10 Συγκριτικές κλινικές και φαρμακολογικές μελέτες μεταξύ ΑΤ 1 ανταγωνιστών Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται οι συγκριτικές δράσεις μεταξύ ΑΥΑ όπως προκύπτουν από κλινικές δοκιμές: Δραση Μείωση μάζας αριστερής κοιλίας 50 Αποτελεσματικότητα Βαλσαρτάνη > Λοσαρτάνη Αύξηση της παραγωγής ΝΟ 51 Παρεμπόδιση της συστολής της στεφανιαίας αρτηρίας 52 Παρεμπόδιση της στεφανιαίας αναστένωσης 53 Μείωση C-αντιδρώσας πρωτεΐνης 54 Μείωση αδιπονεκτόνης και γλυκόζης πλάσματος 55 Αναστολή της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων 56 Μείωση της ιντερλευκίνης-6 και της C-αντιδρώσας πρωτεϊνης 57 Βελτίωση του προφίλ γλυκόζης και λιπιδίων 58 Βαλσαρτάνη > Λοσαρτάνη Exp3174>Καντεσαρτάνη=Βαλσαρτάνη>Λοσαρτάνη Βαλσαρτάνη > Λοσαρτάνη Ολμεσαρτάνη > Βαλσαρτάνη Τελμισαρτάνη > Καντεσαρτάνη Λοσαρτάνη > Βαλσαρτάνη > Καντεσαρτάνη Ολμεσαρτάνη > Τελμισαρτάνη Τελμισαρτάνη > Ολμεσαρτάνη Πίνακας 3.2: Συγκριτικές δράσεις μεταξύ ΑΥΑ 49 Στον παρακάτω πίνακα παρουσίαζεται το φαρμαλογικό προφίλ των ΑΥΑ σύμφωνα με τους Aulakh, Sodhi και Singh. 59 47

Φάρμακο Βιοδιαθεσιμότητα Επίδραση φαγητού Ενεργός μεταβολίτης Χρόνος ημιζωής στο % πρωτεϊνική πρόσδεση Δόση Ανά ημέρα (mg) πλάσμα (h) Λοσαρτάνη 33 Ελάχιστη Ναι 2 98.7 50-100 (Exp 3174) Βαλσαρτάνη Σιλεξιτίλη της καντεσαρτάνης (Καντεσαρτάνη) Τασοσαρτάνη (Ενολτασοσαρτάνη) Ιρμπεσαρτάνη 25 40-50% μείωση Όχι (6-9) 6 (99.8) 95 80-320 42 Όχι Ναι 3.5-4 99.5 4-32 - Όχι Ναι (3-11) - 50-100 3-7 70 Όχι Όχι (36-72) >90 150-300 11-15 Επροσαρτάνη 13 Όχι Όχι 5-9 97.0 200-400 2 φορές Τελμισαρτάνη 40-60 Όχι Όχι ~24 >99.5 40-120 Ζολασαρτάνη 20 - Όχι - - - Ολμεσαρτάνη 26 Όχι Ναι 12-18 99 5-80 (8-13) Πίνακας 3.3: Συγκριτικές δράσεις μεταξύ ΑΥΑ 48

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΡΕΝΙΝΗΣ Η πρόσδεση της αλισκιρένης στη ρενίνη. 60 (Οι α-ελικες απεικονίζονται ως ταινίες και τα β πτυχωτά φύλλα ως βέλη) 49

50

4.1 Εισαγωγή στους αναστολείς ρενίνης Οι αναστολείς της ρενίνης είναι μια κατηγορία αντιυπερτασικών φαρμάκων που υπόσχεται να επιτύχει πληρέστερο αποκλεισμό του συστήματος ρενίνηςαγγειοτασίνης-αλδοστερόνης (ΣΡΑΑ). Η κατηγορία αυτή φαρμάκων, δρα μέσω μείωσης της δραστηριότητας της ρενίνης του πλάσματος, η οποία είναι γνωστό ότι αυξάνεται τόσο με τους αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου, όσο και με τους αποκλειστές των υποδοχέων ΑΤ 1 της αγγειοτασίνης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί οι αναστολείς ρενίνης παρεμποδίζουν το αγγειοτασινογόνο να μετατραπεί σε αγγειοτασίνη Ι. Η ιδέα του αποκλεισμού του ΣΡΑΑ με αναστολή της δράσης της ρενίνης προέκυψε εδώ και περισσότερο από 40 χρόνια. 61-72 4.2 Ενεργοποίηση της προρενίνης- Ρενίνη Η ρενίνη είναι μία ασπαρτική πρωτεάση με 340 αμινοξέα και μοριακό βάρος 40.000. Ανήκει στην ίδια οικογένεια ενώσεων που περιέχει την πεψίνη, την καθεψίνη-d και τη χυμοσίνη. Το σημαντικό χαρακτηριστικό αυτής της οικογένειας ενζύμων είναι ότι σε δύο περιοχές του ενεργού κέντρου περιέχουν δύο ασπαρτικά οξέα. Τρισδιάστατα μοντέλα ανθρώπινης ρενίνης βασισμένα σε δεδομένα κρυσταλλογραφίας ακτίνων-χ αποκαλύπτουν ότι τα αμινοξέα Asp-35 και Asp-226 του ενεργού κέντρου συγκρατούνται με ένα δίκτυο δεσμών υδρογόνου. 67 Το ενεργό κέντρο εμφανίζεται ως μία μακριά, βαθιά κοιλότητα στην οποία μπορεί να γίνει προσαρμογή επτά αμινοξικών μονάδων. Το ένζυμο περιέχει ακόμα ένα τμήμα σε μορφή πτερυγίου, το οποίο όταν προσαρμοστεί πάνω στη σχισμή, συγκρατεί το υπόστρωμα στο ενεργό κέντρο. 66 Η ύπαρξη της ρενίνης έγινε γνωστή για πρώτη φορά το 1898 από τους Bergman και Tigerstedt. Η παραγωγή της πραγματοποιείται από τον παρασπειραματικό σχηματισμό σε μία αρχική αδρανή μορφή, την προρενίνη. Η προρενίνη μετατρέπεται στoν παρασπειραματικό σχηματισμό σε ρενίνη. (Σε αυτό το σημείο αξίζει να αναφερθεί ότι οι β αποκλειστές είναι μία άλλη κατηγορία ενώσεων που μειώνουν την απελευθέρωση ρενίνης από τον παρασπειραματικό σχηματισμό). Η αναλογία προρενίνης-ρενίνης στο πλάσμα είναι σε φυσιολογικό περιβάλλον γύρω στο 9:1. 51

Σχήμα 4.1: Ενεργοποίηση προρενίνης Όπως παρατηρείται στο παραπάνω σχήμα αν η προρενίνη υποστεί πρωτεολυτική διάσπαση, αποσπάται το χαρακτηριστικό της τμήμα, οπότε προκύπτει η ρενίνη. Με την πρωτεολυτική διάσπαση, αποκαλύπτεται η λεγόμενη θήκη του αγγειοτασινογόνου. Εναλλακτικά, μία μη πρωτεολυτική ενεργοποίηση συμβαίνει όταν το χαρακτηριστικό τμήμα της προρενίνης «ανοίγει» (χωρίς να πραγματοποιείται η αφαίρεσή του). Το ενεργό κέντρο μπορεί να προσλάβει τότε μόρια αγγειοτασινογόνου. Όταν η προρενίνη έχει προσδεθεί σε υποδοχέα της, τότε συμβαίνει μη πρωτεολυτική ενεργοποίηση. 62,64 Ο ρυθμός έκκρισης της ρενίνης καθορίζεται από 61 : α) την πίεση στο προσαγωγό αρτηριδίο β) το βαθμό ενεργοποίησης του συμπαθητικού συστήματος (μέσω β1 υποδοχέων στην παρασπειραματική συσκευή) γ) τη συγκέντρωση νατρίου στην περιοχή της πυκνής κηλίδας δ) το μηχανισμό αρνητικού ανάδρομου ελέγχου (μέσω της αγγειοτασίνης II). Μοναδική δράση της ρενίνης θεωρείται η μετατροπή του αγγειοτασινογόνου σε αγγειοτασίνη Ι, δηλαδή υπάρχει μία αξιοσημείωτη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμά της. Μία εκτεταμένη μελέτη σε υπερτασικά άτομα που δε λάμβαναν φαρμακευτική αγωγή κατέληξε στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα της ρενίνης αποτελούν ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για έμφραγμα μυοκαρδίου. Αυξημένα επίπεδα προρενίνης έχουν παρατηρηθεί σε αρρώστους με διαβητική νεφροπάθεια, μικρολευκωματινουρία, αμφιβληστροειδοπάθεια, καρδιακή 52

ανεπάρκεια, υπέρταση και εκλαμψία. Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι πρόσφατα διαπιστώθηκε η ύπαρξη ειδικού υποδοχέα της ρενίνης και προρενίνης στην κυτταρική μεμβράνη, ο ρόλος του οποίου δεν έχει επαρκώς διευκρινιστεί. Μία άποψη που ήδη διατυπώθηκε είναι ότι, μέσω του υποδοχέα αυτού, η ρενίνη και η προρενίνη ίσως να έχουν άμεσες ενδοκυττάριες δράσεις, βλαπτικές για το καρδιαγγειακό σύστημα (σχηματισμός αγγειοτασίνης Ι, υπερτροφία, ίνωση), οι οποίες είναι ανεξάρτητες από αυτές του κλασικού ΣΡΑΑ. Είναι πιθανό, μέσω των μηχανισμών αυτών, οι αναστολείς της ρενίνης να αποδειχθούν εξαιρετικά φάρμακα για την προστασία του καρδιαγγειακού συστήματος. 61 4.3 Σύντομη ιστορική αναδρομή στην έρευνα και ανάπτυξη των αναστολέων ρενίνης Το αγγειοτασινογόνο έχει την ιδιότητα να προσδένει στο ενεργό κέντρο της ρενίνης, με τα αμινοξέα του 6-14 (-His 6 -Pro 7 -Phe 8 -His 9 -Leu 10 -Leu 11 -Val 12 -Tyr 13 - Ser 14 ) να καταλαμβάνουν 9 θέσεις. Όπως ήδη αναφέρθηκε, η ρενίνη διασπά το αγγειοτασινογόνο, οπότε προκύπτει η αγγειοτασίνη Ι (παράγραφός 2.1). Η αρχική ιδέα ήταν να συντεθούν αναστολείς, οι οποίοι θα αποτελούσαν συνθετικά πεπτίδια του πρόδρομου μορίου της ρενίνης. Πάρα πολλά ανάλογα συντέθηκαν με στόχο την εύρεση των βιοδραστικότερων ανταγωνιστών της ρενίνης. Όμως, η χρήση των αναστολέων ρενίνης αυτής της πρώτης γενιάς στην κλινική πράξη δεν ήταν εφικτή, διότι τα νέα μόρια δεν είχαν την κατάλληλη βιοδιαθεσιμότητα όταν χορηγούνταν από το στόμα ή είχαν ανεπαρκή αντιυπερτασική δράση και υψηλό κόστος σύνθεσης. Το πρώτο μόριο που έδειξε μικρή δραστικότητα, όταν η χορήγηση γινόταν από το στόμα ήταν το CGP29287 (σχήμα 4.2). Η επόμενη ιδέα σχεδιασμού πεπτιδικών αναλόγων που μιμούνται την αλληλουχία του υποστρώματος της ρενίνης του αγγειοτασινογόνου, σχετίστηκε με οδηγό τον πεπτιδικό δεσμό Leu-Val. Οι αλλαγές που έγιναν στην πεπτιδική αλληλουχία του αγγειοτασινογόνου είχαν ως σκοπό να δομηθούν μόρια που μοιάζουν στη διαμόρφωση της μεταβατικής κατάστασης υδρόλυσης του δεσμού Leu-Val. Σε επόμενο στάδιο οι συνθετικές απόπειρες εστιάσθηκαν σε ανάλογα της πεπστατίνης, 85 ένα εξαπεπτίδιο που παράγεται στο μεταβολισμό μικροβίων. Η πεπστατίνη έχει σε μικρό ποσοστό, σύζευξη με τη ρενίνη 60,73. Τα ανάλογα που συντέθηκαν είχαν δομή του τυπου A-X-Y-Sta-Ala-Sta- (δηλαδή έμενε πάντα σταθερό το τμήμα -Sta-Ala-Sta- για όλες τις ενώσεις). 74 Με την εξέλιξη των ερευνών συντέθηκαν μόρια με μικρότερο αριθμό αμιδικών δεσμών και μεγαλύτερη σταθερότητα και δράση (αναστολείς 2 ης γενιάς). 53

Αφού αρχικά επιτεύχθηκαν κάποια ικανοποιητικά αποτελέσματα ως προς τη δραστικότητα, δόθηκε έμφαση στον παράγοντα της βιοδιαθεσιμότητας (όταν η χορήγηση γίνεται από το στόμα). Τα πρώτα μόρια που συντέθηκαν σε αυτήν την κατεύθυνση ήταν η ρεμικιρένη (remikiren) και η εναλκιρένη (enalkiren - A-64662). Περαιτέρω βελτίωση στο πρόβλημα της βιοδιαθεσιμότητας επιτεύχθηκε με τα μόρια FK906, ζανκιρένη (zankiren) και Α-74273. Επίσης τα μόρια CP-108671 70 και BILA 2157 BS 71 (σχήμα 4.2 έχει ΜΒ 726 και τέσσερα στερεογονικά κέντρα) βρέθηκαν να αναστέλλουν σε ικανοποιητικό βαθμό την ανθρώπινη ρενίνη (IC 50 4 nm και 1.4 nm αντίστοιχα). Όμως το CP-108671 αναστέλλει επίσης την καθεψίνη D. Όλα τα παραπάνω μόρια είχαν ένα ή περισσότερα από τα εξής μειονεκτήματα: α) μικρό χρόνο ημίσειας ζωής β) ανεπαρκή αντιυπερτασική δράση και γ) υψηλό κόστος σύνθεσης, οπότε τελικά δεν αποτέλεσαν εμπορικά προϊόντα. Η αποτυχία και των αναστολέων δευτερης γενιας οδήγησε τους συνθετικούς χημικούς να αναζητήσουν πιθανους αναστολείς ρενίνης με σύνθεση μη πεπτιδομιμητικών μορίων. Σε αυτό το στάδιο ανάπτυξης της έρευνας για τους αναστολείς ρενίνης πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μορίων υποκατεστημένων πιπεριδινών. Σημαντικές προσπάθειες στον τομέα αυτόν έγιναν από τη φαρμακευτική εταιρία Hoffmann-La Roche. Ενώσεις του τύπου Α και Β εμφανίζουν ικανοποιητική πρόσδεση στον υποδοχέα. Το Ν- της πιπεριδίνης διευθετείται κοντά στα ασπαρτικά οξέα, ενώ το ναφθαλένιο στις ενώσεις τύπου Β αλληλεπιδρά με τα αμινοξέα της S SP 3 θήκης (μία μικρή θήκη για την οποία γίνεται αναφορά παρακάτω). Όμως, η αλληλεπίδραση με το κυτόχρωμα (Cyp) P450 ελαττώνει τη δράση της. Πολλά μόρια υποκατεστημένων πιπεριδινών εγκαταλείφθηκαν στο στάδιο προκλινικών μελετών. 72 Η σύνθεση της ένωσης Γ έγινε στα πλαίσια της έρευνας της προηγούμενης δεκαετίας (2004). Παράλληλα με τις υποκατεστημένες πιπεριδίνες έγιναν απόπειρες εύρεσης αποτελεσματικών αναστολέων ρενίνης κάνοντας χρήση ως υπόστρωμα τις πιπεραζίνες. Αν και βρέθηκαν κάποια πολύ δραστικά μόρια (IC 50 έως 0.18 nm), τα μόρια αυτά προκαλούσαν αναστολή CYP3A4 σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90%. 54

1 η γενια αναστολέων ρενίνης 2 η γενια αναστολέων ρενίνης CGP29287 3 η γενια αναστολέων ρενίνης Hoffmann- La Roche CP-108671 BILA 2157 BS Υποκατεστημένες πιπεριδίνες στην έρευνα νέων αναστολέων ρενίνης Σχήμα 4.2:Παραδείγματα μόριων κατά την εξέλιξη της έρευνας προς σύνθεση αναστολέων ρενίνης 55

Οι κρυσταλλογραφικές μελέτες των πρώτων αναστολέων στο ένζυμο της ρενίνης είχε οδηγήσει στην πληροφορία ότι υπάρχουν οι θήκες S1 και S3 οι οποίες είναι γειτονικές. Το δεδομένο αυτό πρόσφερε μία νέα ιδέα στις ερευνητικές ομάδες που ασχολούνταν με τη σύνθεση αναστολέων ρενίνης. Η ιδέα ήταν ότι για να καταληφθεί η θήκη S3, ίσως να ήταν αποτελεσματική λύση η προσαρτήση ένας νέου υποκαταστάτη ο οποίος δε θα βρίσκεται στον πεπτιδικό σκελετό. Επιπρόσθετα, μία ανακάλυψη-κλειδί ήταν και η ταυτοποίηση μια μικρής βοηθητικής θήκης, της S3 sp (ή S3 aux ). Νέα μόρια σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να καταλαμβάνουν τη θήκη αυτή δείχνοντας αξιοσημείωτα βελτιωμένα χαρακτηριστικά πρόσδεσης. Η θήκη S3 sp βρίσκεται μόνο στη ρενίνη, προσδίδοντάς της ένα νέο χαρακτηριστικό στην ομάδα των ασπαρτικών πρωτεασών. Μερικές από τις συνθέσεις που έγιναν σταδιακά με βάση τους παραπάνω συλλογισμούς παριστάνονται στο πιο κάτω σχήμα. 71 Συνδυασμός ομάδας υποκαταστατών a b c d e IC 50 37 μμ 700 nm 52 nm 8 nm 22 nm Σχήμα 4.3 71 :Αναζήτηση ενός αποτελεσματικού αναστολέα ρενίνης με έναν επιπλέον υποκαταστάτη (ο οποίος δε βρίσκεται πάνω στον πεπτιδικό σκελετό) 56

Με οδηγό τα μόρια του συνδυασμού της ομάδας υποκαταστατών d, έγινε η σύνθεση δύο ακόμα μορίων: IC 50 =4 nm IC 50 =3 nm Σχήμα 4.4: Δραστικά μόρια, πρόδρομα της αλισκιρένης Μετά τη σύνθεση των δύο παραπάνω μορίων δόθηκε έμφαση στην αντικατάσταση του n-bu με διάφορες πολικές ομάδες, έτσι ώστε να μετριαστεί η απώλεια δραστικότητας που είχε παρατηρηρηθεί σε πειράματα μέσα σε πλάσμα. (Τα δύο παραπάνω μόρια ήταν περισσότερο δραστικά εκτός πλάσματος). Tην ίδια εποχή που οι ερευνητές της φαρμακευτικής εταιρίας Hoffmann-La Roche διεξήγαγαν έρευνα σε υποκατεστημένες πιπεριδίνες, οι ερευνητές της φαρμακευτικής εταιρίας Ciba-Geigy (σημερινή Novartis) ανακάλυψαν το μόριο αλισκιρένη (aliskiren) το οποίο ήταν δραστικό μετά από χορήγηση από το στόμα. Στο σχήμα 4.5 παρουσιάζεται η δομή του μορίου της αλισκιρένης και στο σχήμα 4.6 η πρόσδεση της με το υδρόφοβο κέντρο S1-S3 και με τη θήκη S3 SP. 75 O N H 2 OH N NH 2 O O O O Σχήμα 4.5: Αλισκιρένη (SPP 100) 57

Σχήμα 4.6 75 : Αναλυτική παρουσίαση της πρόσδεσης της αλισκιρένης στο υδρόφοβο κέντρο S1-S3 και στη θήκη S3 SP Η πορεία σύνθεσης της αλισκιρένης, η οποία κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας το 1995, λόγω των πολλών στάδιων της, δεν ήταν κατάλληλη για βιομηχανική παραγωγή. Το 1999, οι συνθετικοί φαρμακοχημικοί της εταιρίας Speedel AG σχεδίασαν μία σχετικά οικονομική πορεία σύνθεσης της αλισκιρένης, κάνοντας με αυτόν τον τρόπο εφικτή τη βιομηχανική παραγωγή του συγκεκριμένου μορίου. 65 To 2001 παρουσιάστηκε από τους ερευνητές της εταιρίας Speedel μία νέα σειρά αναστολέων ρενίνης με την ονομασία SPP 600. Toν Ιούνιο του 2005 οι ερευνητές της ίδιας εταιρίας ανακοίνωσαν την ανακάλυψη ακόμα μίας νέας σειράς ενώσεων με την ονομασία SPP 800, ενώ το 2006 ανακοινώθηκε η σειρά SPP 1100. Το μόριο SPP 676 βρίσκεται στη φάση ΙI κλινικών δοκιμών, ενώ το μόριο SPP 635 έφτασε στη φάση ΙΙΙ κλινικών δοκιμών. Στη φάση Ι επέδειξε βιοδιαθεσιμότητα 25-30%. Για το συγκεκριμένο μόριο (SPP 635), ο στόχος της εταιρίας είναι ο έλεγχος της πίεσης σε διαβητικούς που παρουσιάζουν υπέρταση. Το τελευταίο μόριο της ίδιας εταιρίας είναι το SPP 1148, στο οποίο το 2007 ξεκίνησαν οι κλινικές δοκιμές της φάσης Ι. 76 Γενικά, οι πληροφορίες που αντλούνται από την κρυσταλλογραφία με ακτίνες-χ και τη μοριακή μοντελοποίηση έχουν οδηγήσει σε βελτιωμένες προσεγγίσεις ως προς την εύρεση νέων φαρμακευτικών μορίων, τα οποία δρουν ως αναστολείς ρενίνης. 67 58

Μία ανακεφαλαίωση των σημαντικότερων κατηγοριών ενώσεων κατά την εξέλιξη της έρευνας στον τομέα των αναστολέων ρενίνης είναι η εξής 71,72,76 : Συνθετικά πεπτίδια του πρόδρομου μορίου της ρενίνης Πεπτιδικά αναλόγα που μιμούνται την αλληλουχία του υποστρώματος της ρενίνης του αγγειοτασινογόνου Πεπτιδομιμητικοί αναστολείς (πχ. ρεμικιρένη, εναλκιρένη, ζανκιρένη, CGP 38560) Ανάλογα πιπεριδινών Ανάλογα πιπεραζινών Αλισκιρένη (SPP 100) Σειρές SPP 600, SPP 800, SPP 1100. Μόρια SPP 676, SPP 635, SPP 1148 4.4 Αλισκιρένη: Ο κύριος εκπρόσωπος των αναστολέων ρενίνης Η αλισκιρένη έχει πλήρη 24ωρη αντιυπερτασική δράση και εξαιρετικό φαρμακολογικό προφίλ καθώς δεν προκαλεί ανεπιθύμητες ενέργειες σε δοσολογία μέχρι 300 mg την ημέρα. 61 Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται κάποια φαρμακοκινητικά δεδομένα της αλισκιρένης σε σύγκριση με άλλους αναστολείς ρενίνης. ΜΟΡΙΟ ΒΙΟΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ (%) IC 50 (nmol/l) ΗΜΙΣΕΙΑ ΖΩΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ (h) Αλισκιρένη 2.7 0.6 23.7 CGP 38560 < 1.0 0.7 1.1 Εναλκιρένη ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΔΕΔΟΜΕΝΑ 14.0 1.6 Ρεμικιρένη < 1.0 0.8 9.5 Ζανκιρένη ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΔΕΔΟΜΕΝΑ 1.1 ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΔΕΔΟΜΕΝΑ Πίνακας 4.1 65 : Φαρμακοκινητικά δεδομένα αναστολέων ρενίνης των οποίων η χορήγηση γίνεται από το στόμα Είναι ενδιαφέρον το ότι η μείωση της δραστηριότητας της ρενίνης με τη χορήγηση αλισκιρένης διατηρείται για αρκετές μέρες μετά τη διακοπή του. Σε συγχορήγηση με θειαζιδικό διουρητικό, η αλισκιρένη παρέχει αθροιστική 59

