חמצן בהתפתחות ופתוגנזה של הקשיונה

מעורבות Protein Tyrosine ) PTP1 (Phosphatase 1 ורדיקלים חופשיים של חמצן בהתפתחות ופתוגנזה של הקשיונה הגדולה sclerotiorum) (Sclerotinia עבודת-גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית האוניברסיטה העברית ירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות " יולי 2014 ח' בתמוז התשע"ד ע"י אביחי זולטי רחובות

עבודה זו נעשתה בהדרכת פרופסור עודד ירדן המחלקה למחלות צמחים ומיקרוביולוגיה הפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית האוניברסיטה העברית בירושלים

תודות: לפרופסור עודד ירדן על ההדרכה, המקצועיות, הסיוע וההומור לחברי המעבדה לפיסיולוגיה של פטריות, על התמיכה הטכנית, הלימודית והאישית לפרופסור יצחק הדר וחברי מעבדתו

תקציר הקשיונה הגדולה-,Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary היא פטרייה חוטית השייכת לתת המערכה פטריות השק.(Ascomycetes) פטרייה זו היא פתוגנית נקרוטרופית בעלת טווח פונדקאים רחב מאוד, הכולל למעלה מ- 400 מיני צמחים. הקשיונה הגדולה מייצרת קשיונות- גופי קיימא רב תאיים, קשים, המורכבים מקורים דחוסים ומעטפת מלנין. התפתחות הקשיונות מבוקרת על ידי גורמים סביבתיים כדוגמת טמפרטורה, רמת חומציות וזמינות נוטריינטים. מנגנוני הולכת סיגנאלים תאיים כגון רמות camp משתנות ובקרה פוספורלטיבית, מעורבים בעיבוד האות הסביבתי ליצירת מנגנוני בקרה בתהליך ההתפתחות. בעבודה זו, התמקדנו בחלק ממרכיבי הולכת הסיגנאל הקשורים בתהליכי התפתחות ופתוגנזה. לצורך כך, בחנו ראשית את אחד הכלים הנפוצים המשמשים לצורך חקר מנגנוני הולכת סיגנאל- שימוש בפרומוטור אינדוקטיבי המאפשר בקרה חיצונית על ביטוי גנים בעלי עניין. עבודות קודמות ורבות עשו שימוש בפרומוטור של הגן qa-2 מ-,Neurospora crassa כדי להשרות ביטוי גנים בעקבות מעבר לחומצה קווינית כמקור פחמן יחיד. ברבות מעבודות אלו נבנתה התשתית למחקר המולקולארי שבחן את הבקרה החלה על התפתחות הקשיונות בקשיונה הגדולה. על מנת לבחון את המשמעות הפיסיולוגית של שימוש בפרומוטור זה, בחנו את ההשפעה של המעבר לחומצה קווינית על רמות ביטויים של כלל הגנים בקשיונה הגדולה. תוך שימוש ב-,RNAseq מצאנו כי חלה עליה ברמת ביטוי הגנים המעורבים באופן ישיר במטבוליזם של חומצה קווינית כמקור פחמן, כפי שנמצא ב-.N. crassa בנוסף, חלה עליה ברמת ביטוי גנים המשויכים לתהליכים קטבוליים, מטבוליזם- ובכללם במטבוליזם של תרכובות חנקן וסוכרים ובפרט במסלול החומצה השיקימית. לעומת זאת, חלה ירידה ברמת ביטוי הגנים המקושרים למטבוליזם של חומצות גרעין וחומצות אמיניות, וגנים המעורבים בתרגום חלבונים. בנוסף, חל שינוי משמעותי ברמת ביטוי גנים המעורבים בגורמי טרנספורט. שינויים אלו ברמות ביטוי הגנים מעידים כי מקור פחמן זמין משפיע רבות על שגרת קיומה של הקשיונה הגדולה, אך יחד עם זאת, לא נראתה תגובת עקה. על אף התהליכים הרבים שמעורבים בשינוי מקור הפחמן, ניתן להשתמש במערכת ביטוי זאת על מנת לאבחן את ההשפעה של שינויים בביטוי גן נבחן על הפיסיולוגיה והמורפולוגיה של הקשיונה הגדולה. רדיקלים חופשיים של חמצן (ROS)] [Reactive Oxygen Species מעורבים בהתפתחות הקשיון. ROS נוצרים כתוצרי לוואי בתהליכי הפקת האנרגיה והמטבוליזם התאי, אך גם באופן אנזימטי ומכוון כמנגנון הגנה וכסיגנאל החיוני להתפתחות והתמיינות. טירוזין פוספטאזות (PTPs)] [Protein Tyrosine Phosphatases מבוקרות בין היתר על ידי,ROS הגורם לחימצון הפיך של הציסטאין הקטליטי באתר הפעיל של החלבון ולהשתקת פעילותו. בהנחה כי