αντιυπερτασική δράση με πλήρη αναστολή της προκαλούμενης από το διουρητικό αύξησης της δραστηριότητας της ρενίνης του πλάσματος. Σε συγχορήγηση με διυδροπυριδίνη επίσης παρατηρήθηκε αθροιστική αντιυπερτασική δράση μαζί με μείωση της συχνότητας εμφάνισης οιδήματος σφυρών από την αμλοδιπίνη. 61 Aθροιστική αντιυπερτασική δράση παρατηρήθηκε όμως και σε συγχορήγηση με ΑΜΕΑ ή ΑΥΑ. Μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν μείωση της υπερτροφίας και βελτίωση της δυσλειτουργίας της αριστερής κοιλίας, όπως και μείωση της πρωτεϊνουρίας και αναστολή της φλεγμονώδους διαδικασίας στο νεφρικό παρέγχυμα (μείωση του αριθμού των μακροφάγων). 61 Πιο συγκεκριμένα με τη μελέτη ALOFT (Aliskiren Observation of heart Failure Treatment) διερευνήθηκε το πιθανό κλινικό όφελος από την προσθήκη αλισκιρένης ή εικονικού φαρμάκου στην κλασική θεραπευτική αγωγή ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια. Η χορήγηση αλισκιρένης οδήγησε σε ελάττωση, σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο (placebo), το εγκεφαλικό νατριουρητικό πεπτίδιο (brain natriuretic peptide, BNP) και την πρόδρομη μορφή του NT-proBNP, που αποτελούν δείκτες υπερτροφίας της αριστερής κοιλίας, όπως επίσης και την αλδοστερόνη ούρων και τη δραστικότητα ρενίνης πλάσματος. 62 Συγκριτικές μελέτες έδειξαν ότι η προστατευτική δράση της αλισκιρένης στα όργανα στόχους είναι παρόμοια με αυτή των ΑΜΕΑ και ΑΥΑ. Η ερευνητική ομάδα του Grandman σε μία μελέτη που διεξήγαγε και στην οποία συμμετείχαν 652 υπερτασικά άτομα σύγκρινε τη δράση του φαρμακευτικού μορίου ιρμπεσαρτάνη με αυτή της αλισκιρένης. Οι ασθενείς πήραν ημερήσιες δόσεις των 150 mg, 300 mg, 600 mg αλισκιρένης, 150 mg ιρμπεσαρτάνης ή εικονικό φάρμακο. Σε μικρότερες δόσεις των 600 mg δεν παρατηρήθηκαν παρενέργειες στη χορήγηση της αλισκιρένης. Μόνο όταν η δόση αυξήθηκε στα 600 mg παρουσιάστηκε διάρροια σε ένα ποσοστό της τάξεως των 6.9%. 77 Εκτενείς μελέτες, που βρίσκονται ήδη σε εξέλιξη σε αρρώστους με υπερτροφία της αριστερής κοιλίας, καρδιακή ανεπάρκεια, διαβητική νεφροπάθεια κλπ, θα καθορίσουν την τελική θέση της ελκυστικής αυτής κατηγορίας φαρμάκων στην αντιμετώπιση της υπέρτασης και καρδιαγγειακών νόσων. 61 Κάποια συμπεράσματα για τους αναστολείς ρενίνης από τις έρευνες που έχουν διεξαχθεί ως σήμερα είναι τα εξής: Σε σύγκριση με τους ΑΜΕΑ, οι αναστολείς ρενίνης έχουν γενικά λιγότερες παρενέργειες 78,79, αλλά μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματικοί στη μείωση της πίεσης Είναι δυνατό να χορηγηθούν σε συνδυαστική θεραπεία με φάρμακα που οδηγούν σε αύξηση της δράσης της ρενίνης του πλάσματος (διουρητικά, ΑΜΕΑ, ΑΥΑ). 60

Είναι περισσότερο αποτελεσματικοί σε νεαρά και λευκά άτομα, τα οποία έχουν ένα περισσότερο ενεργό ΣΡΑΑ. Μπορεί να είναι χρήσιμοι σε ασθενείς στους οποίους δεν είναι δυνατό να χορηγηθούν ΑΜΕΑ για την πρόληψη καρδιαγγειακών ασθενειών. Όπως και οι ΑΜΕΑ, οι αναστολείς ρενίνης λειτουργούν ως αγγειοδιασταλτικές ουσίες και βελτιώνουν την ελαστικότητα των μεγάλων αρτηριών. Συχνά προσφέρουν επιπρόσθετη προστασία στους ασθενείς με καρδιαγγειακή ασθένεια και συνεπακόλουθη νεφρική δυσλειτουργία. Έχουν περίπου τις ίδιες αντενδείξεις με τους ΑΜΕΑ και τους ΑΥΑ. Η αλισκιρένη πήρε την πρώτη της έγκριση από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των ΗΠΑ το Μάρτιο του 2007, με την εμπορική ονομασία Tecturna. Η Ευρωπαϊκή επιτροπή ενέκρινε επίσης την αλισκιρένη ως μονοθεραπεία ή ως συνδυασμό με άλλα αντιυπερτασικά, με βάση τα στοιχεία από περισσότερους από 7.800 ασθενείς σε 44 κλινικές μελέτες. 80 61

62

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΛΙΠΙΔOΜΙΚΗ (LIPIDOMICS) ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ 63

64

5.1 Εισαγωγή στις βιολογικές μεμβράνες και φαρμακευτική έρευνα Οι βιολογικές μεμβράνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ζωής. Για το λόγο αυτό οι βιολόγοι, βιοχημικοί, βιοφυσικοί όπως και φαρμακοχημικοί, φαρμακολόγοι και γιατροί διεξάγουν βασική έρευνα για να κατανοήσουν τα φαινόμενα στα οποία εμπλέκονται οι βιολογικές μεμβράνες. Οι φαρμακοχημικοί μελετούν τις βιολογικές μεμβράνες ως στόχο για την ανάπτυξη καινοτόμων φαρμακευτικών μορίων (Σχήμα 5.1). σάκχαρο πρωτεΐνη πρωτεϊνικό κανάλι λιπίδια διαμεμβρανική πρωτεΐνη Σχήμα 5.1: Βιολογική μεμβράνη Δομικά οι μεμβράνες αποτελούν πολύπλοκα υγρά κρυσταλλικά συστήματα με στερεές περιοχές (domains) που περιέχουν κυρίως φωσφολιπίδια. Τα φωσφολιπίδια αυτά σχηματίζουν λιπιδικές διπλοστιβάδες στην οποία άλλα βιομόρια είναι ενσωματωμένα όπως πρωτεΐνες και χοληστερόλη. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες εκτελούν σημαντικές λειτουργίες στους ζωντανούς οργανισμούς όπως είναι η επαγωγή χημικών αντιδράσεων και πολλές βιοφυσικές διεργασίες. Με την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες παίζουν πρωτεύοντα ρόλο στον έλεγχο των κυτταρικών διεργασιών, στη φαρμακευτική ανακάλυψη και ανάπτυξη, το ενδιαφέρον των ερευνητών εστιάστηκε στο παρελθόν στην πρόσδεση του προσδέτη (φαρμάκου) στο μοριακό στόχο (πρωτεϊνικός υποδοχέας). Το αποτέλεσμα αυτής της υπερτίμησης του ρόλου των πρωτεϊνών στις βιολογικές διεργασίες, ήταν ο ρόλος του λιπιδικού τμήματος να υποτιμηθεί. Αυτό 65

συνέβηκε επίσης, επειδή το λιπιδικό τμήμα θεωρήθηκε ως ένα αδρανές δομικό στρώμα το οποίο περιβάλλει το πρωτεϊνικό και δρα με παθητικό τρόπο. Τα σύγχρονα δεδομένα ολοένα και προσδίδουν ένα δυναμικό ρόλο στα μεμβρανικά λιπίδια. Είναι γνωστό πια ότι τα μεμβρανικά λιπίδια εμπλέκονται στις χρήσιμες κυτταρικές λειτουργίες, οι οποίες δικαιολογούν την παρουσία διαφόρων τύπων φωσφολιπιδίων. Τα αυξανόμενα ερευνητικά δεδομένα συνηγορούν για το κεντρικό ρόλο του λιπιδικού στρώματος σε μυριάδες κυτταρικές διεργασίες αποδεικνύοντας ότι τα λιπίδια δεν είναι μόνο δομικά στοιχεία και πηγές μεταβολικής ενέργειας. Στην πραγματικότητα, τα λιπίδια είναι ουσιώδη κυτταρικά συστατικά τα οποία έχουν πολλαπλούς και διακριτούς ρόλους στις κυτταρικές και μεταβολικές λειτουργίες. Τα λιπίδια είναι τώρα γνωστό ότι δεν αποτελούν μόνο το φυσικό υπόστρωμα των μεμβρανικών πρωτεϊνών και το φράγμα που απομονώνει και προσδιορίζει τα κύτταρα και οργανίδια, αλλά συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με τον κυτταρικό φραγμό και ελέγχουν την κατανομή και τοπογραφική θέση των περιφερικών πρωτεϊνών στις μεμβρανικές περιοχές όπου μπορούν να αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες που λειτουργούν ως σηματοδότες. Επιπρόσθετα, οι μεταβολές της λιπιδικής σύνθεσης στις μεμβράνες εμφανίζεται να σχετίζεται με την ανάπτυξη διαφόρων ασθενειών. Η συνεχής αναγνώριση του σημαντικού ρόλου των λιπιδίων, τα καθιστά στόχους για τα φαρμακευτικά μόρια των οποίων η φαρμακολογική δράση θα σχετίζεται με την τροποποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των μεμβρανών. Εφόσον η δράση των μεμβρανικών πρωτεϊνών ελέγχεται από τα λιπίδια, είναι αντιληπτό ότι φάρμακα τα οποία είναι ικανά να επηρεάζουν τη λιπιδική οργάνωση θα μπορούσαν να τροποποιήσουν τις δράσεις των μεμβρανικών πρωτεϊνών και το μηχανισμό σηματοδότησης. Επομένως, οι αλληλεπιδράσεις φαρμακευτικών μορίων με μεμβράνες αποτελούν ένα ευρύ και πολύπλοκο πεδίο της φαρμακευτικής Χημείας και μπορεί να εμπλέκει μελέτες φαρμάκων τα οποία είναι ικανά να επηρεάζουν την πρωτεϊνική λειτουργία άμεσα ή έμμεσα με τροποποίηση του λιπιδικού υποστρώματος. Ο πρωτεϊνικός έλεγχος ο οποίος επιτυγχάνεται λόγω των αλληλεπιδράσεων των φαρμακευτικών μορίων με τις μεμβράνες μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στη κυτταρική σηματοδότηση και έκφραση γονιδίων τα οποία θα μπορούσαν να αναστρέψουν την παθολογική κατάσταση (Σχήμα 5.2). 81,82 66

Σχήμα 5.2: Η δράση των λιπιδίων συμπλέκεται με αυτή των πρωτεϊνών για να παραχθεί ένα βιολογικό αποτέλεσμα. 5.2 Δομή μεμβρανών και μοντέλα που χρησιμοποιούνται για τις μελέτες αλληλεπιδράσεων τους με φαρμακευτικά μόρια Δομή μεμβρανών: Τα κύρια συστατικά των μεμβρανών είναι: α. Τα τρία είδη των λιπιδίων:φωσφολιπίδια, γλυκολιπίδια και στερόλες β. Πρωτεΐνες γ. Σάκχαρα που εντοπίζονται στην εξωτερική επιφάνεια και είναι ενωμένα με λιπίδια (γλυκολιπίδια) ή πρωτεΐνες (γλυκοπρωτεΐνες) (Σχήμα 5.3). Από τις στερόλες, η χοληστερόλη είναι το κύριο συστατικό των ευκαρυωτικών μεμβρανών και επηρεάζει ισχυρά τη μοριακή οργάνωσή τους όπως επίσης τη λειτουργία πολλών μεμβρανικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένων των μεμβρανικών μεταφορέων και της μεμβρανικής μεταφοράς συνολικά. Τα πρωτεϊνικά τμήματα ποικίλουν ανάλογα με τη λειτουργία που εκτελούν. 67

Σχήμα 5.3: (άνω) Αριστερά παριστάνεται η χοληστερόλη σε χωροπληρωτικό μοντέλο και πλέγμα ηλεκτρονικής πυκνότητας. Δεξιά παριστάνεται μία φωσφατιδυλοχολίνη. (κάτω) Αριστερά παριστάνεται ένα γλυκολιπίδιο και δεξιά ένα συζευγμένος με G- πρωτεΐνη υποδοχέας. Το ποσοστό της χοληστερόλης γλυκολιπιδίων, φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης σε διαφορετικούς τύπους μεμβράνης παρουσιάζεται στον πίνακα 5.1. 83 Τύπος Μεμβράνης Ποσοστό % λιπιδίων (κατά βάρος) Γλυκολιπίδια Φωσφολιπίδια Χοληστερόλη Ανθρ.Ερυθροκύτταρα 11 61 22 Μυελίνη 28 41 22 Μιτοχόνδρια ήπατος < 5 80 4 (ποντίκι) Ενδοπλασματικό < 5 75 8 δίκτυο Πρωτοπλάστες Ίχνη 80 90 0 βακτηρίων Φυτικοί χλωροπλάστες 80 12 0 Πίνακας 5.1: Το ποσοστό γλυκολιπιδίων, φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης σε διαφορετικούς τύπους της μεμβράνης. 68

Η οργάνωση των βιομεμβρανών έχει τα τελευταία χρόνια αναθεωρηθεί και το ρευστό μωσαϊκό μοντέλο των Singer και Nicholson που ανέπτυξαν το 1972 έχει τροποποιηθεί. Στις σύγχρονες απόψεις η βιομεμβράνη θεωρείται ότι αποτελείται από στερεές περιοχές με καθορισμένη δομή και λειτουργία και ρευστά μεμβρανικά λιπίδια. Αυτές οι περιοχές έχουν διακριτά φυσικά χαρακτηριστικά και σύνθεση η οποία εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις λιπιδίων/λιπιδίων και λιπιδίων/πρωτεϊνών ή μπορεί να είναι εμπλουτισμένες με χοληστερόλη στις οποίες να συσσωρεύονται πρωτεΐνες (rafts). Από την παραπάνω συζήτηση κατανοείται η δομική πολυπλοκότητα των μεμβρανών. Αν προστεθεί το γεγονός της ύπαρξης διαφόρων μεμβρανών στον οργανισμό όπου η σύσταση τους ποικίλει, η πολυπλοκότητα τους αυξάνεται περαιτέρω. Όπως ήδη αναφέραμε η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συστατικών της βιολογικής μεμβράνης μόλις πρόσφατα άρχισε να κατανοείται. Προς απλοποίηση της δομής της μεμβράνης αυτή μπορεί να θεωρηθεί ως μία λιπιδική διπλοστιβάδα στην οποία είναι ενσωματωμένες πρωτεΐνες. Μοντέλα μεμβρανών: Για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων φαρμακευτικών μορίων με τις βιομεμβράνες είναι ανάγκη να χρησιμοποιηθούν απλούστερα συστήματα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα μεμβρανών τα οποία αποτελούνται από λίγα συστατικά και τα οποία μπορούν να παρέχουν ανεκτίμητη εμβάθυνση στην κατανόηση των ιδιοτήτων σύμπλοκων βιολογικών μεμβρανών. Αυτά τα μοντέλα μπορεί να είναι: μικυλλιακά, λιποσωμιακά, επιστρωμένες λιπιδικές διπλοστιβάδες ή μονοστιβάδες. Στην περίπτωση των μελετών μας χρησιμοποιήθηκαν λιπιδικές διπλοστιβάδες οι οποίες περιβάλλονταν από υδάτινο στρώμα και τα οποία καλούνται λιποσώματα. Οι διπλοστιβάδες αυτές ήταν πολυκυστιδικές και είχαν ανομοιογενές σχήμα (multilamellar vesicles-mlvs). Σε διάφορες άλλες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί και μονοκυστιδικές (unilamellar vesicles-ulvs) οι οποίες δημιουργούνται με χρήση υπέρηχων (sonication) ή εξώθηση σε πολυκαρβονικές μεμβράνες. Επίσης σε άλλες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί μικυλλιακές μονοστιβάδες (micelles). Οι μονοκυστιδικές μεμβράνες χωρίζονται σε μικρές με διάμετρο μικρότερο των 100 nm (small unilamellar vesicles SUVs), μεγάλες (large unilamellar vesicles- LUVs) και γιγάντιες (giant unilamellar vesicles-guvs). Οι μεγάλες μονοκυστιδικές μεμβράνες μιμούνται την κυτταρική αρχιτεκτονική. Η λιπιδική διπλοστιβάδα όπως είναι γνωστό είναι κλειστή σε όγκο ο οποίος διαχωρίζεται από το εξωτερικό διάλυμα. Οι μονοκυστιδικές όπως και οι πολυκυστιδικές μεμβράνες χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με φασματοσκοπικές τεχνικές για να μελετηθεί η διαπερατότητα και η 69

σύνδεση των φαρμάκων και να συσχετισθούν τα βιοφυσικά δεδομένα με τις φαρμακευτικές δράσεις των φαρμάκων. 81,82 Οι μονοστιβάδες μιμούνται μόνο τη μία στιβάδα της μεμβράνης. Επίπεδα συστήματα μεμβρανών (planar membranes) χρησιμοποιούνται για να μιμούνται την πλευρική οργάνωση των κυτταρικών επιφανειών. Σχήμα 5.4:(άνω) Τρισδιάστατη απεικόνιση λιπιδικής διπλοστιβάδας και μονοκυστιδικών λιποσωμάτων. Τα μονοκυστιδικά λιποσώματα εμφανίζονται και σε δισδιάστατη απεικόνιση. (μέση) Μικύλια σε κανονική και ανεστραμμένη μορφή. (κάτω) Είδη λιποσωμάτων. 70

5.3 Παραδείγματα χρήσεων φυσικοχημικών μεθόδων σε μελέτες φαρμακευτικών μορίων με μεμβράνες Α.Χρήση μοντέλων πολυκυστιδικών μεμβρανών Μέθοδος NMR στερεής και υγρής κατάστασης (το δείγμα μπορεί να είναι στατικό ή περιστρεφόμενο στο μαγνητικό πεδίο (π.χ. 1 Η, 2 Η, 13 C, 14 N κλπ) Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης 71 Πληροφορίες Δομή, δυναμική και προσανατολισμός φαρμάκων καθώς και τοπογραφικός εντοπισμός Επεξήγηση δράσης ή δραστικότητας Θερμικές μεταβολές και αλλαγές στη συνεργατικότητα των μεμβρανών. Δυναμική, οργάνωση και μεταβολές στις φάσεις μετασχηματισμών των λιπιδίων των μεμβρανών. Φασματοσκοπία Raman και IR Αλλαγές στις φάσεις και μέτρηση ποσοτικών μεταβολών gauche:trans. Αλληλοεπιχώρηση των αλκυλικών αλυσίδων (interdigitation). Β. Χρήση μοντέλων μονοκυστιδικών μεμβρανών Μέθοδος Πληροφορίες Κυκλοϊκός διχρωϊσμός Δευτεροταγείς δομές ενζύμων και μελέτες (circular dichroism-cd) των μεταβολών στις διαμορφώσεις των Συντονισμός ηλεκτρονικής ιδιοπεριστροφής (electron spin resonance-esr) Τεχνικές φθορισμού (fluorescence leakage techniques) Εκπομπή των τμημάτων τρυπτοφάνης σε ενζυμικές ακολουθίες (φυσικά ή τεχνητά ενσωματωμένες) Φθορισμομετρικός συντονισμός με μεταφορά ενέργειας (Fluorescence Resonance Energy Transfer-FRET) πρωτεϊνών που επάγονται από φάρμακα. Χρήση επισημασμένων αισθητήρων που προσδένονται ομοιοπολικά σε διάφορα τμήματα των λιπιδικών αλκυλικών αλυσίδων και σε διάφορες θέσεις. Βοηθούν στη μελέτη του τοπογραφικού εντοπισμού των φαρμάκων και της τροποποίησης που προκαλούν στη ρευστότητα των λιπιδίων και λιπιδικής κίνησης. Γίνεται χρήση φθορισμομετρικών χρωμάτων (dyes) φυσικών ή τεχνητών προσδεδεμένων στα λιπίδια. Μελετάται ο σχηματισμός πόρων και η ολική καταστροφή της μεμβράνης. Τέτοιες μεταβολές έχουν ως συνέπεια την αλλαγή της φθορισμομετρικής εκπομπής. Μελέτη βάθους εισαγωγής πεπτιδίων Μεταφορά ενέργειας από ένα δότη φθορισμομετρικό σε ένα δέκτη μέσω ενός μη ακτινοβολούμενου μηχανισμού. Αυτό συμβαίνει όταν είναι σε μικρή απόσταση μεταξύ τους και μπορούν να μετρηθούν ποσοτικά.

Γ.Χρήση μοντέλων μονοστιβαδικών μεμβρανών Μέθοδος Πληροφορίες Φίλμς Langmuir Πλευρική οργάνωση των κυτταρικών επιφανειών Ισόθερμες πίεσης-εμβαδού επιτρέπουν τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων φαρμάκων με λιπίδια (π.χ. φάσεις μετασχηματισμού μονοστιβάδων και ρευστότητά τους). Μικροσκοπία ατομικής Φθορισμομετριας (Atomic fluorescence microscopy-afm) Μεταβολές στη μορφολογία των λιπιδίων στη μεσεπιφάνεια αέρα-νερού. Κρυογενική ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης και μετάδοσης (Cryogenic scanning and transmission electron microscopy-cryo-sem and cryo-tem). Περίθλαση νετρονίων (neutron scattering) και περίθλαση ακτίνων-χ με αμυχές στην προσπίπτουσα (grazing incidence x-ray scattering GIXD.) Μονοστιβάδες με στερεά υποστηρίγματα (solid supports) Langmuir-Blodget (LB) φίλμς Langmuir-Shaefer φίλμς. Διπλοστιβάδες με στερεά υποστηρίγματα όπως είναι οι μαύρες λιπιδικές μεμβράνες BLM (black lipid membranes). Χαρακτηρισμός της μοριακής δομής της μεμβράνης και αλληλεπιδράσεις φαρμάκων με τη μεμβράνη. Μελέτη βιοφυσικών πτυχών μεμβράνης όπως πρόκληση τάξεως (order) ή κλήση στις αλκυλικές αλυσίδες. Δημοφιλή βιομιμητικά μεμβρανικά συστήματα τα οποία επιτρέπουν την εξέταση πεπτιδικών αλληλεπιδράσεων στη μεσοεπιφάνεια λιπιδίου/νερού και την περιορισμένη κίνηση των λιπιδίων λόγω της ακινητοποίησης της επιφάνειας. Αποδυναμωμένη ανάκλαση φασματοσκοπίας υπερύθρου όπου γίνεται χρήση μετασχηματισμού Fourier (Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy-atr-ftir) Υποστηριγμένες λιπιδικές διπλοστιβάδες με μικροχάντρες (microbeads) και νανουλικά. Καμπύλες λιπιδικές μεμβράνες με υψηλού βαθμού δομική ολοκλήρωση. Μέτρηση δευτεροταγών δομών και προσανατολισμών πεπτιδίων και φαρμάκων σε λιπιδικά περιβάλλοντα. Μελέτη ιδιοτήτων μεμβρανών και βιολογικών λειτουργιών όπως η ρευστότητα και οι αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες. 5.4 Μελέτη των αλληλεπιδράσεων φαρμακευτικών μορίων με τις μεμβράνες και η σχέση τους με τη φαρμακευτική Χημεία Η φαρμακευτική βιομηχανία βρίσκεται σε μία διαρκή αυξανόμενη οικονομική πίεση να επιτύχει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στην ανακάλυψη φαρμάκων. Για να αποφύγει ισχυρότερες επενδύσεις απαιτείται ραγδαία ταυτοποίηση των δυνάμει προβλημάτων που σχετίζονται με τη χορήγηση και μεταφορά της υποψήφιας ένωσης. Γι αυτό αναπτύχθηκαν δοκιμές για να εξακριβωθεί η συμπεριφορά του φαρμάκου σε ένα φράγμα. Έτσι, ο φαρμακοχημικός θα μπορέσει 72

να κατανοήσει πως θα τροποποιηθεί μία δομή ώστε οι ιδιότητες της να βελτιστοποιήσουν την περατότητα της μέσα από το φράγμα. Γενικά, μία φαρμακευτική ένωση απαντά πολλά φράγματα στη διαδρομή της προς το θεραπευτικό στόχο. Το φράγμα μπορεί να είναι φυσικό (μεμβράνη), φυσικοχημικό (διαλυτότητα, ph) ή βιοχημικό (μεταβολισμός). Κάθε φράγμα ελαττώνει την ποσότητα της ουσίας η οποία φθάνει στο θεραπευτικό στόχο. Ο ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων πρέπει να λάβει υπόψη ότι στο εσωτερικό του σώματος υπάρχουν αμοιβαίες αλληλεπιδράσεις μεταξύ φαρμάκων και μεμβρανικών φραγμάτων. Επομένως πρέπει να αναγνωρισθεί ότι τα χαρακτηριστικά των φαρμάκων μπορεί να επηρεάζουν το βαθμό εισδοχής και τον εντοπισμό τους στις μεμβράνες. Επιπρόσθετα, οι αλληλεπιδράσεις των φαρμακευτικών μορίων ποικίλλουν. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις συσχετίζονται με περαιτέρω αλλαγές όπως η διαπερατότητα της μεμβράνης, με μεταβολές στο κυτταρικό σχήμα όπως είναι η μεμβρανική τήξη και τελικά είναι υπεύθυνες για τις σοβαρές μεταβολές στην εκτέλεση των λειτουργιών του κυττάρου. Επίσης, συσχετίζονται με τη λειτουργία των πρωτεϊνών του διαμεμβρανικού υποδοχέα και πρωτεϊνών υπεύθυνων για τη μετάδοση σήματος οι οποίες τελικά σχετίζονται με το μηχανισμό σε μοριακό επίπεδο της δράσης ή των παρενεργειών του φαρμάκου (Σχήμα 5.5). ΦΑΡΜΑΚΟ (pka, διαλυτότητα, λιποφιλικότητα) ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΣΤΗ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΞΙΚΑ ΔΟΜΗ, ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΦΟΡΤΙΟ, ΡΕΥΣΤΟΤΗΤΑ Σχήμα 5.5: Δράση φαρμακευτικών μορίων στις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Η δομή της μεμβράνης επηρεάζει επίσης τη δράση των φαρμάκων γιατί αυτή εξαρτάται από τη φυσιολογική της λειτουργία. Μεμβράνες οι οποίες έχουν 73

υψηλότερη μεταβολική δράση περιέχουν υψηλότερο ποσοστό πρωτεΐνης. Επίσης, η δομή της μεμβράνης εξαρτάται από την κατάσταση της σε μία ασθένεια. Για παράδειγμα, μία ασθένεια επηρεάζει τη δομή της μεμβράνης, τη σύνθεση και το επιφανειακό της φορτίο. Αυτές οι δομικές και βιοφυσικές χημικές πτυχές επηρεάζουν τον τρόπο που τα φάρμακα και άλλες ενώσεις διαπερνούν ή αλληλεπιδρούν με τις μεμβράνες και τελικά τροποποιούν τη φαρμακολογική τους δράση και παρενέργειες. Τα φάρμακα διαχέονται παθητικά στις μεμβράνες ή μέσω διευκόλυνσης τους με σύνδεση σε μία μεμβρανική πρωτεΐνη ή σε ένα μικρό μόριο μεταφορέα. Αν και οι μηχανισμοί διευκόλυνσης του φαρμάκου να διαπεράσει το φράγμα είναι ιδιαίτερα σημαντικοί για την κανονική λειτουργία του κυττάρου συχνά δεν είναι γνωστοί. Η διασαφήνιση του μηχανισμού που επηρεάζει την παθητική διάχυση των ενώσεων που διαπερνούν τις λιπιδικές διπλοστιβάδες είναι μέγιστης σπουδαιότητας στην ανάπτυξη φαρμάκων. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες όπως pka και logp είναι θεμελειώδη χαρακτηριστικά τα οποία θα πρέπει να ληφθούν υπόψη όταν σχεδιάζονται φαρμακευτικά μόρια για θεραπευτικούς σκοπούς. Ανεπτύχθησαν μοντέλα όπου προβλέπεται η απορρόφηση in vivo των φαρμάκων σε ανθρώπινες επιθηλειακές κυτταρικές σειρές (Caco-2). Έτσι μπορούν να ταυτοποιηθούν φάρμακα τα οποία δε θα απορροφηθούν και να αποφευχθεί η σύνθεσή τους. Άλλα συστήματα που αναπτύχθηκαν για τον ίδιο σκοπό είναι: Φυσικοχημικό σύστημα υψηλής απόδοσης σάρωσης (physicochemical highthroughput screening system-pc-htcs) με χρήση παράλληλου πειράματος διαπερατότητας τεχνητής μεμβράνης (parallel artificial membrane permeation assay-pampa) Συντονισμός επιφανειακού πλασμόν (surface plasmon resonance-spr) Βιοχρωματογραφία (biochromatography) Ακινητοποιημένη τεχνητά μεμβρανική χρωματογραφία (immobilized artificial membrane chromatography-iam) 5.5 Μοριακή βάση πρόσδεσης φαρμάκων σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς Υπάρχουν τρεις βασικοί λόγοι που στηρίζουν ότι ένα φαρμακευτικό μόριο μπορεί να προσεγγίσει το ενεργό κέντρο όταν πρώτα εισέλθει στις λιποειδείς διπλοστιβάδες. Ο πρώτος λόγος είναι ότι τα φαρμακευτικά μόρια είναι συχνά λιπόφιλες ή αμφίφιλες ενώσεις, οπότε θα προτιμούν να κατανέμονται στο λιπόφιλο τμήμα ή ενδιάμεσης πολικότητας τμήμα της λιποειδούς διπλοστιβάδας. Ο δεύτερος λόγος είναι ότι η διάχυση ενός φαρμάκου στη μεμβράνη περιορίζεται σε δύο διαστάσεις. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να είναι σημαίνουσας βιολογικής σημασίας. 74

Ένας μηχανισμός διάχυσης που επιτελείται σε δύο διαστάσεις αυξάνει την πιθανότητα προσέγγισης στην πρωτεΐνη ή υποδοχέα ή κανάλι στόχο περίπου 1000 φορές. 84 Ο τρίτος λόγος είναι ότι το εμβαδό της μεμβράνης είναι πολύ μεγαλύτερο από αυτό μίας εξειδικευμένης πρωτεΐνης. Επομένως, μία μη ειδική δέσμευση του φαρμακευτικού μορίου στη μεμβράνη θα φέρει το μόριο σε χωρική εγγύτητα με την πρωτεΐνη στόχο. Οι διάφοροι μηχανισμοί δράσης ενός φαρμάκου παριστάνονται στο παρακάτω σχήμα. Σχήμα 5.6: Στο σχήμα παριστάνονται οι διάφορες περιπτώσεις αλληλεπίδρασης φαρμακευτικών μορίων στο επίπεδο μεμβρανών. Στο άνω σχήμα το φαρμακευτικό μόριο αλληλεπιδρά κατευθείαν με τον υποδοχέα. Η περίπτωση αυτή μπορεί να παρατηρηθεί κυρίως όταν το φαρμακευτικό μόριο αλληλεπιδρά με το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και όχι το ενδοκυττάριο όπως είναι στην περίπτωση του ΑΤ 1 υποδοχέα. Στο μεσαίο σχήμα το φάρμακο αλληλεπιδρά με το λιπιδικό τμήμα της διπλοστιβάδας. Στο κάτω σχήμα παρουσιάζεται ο μηχανισμός δύο σταδίων. Το φαρμακευτικό μόριο εισέρχεται στο εσωτερικό της λιπιδικής διπλοστιβάδας και με πλευρική διάχυση προσεγγίζει και προσδένεται στον υποδοχέα. (Την εικόνα επιμελήθηκε ο Δρ. Κ. Παπακωνσταντίνου). Πρόσφατα ο μηχανισμός άμεσης πρόσδεσης του φαρμακευτικού μορίου στον υποδοχέα μελετήθηκε με πειράματα Μοριακής Δυναμικής σε β-αναστολείς και ένα β-αγωνιστή για να διαπιστωθεί εάν αυτοί μπορούν να δεσμευθούν στους β 1 - και β 2-75

αδρενεργικούς υποδοχείς. Τα μόρια αυτά συνάντησαν δύο εμπόδια στην πορεία τους για να φθάσουν στο ενεργό κέντρο του υποδοχέα. Το ένα εμπόδιο ήταν η αφυδάτωση η οποία συνέβαινε αρκετά μακριά από το ενεργό κέντρο του υποδοχέα και το δεύτερο εμπόδιο οφειλόταν στη γεωμετρία του υποδοχέα πλησίον του ενεργού κέντρου. 85 Ο Hurst και οι συνεργάτες του πρότειναν ότι για τα κανναβιδοειδή μόρια ως πολύ λιπόφοβα προτιμούν το μηχανισμό δύο βημάτων. Τα κανναβιδοειδή εισέρχονται στις λιπιδικές διπλοστιβάδες και με πλευρική διάχυση προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο. 86 Ο Ζουμπουλάκης και οι συνεργάτες του πρότειναν τον ίδιο μηχανισμό για τα αμφίφιλα μόρια ΑΤ 1 ανταγωνιστές (σχήμα 5.7). Σχήμα 5.7: (άνω σχήμα) Τρόπος δράσης ΑΤ 1 ανταγωνιστών στον ΑΤ 1 υποδοχέα. Στο άνω σχήμα αναφέρονται τα δύο βήματα τα οποία θα πρέπει να ακολουθήσουν οι ΑΤ 1 ανταγωνιστές ώστε να προσδέσουν στο ενεργό κέντρο. Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την εισχώρηση τους στις λιπιδικές διπλοστιβάδες. 87-89 Εκεί διαχέονται πλευρικά προς το ενεργό κέντρο (κάτω σχήμα) 90 όπου μέσω αμφοτερικών αλληλεπιδράσεων ενεργοποιούν τον υποδοχέα και τελικά αναστέλλουν τη δράση της αγγειοδιασταλτικής ορμόνης αγγειοτασίνης ΙΙ. 76

Με πειράματα Μοριακής Δυναμικής οι ίδιοι συγγραφείς πρότειναν ότι τα μόρια αυτά μπορούν να εισδύουν στις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Απομένει να εκτελεστούν κατάλληλα πειράματα για να διευκρινιστεί ποιος από τους δύο πιθανούς μηχανισμούς εκφράζει τον πραγματικό, στη δράση φαρμακευτικών μορίων που αλληλεπιδρούν στους συζευγμένους υποδοχείς με τη G-πρωτεϊνη. Δε θα πρέπει να αποκλειστεί και η περίπτωση ότι και οι δύο μηχανισμοί λειτουργούν παράλληλα. 5.6 Ανάπτυξη συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων Η μελέτη των αλληλεπιδράσεων φαρμάκων με μεμβράνες είναι σημαντική και από μία άλλη άποψη. Τα λιποσώματα χρησιμοποιούνται και ως συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Η βελτιστοποίηση της λιπιδικής σύνθεσης, του λιποσωμιακού μεγέθους, της ρευστότητας της μεμβράνης, του επιφανειακού φορτίου, της σταθεροτητας είναι δυνατό να επεκτείνει το θεραπευτικό δείκτη των λιποσωμιακών μεταφορέων σε σύγκριση με τα συμβατικά σκευάσματα (formulations). Στην πραγματικότητα, η αποτελεσματικότητα της βιοδιαθεσιμότητας κατά τη μεταφορά του φαρμάκου και η υψηλή εκλεκτικότητα εξαρτώνται από τη διάχυση του ενσωματωμένου φαρμάκου δια μέσου των λιποσωμιακών τοιχωμάτων τα οποία προδιορίζονται με βελτιστοποίηση του λιποσωμιακού σκευάσματος. Με το σκεπτικό αυτό η αλληλεπίδραση του συστήματος μεταφοράς του φαρμάκου με τη μεμβράνη πρέπει να είναι το πρώτο βήμα μελέτης για να κατανοηθούν οι βιοφυσικές αλληλεπιδράσεις των νανομεταφορέων με τις κυτταρικές μεμβράνες ώστε να αναπτυχθεί ένα αποτελεσματικό σύστημα μεταφοράς φαρμάκων (ή πρωτεΐνης ή γονιδίου). Επισης είναι σημαντικό να είναι γνωστά οποιαδήποτε χαρακτηριστικά νανοϋλικών που μπορούν να προκαλέσουν τοξικά αποτελέσματα. 5.7 Η κατανόηση θεραπευτικών και τοξικών δράσεων των φαρμάκων Μελέτες σε κυτταροκαλιέργειες και in vivo έδειξαν ότι οι αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-λιπιδίου παίζουν σημαντικό ρόλο στις φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες και επηρεάζουν τη μεταφορά τους, κατανομή και συσσώρευση (accumulation). Τελικά οι αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-μεμβράνης ελέγχουν τις δράσεις τους γιατί συχνά τα αποτελέσματα οφείλονται από τον επηρεασμό της κυτταρικής λειτουργίας. Τα φάρμακα όπως είδαμε επιδρούν στους μεμβρανικούς υποδοχείς. Επίσης επιδρούν στη δράση των συστημάτων μεταφοράς. Τα φάρμακα μπορούν επίσης να επιδρούν κατευθείας με ενδοκυτταρικές μεταβολικές διεργασίες, για παράδειγμα με αναστολή 77

ή ενεργοποίηση ενός ενζύμου. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, οι δράσεις των φαρμάκων μπορεί να είναι αποτέλεσμα άμεσης αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς, τα ένζυμα μεταφοράς ή με διαταραχή των μεμβρανών οδηγώντας σε αλλαγές στη μεμβρανική κυρτότητα (curvature) ή τη φάση διαχωρισμού και επομένως στις μεταβολές της πρωτεϊνικής διαμόρφωσης. Ανάλογα με τη σύνθεση της μεμβράνης και τη δομή των φαρμακευτικών μορίων η αλληλεπίδραση μπορεί να ευνοεί ή να παρεμποδίζει τη φαρμακευτική δράση ή τοξικότητα. Ευτυχώς, όπως έχει ήδη αναφερθεί οι περισσότερες διαταραχές που συμβαίνουν σε πολύπλοκες βιολογικές μεμβράνες με αλληλεπίδραση με φαρμακευτικά μόρια μπορούν να μελετηθούν και προσομοιωθούν in vitro και ποσοτικοποιηθούν με διαθέσιμες φυσικοχημικές τεχνικές και με χρήση μοντέλων τεχνητών μεμβρανών. Οι μεταβολές που συμβαίνουν κατά την αλληλεπίδραση ενός φαρμακευτικού μορίου και μίας μεμβράνης, μπορούν να διακρίθούν σε δύο κατηγορίες: Α)Μεταβολές στη δομή της μεμβράνης Αλλαγή στην διαμόρφωση των ακυλικών ομάδων (trans-gauche ισομερειώσεις) Αύξηση της μεμβρανικής επιφάνειας Αλλαγή στο πάχος της μεμβράνης Αλλαγή στη ρευστότητα και συνεργατικότητα Αλλαγή στην εφυδάτωση της πολικής κεφαλής Β)Μεταβολές στο φαρμακευτικό μόριο (διαμόρφωση, φυσικοχημικές ιδιότητες) Η βιολογική δράση του φαρμάκου εξαρτάται από τη διάχυση του στη μεμβράνη. Ουσιαστικά η μεμβράνη μέσω της επιτρεπόμενης διάχυσης, καθορίζει τη φαρμακολογική δράση. Κατά την είσοδο του μορίου στη μεμβράνη υπάρχει πιθανότητα να γίνουν αλλαγές στη διαμόρφωση με άμεσο αποτέλεσμα την επιτάχυνση ή επιβράδυνση της φαρμακολογικής δράσης. Από τα παραπάνω καθίσταται σαφές ότι τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες πρέπει να θεωρούνται ως συζευγμένες οντότητες (partners). Οι πρόσφατες εξελίξεις δημιούργησαν ένα νέο ερευνητικό πεδίο που ονομάσθηκε λιπιδομική (lipidomics) στο οποίο αναγνώριζεται ο ρόλος των λιπιδίων σε πολλές φυσιολογικές συνθήκες και μεταβολικές ασθένεις όπως η παχυσαρκία, αθηροσκλήρωση, προσβολή (stroke), υπέρταση και διαβήτης. 78

Παρατίθενται μερικά παραδείγματα για να καταστήσουν σαφή τα προλεγόμενα: (α) Η διαταραχή της λιπιδικής φάσης των κυτταρικών μεμβρανών από τροποποιητές (modulators) εμφανίζεται να είναι σημαντική στην ενδυνάμωση (potentiating) της αντικαρκινικής θεραπείας και των άλλων θεραπειών των οποίων η αποτελεσματικότητα επηρεάζεται από μηχανισμούς πολλαπλής φαρμακευτικής αντίστασης (multi drug resistance). (β) Η πρόσδεση των μεμβρανικών λιπιδίων μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές στη λειτουργία πρωτεϊνών όπως της φωσφολιπάσης Α 2, 5-λιποξυγoνάσης, οξειδάσης κυτοχρώματος c, λυσοσωμιακές φωσφολιπάσες, φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη ειδική φωσφολιπάση c, σφιγγομυελινάση και πρωτεϊνική κινάση c. (γ) Ένας από τους περισσότερο σπουδαίους φυσιολογικούς ρόλους της μεμβρανικής λιπιδικής σύνθεσης και δομής είναι η συμμετοχή στη κυτταρική σηματοδότηση. Τα μεμβρανικά λιπίδια συνεισφέρουν με διάφορους τρόπους στη σηματοδότηση. Αποτελούν ένα εκλεκτικό φραγμό στις υδρόφοβες ορμόνες και υδρόφιλα σηματοδοτικά μόρια. Είναι ικανά να ελέγχουν τη δράση των μεμβρανικών σηματοδοτικών πρωτεϊνών διατηρώντας καθορισμένη σύνθεση και ρευστότητα. Επηρεάζουν την αλληλεπίδραση των σηματοδοτών πρωτεϊνών διατηρώντας καθαρό αρνητικό επιφανειακό φορτίο στο εσωτερικό τμήμα της μεμβράνης. Αυτό επιτυγχάνεται κύρια από τη φωσφατιδυλοσερίνη και παρέχουν πολλούς από τους σπουδαίους μοριακούς κυτταρικούς σηματοδότες μέσω των φωσφολιπασών και λιπιδικών κινασών. (δ) Οι G πρωτεΐνες αποτελούν τους μοριακούς διακόπτες του οργανισμού. Αυτές μεταβιβάζουν το σήμα όταν έχουν δεσμεύσει τη GTP και σιγούν όταν δεσμεύσουν τη GDP. Οι GPCRs αποτελούν το 80% των γνωστών υποδοχέων για νευροδιαβιβαστές ορμόνες και νευροτροποποιητές και γύρω στο 5% των γονιδίων των ευκαρυωτικών οργανισμών. Η πιθανότητα να ελεχθεί η δραστικότητα των G-πρωτεϊνών μέσω τροποποίησης του λιπιδικού περιβάλλοντος έχει τελευταία χρησιμοποιηθεί για να αναπτυχθούν φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου, παχυσαρκίας, υπέρτασης κλπ. Όπως είναι γνωστό η ενδοκυτταρική G-πρωτεΐνη δρα ως μεταδότης και ελέγχει τη δράση των επενεργουσών (effector) πρωτεϊνών όπως π.χ. αδενυλικής κυκλάσης, γουανυλικής κυκλάσης, φωσφολιπάσης c, ιοντικών καναλιών κλπ. Για να δημιουργηθεί ένα απόθεμα G πρωτεϊνών γύρω από τους συζευγμένους G πρωτεϊνικούς υποδοχείς (GPCRs) είναι ανάγκη η συσσώρευση λιπιδίων που δε σχηματίζουν ελασματώδη (lamellar) φάση. Τέτοια λιπίδια είναι π.χ. η φωσφατιδυλοαιθυλαμίνη (PE), που οργανώνονται σε Ha (εξαγωνικές-hexagonal) φάσεις. Αυτές οι μη ελασματώδεις φάσεις βρέθηκε να αυξάνουν τη δέσμευση των ετεροτριμερών G πρωτεϊνών. Η διεργασία δέσμευσης των G πρωτεϊνών στους 79

GPCRs τερματίζεται όταν οι ελασματώδεις περιοχές (π.χ. λιπιδικά τμήματα-lipid rafts) προκαλούν μία ταχεία έξοδο των G πρωτεϊνών από το περιβάλλον του υποδοχέα. 81,82 Λιπιδικό περιβάλλον Πρόσδεμα+Υποδοχέας Ενεργοποίηση υποδοχέα και G-πρωτεΐνης Ενεργοποίηση αδενυλικής κυκλάσης, αύξηση camp και βιοχημική απόκριση Σχήμα 5.8: Το λιπιδικό περιβάλλον στη μεμβράνη ελέγχει τη βιοχημική απόκριση. 5.8 Ο σημαίνων ρόλος της χοληστερόλης Η χοληστερόλη (παράγραφος 5.2), η εργοστερόλη, η στιγμαστερόλη και οι σιτοστερόλη είναι στερόλες που απαντώνται σε διαφόρους τύπους μεμβρανών σε όλους τους ζωικούς και φυτικούς οργανισμούς (σχήμα 5.9). 91-93 Το γεγονός ότι αυτά τα τέσσερα μόρια έχουν παρεμφερή δομή και συναντώνται τόσο συχνά σε μεμβράνες, δείχνει ότι οι στερόλες έχουν σημαίνων ρόλο στη λειτουργία αυτών των μεμβρανών. Η χοληστερόλη για παράδειγμα η οποία βρίσκεται ανάμεσα στα μόρια των φωσφολιπιδίων των πλασματικών μεμβρανών των ζώων (σχήμα 5.10), θεωρείται ότι σταθεροποιεί τη μεμβράνη, μειώνοντας τη κινητικότητα των μεμβρανικών φωσφολιπιδίων. 93 Οι διαμοριακές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ των μορίων της χοληστερόλης και του νερού που βρίσκεται εντός και εκτός κυττάρου συμβάλλει στη ρευστή αλλά αδιάσπαστη δομή της μεμβράνης, και της προσδίδει λειτουργικότητα. Επιπλέον, έχει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη νευρικών συνδέσμων του εγκεφάλου και βοηθάει τον οργανισμό στο σχηματισμό και την προστασία των νευρώνων και στη δημιουργία των ιστών των κυττάρων. Σε πολλές βιοχημικές 80

διαδικασίες χρησιμεύει ως πρώτη ύλη, όπως π.χ. στην παρασκευή της προβιταμίνης D. 94 Σχήμα 5.9: Οι στερόλες που απαντώνται στις μεμβράνες ζωικών και φυτικών οργανισμών. Σχήμα 5.10: Απεικόνιση κυτταρικής μεμβράνης: 1)φωσφολιπίδια 2) χοληστερόλη 3)γλυκολιπίδια 4)σάκχαρα και 5,6,7,8) Πρωτεΐνες Η χοληστερόλη με την πολική ομάδα υδροξυλίου, μπορεί να αλληλεπιδρά με ομάδες επάνω ή κοντά στην μεμβρανική επιφάνεια (Σχήμα 5.11). Στη ρευστή φάση 81

της μεμβράνης η χοληστερόλη ελαττώνει την περιστροφική ελευθερία των γειτονικών υδρογονανθρακικών αλυσίδων και έτσι ελαχιστοποιεί τη ρευστότητα ή αλλιώς δημιουργεί ακαμψία στην μεμβράνη. Στη φάση πηκτής η χοληστερόλη δρα ως πρόσμιξη που ελαττώνει την τάξη μεταξύ των καλά πακεταρισμένων λιπιδικών αλυσίδων. 83 Σχήμα 5.11: Η χοληστερόλη διατάσσεται παράλληλα με τις αλυσίδες λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων, με την ΟΗ-ομάδα να αλληλεπιδρά με τις πολικές κεφαλές. Οι επιδράσεις της χοληστερόλης με μεμβράνες - μοντέλα έχουν μελετηθεί εκτενώς από διάφορες τεχνικές, όπως π.χ. με προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής, φασματοσκοπία NMR, περίθλαση ακτίνων Χ, Διαφορικής Θερμιδομέτρία Σάρωσης κ.α. 95-103 Από τα πειράματα αυτά πιστεύεται ότι η χοληστερόλη δρα ως ρυθμιστής των κυτταρικών μεμβρανών ρυθμίζοντας τη ρευστότητα τους. Η χοληστερόλη μπορεί επίσης να αυξήσει την μηχανική αντοχή της μεμβράνης. 95,103 Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε διπλοστιβάδες φωσφολιπιδίων ως συνάρτηση της συγκέντρωσης χοληστερόλης δείχνουν μια σημαντική αύξηση στην τάξη των φωσφολιπιδικών αλύσίδων και μειωμένο ποσοστό της gauche διαμορφώσης καθώς και μείωση της πλευρικής διάχυσης των φωσφολιπιδίων. 105,106 Μελέτες 2 Η NMR σε φωσφολιπιδικές διπλοστιβάδες που περιέχουν χοληστερόλη, δείχνουν ότι αξονικές περιστροφές των φωσφολιπιδίων εμφανίζονται σε υψηλότερο ποσοστό συγκριτικά με διπλοστιβάδες φωσφολιπιδίων χωρίς χοληστερόλη. Επιπλέον, το άκαμπτο μόριο της χοληστερόλης φαίνεται να υποβάλλεται σε αξονική περιστροφή πιο αργά από ότι τα αντίστοιχα μόρια φωσφολιπιδίων. 107 82