הינם חיוניים, הייתה בתכניתנו להשתמש בשילוב של פרומוטור אינדוקטיבי (כגון (qa-2 PTPs עם סימון אפיטופי של.PTP1 ptp1 המסומן באפיטופ האימונוגני myc הוחדר לקשיונה הגדולה ול-.N. crassa למרות ביטוי הגן המסומן ברמת ה-,RNA לא נמצא תוצר חלבון המסומן ב-.MYC יתכן כי תוסף האפיטופ פוגע ביציבות החלבון ומונע את תרגומו או מוביל לפירוקו. רמת ביטוי הגנים המקודדים ל- ptps עולה במהלך התפתחות הקשיון, ובמיוחד.ptp1 בניגוד לרמת הביטוי הגבוהה, אנו מצאנו כי חלה עליה כללית בזרחון של שיירי טירוזין במהלך התפתחות הקשיון. חלה הפחתה בפעילות הדה פוספורילציה של טירוזין מחד, אך עליה ברמת הביטוי של ptps מאידך. על בסיס ההשערה כי ROS מעורבים בתהליך התפתחות הקשיון על ידי בקרת פעילות הטירוזין פוספטאזות, נמצא כי רמת ביטוי גנים המקודדים לפוספטאזות עלתה כתוצאה מעקה חימצונית סביבתית- פי שניים עד לפי חמישה. רמת ביטוי הגן המקודד ל- ptp1 עלתה באופן המשמעותי ביותר מבין הפוספטאזות. בנוסף, חלה עליה גם ברמת הביטוי של שתי קטלאזות שנבחנו, ובמיוחד Scat2 (פי 20). בכדי לבודד את התהליכים המבוקרים על ידי עיכוב PTPs מהשפעות הלוואי של,ROS בחנו את ההשפעה של,pervanadate מעכב לא תחרותי ובלתי הפיך של,PTPs על הגדילה, המורפולוגיה וביטוי גנים מעורבים. (1mM) Pervanadate גרם לעיכוב הגידול בקשיונה הגדולה לכדי מחצית, להתפצלות יתר של הקורים, ולהתמיינות של קצוות קורים ליצירת קשיונות. עיכוב פעילות,PTPs לא הוביל לעלייה ברמת ביטוי הגן המקודד ל-.ptp1 בניגוד למצופה, שימוש במעכב זה שאינו תלוי ב-,ROS הוביל לעליה של פי חמישה ברמת הביטוי של הגן.Scat2 עליה זו הוגברה לכדי פי 12,ROS לאור תוצאות אלו, הסקנו כי קיימת בקרה הדדית בין.pervanadate לנוכח השילוב של מי חמצן ו-,PTPs וקטלאזות. לצורך בחינת המעורבות של ptp1 בתהליך הפתוגנזה, וההשפעה של הפרץ החמצוני על ביטויו, נסרקו 11 זנים שונים של צמחי עגבנייה. לא נמצאו הבדלים בעוצמת המחלה כפי שהתבטאה באורך הכתם הנקרוטי. יחד עם זאת, נראו הבדלים בעוצמת הפרץ החמצוני כפי שנמדד על ידי צביעת העלים ב-,(3,3'-Diaminobenzidine) DAB כ- 36 שעות לאחר האילוח. הבדלים אלו היו בקורולציה חיובית לרמת ביטוי הגנים.Scat1, Scat2 ביטוי הגן ptp1 לא השתנה בין הזנים השונים. לאור זאת הסקנו כי הבקרה על ביטוי הגן ptp1 שונה בין תהליכי ההתפתחות לבין תהליכי הפתוגנזה. במחקר זה, נבחנה הבקרה ההדדית של תהליכי זרחון ורדיקלים חופשיים של חמצן על התמיינות קשיונות ופתוגנזה בקשיונה הגדולה. הבנת המנגנונים ומעברי הסיגנאל המבקרים תהליך התפתחותי זה, משמשת כמודל להבנה של תהליכי בקרה מורכבים יותר, ובידיה לסייע לחקלאות בהתמודדותה עם מחלות צמחים הנגרמות מאורגניזמים המייצרים קשיונות.

תוכן עניינים סקירה ספרותית:...1 מחזור חיים:...1 מבנה והתפתחות קשיונות:...2 מסלולי מעבר סיגנאל תאיים והתפתחות קשיונות:...4 רדיקלים חופשיים של חמצן ROS) (Reactive oxygen species כסיגנאלים ומעורבותם באינטראקציה צמח פתוגן:...7 מטרות המחקר:... 9 שיטות וחומרים:... 10 א. שיטות עבודה ב. שיטות עבודה ב- בקשיונה הגדולה:... 10 11... :Neurospora crassa ג. שיטות כלליות בביולוגיה מולקולארית:... 12 ד. תוכנות מחשב וניתוח תוצאות:... 17 תוצאות... 18 בחינת ההשפעה של שינוי מקור פחמן על דפוס ביטוי הגנים ב- :S.sclerotiorum... 18 סימון PTP1 לצורך אפיון אינטראקציות ושינויים ברמת החלבון:... 20 פוספורילציה של שיירי טירוזין השפעתה של עקה חמצונית קבועה על רמת ביטוי בשלבי התפתחות שונים... 22 23... :ptps ביטוי ptps עולה כתוצאה מהשראת עקה חמצונית:... 24 Pervanadate מעכב את גידול הקשיונה הגדולה, ומוביל להתמיינות קשיונות:... 27 28 אך מוביל לעלייה בביטוי...:Scat2 אינו גורם לעלייה ברמת ביטוי הגן,ptp1 Pervanadate הפרץ חמצוני ומעורבותם של קטלאזות בהתבססות הקשיונה הגדולה:... 29 הפתוגנזה מושפעת מגורמים סביבתיים רבים... 29 מדידת תגובת הצמח לאילוח בקשיונה הגדולה:... 29 ביטוי הקטלאזות Scat2,Scat1 מצוי בקשר ישיר עם רמת מי החמצן המופרשת מהעלה... 30 דיון ומסקנות:... 32 שינוי מקור פחמן:... 32

זיהוי החלבונים להם PTP1 מבצע דה- פוספורילציה:... 35 השפעתה של עקה חמצונית על פעילות וביטוי טירוזין הפרץ החמצוני ומעורבותו פוספטאזות:... 36 בהתבססות הקשיונה הגדולה:... 41 מקורות ספרות:... 44

סקירה ספרותית: הקשיונה הגדולה-,Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary היא פטרייה חוטית השייכת למערכת פטריות השק.(Ascomycetes) פטרייה זו פתוגנית נקרוטרופית בעלת טווח פונדקאים רחב מאוד, הכולל למעלה מ- 400 מיני צמחים ווסקולארים (1994 Hall,.(Boland & טווח הפונדקאים מורכב בעיקר מצמחים מכוסי זרע דו פסיגיים אך גם מעט חד פסיגיים ואף מספר חשופי זרע, כאשר מירב הפונדקאים הינם עשבוניים. הפטרייה לרוב מתקיימת באזורים קרירים ולחים (מעל לנקודת הקיפאון ועד ל- ), 32 0 C אך נצפתה גם באזורים חמים ויבשים. למעלה מ- 60 שמות שונים מתארים בספרות מחלות הנגרמות על ידי הקשיונה הגדולה (1979 (Purdy, והנזק השנתי בארה"ב לבדה מוערך ביותר מ- 200 מיליוני דולרים (2006 al.,.(bolton et מחזור חיים: הדבקת הצמח נעשית על ידי אסקוספורות או קורים, לאחר התבססות על גבי רקמה מזדקנת או מתה (2005 Rimmer,.(Hegedus & בקצה קור אווירני חלות התפצלויות דיכוטומיות המובילות ליצירת כרית הדבקה המשמשת לחדירת הרקמה הצמחית בעלים או גבעולים. מבנה כריות ההדבקה יכול להיות בדרגות מורכבות שונות, כתלות במבנה והרכב המשטח ) & Tariq.(Jeffries, 1984 בתגובה להתקפת פתוגן, הצמח מגיב באופן מקומי על ידי פרץ חמצוני באזור הפגיעה, המוביל למות הרקמה (בדומה לתגובת Hyper Sensitive response- HR המתרחשת כאשר פתוגן ביוטרופ תוקף צמח) כמו גם תגובה סיסטמית כללית המאופיינת בהפעלת סיגנלים צמחיים המעורבים במנגנוני הגנה (2004 Dong,.(Durrant & חומצה אוקסאלית חיונית לקשיונה הגדולה, ומעורבת במספר שלבים בפתוגנזה. בין היתר, חומצה אוקסאלית מייצרת תנאים מתאימים לפעילותם של אנזימים מפרקי דופן, המסייעים בחדירת הרקמה הצמחית ובפירוק רכיביה. הימצאות תוצרי הפירוק מעודדת הפעלה נוספת של מסלולי סיגנאל המביאים להגברת רכיבי פירוק הדופן. הקשיונה הגדולה מתמחה בעיקר בפירוק רכיב הפקטין בדופן הצמחי, עובדה הנמצאת בהתאמה לכך שהיא גדלה לרוב על גבי נוף הצמח בצמחים דו- פסיגיים, העשירים בפקטין 2011) al.,.(hegedus & Rimmer, 2005, Amselem et הצלחת החדירה לצמח מובילה ליצירת כתם נקרוטי, המתפשט במהירות (התארכות רדיאלית של 10-30 מ"מ ביום על גבי עלה) (1984 Jeffries,.(Tariq & על גבי עלים נוצר לרוב נגע מימי, המתפשט לכיוון הגבעול או הגזע, שם נוצר נגע כהה ומתחילה נבילה. לעיתים, נוצר נגע מימי ישרות על גבי הגבעול או הגזע. על גבי רקמת הצמח הנגועה, נוצר תפטיר לבן צפוף, ומתפתחים קשיונות ) al., Bolton et 2006). קשיונות הם גופי קיימא קשים המורכבים מקורים דחוסים ומעטפת מלנין ) et Erental 1

.(al., 2008 קשיון רדום יכול לנבוט בשתי דרכים: רבייה מינית (carpogenically) או נביטה תפטירית.(myceliogenically) רבייה מינית מובילה ליצירת -apothecia גוף הפרי המיני של הקשיונה הגדולה, ממנו משתחררים אסקוספורות. אסקוספורות יכולות לנבוט על גבי חומר צמחי מת או ליצור מחלה בצמח בריא כמתואר. בנביטה תפטירית, הקשיון נובט ליצירת קורים המתבססים לרוב על גבי חומר אורגני מת, אך באפשרותם גם לגרום למחלה בצמח בריא (2006 al.,.(bolton et סיכום מחזור חיי הפטרייה מובא להלן באיור מספר 1. איור 1: מחזור חיי הקשיונה הגדולה. קשיונות רדומים בקרקע יכולים לנבוט תפטירית וליצור מחלה בצמחים בריאים, באזור השורשים או בחלקי הצמח הקרובים לפני הקרקע. בתנאי סביבה מסוימים, קשיון ינבוט ליצירת גוף פרי-,apothecia ממנו ישתחררו אסקוספורות, היכולות לגרום למחלה בנוף הצמח. המחלה מובילה לנבילה, נוצרים קשיונות חדשים החוזרים לקרקע וכך מושלם מחזור חיי הפטריה. (http://info.metos.at/tiki Index.php?page=White+Leg+Disease+%28Sclerotinia+sclerotiorum%29+RUS&no_bl=y) נקבע הרצף הגנומי של הקשיונה הגדולה, והוא מכיל 39.6mb המרכיבים כ- 14522 גנים משוערים על גבי 16 כרומוזומים (2011 al.,.(amselem et המידע הגנומי מצוי באתר http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/sclerotinia_sclerotiorum/multiho me.html מבנה והתפתחות קשיונות: קשיונות נפוצים בתת מערכות שונות השייכות לממלכת הפטריות, ביניהם: פטריות השק,(Ascomycotina) פטריות הבסיסה,(Basidiomycotina) ופטריות בלתי- מושלמות (Deuteromycotina).(Willetts & Bullock, (1992 בנוסף לקשיונה הגדולה, ישנם מספר פתוגנים של צמחים בעלי חשיבות כלכלית רבה המייצרים קשיונות כדוגמת : rolfsii Sclerotium 2

.(Erental et al., 2008) Claviceps purpurea,botrytis cinerea הערכה היא שכ- 90% ממחזור החיים של פטריות מהסוג Sclerotinia מועבר בקישון הרדום בקרקע ) & Adams.(Ayers, 1979 את התפתחות הקשיון ניתן לחלק לשלושה שלבים עיקריים: איניציאציה,(initiation) התפתחות (development) והבשלה.(maturation) בשלב האיניציאציה, ניתן להבחין בהתקבצות של קורים מלופפים. האיניציאציה מלווה בהפרשת חומר המשמש להדבקת קורים, המתלפפים עד לאיחוי מלא. בשלב ההתפתחות, מבנה הקורים המלופפים הולך וגדל וחלה אגירה של חומרי תשמורת. בשלב ההבשלה, חל גיבוש של הקשיון, תיחום הקשיון מסביבתו, מלניזציה של המעטפת החיצונית והפרשת נוזלים 1975) Henis,.(Erental et al., 2008, Chet & מבנה הקשיון מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת מעטפת חיצונית,(rind) המורכבת מקצות קורים דחוסים היוצרים שכבה רציפה ואחידה בעובי תא אחד עד למספר תאים בודדים לכל היותר. לרוב, המעטפת החיצונית עשירה במלנין, המשמש לבידוד הקשיון, להגנה בפני קרינה ופירוק ביולוגי. שכבת קליפה (cortex) מכילה תאים מעוגלים, ומאופיינת באגירת חומרי תשמורת בגופים תאיים ייחודיים. שכבת המדולה,(medula) מכילה קורים מלופפים עם מעט התפצלויות ומחיצות. שכבה זו מאופיינת בהתפתחות משמעותית של משתית חוץ-תאית matrix) (extracellular במרווח בין הקורים. המשתית החוץ תאית עשירה בסוכרים ומים, ועוברת פירוק בנביטת הקשיון (1992 Bullock,.(Willetts & הבנת המנגנונים המעורבים בבקרת התפתחות הקשיון הכרחית על מנת להתמודד עם מחלות צמחים הנגרמות מפטריות המייצרות קשיונות. גורמי סביבה רבים מעורבים בבקרת יצירת הקשיון בפטריות שונות. אור: בארכי גל מסוימים יכול לעודד יצירת קשיונות, ובאחרים לעכבם או לפגוע בתהליך המלניזציה של הקשיון. מנות אור שונות יכולות להוביל להבדלים במספר ובגודל הקשיונות שנוצרים בתרבית. בקשיונה הגדולה, אור לא נמצא כגורם המעורב בבקרת יצירת הקשיון ) 2008 al.,.(erantal at טמפרטורה: יכולה להשפיע על כמות, זמן הבשלה ופיגמנטציה של קשיונות. עליה מהירה וזמנית בטמפרטורה יכולה להוביל להתמיינות מסונכרנת של קשיונות. אין אחידות בין ההשפעות של טמפרטורה ואור על היווצרות קשיונות בין מינים שונים של פטריות. לרוב, תנאי הסביבה האופטימאליים לגידול תפטירי, מובילים גם להתמיינות קשיונות. גורמים פיזיים: כגון קריעה או חיתוך של קורים, מחסום המגביל את הגידול (כגון דפנות כלי בגידול בתרבית), מעודדים התמיינות קשיונות. :ph רמת החומציות המתאימה לגידול הפטרייה לרוב מתאימה גם ליצירת הקשיונות. בקשיונה הגדולה, ph ניטרלי או בסיסי מעכב יצירה של קשיונות ) & Chet Erental et al.,,2008 3