Υγρή εύκτακτη φάση (liquid-ordered phase): Πειράματα με συνδυασμό των παραπάνω μεθοδολογιών έδειξαν ότι η χοληστερόλη δημιουργεί μία νέα φάση μετασχηματισμού η οποία καλείται εύτακτη υγρή φάση. Η υγρή εύτακτη φάση είναι υγρή με την έννοια ότι υπάρχει μεταφορική αταξία (translational disorder) και ταχεία διάχυση (rapid diffusion) στο επίπεδο της διπλοστιβάδας αλλά εύτακτη γιατί συχρόνως υπάρχει και μεγάλη διαμορφωτική τάξη στις λιπιδικές αλυσίδες. Όπως θα εξηγηθεί παρακάτω αυτή η υψηλή τάξη στην υγρή εύτακτη φάση οδηγεί σε επιθυμητές μηχανικές ιδιότητες μίας στερεής μεμβράνης χωρίς στην πραγματικότητα να είναι κρυσταλλική. Η υγρή αυτή εύτακτη φάση είναι μοναδική για τη χοληστερόλη και άλλες στερόλες. Σημαντικά χαρακτηριστικά που επηρεάζονται ανάλογα με τη συγκέντρωση της χοληστερόλης στις λιπιδικές διπλοστιβάδες (και τα οποία απαιτούν πειράματα με πολλές τεχνικές και διάφορες ουσίες για διεξαγωγή τελικών συμπεράσματων) είναι τα εξής: Παθητική διαπερατότητα Πρόσδεση διαλυμένων ουσιών Θερμομηχανική της λιπιδικής διπλοστιβάδας Πλευρική διάχυση Λειτουργία πρωτεϊνών Διαπερατότητα: Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον ότι η διαπερατότητα της μεμβράνης παρουσιάζει διακυμάνσεις ανάλογα με τη συγκέντρωση της χοληστερόλης. Απουσία χοληστερόλης, η διπλοστιβάδα παρουσιάζει σημαντική διαπερατότητα. Σε μικρό ποσοστό μοριακής αναλογίας στη διπλοστιβάδα (π.χ. 5%), η χοληστερόλη προκαλεί μικρή αύξηση της διαπερατότητας. Οι μεγάλες συγκεντρώσεις χοληστερόλης (π.χ. 40%) προσδίδουν ευταξία στις λιπιδικές διπλοστιβάδες, λόγω δε της μεγάλης επιφάνειας που καλύπτουν, μειώνουν τη διαπερατότητα τους. 108-109 Πρόσδεση διαλυμένων ουσιών: Η χοληστερόλη δρα ως ανταγωνιστής σε άλλες ουσίες που μπορούν να δεσμευτούν στις μεμβράνες σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Σε μικρές όμως συγκεντρώσεις, όπως συμβαίνει και με την παθητική διαπερατότητα, οδηγεί σε ισχυρότερη δέσμευση λόγω των διακυμάνσεων πυκνότητας (density fluctuations) και κατά συνέπεια πλευρικής ετερογένειας της μεμβράνης. 108,110 Θερμομηχανική της λιπιδικής διπλοστιβάδας: Οι διακυμάνσεις της πυκνότητας κατά τη φάση μετασχηματισμού μίας λιπιδικής διπλοστιβάδας έχει συνέπειες στις θερμομηχανικές ιδιότητες της. Η λιπιδική διπλοστιβάδα κατά τη φάση μετασχηματισμού γίνεται πιο μαλακή (softens) και το πάχος της διπλοστιβάδας 83

αυξάνει ανώμαλα. Η παρουσία χοληστερόλης σε πλήρως δευτεριωμένες διπλοστιβάδες διμυριστικής φωσφατιδυλοχολίνης σε αναλογία >4 mol% έχει ως συνέπεια την εξαφάνιση αυτής της ανώμαλης αύξησης του πάχους. Αντίθετα σε μικρές συγκεντρώσεις έχει το αντίθετο αποτέλεσμα και η εξήγηση που δίνεται είναι ότι αυξάνει τις διακυμάνσεις πυκνότητας. Πλευρική διάχυση: Η χοληστερόλη έχει τη μοναδική ιδιότητα να αυξάνει τη λιπιδική ευταξία, να βελτιώνει τις μηχανικές ιδιότητες και τη διαπερατότητα και συγχρόνως να προσδίδει χαρακτηριστικά υγρού στη διπλοστιβάδα. Σε υψηλές θερμοκρασίες (μεγαλύτερες του Tm των λιπιδικών διπλοστιβάδων) η διάχυση (D) ελαττώνεται με αύξηση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης και σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (μικρότερες του Tm των λιπιδικών διπλοστιβάδων) η διάχυση αυξάνεται μονοτονικά με την αύξηση της χοληστερόλης. 108 Λειτουργία των πρωτεϊνών: Υπάρχουν πολλά παραδείγματα για την επίδραση της χοληστερόλης στη βιοχημική λειτουργία των διαφόρων κυτταρικων διεργασιών. Η χοληστερόλη τείνει να μετατοπίσει την ισορροπία των πλευρικών πιέσεων προς το εσωτερικό της διπλοστιβάδας. Ορισμένες πρωτεΐνες φαίνεται να προτιμούν τη συσσώρευση σε τμήματα πλούσια σε χοληστερόλη (σχήμα 5.12). Συχνά αυτές οι πρωτεΐνες φέρουν μια υδρογονανθράκή αλυσίδα ως «άγκυρα» που ταιριάζει άνετα στο σφιχτό πακετάρισμα της σχεδίας. Πρόσληψη πρωτεϊνών ή απόσπαση στα τμήματα αυτά (rafts) μπορούν εύκολα να διευκολυνθούν με ενζυματική διάσπαση ή προσκόλληση των κατάλληλων υδρογονανθρακικών αλυσίδων. Σχήμα 5.12:Λιπιδική διπλοστιβάδα μέρος της οποίας είναι πλούσιο σε χοληστερόλη (raft) 84

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΥΓΡΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Ο φασματογράφος Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού 800 MHz στο Χημικό Ινστιτούτο της Λουμπλιάνας, ο οποίος χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και διαμορφωτική ανάλυση πρωτεϊνών 85

86

6.1 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Ο Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός [Π.Μ.Σ., γνωστός επίσης με τον αγγλικό όρο Nuclear Magnetic Resonance (NMR)] είναι μία φασματοσκοπική μέθοδος απορρόφησης. Το εξεταζόμενο δείγμα, ευρισκόμενο με τις προσανατολιζόμενες ιδιοπεριστροφές του μέσα σε μαγνητικό πεδίο απορροφά ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε συχνότητες, οι οποίες το χαρακτηρίζουν. Η απορρόφηση που πραγματοποιείται, εξαρτάται από τον πυρήνα που παρατηρείται στο πείραμα. 111 Το δείγμα μπορεί να είναι διαλυμένο σε ένα οργανικό ή υδατικό διαλύτη ή σπανιότερα σε μίγμα διαλυτών ή να βρίσκεται σε στερεή κατάσταση. Ο Π.Μ.Σ. χαρακτηρίζεται τότε υγρής ή στερεής κατάστασης αντίστοιχα. 6.2 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού πρωτονίου ( 1 H-NMR) Στο πείραμα αυτό το δείγμα ακτινοβολείται με απλό παλμό, ο οποίος μεταφέρει τη μαγνήτιση των πυρήνων υδρογόνου στον ανιχνευτή. Ο ρυθμός μεταφοράς της μαγνήτισης διαφέρει από πυρήνα σε πυρήνα και ποικίλει ανάλογα με το χημικό και μαγνητικό περιβάλλον και διαρκεί όσο η ακτινοβόληση του δείγματος που είναι της τάξης των μικροδευτερολέπτων (μs). Στη συνέχεια λαμβάνεται και επεξεργάζεται το επαγόμενο ηλεκτρικό σήμα (Ελεύθερη Φθίνουσα Επαγωγή Free Induction Decay, FID). Με μετασχηματισμό Fourier λαμβάνεται το αντίστοιχο φάσμα στο πεδίο συχνοτήτων. Η φασματοσκοπία 1 H είναι ποσοτική. Μέσω της ολοκλήρωσης των κορυφών λαμβάνεται ο αριθμός των ατόμων των πρωτονίων που περιέχονται σε ένα μόριο. Στο σχήμα 6.1 παρουσιάζεται ένα παράδειγμα φάσματος πρωτονίου. Σχήμα 6.1: Παράδειγμα φάσματος πρωτονίου (φάσμα μoρίου ολμεσαρτάνης σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz). Στο κάτω μέρος της εικόνας καταγράφονται οι ολοκληρώσεις των κορυφών και στο άνω μέρος είναι σημειωμένες οι χημικές μετατοπίσεις. 87

6.3 Φασματοσκοπία άνθρακα-13 ( 13 C-NMR) Το πείραμα της φασματοσκοπίας άνθρακα-13 ακολουθεί την ίδια λογική με αυτή του πρωτονίου. Μειονεκτήματα της φασματοσκοπίας αυτής είναι ότι οι πυρήνες 13 C απαντούν στη φύση σε ποσοστό 1,1% σε σχέση με τους πυρήνες πρωτονίου-1, ενώ η ευαισθησία τους είναι σημαντικά μειωμένη σε σχέση με την ευαισθησία που παρουσιάζουν οι πυρήνες του πρωτονίου. Πλεονέκτημα είναι ότι η περιοχή συντονισμού του άνθρακα κατανέμεται σε ένα εύρος συχνοτήτων 200 ppm, ενώ του πρωτονίου σε ~10 ppm. Επομένως η ταυτοποίηση των άνθρακων οι οποίοι απαρτίζουν το φάσμα 13 C γίνεται ευκολότερα, γιατί υπάρχει λιγότερη επικάλυψη στις κορυφές του λαμβανόμενου φάσματος συντονισμού. Επίσης δεν υφίσταται σύζευξη μεταξύ των ανθράκων λόγω της πολύ μικρής αφθονίας του, φαινόμενο που παρατηρείται στο φάσμα πρωτονίου. Σχήμα 6.2: Παράδειγμα φάσματος 13 C (φάσμα μόριου ολμεσαρτάνης σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz)) 6.4 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού δύο διαστάσεων Τα φάσματα ανώτερης τάξης (δισδιάστατα, τρισδιάστατα κλπ.) χωρίζονται στα ομοπυρηνικά και στα ετεροπυρηνικά. Στα ομοπυρηνικά φάσματα οι συσχετισμοί γίνονται μεταξύ ίδιων πυρήνων (π.χ. 1 Η, 1 Η), ενώ στα ετεροπυρηνικά μεταξύ 88

διαφορετικών (π.χ. 1 Η, 13 C ή 1 Η, 15 Ν). Στα ομοπυρηνικά φάσματα δύο διαστάσεων εμφάνιζονται κορυφές επί της διαγωνίου και εκτός διαγωνίου. Οι επί της διαγωνίου κορυφές αποτελούν προβολές των φασμάτων που βρίσκονται στους κύριους άξονες και είναι οι κορυφές που δεν υφίστανται μεταβολή στη συχνότητα. Οι κορυφές στις οποίες μεταβάλλονται οι συχνότητες εμφανίζονται εκτός διαγωνίου. Είναι συμμετρικές κορυφές και αντικατοπτρίζουν σύζευξη μέσω δεσμού ή χώρου των μελετώμενων πυρήνων. Στην πραγματικότητα η μορφή ενός φάσματος δύο διαστάσεων αποτελείται από ισοϋψείς καμπύλες και η απεικόνισή του χρειάζεται τρισδιάστατο χώρο. Η μετατροπή του τρισδιάστατου φάσματος σε φάσμα δύο διαστάσεων γίνεται με στόχο την ευκολότερη αποτίμησή του. 6.4.1 Ομοπυρηνικό πείραμα 2D COSY (COrrelation SpectroscopY) Στο ομοπυρηνικό πείραμα 1 Η, 1 Η 2D COSY, στους δύο άξονες F 1 και F 2, περιέχονται απορροφήσεις του ίδιου πυρήνα, του 1 Η. Οι κορυφές που εμφανίζονται στη διαγώνιο είναι η προβολή των απορροφήσεων των 1 Η, ενώ οι συμμετρικές κορυφές εκτός διαγωνίου συνδέουν τις απορροφήσεις δύο συζευγμένων πυρήνων μέσω δεσμού. Σε ένα φάσμα COSY οι πληροφορίες που καταγράφονται, αντιστοιχούν σε συζεύξεις μόνο μεταξύ γειτονικών πρωτονίων. Σχήμα 6.3: Μεγέθυνση του φάσματος COSY της ολμεσαρτάνης σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz (περιοχή 0,50 3,00 ppm στους άξονες F 1 και F 2 ). Τα σήματα εκατέρωθεν της κύριας διαγωνίου είναι συμμετρικά και δείχνουν το συσχετισμό μεταξύ των πρωτονίων.τέτοια συμμετρικά σήματα καταγράφονται στις εκτός διαγωνίου χημικές μετατοπίσεις 1,50 και 2,81ppm. 89

6.4.2 Ομοπυρηνικό πείραμα 2D TOCSY (TΟtal Correlation SpectroscopY) To πείραμα TOCSY (σε σύγκριση με το πείραμα COSY όπου παρατηρούνται συζευγμένες ιδιοπεριστροφές μόνο γειτονικών πυρήνων), εμφανίζει και συζεύξεις με μη γειτονικούς πυρήνες. Η χρησιμότητά του πειράματος TOCSY απεικονίζεται στο σχήμα 6.4. Σχήμα 6.4: Έστω δύο ανεξάρτητα συστημάτα περιστροφής, με κορυφές, Α, Μ, Χ, και Α*, Μ*, Χ*. Το Α συνδέεται με το Μ, το οποίο συνδέεται με το Χ. Το Α* συνδέεται με το Μ *, το οποίο συνδέεται με το Χ*. Έστω ότι οι κορυφές Μ και Μ* έχουν τις ίδιες χημικές μετατοπίσεις. Aπό το COSY είναι αδύνατο να ταυτοποιηθεί αν το Α ανήκει στο ίδιο σύστημα περιστροφών με το Χ ή το Χ*. Στο TOCSY όμως λόγω των επιπλέον κορυφών, μπορεί να ταυτοποιηθεί ότι το Α ανήκει στο ίδιο σύστημα περιστροφής με το Χ και το Α* με το Χ*. 6.4.3 Ομοπυρηνικό πείραμα 2D ΝΟΕSY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) Στο πείραμα δύο διαστάσεων NOESY εφαρμόζονται δύο παλμοί 90 ο (όπως συμβαίνει και στο πείραμα COSY), μεταξύ των οποίων μεσολαβεί ο χρόνος t m (mixing time). Οι εκτός διαγωνίου κορυφές παριστάνουν τις συζεύξεις δύο πυρήνων που βρίσκονται σε χωρική εγγύτητα μέσα στο ίδιο μόριο. Ένα παράδειγμα φάσματος NOESY απεικονίζεται στο σχήμα 6.5. 90

Σχήμα 6.5: Μεγέθυνση του φάσματος ΝΟΕSY της ολμεσαρτάνης σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz (περιοχή 2,6 6,0 ppm στους άξονες F 1 και F 2 ). Τα σήματα εκατέρωθεν της κύριας διαγωνίου (με μπλε χρώμα) είναι συμμετρικά και δείχνουν το συσχετισμό μεταξύ των πρωτονίων στα 2,81 και 5,85 ppm. σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz 6.4.4 Ετεροπυρηνικό πείραμα 2D HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) Στo ετεροπυρηνικό φάσμα 2D-HSQC παριστάνονται οι ετεροπυρηνικές συζεύξεις 1 J X-H. Οι πυρήνες των ισοτόπων άνθρακα-13 (ή άλλων πυρήνων όπως 15 Ν) αλληλεπιδρούν με τα πρωτόνια με διάφορους τρόπους. Μπορούν να μεταφέρουν μαγνήτιση ο ένας στον άλλο καθώς αποδιεγείρονται, αλλά και να συζευγνύονται μεταξύ τους. Η σταθερά σύζευξης των πρωτονίων που συνδέονται απευθείας με τους άνθρακες είναι κατά μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από τις αντίστοιχες σταθερές σύζευξης των πρωτονίων που χωρίζονται με δύο ή τρεις δεσμούς με άνθρακες και για αυτό το λόγο ανιχνεύονται. 112 Στην περίπτωση του φάσματος HSQC-DEPT, το 91

χρώμα ενός σήματος υποδηλώνει αν ο C φέρει μονό αριθμό πρωτονίων (μεθύλιο ή μεθίνιο) ή ζυγό (μεθυλένιο). Στο παράδειγμα του σχήματος 6.6 με μπλε χρώμα παριστάνονται οι άνθρακες μεθίνιων και μεθύλιων, ενώ με κόκκινο χρώμα παριστάνονται οι άνθρακες των μεθυλενίων. Σχήμα 6.6: Παράδειγμα φάσματος HSQC-DEPT της ολμεσαρτάνης, όπου το χρώμα κάθε σήματος υποδηλώνει αν ο άνθρακας φέρει μονό ή ζυγό αριθμό πρωτονίων. Στο σχήμα με μπλε χρώμα παρατηρούνται τα σήματα μεθυλίων και μεθινίων και με κόκκινο χρώμα τα σήματα μεθυλενίων.για παράδειγμα με τις κόκκινες γραμμές έχει σημειωθεί ο συσχετισμός του πρωτονίου στα 1,50 ppm με τον άνθρακα που έχει χημική μετατόπιση 22,44 ppm. 6.4.5 Ετεροπυρηνικό πείραμα 2D HΜΒC (Heteronuclear Multi-Bond Connectivity) Σε ένα φάσμα 2D-HMBC ανιχνεύονται οι συσχετισμοί μεταξύ ενός πρωτονίου και των γειτονικών ατόμων άνθρακα. Μπορούν να ανιχνεύονται μέχρι και 4 J H-C ή πιο σπάνια 5 J H-C (εξαρτάται από τις παραμέτρους που χρησιμοποιούνται κατά το πείραμα). Χαρακτηριστικό του πειράματος 2D-HMBC είναι η εφαρμογή παλμικής 92

αλληλουχίας 90 ο και 180 ο για τον πυρήνα του πρωτονίου και τριών όμοιων παλμών 90 ο για τον πυρήνα του άνθρακα. Η χρονική διάρκεια μεταξύ των εφαρμοζόμενων δύο πρώτων παλμών 90 ο στους ετεροπυρήνες είναι καθορισμένη. Η παλμική αλληλουχία μεταβάλλεται από χρονικά διαστήματα καθορισμένης (τ) ή μεταβλητής (t 1 ) χρονικής διάρκειας. Ανάλογα δε με τους πυρήνες οι οποίοι θα συζευχθούν στο πείραμα ο καθορισμένος χρόνος κυμαίνεται μεταξύ 0,06-0,1 s. Παράδειγμα φάσματος HMBC παριστάνεται στο σχήμα 6.7. Σχήμα 6.7: Παράδειγμα φάσματος ΗΜΒC της ολμεσαρτάνης σε CD 3 OD, που έχει ληφθεί σε φασματογράφο 800 MHz (μεγέθυνση της περιοχής 5,50-8,00 ppm στον άξονα x και 120-170 ppm στον άξονα y). Στο πείραμα αυτό ανιχνεύονται οι συσχετισμοί μεταξύ ενός πρωτονίου και των γειτονικών ατόμων άνθρακα. Για παράδειγμα με τις κόκκινες γραμμές έχει σημειωθεί ο συσχετισμός μεταξύ των πρωτονίων με χημική μετατόπιση 5,85 ppm και του γειτονικού άνθρακα με χημική μετατόπιση 137,43 ppm. 93

94

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ ΣΤΕΡΕΑΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Ο φασματογράφος Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού στερεάς κατάστασης 850 MHz στο Kέντρο Βιοφυσικής της Φρανκφούρτης 95

96

7.1 Εισαγωγή στη φασματοσκοπία NMR στερεάς κατάστασης Ιστορικά, η λήψη φασμάτων NMR υψηλής διαχωριστικής ικανότητας ήταν εφικτή μόνο σε διαλύματα. Τα στερεά λόγω των απορροφήσεων μεγάλου εύρους παρουσίαζαν φάσματα τα οποία δεν ήταν δυνατό να ερμηνευτούν. Επομένως η φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού περιοριζόταν σημαντικά, αφού πολλές ενώσεις είναι αδιάλυτες ή ελάχιστα διαλυτές σε νερό ή σε οργανικούς διαλύτες. Επίσης πολλές φορές η διάλυση των στερεών επιφέρει αλλαγές και επομένως δομικά χαρακτηριστικά της στερεάς κατάστασης δεν είναι δυνατό να παρατηρηθούν. 113 Σήμερα οι πληροφορίες που μπορούν να αντληθούν από φάσματα NMR στερεάς κατάστασης (υψηλής διακριτικής ικανότητας) είναι εξίσου σημαντικές με τις αντίστοιχες πληροφορίες που λαμβάνονται από φάσματα υγρής κατάστασης. Για να είναι εφικτό αυτό απαιτείται ειδικός εξοπλισμός ώστε να επιτευχθεί αποσύζευξη, καθώς και εφαρμογή διάφορων τεχνικών όπως για παράδειγμα της περιστροφής υπό μαγική γωνία (Magic Angle Spinning), την τεχνική της διασταυρούμενης πόλωσης (Cross polarization), ειδικοί αισθητήρες και ειδικά πειράματα δύο διαστάσεων. 114 Η ερμηνεία των φασμάτων δειγμάτων σε στερεά κατάσταση έχει αποδείξει ότι οι ευρείες κορυφές δεν αποτελούν μειονέκτημα, αλλά αντίθετα δίνουν ποικίλες πληροφορίες για τη δομή, τη διαμόρφωση και τη δυναμική. Η χρήση της συγκεκριμένης φασματοσκοπίας μπορεί να επεκταθεί στην εξέταση πολλών υλικών. 114 Παρακάτω δίνεται ο περιοδικός πίνακας χωρισμένος σε τρεις ζώνες ατόμων με βάση το πόσο χρήσιμα είναι για τον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό σε στερεή κατάσταση. Διακρίνονται οι εξής κατηγορίες : Υποψήφοι πυρήνες για NMR στερεάς κατάστασης Χαμηλής ευαισθησίας πυρήνες για NMR στερεάς κατάστασης Πυρήνες που γενικά δε δίνουν NMR (δεν παρουσιάζουν ιδιοπεριστροφή) 97

Σχήμα 7.1. Ο περιοδικός πίνακας χωρισμένος σε τρεις ζώνες ανάλογα με τη σημαντικότητα των πυρήνων που περιλαμβάνουν, ως υποψήφιους για τη χρήση τους σε πειράματα ΝΜR στερεάς κατάστασης 7.2. Ερμηνεία του αυξημένου εύρους των κορυφών σε φάσματα NMR στερεής κατάστασης Οι παράγοντες που προκαλούν αύξηση του εύρους των παρατηρούμενων κορυφών σε δείγματα που βρίσκονται σε στερεή κατάσταση είναι τρεις 113 : η ανισοτροπία χημικής μετατόπισης η αλληλεπίδραση διπόλου-διπόλου οι μεγάλοι χρόνοι αποδιέγερσης των στερεών δειγμάτων Παρακάτω δίνονται κάποιες επιπρόσθετες πληροφορίες για κάθε παράγοντα που αναφέρθηκε. 7.2.1 Ανισοτροπία χημικής μετατόπισης Η χημική μετατόπιση προκύπτει ως ένα συνολικό αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων του πυρήνα με το ηλεκτρονιακό περιβάλλον του και με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο Β 0. Είναι επίσης γνωστό ότι η χημική μετατόπιση ενός πυρήνα εξαρτάται και από τον προσανατολισμό του σε σχέση με το μαγνητικό πεδίο. Αν εξεταστεί ένα στερεό δείγμα, θα παρατηρηθεί ότι οι δεσμοί των μορίων του μπορούν να προσανατολισθούν σε διάφορες διευθύνσεις σχηματίζοντας με αυτόν τον τρόπο διαφορετικές γωνίες με τη διεύθυνση του μαγνητικού πεδίου. Το γεγονός αυτό προκαλεί μεταβολή στη χημική μετατόπιση του παρατηρούμενου πυρήνα και το 98