Godoy et ) ומוטנטים שאינם מייצרים חומצה אוקסאלית לא מייצרים קשיונות (Henis, 1975 ph הוא פקטור שעתוק המעורב בהפעלה והשתקה של ביטוי גנים בתנאי PAC1.(al., 1990 בסיסיים. מוטנט ב- pac1 פגוע בתהליך יצירת הקשיונות, ואינו מסוגל ליצר שכבת מעטפת חיצונית בדומה לזן הבר (2003.(Rollins, גורמים תזונתיים: מקור פחמן או תוספת של חומצות אמינו למצע הגידול (המשמשות כחומרי מוצא / ביניים במסלולים מטבולים רבים) משפיעים על היווצרות קשיונות. תרכובות המכילות אטומי גופרית, או תרכובות המגיבות עם קשרי גופרית (כדוגמת,(iodoacetic acid משפיעות אף הן על היווצרות קשיונות. חומרים המופרשים ממיקרואורגניזמים שונים, גם מתרבית של הקשיונה הגדולה, מעודדים יצירת קשיונות (1975 Henis, (Chet & מסלולי מעבר סיגנאל תאיים והתפתחות קשיונות: בקרה פוספורלטיבית: כל התאים החיים חשים את סביבתם ומגיבים אליה. סיגנאלים חיצוניים יכולים לגרום להפעלה או השתקה של מסלול תאי או התפתחותי בהתאם לצורך. תגובה אפשרית לתנאי סביבה משתנים כוללת עיבוד המידע הסביבתי במנגנון המאפשר מודיפיקציה הפיכה של חלבונים כדוגמת פוספורילציה- זרחון. מלבד ההשפעה של סיגנאלים חיצוניים ועקות סביבתיות על זרחון חלבונים, בקרה זו חשובה בתהליכים תאיים שגרתיים כמו מטבוליזם, תעבורת חומרים אל ומחוץ לתא והפעלה של פקטורי שעתוק (1999 Yarden,.(Dickman & רצפטור טרנס ממברנאלי הנקשר לסיגנאל מסוים יכול להפעיל מספר מסלולי העברת סיגנאל ליצירת תגובה תאית. אחד מאותם מעברי סיגנאל כולל עיבוד האות להפעלת adenylate.(cyclic Adenosine MonoPhosphate) camp המסנתז את הסיגנאל השיניוני cyclase סינתזת camp מופעלת על ידי שלל סיגנאלים חיצוניים כדוגמת טמפרטורה, נוטריינטים, הורמונים ואור. kinase) PKA (camp-dependent protein הוא חלבון המטרה ל-.cAMP בצורתו הלא פעילה החלבון מורכב מטטרהמר המכיל שתי יחידות קטליטיות ושתי יחידות רגולטוריות. כאשר נקשר,cAMP הקומפלקס נפרד לדימר המורכב משתי תת היחידות הרגולטוריות, ולשני מונומרים של היחידה הפעילה המבצעת זרחון של חלבוני מטרה במסלול מעבר הסיגנאל המופעל על ידי.cAMP מסלול מעבר סיגנאל זה משפיע על תהליכים כגון התארכות פולרית של קורים, התפתחות, רבייה מינית, הנבגה, ונביטה ) Yarden, Lee et al., 2003, Dickman & 1999). בקשיונה הגדולה, פעילות PKA גבוהה בשלב התפתחות הקשיון לעומת איניציאל או קשיון בוגר 2005) al., IBMX,Caffeine.(Harel et ו- NaF מעלים את ריכוז ה- camp 4