φαινόμενο αυτό ονομάζεται χημική ανισοτροπία. Σε αυτό το σημείο αξίζει να διευκρινιστεί ότι στην περίπτωση υγρών δειγμάτων ο παράγοντας αυτός μηδενίζεται, γιατί συμβαίνουν ταχείες μεταβολές των προσανατολισμών που λαμβάνουν οι δεσμοί των παρατηρούμενων πυρήνων. Για το λόγο αυτό το ημίσειο εύρος τους κυμαίνεται μεταξύ 2-3 Hz. Αλληλεπίδραση ενός πυρήνα με το μαγνητικό πεδίο B 0 : Μικρά ηλεκτρικά ρεύματα επάγονται από το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο στο μόριο και ως επακόλουθο δημιουργείται στον πυρήνα ένα τοπικό μαγνητικό πεδίο. 111 Ο προσανατολισμός και το μέγεθος του προκύπτοντος τοπικού μαγνητικού πεδίου εκφράζεται ως ένας τανυστής χημικής μετατόπισης (chemical shift tensor). Ο τανυστής χημικής μετατόπισης στο μόριο δίνεται ως εξής: Σχήμα 7.2 Μικρά ηλεκτρικά ρεύματα επάγονται από το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο στο μόριο και ως επακόλουθο δημιουργείται στον πυρήνα ένα τοπικό μαγνητικό πεδίο. Β 0 είναι το πεδίο, Β ind το επαγόμενο πεδίο, ενώ το σ εκφράζει τη μαγνητική προάσπιση στον πυρήνα. Επίσης ισχύει ότι H CSA = γћb 0 σι= =γћ(b 0x, B 0y, B 0z ) (σχέση 7.1) όπου, Ι η ιδιοπεριστροφή και γ ο γυρομαγνητικός λόγος. Επίσης CSA (chemical shift anisotropy) είναι η ανισοτροπία χημικής μετατόπισης και H CSA ο αντίστοιχος όρος της χαμιλτωνιανής. Η εξάρτηση της μαγνητικής προάσπισης από τον προσανατολισμό παρουσιάζεται παραστατικά στο επόμενο σχήμα. 99

Σχήμα 7.3 Η εξάρτηση της μαγνητικής προάσπισης από τον προσανατολισμό Γενικά ισχύει η σχέση σ 11 σ 22 σ 33 (σχέση 7.2) ενώ όταν υπάρχει αξονική συμμετρία (κεντρικό σύστημα αξόνων) ισχύει ο παρακάτω τύπος: (σχέση 7.3) και ισχύει σ 11 =σ 22. Οι σ 11,σ 22,σ 33 παρατηρούνται στο πιο κάτω σχήμα 7.4. Θεωρείται ότι παράλληλα με τον z άξονα είναι το Β 0 και τα σ 11, σ 22,σ 33 περιγράφουν το μέγεθος του τανυστή στις τρεις διαστάσεις. Η χημική μετατόπιση ενός πυρήνα σε έναν απλό κρύσταλλο θα μεταβάλλεται καθώς ο κρύσταλλος περιστρέφεται μέσα στο πεδίο. Όταν υπάρχει ένα κονιοποιημένο δείγμα υπάρχουν όλοι οι δυνατοί προσανατολισμοί των μορίων και ως αποτέλεσμα, στο φάσμα ΝΜR που προκύπτει, περιγράφεται το πρότυπο του τανυστή κονιοποιημένου δέιγματος. Ορίζεται ο συντελεστής κ ως κ=3(σ iso -σ 22 )/σ 33 -σ 11 (7.4) Έχοντας ορίσει τον παραπάνω συντελεστή, παρουσιάζονται τρία θεωρητικά πρότυπα τανυστών χημικής μετατόπισης. Στην πρώτη περίπτωση (άνω σχήμα) δεν 100

παρατηρείται αξονική συμμετρία, ενώ στις δύο επόμενες παρατηρείται αξονική συμμετρία. Σχήμα 7.4 Θεωρητικά πρότυπα τανυστών χημικής μετατόπισης. Οι φασματικοί αυτοί τύποι παρέχουν σημαντικές ηλεκτρονιακές, γεωμετρικές και δυναμικές πληροφορίες για το μελετούμενο σύστημα 7.2.2 Αλληλεπίδραση διπόλου-διπόλου Έχει δειχτεί ότι σε στερεά δείγματα τα μόρια δεν είναι δυνατό να κινηθούν ισότροπα με άμεση συνέπεια οι στατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ διπόλων να δημιουργούν αρκετά μεγάλη διεύρυνση, σε βαθμό που τα φάσματα στερούνται λεπτομερών πληροφοριών. Έτσι, τα μεγάλα εύρη φασμάτων στερεών δειγμάτων οφείλονται σε μεγάλο ποσοστό στη «διπολική διεύρυνση». Πιο συγκεκριμένα, αν υποτεθεί ότι υπάρχει ένα δείγμα στερεάς κατάστασης το οποίο βρίσκεται σε κατάσταση σκόνης, η μαγνητική αλληλεπίδραση κάθε κρυσταλλικού κόκκου σκόνης έχει διαφορετική τιμή με αποτέλεσμα οι διπολικές αλληλεπιδράσεις να προκαλούν διεύρυνση των κορυφών των φασμάτων NMR στερεής κατάστασης. Αντίθετα αν βρίσκεται σε υγρή μορφή, τα μόρια επαναπροσανατολίζονται γρήγορα και οι πυρηνικές περιστροφές υφίστανται το μέσο χρόνο της διπολικής αλληλεπίδρασης σε όλους στους δυνατούς προσανατολισμούς που υπάρχουν. 113,114,115 Γενικά, η διπολική αλληλεπίδραση δημιουργείται όταν μία από τις δύο ιδιοπεριστροφές βρίσκεται στο μαγνητικό πεδίο που παράγεται από την άλλη πυρηνική ιδιοπεριστροφή. Αυτή θεωρείται ως άμεση αλληλεπίδραση δύο μαγνητικών διπόλων στο χώρο και εξαρτάται τόσο από το γυρομαγνητικό λόγο γ των πυρήνων, όσο και από την απόστασή στους r jk -3, εννοώντας την μέση τιμή της τρίτης δύναμης 101

της απόστασης των πυρήνων. Ορίζοντας ως R jk DD τη διπολική αλληλεπίδραση ισχύει η παρακάτω μαθηματική σχέση R jk DD = μ ο γ j γ k h/4π <r 3 jk> (σχέση 7.5) Όπου γ j ο γυρομαγνητικός λόγος του πυρήνα j που σχετίζεται με τη μαγνητική ροπή με τη σχέση μ j = γ j h/2 (σχέση 7.6) O γυρομαγνητικός λόγος είναι χαρακτηριστικός για κάθε πυρήνα. Για τον πυρήνα του υδρογόνου, 1 Η, γ = 42,58 MHz/Tesla. Για παράδειγμα για ενδοατομικές αποστάσεις 10 Å σε δύο πυρήνες 1 Η (αλληλεπίδραση 1 Η- 1 Η) η διπολική σταθερά συζεύξεων R DD είναι ίση με 120 khz. Όταν υπάρχει αλληλεπίδραση 1 Η- 13 C με ενδοατομική απόσταση 1 Å, είναι η R DD = 30 khz, ενώ όταν η ενδοατομική απόσταση είναι 2 Å, η R DD = 3,8 khz. Σχήμα 7.5 Η διπολική αλληλεπίδραση δημιουργείται όταν μία από τις δύο ιδιοπεριστροφές βρίσκεται στο μαγνητικό πεδίο που παράγεται από την άλλη πυρηνική ιδιοπεριστροφή. 7.2.3 Μεγάλοι χρόνοι αποδιέγερσης Είναι γνωστό ότι οι διεγερμένοι πυρήνες επανέρχονται στην αρχική στους κατάσταση, δηλαδή αποδιεγείρονται, ανταλλάσοντας ενέργεια με το περιβάλλον. Στην περίπτωση υγρών δειγμάτων η διαδικασία αυτή είναι πολύ αποδοτική λόγω της τυχαίας κίνησης των μορίων. Αντίθετα, όταν εξετάζονται στερεά δείγματα, οι μοριακές κινήσεις είναι αρκετά περιορισμένες και επομένως η αποδιέγερση γίνεται με πολύ αργό ρυθμό και η ανταλλαγή ενέργειας με το περιβάλλον γίνεται πολύ πιο δύσκολα. 113 102

7.3 Διπολική σχάση σε φάσματα NMR μονοκρυσταλλικών στερεών Τα ομοειδή ή ετεροειδή άτομα με όμοιες ιδιοπεριστροφές (για παράδειγμα Ι 1 =Ι 2 =1/2) τα οποία συνδέονται με διπολική αλληλεπίδραση, διαφέρουν στις συχνότητες μεταπτώσεως. Στην περίπτωση των ετεροειδών περιστροφών παρατηρείται διπλή κορυφή για το καθένα, η οποία δίνεται από τον τύπο: 114 Δν ετεροειδή =v 1 ±½ R DD (3cos 2 θ-1) (σχέση 7.7) Από την παραπάνω σχέση παρατηρείται ότι η μετάπτωση των ετεροειδών πυρήνων εξαρτάται από τη γωνία θ μεταξύ του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου και του ανύσματος μεταξύ των πυρήνων. Σημειώνεται ότι οι κορυφές αφορούν μονοκρυσταλλικά και όχι άμορφα δείγματα. Δύο πυρήνες με όμοιες ιδιοπεριστροφές παρουσιάζουν μία διπλή κορυφή στην οποία οι δύο συνιστώσες της συχνότητας βρίσκονται εκατέρωθεν της κοινής συχνότητας ν 0. Την κοινή αυτή συχνότητα ν 0, θα την είχαν οι δύο πυρήνες στην υποθετική περίπτωση που δε συνδέονταν με διπολική αλληλεπίδραση. Στους ομοειδείς πυρήνες ισχύει ο παρακάτω ο τύπος Δν ομοειδή =v 0 ±¾ R DD (3cos 2 θ-1) (σχέση 7.8) 7.4 Διπολική διεύρυνση (λόγω διπολικών αλληλεπιδράσεων με τον πυρήνα) Όπως έχει ήδη αναφερθεί οι στατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διπόλων προκαλούν μεγάλη διεύρυνση στις παρατηρούμενες κορυφές. Στο φαινόμενο αυτό (τη διεύρυνση) αντιτίθεται μερικώς η διακύμανση (ή διάχυση) των ιδιοπεριστροφών. Έτσι για παράδειγμα στο μεγάλο εύρος των φασμάτων 13 C οργανικών στερεών, το οποίο οφείλεται κυρίως στη διεύρυνση λόγω διπολικής αλληλεπίδρασης με τα γειτονικά πρωτόνια, αντιτίθενται οι διακυμάνσεις των ροπών των πρωτονίων. 114 7.5 Διπολική αποσύζευξη Σε στερεά δείγματα, για τους πυρήνες 13 C, οι ευρείς συντονισμοί παρατηρούνται λόγω των μεμονωμένων διπολικών συζεύξεων στα πρωτόνια και τους τυχαίους προσανατολισμούς των διανυσμάτων C-H ως προς το άνυσμα του μαγνητικού πεδίου. Η εφαρμογή υψηλής ισχύος για την αποσύζευξη των πρωτονίων 103

μπορεί να απαλείψει τις διπολικές αλληλεπιδράσεις. Αυτό επιτυγχάνεται με την ακτινοβόληση του δείγματος στη συχνότητα σύζευξης των πρωτονίων για να απαλείψει τα ορατά αποτελέσματα αυτών των αλληλεπιδράσεων στο φάσμα. Συνήθως απαιτούνται αποσυζευκτικά πεδία της τάξης των 60 khz και η παραγωγή τους απαιτεί αντίστοιχα ισχύ άνω των 100 W. Έτσι για τα παραπάνω χρειάζονται μεγάλοι ενισχυτές και συχνά παράγονται μη αμελητέα ποσά θερμότητας στο δείγμα. 114 Η σύζευξη 13 C- 1 Η είναι αρκετά σημαντική στις οργανικές ενώσεις και δημιουργεί πολύπλοκα φάσματα, τα οποία δύσκολα ερμηνεύονται. Το φαινόμενο της σύζευξης 13 C- 1 Η είναι ιδιαίτερα έντονο σε οργανικές ενώσεις με μεγάλο μοριακό βάρος, γι αυτό εφαρμόζεται πάντοτε συστηματική αποσύζευξη πρωτονίων ή αποσύζευξη του θορύβου των πρωτονίων (proton noise decoupling), όπως συνήθως καλείται. Με τον τρόπο αυτό κάθε άνθρακας του μορίου της οργανικής ένωσης παρουσιάζει μία φασματική γραμμή. 7.6 Περιστροφή του δείγματος υπό μαγική γωνία (MAS-Magic Angle Spinning) Η περιστροφή του δείγματος υπό μαγική γωνία ως προς το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο είναι μία πολύ διαδεδομένη τεχνική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε στερεά δείγματα προκειμένου να εξαλειφθεί η ανισοτροπία της χημικής μετατόπισης και να επιτευχθεί η ισοτροπική μετατόπιση που παρατηρείται στον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό υγρής φάσης. Όταν η μαγνητική προάσπιση είναι προσανατολισμένη σε σχέση με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο Β 0 ισχύει η σχέση σ= λ 1 2 σ 11, + λ 2 2 σ22+ λ 3 2 σ 33 (7.9) όπου λ 1 = cosα sinβ λ 2 = sinα sinβ λ 3 = cosβ και α, β οι γωνίες που προσδιορίζουν τον προσανατολισμό του κύριου συστήματος αξόνων όπως παρουσιάζεται στο πιο κάτω σχήμα 104

Σχήμα 7.6 Οι γωνίες α,β,γ που προσδιορίζουν τον προσανατολισμό του κύριου συστήματος αξόνων Στην υγρή φάση τα μόρια περιστρέφονται ταχέως ομοιόμορφα ως προς όλες τις κατευθύνσεις (ισοτροπικά) και η αντίστοιχη χημική μετατόπιση ισούται με σ iso = (σ 11 +σ 22 +σ 33 )/3 (σχέση 7.10) Σε στερεά δείγματα η χημική μετατόπιση εξαρτάται από τον προσανατολισμό του ηλεκτρονικού νέφους γύρω από τον πυρήνα σε σχέση με το μαγνητικό πεδίο. Όταν περιστρέφεται το δείγμα και η γωνία θ μεταξύ του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου και του ανύσματος μεταξύ των πυρήνων είναι θ= 54 o 44 (54.74º), τότε εξαλείφεται η ανισοτροπία χημικής μετατόπισης και μπορεί να επιτευχθεί η ισοτροπική μετατόπιση που παρατηρείται στον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό υγρής φάσης, δηλαδή ισχύει σ=σ iso. Όταν το δείγμα περιστρέφεται με υψηλή συχνότητα γύρω από κάποιο άξονα (υπό γωνία θ) ως προς το μαγνητικό πεδίο Β 0 οι συντελεστές λ είναι συναρτήσεις του χρόνου. Θεωρώντας ένα μέσο όρο ως προς το χρόνο, προκύπτει η εξίσωση σ= ½ sin 2 θ (σ 11 +σ 22 +σ 33 ) + ½ (3cos 2 θ-1) (σχέση 7.11) Για θ=54.74º είναι sinθ=0.66 και 3cos 2 θ-1=0. Η γωνία θ=54.74º ονομάζεται μαγική γωνία (Magic Angle). Η γωνία θ μπορεί να κατανοηθεί στο σχήμα 7.7 που ακολουθεί. Ουσιαστικά παρατηρείται ότι πρόκειται για τη γωνία που σχηματίζεται μεταξύ του z άξονα και 105

της διαγωνίου του κύβου. Γρήγορη περιστροφή του δείγματος γύρω από τη συγκεκριμένη γωνία εξαλείφει τις διπολικές αλληλεπιδράσεις. 116 Σχήμα 7.7 Όταν το δείγμα περιστρέφεται υπό γωνία θ, σε σχέση με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, ίση με θ= 54 o 44 (54.74º), τότε εξαλείφεται η ανισοτροπία χημικής μετατόπισης. Η μαγική γωνία είναι η γωνία που σχηματίζεται μεταξύ του z άξονα και της διαγωνίου του παραπάνω κύβου του σχήματος. Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στη φασματοσκοπία NMR στερεής κατάστασης πρέπει να είναι λεπτά κονιοποιημένα και καλά συσκευασμένα στον περιστροφέα, ο οποίος περιστρέφεται συνήθως με ταχύτητες από 2-36 khz ανάλογα με τη διάμετρό του και τον τύπο του πειράματος που πραγματοποιείται. 114 H τεχνική μπορεί να θεωρηθεί ως περιστροφή του δείγματος γύρω από τη διαγώνιο του παραπάνω κύβου, περιστροφή αρκετά γρήγορη ώστε να αλληλομετατρέπονται οι άξονες x, y, z. 7.7 Διασταυρούμενη πόλωση (Cross polarization) Η διασταυρούμενη πόλωση είναι μία τεχνική η χρήση της οποίας έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ευαισθησίας και την ελάττωση του χρόνου λήψης φάσματος σε ένα πείραμα NMR στερεής κατάστασης. Σε αυτήν την τεχνική, η πόλωση από την περιστροφή πυρήνων όπως 1 Η ή 19 F που βρίσκονται σε μεγαλύτερη φυσική αφθονία μεταφέρεται σε πυρήνες με μικρή φυσική αφθονία όπως 13 C ή 15 Ν. Με αυτόν τον τρόπο ενισχύεται ο λόγος σήματος προς θόρυβο. Τα 1 Η και 19 F έχουν μεγαλύτερους γυρομαγνητικούς λόγους και ως αποτέλεσμα έχουν μεγαλύτερη μαγνήτιση σχετικά με άλλους πυρήνες. Η τεχνική της διασταυρούμενης πόλωσης βρίσκει εφαρμογή όταν χρειάζεται η λήψη φασμάτων 13 C οπότε γίνεται χρήση της μεγάλης μαγνήτισης του πρωτονίου. Έτσι για παράδειγμα 106

μπορεί να επιλυθεί το πρόβλημα των μεγάλων χρόνων αποδιέγερσης των πυρήνων 13 C, γιατί οι χρόνοι αποδιέγερσής τους καθορίζονται από μικρούς χρόνους αποδιέγερσης των πρωτονίων. 117,118 Για την πραγματοποίηση ενός πειράματος CP/MAS η ακολουθία των παλμών που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει τέσσερα στάδια: Στο πρώτο στάδιο εφαρμόζεται στο 1 H ένας παλμός (B 1H ) κατάλληλης διάρκειας ικανός να προκαλέσει εκτροπή της μαγνήτισης των πρωτονίων κατά 90º στο επίπεδο X-Y. Η μαγνήτιση προσανατολίζεται στον y-άξονα, όπου και εκτρέπεται η Β 1Η. Η συχνότητα περιστροφής της μαγνήτισης είναι ω H =γ Η Β 1Η Ταυτόχρονα οι πυρήνες 13 C αλληλεπιδρούν με τα πρωτόνια με εφαρμογή ενός παλμού που κλειδώνει (spin lock) τους πυρήνες 13 C στο περιστρεφόμενο σύστημα αναφοράς (στο χρονικό διάστημα που διαρκεί ο εξαναγκασμός των ιδιοπεριστροφών των πρωτονίων). Ισχύει επίσης για τη συχνότητα περιστροφής της μαγνήτισης του 13 C, ω C =γ C Β 1C. Η μεταφορά πόλωσης από τους πυρήνες των πρωτονίων στους πυρήνες άνθρακα συμβαίνει όταν εξισωθούν οι ω H και ω C (χρονικό διάστημα milliseconds). Τότε τελειώνει το κλείδωμα για τους πυρήνες 13 C. Ανιχνευση του σήματος 13 C με σύγχρονη αποσύζευξη των 1 H. Τα παραπάνω περιγράφονται στο σχήμα που ακολουθεί. Σχήμα 7.8 Οι διάφορες διεργασίες που επιτελούνται στους πυρήνες πρωτονίου και άνθρακα κατά την εκτέλεση πειράματος 13 C CP/MAS. Στο κάτω μέρος του σχήματος περιγράφονται οι τρεις χρόνοι του πειράματος (τ CT =τ CONTACT TIME, τ AQ =τ ACQUISITION, τ R =τ RECEPTION ). 107

Η εξίσωση των συχνοτήτων γ C Β 1C = γ Η Β 1Η (σχέση 7.12) ονομάζεται συνθήκη Hartmann-Hahn. Θεωρώντας γενικά ως Ι έναν πυρήνα σε μεγάλη φυσική αφθονία και S έναν πυρήνα σε μικρή φυσική αφθονία, λόγω της παραπάνω συνθήκης Hartmann-Hahn, η τεχνική της διασταυρούμενης πόλωσης ενισχύει το σήμα κατά έναν παράγοντα γ I /γ S. Συμπερασματικά, στον παρακάτω πίνακα αναγράφονται περιληπτικά τα σηναντικότερα προβλήματα που παρουσιάζονται στη λήψη φασμάτων ΝΜR στερεής κατάστασης και τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την επίλυση των προβλημάτων. ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΣ ΑΡΣΗ ΤΟΥΣ ΙΣΧΥΡΕΣ ΔΙΠΟΛΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕΓΑΛΟΙ ΧΡΟΝΟΙ ΑΠΟΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΑΝΙΣΟΤΡΟΠΙΑ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΥΨΗΛΗΣ ΙΣΧΥΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΣΥΖΕΥΞΗ ΔΙΑΣΤΑΥΡΟΥΜΕΝΗ ΠΟΛΩΣΗ (CROSS POLARIZATION) ΠΕΡΙΣΤΡΟΦΗ ΥΠΟ ΜΑΓΙΚΗ ΓΩΝΙΑ (MAGIC ANGLE SPINNING) Πίνακας 7.1:Τα προβλήματα στη λήψη φασμάτων ΝΜR στερεής κατάστασης και οι εφαρμοσμένες τεχνικές προς άρση τους Επίσης όταν υπάρχει μικρή ευαισθησία για πυρήνες με μικρή αφθονία, μπορεί να εφαρμοσθεί συνδυασμός των τεχνικών περιστροφής υπό μαγική γωνία και διασταυρούμενη πολώση. 7.8 Τετραπολική ροπή 118-122 Οι πυρήνες με spin μεγαλύτερο του 1/2 (>1/2) όπως οι 14 Ν, 2 Η, 35 Cl έχουν τετραπολική ροπή. Η τετραπολική ροπή προκαλεί ένα ανισότιμο ηλεκτρικό πεδίο κατά μήκος του πυρήνα. Το αποτέλεσμα είναι να παρατηρείται ένας μηχανισμός 108

υψηλής ικανότητας για αποδιέγερση, για τους πυρήνες αυτούς και για κάθε γειτονικό πυρήνα 13 C. Οι πυρήνες με τετραπολική ροπή δίνουν φάσματα Πυρηνικού Τετραπολικού Συντονισμού, που είναι αρκετά πολύπλοκα και αποτελούν ιδιαίτερο κλάδο της φασματοσκοπίας NMR. Η τετραπολική αποκατάσταση είναι ένας σημαντικός μηχανισμός αποκατάστασης (ή αποδιέγερσης) των πυρηνικών ιδιοπεριστροφών με τιμή μεγαλύτερη από ½. Αξίζει να σημειώθεί ότι 73% των ενεργών πυρήνων NMR είναι τετραπολικοί πυρήνες. Στον πιο κάτω πίνακα παρουσιάζονται τα περισσότερο άφθονα ισότοπα στον περιοδικό πίνακα. Σε κάθε στοιχείο αναγράφεται και η ιδιοπεριστροφή του. Σχήμα 7.9 Τα περισσότερο άφθονα ισότοπα στον περιοδικό πίνακα. Στα άσπρα τετράγωνα κουτιά αναγράφεται η ιδιοπεριστροφή κάθε στοιχείου. Με ακέραιη ιδιοπεριστροφή οι πυρήνες που μελετώνται στην πράξη συχνότερα είναι δύο, οι 2 Η και 14 N. Στα παρακάτω σχήματα παρουσιάζεται πως η μη συμμετρική κατανομή νουκλεονίων έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μίας μη σφαιρικής κατανομής 109

θετικού ηλεκτρικού φορτίου. Σε αντίθεση ένας μη τετραπολικός πυρήνας με Ι= ½ έχει σφαιρική κατανομή φορτίου. Πυρήνας με spin=½ Τετραπολικός πυρήνας (Ι>1/2) Σχήμα 7.10 Απεικόνιση τετραπολικού πυρήνα, καθώς και του προσήμου της τετραπολικής ροπής. Η ασύμμετρη κατανομή φορτίου σε έναν πυρήνα περιγράφεται από την πυρηνική ηλεκτρική τετραπολική ροπή, eq, η οποία μετράται σε barn. Η τετραπολική ροπή είναι μία ενδογενής ιδιότητα του πυρήνα και είναι ίδια ανεξάρτητα από το περιβάλλον. Ένας τετραπολικός πυρήνας αλληλεπιδρά με βαθμίδες ηλεκτρικού πεδίου μέσα στο μόριο (με τον όρο βαθμίδες εννοούμε χωρικές αλλαγές της έντασης του ηλεκτρικού πεδίου μέσα στο μόριο). Η αλληλεπίδραση γίνεται μεταξύ της πυρηνικής ηλεκτρικής τετραπολικής ροπής και του τανυστή που περιγράφει τις βαθμίδες του ηλεκτρικού πεδίου του περιβάλλοντος του πυρήνα. Ο τανυστής αυτός ορίζεται ως V και ισούται με: (σχέση 7.13) 110

Σε περίπτωση που υπάρχει αξονική συμμετρία ο V ονομάζεται V PAS και ισούται (σχέση 7.14) (σχήμα 7.11) Τα κύρια συστατικά του τανυστή ορίζονται έτσι ώστε να ισχύει η συνθήκη (σχέση 7.15) Σχήμα 7.11 Το μέγεθος της τετραπολικής αλληλεπίδρασης δίνεται από την πυρηνική τετραπολική σταθερά σύζευξης (σε khz ή ΜΗz συνήθως) από τη σχέση C Q = eq V 33 /h (σχέση 7.16) ασυμμετρίας η Η ασυμμετρία της τετραπολικής αλληλεπίδρασης δίνεται από την παράμετρο η=( V 11 - V 22 )/ V 33, όπου 0 η 1 (σχέση 7.17) και όταν η=0 υπάρχει αξονική συμμετρία. Αξίζει να σημειωθεί ότι καθώς μειώνεται η σφαιρική συμμετρία σε ένα μόριο, (αυξάνονται ουσιαστικά οι χωρικές αλλαγές του ηλεκτρικού πεδίου μέσα στο μόριο), αυξάνεται και η τετραπολική αλληλεπίδραση. 111

Η τετραπολική αλληλεπίδραση μπορεί να εκφραστεί ως ένα άθροισμα αλληλεπιδράσεων πρώτης και δεύτερης τάξης (σχέση 7.18) Στο πιο κάτω σχήμα φαίνεται η επίδραση κάθε όρου (πρώτης και δεύτερης τάξης αλληλεπιδράσεις) στα ενεργειακά επίπεδα ενός πυρήνα με spin 5/2. H z H Q (1) H Q (2) Σχήμα 7.12 Ενεργειακά επίπεδα ενός πυρήνα με spin 5/2. H πρώτης τάξης αλληλεπίδραση είναι ανάλογη του C Q και η δεύτερης τάξης αλληλεπίδραση είναι ανάλογη του όρου C 2 Q /ν 0 και είναι πολύ μικρότερη (τα μεγέθη στο παραπάνω σχήμα δεν είναι τόσο μεγάλα για τις δεύτερης τάξης αλληλεπιδράσεις αλλά σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να είναι ορατό το είδος της αλλαγής). Αξίζει να σημειωθεί ότι η πρώτης τάξης αλληλεπίδραση δεν επηρεάζει την κεντρική μετάπτωση. Στο πιο κάτω σχήμα παριστάνονται οι μεταπτώσεις για τρεις τετραπολικούς πυρήνες. 112

Σχήμα 7.13 Οι μεταπτώσεις για τρεις τετραπολικούς πυρήνες. (CT=Central transition κεντρική μετάπτωση, ST=Satellite transition δορυφορική μετάπτωση) Στην περίπτωση του 2 Η (τετραπολικός πυρήνας με Ι=1) τα ενεργειακά επίπεδα είναι τρία. Αυτά τα επίπεδα διαταράσσονται από την τετραπολική αλληλεπίδραση όπως παριστάνεται στο σχήμα 7.14. 113

Σχήμα 7.14: (άνω) Ενεργειακές στιβάδες Zeeman και τετραπολική αλληλεπίδραση. (κάτω) Τυπικό φάσμα 2 Η. Στο φάσμα δείχνονται οι τετραπολικές διασχίσεις των 0 και 90 καθώς και η θέση της μαγικής γωνίας (54,7 ). Ο αριθμημένος άξονας παριστάνει συχνότητα σε μονάδες ΚΗz. Επίσης παρακάτω παριστάνονται αναλυτικά οι μεταπτώσεις για έναν πυρήνα με spin 3/2. Με τα χρωματισμένα βέλη γίνεται η πλήρης αντιστοίχιση των μεταπτώσεων στο φάσμα. Σχήμα 7.15 Οι μεταπτώσεις για έναν πυρήνα με spin 3/2 114

7.9 Πεδία εφαρμογών πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού Τα πεδία στα οποία βρίσκει χρήση ο Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός αυξάνονται διαρκώς στις μέρες μας. Ενδεικτικά μπορούμε να αναφέρουμε ότι ο Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός στερεάς κατάστασης έχει ήδη χρησιμοποιηθεί στη μελέτη βιολογικών μορίων, φαρμάκων, οργανικών και ανόργανων συμπλόκων, σε μικροπορώδη στερεά, σε μεταλλεύματα, τσιμέντα, γυαλιά, κεραμικά, κράματα ημιαγωγών, τρόφιμα, αρχαιoλογικά δείγματα, πολυμερή κλπ. Η εκτεταμένη χρήση οφείλεται στο ότι πολλοί ενεργοί πυρήνες για το συγκεκριμένο είδος φασματοσκοπίας είναι διαθέσιμοι και έχουν γίνει ήδη αντικείμενο μελέτης. Στην ανάπτυξη του συντέλεσε η διαρκής εξέλιξη νέων τεχνικών, μέσω των οποίων επιλύονται προβλήματα που παρουσιάζονται κατά τις εφαρμογές. Όπως ήδη αναφέρθηκε ο Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός στερεάς κατάστασης αποτελεί μία χρήσιμη τεχνική για τη μελέτη φαρμάκων. Οι πληροφορίες που αντλούνται από τα φάσματα NMR σε συνδυασμό με άλλες φυσικοχημικές τεχνικές, χρησιμοποιούνται για την κατανόηση του τρόπου δράσης των φαρμάκων. Συνολικά οι σημαντικότερες σύγχρονες επιστημονικές προσεγγίσεις για το σχεδιασμό νέων φαρμάκων είναι οι εξής: 123 Μετατροπή ήδη γνωστών φαρμακευτικών δραστικών ουσιών Μετατροπή φυσικών ουσιών Φυσικοχημικές μελέτες γνωστών φαρμάκων με σκοπό την κατανόηση του τρόπου δράσης. Παραδείγματα φυσικοχημικών τεχνικών είναι NMR στερεάς κατάστασης, φασματοσκοπία Raman, DSC κλπ. Σχεδιασμός φαρμάκων με τη βοηθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή Μελέτη του μεταβολισμού των φαρμάκων 7.10 Ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων Για το σχεδιασμό νέων φαρμάκων είναι πολύ σημαντικό να προσδιορισθούν οι επιδράσεις ήδη γνωστών φαρμακευτικών μορίων, τόσο σε επίπεδο υποδοχέα, όσο και σε επίπεδο μεμβρανών. Ο προσδιορισμός αυτός μπορεί να γίνει με πειραματικές (συνήθως NMR και κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ) και με θεωρητικές μεθόδους (π.χ. εφαρμογή κβαντομηχανικής και μοριακής μηχανικής). Η συλλογή δεδομένων από διαφορετικά επιστημονικά πεδία (βιοφυσική, βιολογία, θεωρητική χημεία), η οποία συνοψίζεται στο σχήμα 7.16, είναι αυτή που καθοδηγεί τους συνθετικούς χημικούς στην ανακάλυψη νέων μορίων. 115

Χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνικές μοριακών γραφικών μπορεί να απεικονίσθεί η τρισδιάστατη αρχιτεκτονική των μορίων στην ενεργειακά ευνοϊκότερη διαμόρφωση. Στη διαμόρφωση αυτή είναι δυνατό να τροποποιήθεί δομικά κάποιες λειτουργικές ομάδες με στόχο να μελετήθούν νέες δομές ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Επίσης είναι δυνατό να σχεδιαστεί τρισδιάστατα η προσαρμογή ενός φαρμακευτικού μορίου σε έναν υποδοχέα. Είναι σαφές λοιπόν ότι χρησιμοποιώντας τεχνικές όπως ο Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός στερεάς κατάστασης είναι δυνατό να αποκτήθούν πολύτιμες γνώσεις που τελικά θα χρησιμεύσουν στην ανακάλυψη νέων φαρμακευτικών μορίων. 123 Σχήμα 7.16:Μέθοδοι που συνεισφέρουν στη συλλογή δεδομένων (σε επίπεδο υποδοχέα και σε επίπεδο μεμβρανών) με στόχο τη σύνθεση νέων φαρμακευτικών μορίων 7.11. Βελτιστοποίηση μίας ένωσης-οδηγού 123 Για μία γνωστή φαρμακευτική ουσία, διεξάγεται έντονη ερευνητική προσπάθεια για την εξάλειψη των παρενεργειών της καθώς και τη βελτιστοποίηση των επιθυμητών ιδιοτήτων. Συχνά οι μετατροπές που γίνονται στην ένωση-οδηγό δεν εντοπίζονται στο φαρμακοφόρο τμήμα, αλλά στο υπόλοιπο μόριο. Οι μελέτες που στοχεύουν στην εύρεση ενός δραστικότερου φαρμάκου είναι τόσο χρονοβόρες, όσο και μεγάλου κόστους. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το εξής. Από το μόριο της κινίνης (quinine) χρειάστηκε να συντεθούν και να μελετηθούν για ανθελονοσιακή δράση 10.000 ενώσεις μέχρι να ανακαλυφθεί η πλασμοκίνη (plasmoquine), 12.000 ενώσεις για την ανακάλυψη της ατεμπρίνης (atebrine)και 14.000 μέχρι τη στιγμή που ανακαλύφθηκε η χλωροκίνη (chloroquine). 116

Με τον ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων γίνεται προσπάθεια να περιορισθεί ο αριθμός των συνολικών υποψηφίων τροποποιημένων μορίων (τροποποιημένων ως προς την ένωση-οδηγό), επιλέγοντας να μελετηθούν ενώσεις που είναι πιθανότερο να έχουν επιθυμητές ιδιότητες. Οι σχέσεις δομής-δράσης οδηγούν σε χρήσιμα συμπεράσματα που καθοδηγούν τις ενέργειες μας στη σύνθεση νέων μορίων. Ανάλυση διαμόρφωσης φαρμακευτικών μορίων Αλληλεπιδράσεις φαρμακευτικών μορίων με κέντρα δράσης Ποσοτικές σχέσεις δομής-δράσης Βιολογική αποτίμηση Σύνθεση νέων φαρμακευτικών μορίων Σχήμα 7.17 Ορθολογικός σχεδιασμός φαρμάκων Μία εφαρμογή της φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού στερεάς κατάστασης είναι η μελέτη των αλλαγών που προκαλούνται καθώς ένα φαρμακευτικό μόριο εισέρχεται στη μεμβράνη. Κατά την είσοδο του μορίου προκαλούνται αλλαγές στη διάταξη των λιπιδίων της διπλοστιβάδας, οπότε ως επακόλουθο αποτέλεσμα παρατηρούνται μεταβολές και στη ρευστότητα της διπλοστιβάδας. Ουσιαστικά η ρευστότητα της λιποειδούς διπλοστιβάδας είναι συνέπεια των διαμορφωτικών αλλαγών των αλυσίδων των υδρογονανθράκων. 7.12 Φασματοσκοπία 2 Η-ΝΜR σε στερεή κατάσταση Για τη μελέτη των μορίων που είναι συνδεδεμένα με τη μεμβράνη γίνεται συχνά επισήμανση με δευτέριο των μορίων προσδετών και λαμβάνονται διάφορα φάσματα NMR. Προκύπτουν έτσι πληροφορίες για τη δομή και τη διαμόρφωση των συνδεδεμένων μορίων. Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται επίσης στην εύρεση του προσανατολισμού των ενώσεων που προσδένονται στη μεμβράνη. Απαιτούνται δευτερίωσεις του μορίου που εξετάζεται στα άκαμπτα δομικά του τμήματα. 113,118 117

Η χρήση μεθοδολογίας 2 Η-ΝΜR σε στερεή κατάσταση μπορεί να δώσει απαντήσεις για τη δραστική συγκέντρωση εισδοχής φαρμακευτικών μορίων. Η μεθοδολογία 2 Η-ΝΜR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να δώσει πληροφορίες για τον τοπογραφικό εντοπισμό των φαρμακευτικών μορίων με επιλεκτική δευτερίωση των φωσφολιπιδίων των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Συχνά τίθεται το ερώτημα αν η διαφορετική φαρμακευτική δράση δύο μορίων, (που μοιάζουν αρκετά δομικά, π.χ. αλφαξαλόνη και Δ 16 -αλφαξαλόνη), εξαρτάται άμεσα από το διαφορετικό βαθμό διείσδυσης στις μεμβράνες. Στην περίπτωση των αλφαξαλόνη και Δ 16 -αλφαξαλόνη παρατηρώντας διαφορές στο εμβαδό αντίστοιχων κορυφών σε φάσματα δευτερίου εκτιμήθηκε η έκταση της διείσδυσης των φαρμακευτικών μορίων σε συγκεκριμένη μεμβράνη. Η διαφορετική όμως βιολογική δράση πιθανόν να μην έχει σχέση μόνο με το ποσοστό διείσδυσης, αλλά και με το διαφορετικό τρόπο δράσης των μορίων. 113,118 7.13 Φασματοσκοπία 31 P και 13 C ΝΜR Η χρήση της φασματοσκοπίας 118 31 P επιτρέπει την παρατήρηση των διαμορφωτικών αλλαγών που παρατηρούνται σε συγκεκριμένη τοπογραφική θέση της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Για παράδειγμα μπορούν να παρατηρηθούν διαμορφωτικές μεταβολές στην πολική κεφαλή όταν διεισδύσει ένα βιοδραστικό μόριο. Το φάσμα 31 P εξαρτάται τόσο από τη χημική ανισοτροπία των πυρήνων του φωσφόρου όσο και από τις διπολικές αλληλεπιδράσεις πρωτονίου-φωσφόρου. Αν και ο πυρήνας του φωσφόρου είναι ευαίσθητος, η ευαισθησία μπορεί να βελτιωθεί με τη χρήση της τεχνικής της διασταυρούμενης πόλωσης. 113,118 Συγκεκριμένα, ο 31 P, είναι το μόνο σταθερό ισότοπο του Φωσφόρου, με ιδιοστροφορμή Ι = ½ και φυσική αφθονία 100%. H ευαισθησία του στο NMR είναι περίπου 7% σε σχέση με το 1 Η. Για το 31 P ο γυρομαγνητικός λόγος είναι 10,841 γ/10 7 rad T -1 s -1. Η παρουσία κάποιου φαρμακευτικού μορίου της κατηγορίας των ΑΤ 1 ανταγωνιστών στις μεμβράνες οδηγεί σε φάσματα που έχουν διαφορές συγκριτικά με τα φάσματα των αμιγών μεμβρανών. Οι διαφορές αυτές συνίστανται: (α) σε αλλαγή των εντάσεων κορυφών (β) σε αλλαγή χημικών μετατοπίσεων (γ) σε αλλαγή του πλάτους των φασματικών γραμμών. Τέτοιες μεταβολές στις φασματικές γραμμές δίνουν πληροφορίες για τις αλλαγές στις δυναμικές ιδιότητες των μεμβρανών λόγω της παρουσίας των φαρμακευτικών μορίων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις μπορούν να γίνουν τόσο σε φασμάτα NMR 13 C και όσο και σε 31 P. 124

Τα φάσματα 31 Ρ-NMR σε πρότυπες φωσφολιπιδικές και βιολογικές μεμβράνες καλύπτουν ένα εύρος χημικών μετατοπίσεων της τάξης των 50 ppm μέχρι 100 ppm. Η μορφή του φάσματος οφείλεται: i) στην ανισότροπη χημική μετατόπιση (CSA) των πυρήνων του φωσφόρου, ii) στις διπολικές αλληλεπιδράσεις πρωτονίου φωσφόρου και iii) στις ειδικές δομικές και δυναμικές συνθήκες που επικρατούν στις μεμβράνες. 119

120

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΔΟΜΕΤΡΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ (DSC) 121

122

8.1 Γενικά για τη Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης Η Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry- DSC), χρησιμοποιείται για τη μελέτη των μεταβάσεων, δηλαδή κατά τη θέρμανση ή ψύξη, ευρέος φάσματος υλικών όπως κεραμικά, πολυμερή, υγροκρυσταλλικά υλικά και συστήματα όπως οι λιπιδικές διπλοστιβάδες. Με τον όρο μεταβάσεις περιγράφονται οι μεταβολές που πραγματοποιούνται σε ένα σώμα όταν αυτό θερμαίνεται ή ψύχεται. Για παράδειγμα η τήξη ενός πολυμερούς είναι μία θερμική μετάβαση, ενώ η ψύξη μιας υγροκρυσταλλικής λιπιδικής διπλοστιβάδας είναι μία ψυκτική μετάβαση. Ένα Διαφορικό Θερμιδόμετρο αναπαρίσταται στο Σχήμα 8.1. Αποτελείται από ένα σύστημα ελέγχου θερμοκρασίας (με θερμαντές) το οποίο αυξάνει ή ελαττώνει κατά γραμμικό τρόπο τη θερμοκρασία του προς εξέταση δείγματος και του δείγματος αναφοράς. Η θέρμανση ή ψύξη γίνεται με σταθερό, όμοιο και προκαθορισμένο τρόπο, χρησιμοποιώντας πηγή θέρμανσης ή ψύξης. Το σύστημα ελέγχου αποτελείται από δύο βρόχους ελέγχου, οι οποίοι λειτουργούν για να διατηρήσουν το υπό μελέτη δείγμα και το δείγμα αναφοράς στην ίδια θερμοκρασία. Ο ένας βρόχος ελέγχει το μέσο ποσοστό θέρμανσης των δύο δειγμάτων, ενώ ο άλλος βρόχος εξαλείφει οποιαδήποτε διαφορά θερμοκρασίας (ΔT) προκαλείται από μια θερμοδυναμική μεταβολή στο δείγμα. Το ποσοστό ροής θερμότητας στο δείγμα μετράται και ρυθμίζεται η διαφορική θερμότητα (differential heat) προκειμένου να διατηρηθεί η διαφορά θερμοκρασίας των δύο δειγμάτων μηδέν. Αυτή η θερμότητα είναι ανάλογη προς τη στιγμιαία συγκεκριμένη θερμοχωρητικότητα του δείγματος C p (υπό σταθερή πίεση) και με την επιλογή πρότυπου γνωστής θερμοχωρητικότητας, είναι δυνατό να ληφθούν τα ακριβή στοιχεία θερμοχωρητικότητας για ένα άγνωστο δείγμα. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του θερμιδομέτρου υπάρχει σταθερή ροή ξηρού αερίου Ν 2 ώστε να είναι αδρανές το περιβάλλον των δειγμάτων. Τέλος υπάρχει υπολογιστής που καταγράφει τη θερμοκρασία (θερμογράφημα) και ρυθμίζει τη ροή της θερμότητας και ένα σύστημα ελέγχου (σχήμα 8.1). 114, 125 H ΔT, είναι ανάλογη προς τη μεταβολή της ενθαλπίας ΔH, τη θερμοχωρητικότητα C p υπό σταθερή πίεση και τη συνολική θερμική αντίσταση R. Αυτή η θερμική αντίσταση αποτελείται από δύο συστατικά, R 0 και R S. Το R 0 είναι η αντίσταση του οργάνου και R S είναι η αντίσταση του ίδιου του δείγματος συμπεριλαμβανομένης και της ατελούς θερμικής επαφής. Ισχύει η σχέση: dh/dt=1/r 0 (dt/dt) (σχέση 8.1) όπου dt/dt είναι ο ρυθμός σαρώσεως. 123

Σχήμα 8.1: Διάταξη οργάνου διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης. Τα κύρια συστατικά της είναι α) Θερμαντές με τους οποίους επιτυγχάνεται γραμμική αύξηση ή ελάττωση της θερμοκρασίας β) οι κυψελίδες στις οποίες τοποθετούνται τα δείγματα αναφοράς και μελέτης γ) αδρανής ατμόσφαιρα αζώτου. Η ΔQ όταν συμβαίνει μία μετάβαση μετασχηματισμού στο δείγμα καταγράφεται ως θερμογράφημα 8.2 Χρήσιμες παράμετροι στη Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης Η παράμετρος που καταγράφεται κατά τη διεξαγωγή θέρμανσης ή τήξης του δείγματος είναι η διαφορική ειδική θερμοχωρητικότητα υπό σταθερή πίεση (C p =C p υλικού - C p υλικού αναφοράς ), σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία. Στην περίπτωση που στο δείγμα δεν υφίσταται κάποιο θερμικό γεγονός, ο καταγραφέας καταγράφει μία σταθερή ευθεία γραμμή βάσης που δηλώνει ότι η εξοδική αναφορική ισχύς είναι μηδέν. Όταν όμως συντελεστεί κάποιο θερμικό γεγονός, τότε ως αποτέλεσμα προκύπτει μία καμπύλη με τα κοίλα στραμμένα είτε προς τα πάνω είτε προς τα κάτω. Η φορά με την οποία γίνεται η καταγραφή εξαρτάται από το αν το θερμικό γεγονός είναι ενδόθερμο ή εξώθερμο. Στο Σχήμα 8.2 απεικονίζεται διαγραμματικά η μεταβολή της διαφορικής ειδικής θερμοχωρητικότητας υπό σταθερή πίεση (C p ) σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία για μία ενδόθερμη μεταβολή. 124

Σχήμα 8.2: Μεταβολή της διαφορικής ειδικής θερμοχωρητικότητας υπό σταθερή πίεση (C p ) σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία για μία ενδόθερμη μεταβολή. Στην καμπύλη υποδεικνύονται οι χρήσιμοι παράμετροι για την ανάλυση των αποτελεσμάτων Οι χρήσιμες παράμετροι μίας ενδόθερμης ή εξώθερμης καμπύλης που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των αποτελεσμάτων είναι οι ακόλουθες: Θερμοκρασία μετασχηματισμού φάσης T m. Είναι η θερμοκρασία στην οποία η ειδική θερμοχωρητικότητα C p έχει τη μέγιστη τιμή της. Για μία συμμετρική καμπύλη η T m αντιπροσωπεύει τη θερμοκρασία στην οποία η μετάβαση (π.χ. από τη στερεή στην υγρή-κρυσταλλική φάση) έχει κατά το ήμισυ ολοκληρωθεί. Θερμοκρασία στην οποία αρχίζει ο θερμικός μετασχηματισμός (Τ onset ). Το εύρος στο ήμισυ της καμπύλης Τ m1/2. Το εμβαδόν που περικλείεται από την καμπύλη, το οποίο αντιστοιχεί στην ενθαλπία μετασχηματισμού (ΔΗ) εκφράζεται σε kcal/mol ή σε J/g. 8.3 Μεταβάσεις φάσης λιπιδικής διπλοστιβάδας Αναφέρθηκε ήδη ότι η Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης βρίσκει ευρείες εφαρμογές σε διάφορα υλικά και συστήματα. Στη διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι θερμικές μεταβολές μοντέλων λιποειδών διπλοστιβάδων, όπου ενσωματώθηκαν χοληστερόλη ή κάποιο φάρμακευτικό μόριο ή και τα δύο. Οι λιποειδείς διπλοστιβάδες μπορούν να υφίστανται σε μορφή πηκτής (gel) ή υγρής κρυστάλλικής φάσης ανάλογα με τη θερμοκρασία. Η μετάβαση φάσης μεταξύ αυτών των δύο καταστάσεων, μπορεί να παρατηρηθεί με χρήση της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης. Στη φάση πηκτής, οι αλκυλικές αλυσίδες επεκτείνονται πλήρως. Κατά τη θερμοκρασία μετάβασης, οι αλκυλικές αλυσίδες διαστρεβλώνονται και συμβαίνει trans-gauche ισομερίωση. Στο σχήμα 8.3 παρουσιάζονται διάφορες 125