ומעכבים יצירה של קשיונות. תוספת חיצונית של camp מעכבת אף היא יצירה של קשיונות.(Rollins & Dickman, 1998, Lee et al., 2003) :MAPK סרין/ תריאונין קינאזות המופעלים על ידי מגוון סיגנלים חיצוניים ומתווכים בהעברת הסיגנל הסביבתי מהדופן עד לגרעין התא. לרוב, מעבר הסיגנאל כולל שרשרת זרחונית בה מספר רכיבים. כאשר אות חיצוני נקלט, חל עיבוד האות המוביל לזרחון של MAPKK קינאז, המזרחן MAPK קינאז, שמוביל לזרחון של MAP קינאז, הגורם להפעלה או השתקה של פקטור שעתוק. MAPK מעורבים בתהליכים כגון גדילה, התפתחות, רביה, תגובה לעקה ווירולנטיות (1999 Yarden,.(Dickman & בקשיונה הגדולה, רמת ביטוי הגן (MAPK) Smk1 עולה משמעותית בזמן התפתחות האיניציאל של הקשיון, המלווה גם בעליה בצורה הפעילה המזורחנת של.SMK1 ירידה בביטוי הגן הנגרמת על ידי מוטנט antisense בעל ביטוי מופחת, או עיכוב פעילות החלבון (המעכב,(PD98059 גרמו לירידה משמעותית בקצב גידול הפטרייה ובהבשלת קשיונות. ביטוי ופעילות SMK1 תלויים ברמת החומציות ומושפעים מריכוז ה-.cAMP ביטוי קבוע וגבוה של Smk1 גרם להיווצרות קשיונות גם בריכוזים גבוהים של Chen et ) camp (al., 2004 את פעולת הזרחון ההפיך משלימות הפוספטאזות, חלבונים המורידים שייר פוספאט מסרין/ תריאונין, היסטידין או טירוזין. קיים חוסר התאמה בפטריות חוטיות בין מספר חלבוני הקינאז לפוספטאז, וככל הנראה חוסר סימטריה זו מתבטא בספציפיות שונה של החלבונים לסובסטראט. (Dickman & Yarden, 1999) :PP2A סרין/ תריאונין פוספטאז המורכב מהטרודימר של יחידה קטליטית ויחידה המעוגנת לה. בנוסף, תת יחידה רגולטורית משתנה יכולה להקשר למבנה ההטרודימר ולקבוע את זהות הסובסטרט. ליחידה הרגולטורית השפעה על המיקום התאי הכללי של הפוספטאז ) & Dickman.(Yarden, 1999 בקשיונה הגדולה, מעכב (Cantharidin) PP2A ומוטנט antisense בעל ביטוי מופחת ביחידה הקטליטית של האנזים הראו כי הפוספטאז הכרחי לגדילה. רמת ביטוי הגן המקודד לתת יחידה רגולטורית משתנה,,rgb1 הייתה גבוהה יותר בשלב הקשיון הבוגר. מוטנט בעל ביטוי מופחת ב- rgb1 גדל באופן איטי והבשלת הקשיון הייתה פגומה. כמו כן, המוטנט לא ייצר כריות הדברה ולא גרם למחלה בעלים ללא פציעה (2007 al., (Erental et. :(Calcineurin) PP2B סרין/ תריאונין פוספטאז, המשופעל על ידי יוני סידן ושמור מאוד בין כל האאוקריוטים. החלבון מורכב מהטרודימר של יחידה קטליטית ויחידה רגולטורית. Calmodulin נקשר להטרודימר בנוכחות סידן ומפעיל אותו (1999 Yarden,.(Dickman & 5

בקשיונה הגדולה, ביטוי הגן pp2b משתנה בשלבי התפתחות שונים. ביטוי הגן גבוה בקשיון מתפתח או קשיון בוגר, והולך ויורד בשלב נביטת הקשיון ובתפטיר. מעכב PP2B (A,(cyclosporine ומוטנט antisense ביחידה הקטליטית, הוכיחו כי הפוספטאז מעורב בתהליך הגדילה, היווצרות קשיונות והבשלתם, נביטה תפטירית של קשיונות ופתוגנזה. בנוסף, שלמות הדופן של מוטנט ב- pp2b נפגעה וחלה ירידה משמעותית ברכיב ה- β-1,3-glucan בדופן הפטרייה 2006) al.,.(harel et :(Protein Tyrosine Phosphatases) PTPs טירוזין פוספטאזות, מבצעות דה- פוספורילציה בשני שלבים- תחילה נוצר קשר קוולנטי בין הפוספאט לפוספטאז, לאחר מכן, חלה הידרוליזה של הפוספאט ושחרורו (2006 al.,.(ostman et זרחון שיירי טירוזין משמש כמנגנון בקרה דומיננטי בעיקר באאוקריוטים רב תאיים. בקרה פוספורילטיבית על שיירי טירוזין מעורבת בתהליכים של תקשורת בין תאים, החיונית לתהליכי ההתפתחות העוברית, התמיינות רקמות, ובקרה על המערכת החיסונית. תהליכים נוספים כגון: תנועה, מבנה התא, התמיינות, ותהליכים תאיים כגון בקרה על שעתוק, עיבוד,mRNA והובלה של חומרים אל ומחוץ לתא מבוקרים אף הם על ידי פוספורילציה של טירוזין. בגנום ההומני נמצאו כ- 107 טירוזין פוספטאזות לעומת 90 טירוזין קינאזות, אך מספר האנזימים הפעיל דומה מאוד (2004 al.,.(alonso et לטירוזין פוספטאזות השפעה על היווצרות או מניעה של מחלות. PTPs מסוימים מעכבים פעילות של טירוזין קינאזות המופעלים בתאים סרטניים, ועל ידי כך מעכבים את התהליך הסרטני. PTPs אחרים פעילים בתאים סרטניים ליצירת התגובה האופיינית (2006 al., PTP.(Ostman et גם מעורבים במעברי סיגנלים המופעלים על ידי הורמונים כדוגמת אינסולין ),2002 al., Buckley et.(elchebly et al., 1999 הטירוזין פוספטאזות ההומניות חולקו לארבע קבוצות שונות, בהתאם לדמיון ברצף חומצות האמינו באתר הפעיל, המעיד על מקור אבולוציוני משותף. קבוצה 1, הגדולה ביותר כוללת גם טירוזין פוספטאזות המזהות באופן ספציפי ביותר טירוזין, וגם -dual-specific פוספטאזות המזהות בין היתר סרין, תריאונין, mrna ואף.inositol phospholipids קבוצה שנייה של טירוזין פוספטאזות ספציפית לשיירי טירוזין, ומכילה פוספטאזות בעלות משקל מולקולרי קטן. פוספטאזות מקבוצה זו חולקות דמיון גבוה בין ממלכות שונות, ונפוצות מאוד גם בפרוקריוטים. קבוצה שלישית, מכילה חלבונים בעלי ספציפיות לטירוזין ותריאונין, ככל הנראה התפתחה מחלבוני Rhodanese בקטריאלים. חלבונים מקבוצה זו מבקרים Cyclin-dependent kinases (CDKs) החיוניים למחזור התא. קבוצה רביעית שונה משאר הקבוצות, המבוססות על ציסטאין באתר הפעיל. טירוזין פוספטאזות המשתייכות לקבוצה זו, מכילות אספארטאט באתר הפעיל, 6

ופעילות לשיירי טירוזין וסרין. מקובל גם לחלק את הטירוזין פוספטאזות לממברנלים ) Receptor.(Alonso et al., 2004) וציטוזולים,(like PTPs בקשיונה הגדולה נמצאו ארבעה טירוזין פוספטאזות על סמך רצף המוטיב הקטליטי השמור בחלבונים אלו:.(I/V)HCXAGXXR(S/T)G רמת ביטוי הגן המקודד ל- ptp1 עלתה פי 30 בשלב האיניציאל ביצירת הקשיון. מוטנט antisense מושרה לגן ptp1 הראה כי ירידה בביטוי ptp1 מונעת היווצרות קשיונות. בתנאים אינדוקטיבים, לא נראו התלפפויות קורים, קורי המוטנט היו מצומקים ובעלי מחיצות רוחב עבות באופן חריג. יצירת כריות הדבקה הייתה פגומה, ובעקבותיה הוירולנטיות נפגעה. בנוסף, המוטנט היה רגיש יותר לעקה אוסמוטית ) Minkov,.(2010 רדיקלים חופשיים של חמצן ROS) (Reactive oxygen species- כסיגנאלים ומעורבותם באינטראקציה צמח פתוגן: D'Autreaux & ) מתארים שלל צורונים פעילים הנובעים מחמצון חלקי של חמצן ROS.(Toledano, 2007 רדיקלים חופשיים של חמצן נוצרים באופן טבעי כתוצר לוואי בתהליך הנשימה במיטוכונדריה, ובעיקר בקומפלקס 1 ו- 3 בשרשרת הציטוכרומים (2011.(Finkel, רדיקלים חופשיים של חמצן מגיבים עם שלל מולקולות תאיות כדוגמת: חומצות גרעין, חלבונים, סוכרים וליפידים, וגורמים ליצירת מוטציות ב-,DNA השתקה של פעילות חלבונים ואף למוות תאי 2009).(Bartosz, (NOX) NADPH oxidase הם משפחה שמורה מאוד של חלבונים ממברנאלים אאוקריוטים שמחזרים חמצן ליצירת סופר אוקסיד ) - O2). מצורון פעיל זה של חמצן נוצרים רדיקלים חופשיים נוספים כדוגמת מי- חמצן ) 2 H) 2 O והידרוקסיד רדיקל ).(OH אנזימי ה- NOX מייצרים רדיקלים חופשיים בפגוציטים במערכת החיסונית של יונקים, לאחר חשיפה לגורם פולש. העלייה ברדיקלים החופשיים מהווה תגובה של המערכת החיסונית למיקרואורגניזמים, ומובילה לנטרולם. גם בצמחים אנזימי ה- NOX מובילים לפרץ חמצוני בתגובה לפציעה או לחדירת פתוגן, וגורמים להרג הרקמה ויכולים להוביל לנטרול הפתוגן. הפרץ החמצוני מהווה תגובה ראשונית המשותפת לכלל מיני הצמחים, ומשמש מחסום להתפשטות פתוגנים מסוימים בצמח. הפרץ החמצוני מוביל ליצירת רקמה נקרוטית, בה הופעל מנגנון מוות תאי מתוכנן ) program.(amselem et al., 2011, Hegedus & Rimmer, 2005) (cell death- PCD הקשיונה הגדולה מפרישה חומצה אוקסאלית, הגורמת לעיכוב זיהוי הפטרייה המוביל לפרץ החמצוני עד להתבססותה. לאחר התבססות, חל פרץ חמצוני מאוחר ומועט, המוביל למות הרקמה הצמחית, ליצירת כתם נקרוטי, ולהמשך התפשטות הפטרייה ברקמת הצמח ),2011 al., Williams et 7

al., 2000.(Cessna et אנזימי NOX נפוצים גם ברקמות אחרות וביצורים ללא מערכת חיסונית מוגדרת. פעילותם הראתה כי יצור רדיקלים חופשיים בתא חיונית עבור תהליכי הגנה אך גם עבור חישת עקות והתפתחות (2010 Lambeth,.(Aguirre & בקשיונה הגדולה זוהו שני גנים ממשפחת ה-.NOX גנים אלו חשובים לתהליך יצירת הקישיונות ו- SsNox1 חיוני לוירולנטיות.(Kim et al., 2011) אנזימים נוספים המייצרים רדיקלים חופשיים כוללים בין היתר: oxidase, xanthine.(finkel, 2011) cyclooxygenases, cytochrome p450 enzymes, lipoxygenases הרדיקלים החופשיים מחוזרים ליצירת צורונים פחות פעילים על ידי אנטיאוקסידנטים כדוגמת הפפטיד גלוטתיון, או האנזימים (SOD) superoxide dismutase (המפרק סופר אוקסיד לחמצן ומי חמצן), קטאלאז (הופך מי חמצן למים וחמצן) ופרוקסירדוקסין,peroxiredoxins) המפרק מי חמצן). יצור הרדיקלים החופשיים בתא באופן מכוון, והתהליכים הרבים המבוקרים על ידם, הובילו לניסוח תיאוריית העקה החמצונית. תיאוריה זו מציעה כי רדיקלים חופשיים משמשים כבקר התפתחותי במיקרואורגניזמים רבים. מהלך החיים של מיקרואורגניזמים ניתן לחלוקה לשלבים התפתחותיים שונים, ביניהם חל תהליך התמיינות הנובע מחוסר יציבות הנגרמת כתוצאה מעקה חמצונית (1990 Aguirre,.(Hansberg & תיאוריה זו נוסחה גם עבור התהליך של יצירת קשיונות. כאשר בגידול תפטירי נוצרת מיקרוסביבה לא יציבה בה ריכוז הרדיקלים החופשיים גבוה, חלה התמיינות והאזורים הלא יציבים מבודדים. דרך התמיינות זו משיבה את הפטרייה לאקלים חימצוני יציב 2006) al.,.(georgiou et קבוצות תיול בשיירי ציסטאינים יכולים לעבור חמצון על ידי רדיקלים חופשיים של חמצן. ה- pka של תיול על גבי ציסטאין חופשי נע בין 8 ל- 9, אך בחלבונים מסוימים, הסביבה החלבונית יוצרת מיקרוסביבה בה ערך ה- pka צונח לטווח שבין 4 ל- 5, המהווה מטרה נוחה מאוד לחמצון על ידי רדיקלים חופשיים (2011.(Finkel, מחקרים רבים הראו כי PTP מהווים מטרה לחמצון הפיך על ידי רדיקלים חופשיים, ביונקים 2002) al.,,(meng et בצמחים 2003) Luan, (Gupta & ואף בקשיונה הגדולה ישנה קורולציה בין רמת הרדיקלים החופשיים ורמת הזרחון של טירוזין (2010 (Minkov, בקרת התפתחות הקשיון מהווה מטרה מרתקת למחקר היות והקשיון משמש כצורת השתמרות עיקרית של מספר פטריות פיטופתוגניות הגורמות לנזקים אדירים בחקלאות. הבנת המנגנונים המעורבים בהתפתחות הקשיון יכולה לשמש גם כמודל להבנת הבקרה החימצונית על תהליכים התפתחותיים פשוטים. 8