μεσομορφικές καταστάσεις μιας λιποειδούς διπλοστιβάδας διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης σε ένα θερμογράφημα DSC. Σχήμα 8.3: Μετάβαση φάσης λιπιδικής διπλοστιβάδας DPPC, όπως καταγράφεται με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης: (α) φάση στερεάς πηκτής (gel phase), (β) προμετάβαση φάσης (pretrasition phase), (γ) κυματοειδής φάση (ripple phase), (δ)μετάβαση φάσης (transition phase), (ε) υγρή κρυσταλλική φάση (liquid phase). Οι παράγοντες οι οποίοι μπορούν να επηρεάσουν τη θερμοκρασία μετάβασης φάσης μίας λιπιδικής διπλοστιβάδας είναι: 126,127 To μήκος των αλυσίδων: Συγκεκριμένα παρατηρείται αύξηση της θερμοκρασίας μετάβασης με αύξηση του μήκους των αλυσίδων Η ακορεστότητα: Η ύπαρξη ακόρεστων δεσμών στις αλυσίδες των λιπιδίων, προκαλεί ελάττωση στη θερμοκρασία μετάβασης φάσης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι πολλαπλοι δεσμοί ελαττώνουν την ευελιξία και τη δυνατότητα οργάνωσης (packing) των αλκυλικών αλυσίδων με απόρροια την εξασθένηση των δυνάμεων Van der Waals. 126

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN Φασματογράφος Perkin-Elmer NIR FT-Raman εγκατεστημένος στο εργαστήριο Φυσικοχημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών. 127

128

9.1 Σκέδαση Raman Με τον όρο σκέδαση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας περιγράφεται το φαινόμενο της απορρόφησης και επανεκπομπής φωτός. H φασματοσκοπία Raman χαρακτηρίζεται από το φαινόμενο σκέδασης Raman που προκύπτει λόγω αλληλεπίδρασης της ακτινοβολίας με την ύλη. Συγκεκριμένα, μονοχρωματικό ορατό φως από laser, σκεδάζεται από το δείγμα. Το σκεδαζόμενο φως μπορεί να παρατηρηθεί από οποιαδήποτε κατάλληλη διεύθυνση, συνήθως όμως, η παρατήρηση γίνεται σε διεύθυνση κάθετη με την προσπίπτουσα ακτινοβολία. Το φαινόμενο κατά το οποίο φως συχνότητας ν 0 σκεδάζεται προς όλες τις διευθύνσεις με ένταση της τάξεως του 1/1000 της εντάσεως της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, χωρίς αλλαγή της συχνότητας ονομάζεται σκέδαση Rayleigh. Παρατηρείται όμως και ανελαστική (μεταβολή συχνότητας) σκέδαση με συχνότητες ν i και ισχύει η παρακάτω σχέση για την ενέργεια: ΔΕ= h (ν 0 - ν i ) (σχέση 10.1) όπου h=6.6262 x 10-34 J s αποτελεί τη σταθερά του Planck και ΔΕ αντιστοιχεί στη διαφορά ενέργειας μεταξύ δύο δονητικών καταστάσεων του δείγματος. Η συχνότητα ν 0 συνήθως είναι ορατής ακτινοβολίας, αλλά η διαφορά (ν 0 - ν i ) είναι υπέρυθρης ακτινοβολίας. Η ανελαστική σκέδαση ν i ν 0 ονομάζεται σκέδαση Raman. 128 Σχήμα 9.1: Η συχνότητα της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας Raman είναι ν o ± ν mol, όπου ν mol ορίζεται ότι είναι η συχνότητα δόνησης ενός μορίου. 9.2 Γραμμές Stokes και γραμμές anti-stokes Στην περίπτωση της ανελαστικής σκέδασης, όταν η αλληλεπίδραση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με ένα μόριο, αναγκάζει ένα ηλεκτρόνιο να μεταβεί σε υψηλότερη ενεργειακή κατάσταση, παραμένει σε αυτή για ελάχιστο χρονικό διάστημα (~ 10-11 s) και στη συνέχεια μπορεί να συμβεί μία από τις πιο κάτω περιπτώσεις: 129

Στην πρώτη περίπτωση αν το μόριο έχει αποκτήσει ενέργεια ΔΕ = hν m, όπου ν m η συχνότητα δόνησης του μορίου, τότε η ενέργεια του σκεδαζόμενου φωτονίου θα μειωθεί κατά το ίδιο ποσό, ώστε να διατηρηθεί η ενέργεια. Η ενέργειά του λοιπόν θα είναι hν ο hν m και η συχνότητά του ν ο - ν m. Τα φωτόνια αυτά δίνουν τις λεγόμενες γραμμές Stokes στο φάσμα Raman. Στη δεύτερη περίπτωση, το μόριο χάνει ενέργεια ΔΕ = hν m. Η ενέργεια της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας θα είναι hν o + hν m και η συχνότητα ν ο + ν m, με αποτέλεσμα να παρατηρούνται οι γραμμές anti-stokes στο φάσμα Raman. Σχήμα 9.2: Η διαφορά μεταξύ γραμμών Stokes και anti-stokes. Όταν παρατηρούνται γραμμές Stokes η ενέργεια του σκεδαζόμενου φωτονίου μειωνεται, ενώ όταν παρατηρούνται γραμμές anti-stokes, η ενέργεια της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας αυξάνεται. 9.3 FT (Fourier Transform) Raman Στη συμβατική φασματοσκοπία Raman μετράται η ένταση της ακτινοβολίας σε συνάρτηση με τη συχνότητα ή τον κυματαριθμό. Στους σύγχρονους φασματογράφους Raman εφαρμόζεται η FT (Fourier Transform) Raman, στην οποία μετράται η ένταση της ακτινοβολίας πολλών μηκών κύματος ταυτόχρονα. Το φάσμα στη συνέχεια μετατρέπεται σε συμβατικό φάσμα με μετασχηματισμό Fourier, 130

με τη χρήση υπολογιστικού προγραμμάτος. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της τεχνικής FT είναι ότι μετασχηματίζονται όλα τα μήκη κύματος ταυτόχρονα, επομένως μειώνεται ο χρόνος ανάλυσης του δείγματος. Το γεγονός αυτό παρέχει επίσης βελτιωμένη ανάλυση και λόγους σήμα προς θόρυβο (S/Ν) μεγαλύτερους σε σχέση με τη συμβατική φασματοσκοπία Raman. 129 9.4 Οργανολογία Raman Οι φασματογράφοι FT-Raman διαθέτουν laser Nd:YAG με ακτινοβολία διέγερσης στα 1064 nm (9.395 cm -1 ). Το συγκεκριμενο laser, το οποίο βρίσκεται στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (NIR), έχει ως μειονέκτημα τη μείωση της εντάσεως του σήματος κατά 16 φορές σε σχέση με το ορατό laser στα 514,5 nm. Επειδή η ακτινοβολία Raman έχει πολύ μικρή ένταση, η οποία είναι ανάλογη προς την ένταση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, απαιτείται η χρήση μεγάλης εντάσεως μονοχρωματική δέσμης. Για το λόγο αυτό η φασματοσκοπία Raman δεν είχε βρει ευρείες εφαρμογές στο παρελθόν, γιατί δεν είχε αναπτυχθεί η απαραίτητη τεχνολογία. Μετά την ανακάλυψη των φωτεινών πηγών Laser που παρέχουν αυστηρώς μονοχρωματική ακτινοβολία μεγάλης εντάσεως, η φασματοσκοπία Raman άρχισε να βρίσκει πολλές χημικές εφαρμογές. Στις σύγχρονές διάταξεις Raman χρησιμοποιείται κυρίως ανιχνευτής InGaAs. Eπίσης, πολύ σημαντικό τμήμα της οργανολογίας του οργάνου είναι τα οπτικά φίλτρα. Αρχικά πρέπει να εξαλείφεται η γραμμή Rayleigh από τη διέγερση του laser για να μην κορεστεί ο ανιχνευτής. Η γραμμή Rayleigh, η οποία είναι 10 6 φορές πιο ισχυρή από τις Stokes, πρέπει να φιλτράρεται με τέτοιο τρόπο, ώστε να είναι συγκρίσιμη με την ισχυρότερη γραμμή του φάσματος Raman. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιμοποιούνται διηλεκτρικά φίλτρα μεγάλης διαδρομής σε σειρά, καθώς και διάφοροι άλλοι τύποι φίλτρων. 131

Σχήμα 9.3: Διάταξη φασματοσκοπίας Raman. Η δέσμη του laser οδηγείται στο δείγμα με τη βοήθεια ενός περιστρεφόμενου πρίσματος και ενός φακού εστίασης. Η σκεδαζόμενη ακτινοβολία από το δείγμα συλλέγεται και ο διαχωριστής δέσμης την κατευθύνει σε ένά ακόμα φακό εστίασης. Μία οπτική ίνα οδηγεί το συλλεγόμενο εκπεμπόμενο φως στο ανιχνευτή (στο φασματόμετρο). Τέλος εξάγονται οι πληροφορίες στην οθόνη που καταγράφεται το φάσμα Raman. 9.5 Εφαρμογές της φασματοσκοπίας Raman στις λιποειδείς διπλοστιβάδες Η φασματοσκοπία Raman χρησιμοποιείται συχνά για τη συλλογή πληροφοριών σε πειράματα όπου τα δείγματα περιέχουν μόνο λιπιδικές διπλοστιβάδες (π.χ. DPPC, DMPC κλπ.) ή λιπιδικές διπλοστιβάδες με φάρμακα. Ενδεικτικά, το φάσμα Raman των διπλοστιβάδων DPPC στους 25 C παρουσιάζεται στο σχήμα 9.4. Από την ερμηνεία των διάφορων περιοχών του φάσματος μπορούν να ληφθούν αρκετές πληροφορίες (για παράδειγμα για τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλκυλικών αλυσίδων των φωσφολιπιδίων και κατά συνέπεια για τη διευθέτησή τους). Αναλυτικά, οι χαρακτηριστικότερες κορυφές που παρουσιάζονται στο φάσμα Raman των διπλοστιβάδων DPPC στους 25 C αναφέρονται στον πίνακα 9.1. 130 132

Ένταση 2,38 2,3 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 Int 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,00 3500,0 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400,0 Raman Shift / cm-1 cm -1 Σχήμα 9.4: Φάσμα Raman των διπλοστιβάδων DPPC στους 25 C Κυματαριθμοί (cm -1 ) 133 Τύπος Δόνησης 714 Συμμετρική δόνηση έκτασης του δεσμού C-N της χολίνης 760 Συμμετρική δόνηση έκτασης του δεσμού O-P-O 822 Μη συμμετρική δόνηση έκτασης του δεσμού O-P-O 889 Παλινδρομική κάμψη γωνιών (rocking) CH 3 και δόνηση έκτασης του δεσμού C-C της τελικής ομάδας CH 2 CH 3 968 Ασύμμετρη δόνηση έκτασης του δεσμού C-N της χολίνης 1000-1150 Δονήσεις έκτασης του δεσμού C-C της αλκυλικής αλυσίδας 1294 Δονήσεις στρέψης των μεθυλενίων της αλκυλικής αλυσίδας 1436 "Ψαλιδοειδής" δόνηση των μεθυλενίων της αλκυλικής αλυσίδας 1721 και 1735 Δόνηση τάσης της ομάδας του καρβονυλίου 2845 Συμμετρική δόνηση έκτασης της ομάδας των μεθυλενίων 2880 2935 Μη συμμετρική δόνηση έκτασης της ομάδας των μεθυλενίων Συμμετρική δόνηση έκτασης του δεσμού C-H του τελικού μεθυλίου της αλκυλικής αλυσίδας 3040 Μη συμμετρική έκταση των μεθυλίων της χολίνης Πίνακας 9.1:Οι χαρακτηριστικότερες κορυφές που παρουσιάζονται στο φάσμα Raman των διπλοστιβάδων DPPC στους 25 C

9.5.1 Περιοχή 2800-3100 cm -1 Οι κορυφές τις περιοχής αυτής περιγράφουν τη δόνηση τάσης του δεσμού C-H των μεθυλενίων και του τελικού μεθυλίου των αλκυλικών αλυσίδων της λιπιδικής διπλοστιβάδας DPPC. Οι κορυφές, στα 2880 cm -1 και 2850 cm -1, αποδίδονται στη μη συμμετρική και συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού C-H των μεθυλενίων αντίστοιχα, ενώ η κορυφή στα 2935 cm -1 αποδίδεται στη συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού C-H του τελικού μεθυλίου της υδρογονανθρακικής αλυσίδας. Ακόμα δύο κορυφές τις περιοχής αυτής εμφανίζονται στα 2960 cm -1, η οποία αντιστοιχεί στην ασύμμετρη δόνηση τάσης του δεσμού C-H του τελικού μεθυλίου και στα 3040 cm -1 που αντιστοιχεί στη συμμετρική δόνηση τάσης του μεθυλίου της χολίνης (σχήμα 9.5). Με τη μελέτη της περιοχής αυτής του φάσματος Raman, προκύπτουν πληροφορίες για τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλκυλικών αλυσίδων γειτονικών μορίων DPPC και κατά συνέπεια για τη διευθέτησή τους. Οι εντάσεις των κορυφών αυτής της περιοχής του φάσματος Raman είναι οι πιο ισχυρές και ξεπερνούν κατά πολύ τις εντάσεις των υπολοίπων περιοχών του. Επιπρόσθετα, οι εντάσεις και οι συχνότητες των κορυφών αυτών μεταβάλλονται εξαιτίας των αλλαγών στη διάταξη των αλυσίδων κατά τη μετάβαση από την στερεή στην υγρή κρυσταλλική φάση. 0,40 0,35 2880 2850 Ένταση Int 0,30 0,25 0,20 0,15 Ε 0,10 3040 2960 2935 0,05 3100 3080 3040 3000 2960 2920 2880 2840 2800 cm -1 Σχήμα 9.5: Περιοχή 2800 3100 cm -1 στο φάσμα Raman των διπλοστιβάδων DPPC (25 ºC). 134

Η εισδοχή φαρμακευτικών μορίων στις λιποειδείς διπλοστιβάδες προκαλεί περαιτέρω αλλαγές στη διευθέτησή τους και κατά συνέπεια μεταβολές στην ένταση και στη συχνότητα των κορυφών. Ο λόγος των εντάσεων των κορυφών στα 2880 cm -1 και 2850 cm -1, δηλαδή ο λόγος Ι 2850/2880 παρέχει πληροφορίες για τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλκυλικών αλυσίδων, οι οποίες καθορίζουν το «πακετάρισμα» των διπλοστιβάδων. Επιπλέον, ο λόγος των εντάσεων Ι 2935/2880 δίνει πληροφορίες για τις ενδομοριακές και διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλυσίδων των φωσφολιπιδίων. 129-135 9.5.2 Περιοχή 1000 1200 cm -1 Στην περιοχή 1000-1200 cm -1 παρατηρούνται οι δονήσεις των δεσμών C-C των αλκυλικών αλυσίδων. Οι χαρακτηριστικές κορυφές εμφανίζονται στα 1060 cm -1, στα 1090 cm -1 και στα 1130 cm -1. Πιο έντονες είναι οι κορυφές στα 1060 cm -1 και 1130 cm -1 οι οποίες αντιστοιχούν στην εκτός και στην επί του επιπέδου δόνηση τάσης του δεσμού C-C αντίστοιχα, για τις trans διαμορφώσεις των αλκυλικών αλυσίδων. Η κορυφή στα 1090 cm -1 είναι μικρότερης έντασης και αντιστοιχεί στη δόνηση τάσης του δεσμού C-C των gauche διαμορφώσεων (Σχήμα 9.6). 0,14 0,13 0,12 0,11 1060 Ένταση 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 1130 1090 1200 1180 1160 1140 1120 1100 1080 1060 1040 1020 1000 cm -1 Σχήμα 9.6: Περιοχή 1000-1200 cm -1 του φάσματος Raman των διπλοστιβάδων DPPC στους 25 ºC. 135

Οι εντάσεις και οι συχνότητες των κορυφών αυτών επηρεάζονται εύκολα από διαμορφωτικές μεταβολές που πραγματοποιούνται κατά μήκος των αλκυλικών αλυσίδων των φωσφολιπιδίων. Περισσότερο επηρεάζονται από τις διαμορφωτικές μεταβολές, οι κορυφές στα 1090 cm -1 και 1130 cm -1. Με την αύξηση της θερμοκρασίας, ένα ποσοστό των αλυσίδων αλλάζουν διαμόρφωση από trans σε gauche. Η ένταση της κορυφής στα 1130 cm -1, η οποία αποδίδεται στη δόνηση C-C των trans διαμορφώσεων, μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Αντιθέτως, αυξανομένης της θερμοκρασίας, εμφανίζεται αύξηση στην ένταση της κορυφής στα 1090 cm -1, η οποία αντιστοιχεί στη δόνηση των gauche διαμορφώσεων. Ο λόγος των εντάσεων Ι 1090/1130 δίνει πληροφορίες για τις για τις αλλαγές στις στην ισομερείωση gauche:trans στις αλκυλικές αλυσίδες. 136

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΑΚΤΙΝΩΝ-Χ Το σύγχροτρο ELETTRA (άνω) εγκατεστημένο στην Τριέστη της Ιταλίας. Με κόκκινο εμφανίζονται οι πηγές όπου τροφοδοτούν τα διάφορα ερευνητικά εργαστήρια. Ένα τέτοιο εργαστήριο παρουσιάζεται στην κάτω φωτογραφία. 137

138

10.1 Περίθλαση ακτίνων-x Η περίθλαση ακτίνων-x αποτελεί μία ευρύτατα χρησιμοποιούμενη φυσικοχημική τεχνική, η οποία εφαρμόζεται σε κρυσταλλικές δομές ή γενικά σε συστήματα τα οποία παρουσιάζουν περιοδικότητα. Οι βιολογικές μεμβράνες αποτελούν ένα τέτοιο σύστημα, αφού αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες λιπιδικές διπλοστιβάδες στις οποίες είναι ενσωματωμένα διάφορα μόρια βιολογικής σπουδαιότητας. Όπως έχει ήδη εξηγηθεί, το πολικό τμήμα των λιπιδικών διπλοστιβάδων περιβάλλεται από υδάτινη στιβάδα. Στις μελέτες μας, όπως έχει ήδη αναφερθεί και για τις προηγούμενες τεχνικές, χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα λιπιδικών διπλοστιβάδων. Αποτελούνταν δηλαδή από ενυδατωμένη φωσφατιδυλοχολίνη, όπου σε αυτήν ενσωματωνόταν η ολμεσαρτάνη. Σε μερικά δείγματα η ενσωμάτωση περιλαμβάνε το ύψιστης βιολογικής σημασίας μόριο χοληστερόλη. Η διαδικασία παρασκευής αυτών των πλήρως ενυδατωμένων συστημάτων (multilamellar vesicles) δημιουργούσε πολυστιβαδικά λιποσώματα, τα οποία διατάσσονταν κανονικά και έδιναν 1-2 τάξεις περιθλάσεως (diffraction orders). Με χρήση του νόμου του Bragg nλ= 2d. ημθ υπολογίζεται το πάχος της λιπιδικής διπλοστιβάδας (d spacing). To n υποδηλώνει τον αριθμό της τάξης και το θ τη γωνία Bragg (θ η γωνία κατά την οποία δέχεται μονοχρωματική ακτινοβολία ένα επίπεδο, στην περίπτωσή της μελέτης μας είναι η γωνία κατά την οποία δέχεται ακτινοβολία η λιπιδική διπλοστιβάδα). To λ αποτελεί το μήκος της ακτινοβολίας (στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε Κ α ακτινοβολία). Σχήμα 10.1: Η γωνία θ και η απόσταση (πάχος) d, όπως περιγράφονται στο νόμο του Bragg για ένα πολυστιβαδικό σύστημα. 139

Σχημα 10.2: (άνω) Απεικόνιση ενός πειράματος περίθλασης ακτίνων-χ σε ένα δείγμα που περιέχει πολυστιβαδικά λιποσώματα (MLVs). (κάτω) Περίθλαση ακτίνων-χ σε λιπιδικές διπλοστιβάδες. Το φάσμα ακτίνων-χ αποτελείται μόνο από δύο τάξεις περίθλασης που παρατηρούνται στις υγρές κρυσταλλικές μεμβράνες. Η προσομοίωση του φάσματος μπορεί να δώσει σημαντικές παραμέτρους της μεμβράνης (d H, d c, d w και d Β ). Ανάλογα με τη γωνία που χρησιμοποιείται, τα πειράματα χαρακτηρίζονται ως α) ευρείας γωνίας (>15 ) ή με το διεθνή όρο WAX (wide angle x-ray diffraction) β) μικρής γωνίας (<15 ) ή με το διεθνή όρο SAX (small angle x-ray diffraction). Τα πειράματα SAX παρέχουν τις εξής πληροφορίες: Ηλεκτρονιακή πυκνότητα της διπλοστιβάδας χωρίς ή με παρουσία φαρμάκων (σχήματα 10.3 και 10.4). Η διαφορά των δύο ηλεκτρονιακών προφίλ δείχνει τον τοπογραφικό εντοπισμό των φαρμάκων. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη λήψη αυτής της πληροφορίας είναι η λιπιδική διπλοστιβάδα να παρουσιάζει αρκετές τάξεις περιθλάσεως. Αυτό παρατηρείται μόνο στις μερικώς ενυδατωμένες λιπιδικές διπλοστιβάδες Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκαν πλήρως ενυδατωμένες λιπιδικές διπλοστιβάδες. 140

Σχήμα 10.3: Ηλεκτρονιακό προφίλ πυκνότητας λιπιδικής διπλοστιβάδας κατά μήκος της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Όπως παρατηρείται κατά μήκος της αλκυλικής αλυσίδας το ηλεκτρονιακό προφίλ πυκνότητας είναι μικρότερο συγκριτικά με αυτό της πολικής κεφαλής. Αυτό μπορεί να κατανοηθεί από το γεγονός ότι η πολική κεφαλή περιλαμβάνει άτομα οξυγόνου, αζώτου και φώσφορου τα οποία έχουν μεγαλύτερο μοριακό βάρος από τους άνθρακες και υδρογόνα. Ο γλυκερινικός σκελετός όπου υπάρχουν άτομα οξυγόνου παρουσιάζει ηλεκτρονιακή πυκνότητα μεγαλύτερη από αυτή της αλκυλικής αλυσίδας αλλά μικρότερη από της πολικής κεφαλής. Τα ηλεκτρονιακά αυτά προφίλ χρησιμοποιούνται για να εντοπίσουν τη θέση κατανομής φαρμακευτικών μορίων. Αυτά στη θέση εισδοχής θα παρουσιάζουν αυξημένη ηλεκτρονιακή πυκνότητα. 136 141

Σχήμα 10.4: Ένα παράδειγμα όπου καταδεικνύεται ο τοπογραφικός εντοπισμός της Δ 8 - τετραϋδροκανναβινόλης και του ιωδίου του ιωδιωμένου παράγωγού του με χρήση ακτίνων-χ παριστάνεται στο παραπάνω σχήμα. ηλεκτρονιακό προφίλ της διαφοράς μεταξύ της λιπιδικής Η διαφορά Β-Α παρουσιάζει το διπλοστιβάδας της διμυριστικής φωσφατιδυλοχολίνης που περιέχει Δ 8 -τετραϋδροκανναβινόλη και αυτής της διμυριστικής φωσφατιδυλοχολίνης. Όπως παρουσιάζεται άνω από το σχήμα η Δ 8 - τετραϋδροκανναβινόλη εντοπίζεται στο ενδιάμεσης πολικότητας τμήμα της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Η διαφορά C-B παρουσιάζει το ηλεκτρονιακό προφίλ της διαφοράς μεταξύ της λιπιδικής διπλοστιβάδας της διμυριστικής φωσφατιδυλοχολίνης που περιέχει 5 -Ι- Δ 8 -τετραϋδροκανναβινόλη και αυτής που περιέχει Δ 8 -τετραϋδροκανναβινόλη. Το ιώδιο είναι άτομο μεγάλου μοριακού βάρους και μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί με τη χρήση ακτίνων-χ. Η μέθοδος αυτή παρέχει τον τοπογραφικό εντοπισμό του ιωδίου. Εφαρμόζεται όπως στην περίπτωση αυτή όταν τα δύο μόρια παρουσιάζουν παρόμοια βιολογική δράση. 136 Πάχος λιποστιβάδας πάχος υδάτινης στιβάδας. Η πληροφόρια αυτή είναι εφικτό να αποκτηθεί, όταν παρατηρείται μικρός αριθμός τάξεων περιθλάσεως όπως συμβαίνει με τις πλήρως ενυδατωμένες λιπιδικές διπλοστιβάδες (σχήμα 10.5). 142