מטרות המחקר: א. איתור חלבוני המטרה להם PTP1 מבצע דה- פוספורילציה ב. בחינה באם קיימת השפעה ייחודית של עקה חמצונית על ביטוי ptps ג. השפעת מעכב PTPs על המורפולוגיה של הקשיונה הגדולה ועל שינוי בדפוס ביטוי גנים המעורבים בבקרה החמצונית ד. בחינת הבדלים בפרץ החמצוני בזנים שונים של עגבנייה וברור האם חלים שינויים בביטוי ptp1 המלווים הבדלים אלו 9

שיטות וחומרים: א. שיטות עבודה בקשיונה הגדולה: מצעי גידול: לצורך תחזוקה שגרתית של הקשיונה הגדולה, הפטרייה גודלה על מצע PDA בתוספת 0.5% אגר מתוצרת Difco (Sparks, USA) BD Agar) (Potato Dextrose (2% אגר סופי). לצורך מדידת קוטר גידול הפטרייה בתנאי עקה, הפקת /RNA חלבון (על פי המפורט בטקסט), 0.2gr MgSO4, 0.6gr K2HPO4, 0.15gr KCl, 1gr ) Joham הפטרייה גדלה על מצע NH4NO3, 0.0001gr thiamine chloride, 0.009gr FeSO4, 0.008gr MnSO4, 0.009gr,(ZnSO4 בתוספת Glucose/ Quinic acid 0.15mM לליטר, ו- 2% אגר. לצורך איסוף רקמה, Medicell international, ) 44.4mM הקשיונה הגדולה גודלה על גבי ממברנת דיאליזה (London BD Difco Potato PDB לטרנספורמציה לפרוטופסלטים, הפטרייה גודלה במצע (Dextrose) Broth נוזלי. גידול במצעים מוצקים נעשה באינקובטור 18. 0 C גידול במצע נוזלי נעשה בטלטול תנאי גידול:.18 0 C,160rpm טרנספורמציה לפרוטופלסטים: הטרנספורמציה נעשתה על פי פרוטוקול שנוסה במהלך עבודה (2003,(Rollins, בהתאם לשינויים זו ומתבסס על פרוטוקול סטנדרטי לקשיונה הגדולה המצורפים: הפקת פרוטופלסטים: לצורך עיכול דופן הפטרייה נעשה שימוש ב- 500, mg Lysing Enzymes Sigma- ) 12.5 U Chitinase from Trichoderma viride from Trichoderma harzianum,(aldrich St. Louis USA בבופר 0.5M סוכרוז, בנפח 20 מ"ל, לתרחיף קורים 5 מ"ל. טרנספורמציה: לכל 2 מ"ל פרוטופלסטים הוסף (>300ng/ul),150ul Heparin,100ul DNA.(Sigma- Aldrich) 30ul spermidin 100mM sodium orthovanadate :pervanadate שימוש במעכב טירוזין פוספטאזות Aldrich) (Sigma- נמהל ב- DDW ועבר טיטרציה ל-.pH=10 התמיסה עברה הרתחה עד להפיכתה לצלולה ושקופה. 100mM H 2 O 2 ליצירת.pervanadate לאחר 100mM sodium orthovanadate עורבבו עם 0.5-2mM למצע הגידול לריכוז סופי של pervanadate דקות אינקובציה, הוסף ה- 10.pervanadate תנאי גידול ובחינת רגישות עגבניות לקשיונה הגדולה: 11 זני עגבניות התקבלנו באדיבות- TomaTech (רחובות, ישראל). זנים אלו נזרעו וגודלו בחממות חי-שתיל (אזור תעשייה אשקלון 10

ישראל) למשך 30 יום. לאחר מכן, השתילים נאספו ונזרעו בחממת פיטופתולוגיה בפקולטה לחקלאות (C 24) 0 או בתא גידול מתוצרת Conviron בתנאים של 24 0 C ו- 12 שעות אור. לאחר 30 יום גידול נוספים, נאספו עלים לצלחות פטרי המכילות נייר ספוג מים לשמירה על לחות גבוהה. על גבי העלים הונחה דיסקית 0.8 מ"מ PDA עליה גדלה הקשיונה הגדולה. העלים המאולחים הועברו לגידול ב- 18 0 C ל- 56 שעות. לאחר זמן זה, העלים נסרקו בסורק שולחני. שטח הנגע חושב על ידי מדידת אורך מקסימאלי מקצה הכתם הנקרוטי לקצהו הרחוק ביותר תוך שימוש בתוכנת.ImageJ צביעת :(3,3' Diaminobenzidine) DAB עלי עגבנייה מנותקים ומאולחים הושרו בתמיסת '3,3 Diaminobenzidine 1mg/ml,(pH=3.8) למשך 40 דקות בוואקום ונשטפו במים מזוקקים. לאחר מכן, העלים עברו תהליך הלבנה -(bleaching) הרתחה באתנול: חומצה אצטית: גליצרול ביחס של 1:1:4 בהתאמה עד להלבנה מלאה. ב. שיטות עבודה ב- :Neurospora crassa תבדידים בהם נעשה שימוש בעבודה זו: זן הבר, MYC::COT1 מצעי גידול:,Vogel's minimal medium בתוספת 1.5% סוכרוז,(vgs) ולמצע מוצק- 1.5% אגר. אלקטרופורציה: התבצעה על פי הפרוטוקול (2008 al.,.(ziv et תבדיד זן הבר גודל למשך 10 ימים במצע.VGS 1.5% agar נבגים נאספו ונשטפו מספר פעמים בתמיסת סורביטול 1M וסורכזו בצנטריפוגה 4500rpm) 30µl.(4 C, 5min, נבגים בריכוז 3x10 9 spores/ml הוכנסו לקיווטה Gene pulser cuvette 0.2cm electrode gap, BioRad USA) (Hercules, California, עם DNA 0.5-1µg בנפח.10µl תהליך האלקטרופורציה התבצע במכשיר מסוג (BioRad) Gene pulser II בתנאים הבאים: ohms, 50 1.5 kv, 200 160rpm והם טולטלו למשך שלוש שעות ב- vgs מצע 360ul לאחר מכן, הוסף לנבגים.µF בטמפרטורה של 25. 0 C הנבגים נזרעו על גבי צלחות עם מצע Vogel's minimal medium -FGS) FGS תוספת,L-sorbose המעכב ביוסינתזת גליקוגן וגלוקאן ומוביל לגדילה מושבתית) בתוספת μg/ml).hygromycin B 100) לאחר שלושה עד חמישה ימים, המושבות נסרקו ב-.(www.fgsc.net/Neurospora/NeurosporaProtocolGuide.htm) PCR 11