Σχήμα 10.5: Πειράματα SAXS σε διπαλμιτικές φωσφατιδυλοχολίνες απουσία και παρουσία του δραστικού κανναβινοειδούς AΜG-3 και του μη δραστικού AΜG-18. Παρατηρούνται δύο ή τρεις τάξεις κορυφές περίθλασης (diffraction orders). Αυτές είναι ικανές για να παρέχουν πληροφορίες όσο αφορά το πάχος των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Η μέτρηση του πάχους της διπλοστιβάδας παρουσία και απουσία φαρμακευτικού μορίου δίνει πολύτιμες πληροφορίες όσο αφορά φαινόμενα όπως αυτού της αλληλοεισχώρησης (interdigitation). 137 Τα πειράματα WAX δίνουν πληροφορίες για τη ρευστότητα της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Όταν η λιπιδική διπλοστιβάδα βρίσκεται σε φάση πηκτής οι ανθρακικές αλυσίδες των φωσφατιδυλοχολινών έχουν κλίση προς το κάθετο επίπεδό τους. Αυτό παρατηρείται στα πειράματα WAX με κορυφή στα 4,22 Å, η οποία φέρει ώμο στα 4.12 Å. Στη προμετάβαση μετασχηματισμού ο ώμος με την κορυφή συνενώνονται σε μία συμμετρική κορυφή στα 4.21 Å. Στην υγρή κρυσταλλική φάση δεν παρατηρείται καμία κορυφή (σχήμα 10.6). 143

Σχήμα 10.6: Πειράματα WAXS σε διπαλμιτικές φωσφατιδυλοχολίνες απουσία και παρουσία του δραστικού κανναβινοειδούς AΜG-3 και του μη δραστικού AMG-18. Τα πειράματα αυτά όπως επεξηγήθηκε δίνουν πληροφορίες για τη μεσομορφική κατάσταση μίας λιπιδικής διπλοστιβάδας παρουσία ή απουσία φαρμακευτικού μορίου. Για παράδειγμα στους 45 ο C και τα τρία δείγματα βρίσκονται στην υγρή κρυσταλλική φάση. Στους 20 C μόνο η διπλοστιβάδα της διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης και αυτής που περιέχει το μη δραστικό κανναβινοειδές AMG-18 βρίσκονται στη φάση πηκτής. Η λιπιδική διπλοστιβάδα που περιέχει το δραστικό κανναβινοειδές βρίσκεται σε μία ενδιάμεση φάση μεταξύ πηκτής και υγρής κρυσταλλικής φάσης. 137 Τα πειράματα τα οποία αναφέρονται στη διδακτορική διατριβή εκτελέστηκαν υπό την καθοδήγηση του ερευνητή Δρ. Μ. Rappolt στο Ευρωπαϊκό Κέντρο της Τεργέστης (Trieste), όπου υπάρχουν ισχυρές πηγές ακτινοβολίας του συγχρότρου. Σε σύγκριση με τις συμβατικές πηγές, αυτές που παράγονται από τα σύγχροτρα είναι δέκα χίλιαδες φορές ή περισσότερο ισχυρές. Με τον τρόπο αυτό, ο χρόνος των 144

πειραμάτων επιταχύνεται σημαντικά. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα των μη συμβατικών αυτών πηγών ακτίνων-x είναι ότι μπορούν να γίνονται παρατηρήσεις φαινομένων βιολογικών συστημάτων, που πραγματοποιούνται σε μικρό χρονικό διάστημα. Το μειονέκτημα που παρουσιάζει η χρήση του συγχρότρου είναι ότι χρειάζονται δαπανηρές εγκαταστάσεις. Στην Ελλάδα για παράδειγμα δεν υπάρχει τέτοια εγκατάσταση. Τα παραπάνω πλεονεκτήματα της τεχνικής, την καθιστούν ως συμπληρωματική της συμβατικής ή κλασικής φασματοσκοπίας περίθλασης ακτίνωνx. 10.2 Σύγχροτρον Αυστριακής Ακαδημίας Το συνεργαζόμενο εργαστήριο του ΙΒΝR (Institute of Biophysics and Nanosystem Research) διαθέτει 2.4 Gev, τρίτης γενιάς πηγή ακτίνοβολίας συγχροτρον, η οποία ονομάζεται Elettra και τέταρτης γενιάς πηγή φωτός laser (Fermi & Elettra). Σχήμα 10.7: Αριστερά, το σύγχροτρο ELETTRA εγκατεστημένο στην Τριέστη της Ιταλίας. Με κόκκινο εμφανίζονται οι πηγές όπου τροφοδοτούν τα διάφορα ερευνητικά εργαστήρια. Ένα τέτοιο εργαστήριο παρουσιάζεται στα δεξιά. Στο σύγχροτρο είναι διαθέσιμες 24 πηγές φωτός (beamlines) και αντίστοιχοι πειραματικοί σταθμοί. Ένας από αυτούς ανήκει στο Ερευνητικό Ινστιτούτο Βιοφυσικής και Νανοσυστημάτων, το οποίο αποτελεί τμήμα της Αυστριακής Ακαδημίας. Σε συνεργασία με το ΙΒΝR διατίθεται ετήσιως περιορισμένος πειραματικός χρόνος εκτέλεσης πειραμάτων από την ερευνητική μας ομάδα. 145

Σχήμα 10.8: Η πηγή στο Ερευνητικό Ινστιτούτο της Αυστρίας (ΙΒΝ) όπου διεξάγονται πειράματα Ακτίνων-Χ SAXS και WAX. Το σύστημα αποτελείται από τρία τμήματα. Τα δύο αριστερά αποτελούν την τροφοδοσία και οπτική διευθέτηση μέσων φακών ώστε οι ακτίνες-χ να κατευθυνθούν προς το δείγμα. Στο πειραματικό τμήμα προς τα δεξιά παριστάνεται η κατεύθυνση των παραγόμενων και εστιασμένων ακτίνων-χ όπου οδηγούνται μέσω του ανιχνευτή στην καταγραφή της περίθλασής τους. 146

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11-ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ ΛΕΞΙΚΟ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΟΡΩΝ 147

148

Στο προσάρτημα αυτό δίνονται ορισμοί και διευκρινιστικά στοιχεία για τους ιατρικούς όρους που χρησιμοποιήθηκαν στο θεωρητικό υπόβαθρο της διδακτορικής διατριβής. Οι ιατρικοί όροι δίνονται με αλφαβητική σειρά. Αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια (ΑΕΕ) 138-141 Το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο (ΑΕΕ) ορίζεται ως μία αιφνίδια νευρολογική βλάβη ή έλλειμμα λόγω ισχαιμίας ή αιμορραγίας στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Τα ισχαιμικά εγκεφαλικά επεισόδια (ΙΕΕ) αποτελούνται από τοπική απόφραξη ενός αγγείου, με αποτέλεσμα τη μείωση προσφοράς οξυγόνου και γλυκόζης στον εγκέφαλο με τις συνεπακόλουθες μεταβολικές διαταραχές. Λίγα λεπτά μετά την απόφραξη ενός αγγείου και τη διακοπή προσφοράς αίματος επέρχεται θάνατος των νευρικών κυττάρων στο κέντρο της βλάβης. Σε μία περιοχή γύρω από τον πυρήνα κεντρικής βλάβης υπάρχει λειτουργικά επηρεασμένος (αλλά πάντως βιώσιμος), ιστός αιματούμενος από παράπλευρα αγγεία. Αυτή η περιοχή μπορεί με έγκαιρη επέμβαση να σωθεί, διαφορετικά θα νεκρωθεί από τον κυτοτοξικό βιολογικό καταρράκτη που ακολουθεί την ισχαιμία. Για το λόγο αυτό το ΑΕΕ αποτελεί μία επείγουσα κατάσταση όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου. Υπάρχουν βέβαια πολλές ομοιότητες μεταξύ των δύο αυτών περιστατικών αλλά και δύο βασικές διαφορές: Η απόφραξη μιας στεφανιαίας αρτηρίας οδηγεί πάντα σε έμφραγμα, ενώ δε συμβαίνει το ίδιο με απόφραξη μίας εγκεφαλικής αρτηρίας λόγω της πλούσιας παράπλευρης κυκλοφορίας και της διπλής αιμάτωσης μέσω του κύκλου Williss. Η εμβολή και αιμορραγία είναι συχνά αίτια ΑΕΕ όχι όμως εμφράγματος. Το 25-30% των ασθενών που υπέστησαν ΑΕΕ θα πεθάνει εντός έτους, ενώ περισσότεροι από το 1/3 των ασθενών θα υποστούν νέο και συχνά σοβαρότερο ΑΕΕ. Τα ΙΕΕ έχουν καταμετρηθεί ότι φθάνουν το 80% του συνόλου των ΑΕΕ. Οι προδιαθεσιακοί παράγοντες για ΑΕΕ χωρίζονται σε μη τροποποιήσιμους (φύλο, ηλικία, εθνικότητα, οικογενειακό ιστορικό), με σημαντικότερο την ηλικία και σε τροποποιήσιμους παράγοντες (αρτηριακή υπέρταση, σακχαρώδης διαβήτης, κάπνισμα, καρδιακές παθήσεις, στένωση των καρωτίδων, προηγηθέντα ισχαιμικά επεισόδια) με σημαντικότερο τη αρτηριακή υπέρταση. Έχει αποδειχθεί ότι η υπέρταση στη μέση και μεγάλη ηλικία αποτελεί τον κυρίαρχο παράγοντα κινδύνου τόσο για ισχαιμικά όσο και για αιμορραγικά ΑΕΕ (έως 70% συνολικά και περίπου 80% σε αιμορραγικά) 139. Ακόμη και μικρές αυξήσεις της αρτηριακής υπέρτασης 149

πάνω από το φυσιολογικό μπορούν να αυξήσουν υπερβολικά τον κίνδυνο για ΑΕΕ. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι ασθενής με ΣΑΠ 170 mm Hg εμφανίζει 84% μεγαλύτερο κίνδυνο για ΑΕΕ σε σύγκριση με κάποιον που έχει ΣΑΠ μικρότερη των 140 mm Hg. 140,141 Τα συμπτώματα που παρουσιάζονται στην περίπτωση ΑΕΕ μπορεί να είναι ένα ή περισσότερα από τα παρακάτω: Ετερόπλευρη αδυναμία ή μείωση αισθητικότητας Αφασία, απραξία, δυσαρθρία Μερική ή ολική ημιανοψία Σύγχυση ή απώλεια μνήμης Ίλιγγος, νυσταγμός Αθηροσκλήρωση Στεφανιαία νόσος 2,142,143 Η αθηροσκλήρωση ορίζεται ως εξής. Υπό την επίδραση των προδιαθεσικών παραγόντων επέρχεται δυσλειτουργία του ενδοθηλίου των στεφανιαίων αρτηριών. Στη συνέχεια η χοληστερίνη και ειδικά η LDL (κακή) χοληστερίνη εισέρχεται στο τοίχωμα του αγγείου και προσελκύει τα μονοκύτταρα που και αυτά προσλαμβάνουν χοληστερίνη. Έτσι σχηματίζεται η αθηρωματική πλάκα ή αθήρωμα. Σχήμα 11.1: Δημιουργία αθηροσκλήρωσης 150

Ο παραπάνω ορισμός μπορεί να γίνει απόλυτα σαφής με την απεικόνιση που παρουσιάζεται στα σχήματα 11.2-11.5. Το τοίχωμα μιας αρτηρίας αποτελείται από διάφορα στρώματα. Η εσωτερική επένδυση ή το εσωτερικό στρώμα (ενδοθήλιο) είναι συνήθως ομαλή και συνεχής. Η αρτηριοσκλήρωση αρχίζει όταν τραυματίζεται το ενδοθήλιο. Κατόπιν ορισμένα λευκοκύτταρα του αίματος αποκαλούμενα μονοκύτταρα ενεργοποιούνται και κινούνται από το αίμα και μέσω του τραυματισμένου ενδοθηλίου μιας αρτηρίας στο τοίχωμα αυτής. Σχήμα 11.2 142 Μέσα στο τοίχωμα μετασχηματίζονται σε αφρώδη κύτταρα, τα οποία είναι κύτταρα που συλλέγουν τα λιπαρά υλικά, κυρίως χοληστερόλη. Ταυτόχρονα, τα λεία μυικά κύτταρα κινούνται από το μέσο χιτώνα προς το ενδοθήλιο και εκεί πολλαπλασιάζονται. Επίσης συνδετικός και ελαστικός ιστός συσσωρεύεται κάτω από το ενδοθήλιο, όπως επίσης και συντρίμμια κυττάρων, κρύσταλλοι χοληστερόλης και ασβέστιο. Αυτή η συσσώρευση των αφρωδών κυττάρων, των λείων μυικών κυττάρων και άλλων υλικών, διαμορφώνει μια ετερόκλητη συσσώρευση αποκαλούμενη αθήρωμα (επίσης γνωστή και ως αθηρωσκληρυντική πλάκα). 151

Σχήμα 11.3 142 Καθώς η πλάκα μεγαλώνει από τη συνεχή εναπόθεση των ανωτέρω υλικών, αυξάνει το πάχος και καταλαμβάνει το εσωτερικό της αρτηρίας. Αυτό δημιουργεί τοπικά στένωση της αρτηρίας που εμποδίζει την ομαλή ροή του αίματος. Χαρακτηριστικό είναι το σχήμα 11.4, όπου παρουσιάζεται με ενδεικτικό τρόπο μια εικόνα προχωρημένης βλάβης στην αθηροσκλήρωση Σχήμα 11.4 142 Η στένωση των στεφανιαίων αρτηριών γίνεται από το σχηματισμό μιας πλάκας (αθήρωμα) στο τοίχωμα της αρτηρίας. Με το χρόνο η πλάκα αυξάνει σε πάχος έτσι 152

ώστε μικραίνει τη διάμετρο του αυλού της αρτηρίας δηλαδή προκαλείται στένωση του αγγείου. Η ροή του αίματος ελαττώνεται, εφ όσον η στένωση του αυλού της αρτηρίας γίνει μεγαλύτερη του 50% της διαμέτρου ή μεγαλύτερα του 75% του εμβαδού της επιφανείας του αυλού της αρτηρίας. Η ελάττωση της προσφοράς οξυγόνου στο μυοκάρδιο εκφράζεται κλινικά με την στηθάγχη. Σχήμα 11.5 142 Αμφιβληστροειδοπάθεια Η Διαβητική Αμφιβληστροειδοπάθεια αποτελεί μια από τις κυριώτερες αιτίες τύφλωσης. Παρουσιάζεται σε διαβητικούς ασθενείς και προκαλείται από αλλοιώσεις των αγγείων του αμφιβληστροειδούς. Τα αγγεία αυτά στους διαβητικούς ασθενείς μπορεί να παρουσιάζουν διαρροή (μικρή αιμορραγία), μικροαποφράξεις με συνέπεια την ισχαιμία, και σε προχωρημένο στάδιο μπορεί να αναπτυχθούν παθολογικά νεοαγγεία στην επιφάνεια του αμφιβληστροειδούς. Τα νεοαγγεία αυτά μπορεί να προκαλέσουν αιμορραγία στο εσωτερικό του οφθαλμού ενώ σε πιο προχωρημένη μορφή της νόσου μπορεί να οδηγήσουν σε αποκόλληση αμφιβληστροειδούς και μη αναστρέψιμη απώλεια όρασης. Τέλος, η ανάπτυξη νεοαγγείων στο πρόσθιο τμήμα του οφθαλμού μπορεί να προκαλέσει σοβαρής μορφής γλαύκωμα (αύξηση της πιέσεως του οφθαλμού). 144 153

Εκλαμψία Εκλαμψία είναι αρρώστια που προσβάλλει τις γυναίκες κατά την εγκυμοσύνη, τη γέννα και μετά από αυτή, συνοδεύεται κυρίως από λευκωματουρία, πρηξίματα, ολιγουρία, υπέρταση,και χαραχτηρίζεται από τονικούς και κλονικούς σπασμούς. 145 Διαβητική νεφροπάθεια Η διαβητική νεφροπάθεια είναι μία εκ των επιπλοκών του σακχαρώδη διαβήτη, η οποία ορίζεται ως μια κατάσταση και παράλληλα μια εξελικτική πτωτική πορεία που έχει τελική κατάληξη της την νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. 146 Αποτελεί επίσης μια κλινικοϊστοπαθολογική έννοια που αναλόγως της βαρύτητας της ταξινομείται σε 5 στάδια: 1. Υπερτροφία υπερλειτουργία του νεφρικού παρεγχύματος. 2. Μικρολευκωματινουρία. 3. Αρχόμενη Διαβητική Νεφροπάθεια 4. Λευκωματουρία 5. Νεφρική Ανεπάρκεια τελικού σταδίου Πρόκειται για επιπλοκή που παρατηρείται περίπου στο 30% των ασθενών που πάσχουν από τη νόσο αυτή. Προδιαθεσικοί παράγοντες για εκδήλωση Διαβητικής Νεφροπάθειας αποτελούν: 1. Η γενετική βάση 2. Το φύλο, η ηλικία, η διάρκεια του Σακχαρώδη Διαβήτη 3. Η ρύθμιση του Σακχάρου 4. Η Αρτηριακή Υπέρταση 5. Το κάπνισμα Καρδιά Η καρδιά είναι μια τετράχωρος (δύο κόλποι και δύο κοιλίες) μυϊκή αντλία για την κυκλοφορία του αίματος στο σώμα μας. Έχει 4 βαλβίδες (τριχλώχινα, πνευμονική, μιτροειδή και αορτική βαλβίδα). Επίσης έχει δύο προσαγωγά αγγεία (άνω και κάτω κοίλες φλέβες, πνευμονικές φλέβες) και δύο απαγωγά αγγεία (πνευμονική αρτηρία και αορτή). Τα αιμοφόρα αγγεία της καρδιάς ονομάζονται στεφανιαίες αρτηρίες. Ο καρδιακός μυς χρειάζεται οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες, τις οποίες παίρνει από τις στεφανιαίες αρτηρίες. Η αορτή μόλις βγει από την καρδιά και αμέσως πάνω από την αορτική βαλβίδα δίνει τη δεξιά και αριστερά στεφανιαία αρτηρία. Η δεξιά 154

στεφανιαία διακλαδίζεται σε επιχείλιο κλάδο, οπίσθιο κατιόντα και οπισθιοπλάγιο κλάδο. Η αρχή της αριστεράς στεφανιαίας ονομάζεται στέλεχος και μετά διχάζεται στον πρόσθιο κατιόντα (κλάδοι: διαγώνιοι και διαφραγματικοί) και περισπωμένη (κλάδοι: επιχείλιος). 2 Σχήμα 11.6: Η καρδιά αποτελεί την αντλία για την κυκλοφορία του αίματος Καρδιακή ανεπάρκεια Η καρδιακή ανεπάρκεια είναι μία σοβαρή κατάσταση κατά την οποία η αντλητική δραστηριότητα της καρδιάς υπολειτουργεί. Πρόκειται ουσιαστικά για αποδυνάμωση του καρδιακού μυ. Σε πρώιμα στάδια τα συμπτώματα μπορεί να μην είναι τόσο εμφανή και συχνά, όμως σε προχωρημένο στάδιο τα συμπτώματα είναι ιδιαίτερα σοβαρά, αφού η καρδιά είναι ανίκανη να αντλεί αποτελεσματικά ώστε να καλύπτει τις ανάγκες του οργανισμού σε αίμα και οξυγόνο. Ως αποτέλεσμα της καρδιακής ανεπάρκειας προκαλούνται προβλήματα στην αναπνοή, κούραση και πρήξιμο στα πόδια και αύξηση του όγκου της καρδιάς. Παράγοντες που αυξάνουν τον κίνδυνο για καρδιακή ανεπάρκεια είναι η υπέρταση, η στεφανιαία νόσος και προηγούμενο επεισόδιο καρδιακής προσβολής. 142,147 155

Μικρολευκωματινουρία Η πρώιμη διάγνωση της διαβητικής νεφροπάθειας στηρίζεται στην ανίχνευση μικρών ποσών λευκωματίνης στα ούρα, που χαρακτηρίζονται ως μικρολευκωματινουρία (ΜΛ). Ως ΜΛ ορίζεται η απέκκριση στα ούρα 30 300 mg λευκωματίνης το 24ωρο (ή 20 200 μg/min ή 30 300 μg/mg κρεατινίνης) σε 2 από 3 συλλογές ούρων σε χρονικό διάστημα 3 6 μηνών. O παθοφυσιολογικός μηχανισμός πρόκλησης της μικρολευκωματινουρίας δεν είναι επακριβώς γνωστός, αλλά για την εμφάνισή της έχουν ενοχοποιηθεί η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, η φλεγμονή και η ενδονεφρική ενεργοποίηση του συστήματος ρενίνης-αγγειοτασίνης. Η ΜΛ αποτελεί προγνωστικό δείκτη διαβητικής νεφροπάθειας αλλά και ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου καρδιαγγειακής νόσου σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 ή 2. 148 Οίδημα σφυρών Το αμφοτερόπλευρο οίδημα των σφυρών, που συμβαίνει συνήθως την νύχτα είναι συνήθως σημάδι καρδιακής ανεπάρκειας ή αμφοτερόπλευρης φλεβικής ανεπάρκειας. Μονόπλευρο οίδημα του κάτω άκρου μπορεί να οφείλεται σε φλεβική θρόμβωση ή λεμφική απόφραξη. Γενικευμένο οίδημα στα άκρα συμβαίνει σε άτομα με νεφρωσικό σύνδρομο, βαριά καρδιακή ανεπάρκεια, ή ηπατική κίρωση. 149 Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου Το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου οφείλεται σε αιφνίδια απόφραξη ενός κλάδου των στεφανιαίων αρτηριών λόγω ρήξης ή διάβρωσης της αθηρωματικής πλάκας και δημιουργίας θρόμβου ο οποίος αποφράσσει πλήρως την υπεύθυνη στεφανιαία αρτηρία με αποτέλεσμα την διακοπή της κυκλοφορίας του αίματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη νέκρωση μιας περιοχής του μυοκαρδίου. Το έμφραγμα τού μυοκαρδίου προσβάλλει συνήθως τους άνδρες στην ηλικία μεταξύ 50 και 60 ετών (με αναλογία 5 προς 1 σε σχέση με τις γυναίκες). Πρέπει να σημειωθεί ακόμη η μεγαλύτερη συχνότητα και βαρύτητα του εμφράγματος στα διαβητικά άτομα. 156

Σχήμα 11.7 2 Με τον όρο «οξύ» δεν υπονοείται βαρύτητα. Το οξύ σημαίνει πρόσφατο, εν αντιθέσει προς το χρόνιο. Για το ήμισυ των ασθενών ο θάνατος είναι αιφνίδιος (επέρχεται σε διάστημα μικρότερο της μιας ώρας). Ο κύριος μηχανισμός της γενέσεως του εμφράγματος του μυοκαρδίου είναι η αιφνίδια παραγωγή θρόμβου από αιμοπετάλια που αποφράσσει μια αρτηρία η οποία ως τη στιγμή εκείνη λειτουργούσε κανονικά ή σχεδόν. Οι θρόμβοι παράγονται στην κοίτη αθηρωματικών πλακών που σχηματίζονται στο τοίχωμα των αρτηριών και έχουν στο κέντρο τους σημαντική ποσότητα λίπους. Διάφοροι μηχανισμοί κυτταρικοί και χημικοί ανταγωνίζονται αλλήλους: άλλοι για να απομακρύνουν το λίπος έτσι που να σκληρύνουν οι πλάκες και να μην είναι εύθραυστες και άλλοι παρεμποδίζουν τους μηχανισμούς αυτούς ώστε πολλές πλάκες να έχουν τη μορφή αποστημάτων που είναι έτοιμα να σπάσουν και να προσφέρουν επιφάνεια πρόσφορη για την παραγωγή θρόμβων. Αυτός είναι και ο λόγος που συνήθως οδηγεί στο παράδοξο, του να είναι υπόλογες εμφραγμάτων αρτηρίες όχι πολύ στενωμένες. Η περιοχή που τροφοδοτούν είναι ανέτοιμη, δεν διαθέτει παράπλευρα αγγεία και στραγγαλίζεται από την απουσία αίματος. Περίπου 20 λεπτά κατάργησης της κυκλοφορίας οδηγεί σε νέκρωση (έμφραγμα) σε όλο το πάχος του τοιχώματος της κοιλίας (διατοιχωματικό). 2 Σακχαρώδης διαβήτης Ο σακχαρώδης διαβήτης είναι μία μεταβολική πάθηση που χαρακτηρίζεται από χρόνια υπεργλυκαιμία και διαταραχές του μεταβολισμού των υδατανθράκων, των λιπών και των λευκωμάτων ως αποτέλεσμα ελαττωματικής έκκρισης ή 157