ג. שיטות כלליות בביולוגיה מולקולארית: לצורך הגברה, מניפולציה ושימור של מקטעי דנ"א שונים, נעשה שימוש בחיידקי Esherichia coli מהגזע.DH5α החיידקים גודלו על מצע,LB נוזלי או מוצק (2% אגר). טרנספורמציה נעשתה על ידי מתן.heat shock שימור החיידקים כמו גם הטרנספורמציה נעשו על פי הפרוטוקול ב-, 2001 Russell.Sambrook & החיידקים עברו סלקציה לעמידות לאמפיצילין בריכוז של.100ug/ml דנ"א מחיידקים הופק מערכה מסחרית, על פי פרוטוקול החברה QIAprep Spin Miniprep (Hilden, Germany) kit Qiagen בניית פלסמידים: חיתוך דנ"א נעשה על ידי שימוש באנזימי רסטריקציה מתוצרת Burlington ) Fermentas (Canada בהתאם לתנאים המומלצים עבור כל ריאקציה בפרוטוקול החברה. בריאקצית PCR המובילה ליצירת מוטגנזה נקודתית, תוצר ה- PCR נחתך ב- Dpn1 (החותך דנ"א המכיל מתילציות) כדי להפטר מעודפי הפלסמיד ללא המוטגנזה. דה-פוספורילציה של קצוות דנ"א: בחיתוך פלסמיד באנזים רסטריקציה בודד, בטרם הליגאציה, נעשה טיפול ב-,SAP) Shrimp Alkaline Phosphatase מתוצרת New England (Biolabs, Massachusetts USA על פי פרוטוקול היצרן, על מנת למנוע ליגאציה של הפלסמיד ללא המחדר. ליגאציה נעשתה על ידי האנזים T4 DNA Ligase מתוצרת.Fermentas,Larova (Jena Germany) מתוצרת RedTaq סריקות סטנדרטיות נעשו באנזים ב- :PCR כאשר בכל ריאקציה:,1ul DNA,18ul ultra pure water,5ul master mix 0.5ul primer forward (100mM) 0.5ul primer reverse (100mM) תכנית ה- :PCR Initial denaturation 94 C 2 min Denaturation 94 C 30 sec Annealing 61 C 30 sec Elongation 72 C 60 sec/kb Final Extension 72 C 2 minutes Hold 4 C X 35 לצורך בניית פלסמידים, נעשה שימוש ב- Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with (New England biolabs) HF Buffer על פי התכנית: 12

Initial Denaturation 98 C 30 seconds 98 C 10 seconds 61 C 22 seconds X 35 72 C 30 seconds/kb Final Extension 72 C 10 minutes Hold 4 C BIO-RAD מתוצרת S1000 TM thermal cycler נעשה במכשיר PCR ניקוי תוצרי PCR וניקוי דנ"א לאחר חיתוך באנזימי רסטריקציה נעשו בקיט מסחרי Wizard.Promega (Wisconsin, USA) מתוצרת SV gel and PCR Clean-Up System הפרדת מקטעי דנ"א על גבי ג'ל אגרוז: מקטעי דנ"א הופרדו על גבי ג'ל אגרוז 1% במכשיר.60-110 Volt סמן אלקטרופורזה אופקי, המכיל בופר EDTA) TAE (Tris Acetate במתח הגודל בו נעשה שימוש: (100-10000bp) GeneRuler TM Ladder Mix מתוצרת.Fermentas הפקת :DNA הפקת DNA נעשתה על ידי כתישת הרקמות במכשיר beadbeater- 16 Mini USA) (BioSpec Bartlesville עם כדוריות זירקוניום 0.5mM והמשך ההפקה בקיט מסחרי על פי פרוטוקול היצרן (Sigma- Aldrich) GenElute TM Plant genomic DNA miniprep kit טבלה 1: הפריימרים בהם נעשה שימוש בעבודה זו. מודגשים על גבי הרצף: אתרי חיתוך לאנזימי הרסטריקציה.Sph1,BstBI,Apa1 קו תחתון- לינקרים המשלימים לרצף הפלסמיד.pUC19 אתרי המוטגנזה הנקודתית מסומנים באותיות קטנות Primer name Primer sequence project actinf GTAACGAACGTTTCCGTGCT general actinr CACCGATCCAGACGGAGTAT general pmp6f181 GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGTGAGCGGATAACAATTTCAC PTPmyc pmp6r1765 TTCGAAGGTACCTGAGACATCTTGTTGC PTPmyc pcsn44f722 GCAACAAGATGTTCTCAGGTACCTTCGAAGGGCCCGACTCCTGCATTAGGAAGC PTPmyc pcsn44r3184 GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCAAAGGGAACAAAAGCTGGAG PTPmyc ptpf1 GAAGGGCCCAATGAGTCCCGGAGGAAGAGT PTPmyc ptpr3111 TTTTTGCATGCTCCCAACCTATCCCATCTCA PTPmyc PTP2277CtoSf CTCGACCAATGCTTGTCCATaGTAGTGCAGGTTGTGGTCGAA mutagenesis PTP2277CtoSr TTCGACCACAACCTGCACTACtATGGACAAGCATTGGTCGAG mutagenesis PTP2133DtoAf TACATTATTCCTCCTGGCCAGcaTTTGCATCCCCTGCAAAAC mutagenesis PTP2133DtoAr GTTTTGCAGGGGATGCAAAtgCTGGCCAGGAGGAATAATGTA mutagenesis paz11f1518 GCAGTTTGCTGCCTGATACA for sequencing Puc19F151 CGGCATCAGAGCAGATTGTA for sequencing Puc19R905 TTTTTGTGATGCTCGTCAGG for sequencing paz11f1856 CTGTTCCCTTGTTTCCCAAA for sequencing 13

RNeasy Plant ההפקה נעשתה בקיט מסחרי.DNA רקמה נכתשה באופן זהה להפקת :RNA Turbo DNA-free Kit RNA :DNAse תוצר ההפקה עבר טיפול.Mini Kit (QIAGEN) בהפקת מהקשיונה הגדולה על.(Ambion Life technologies, Austin, TX, USA) גבי עלי עגבנייה, תוצר ההפקה מהקיט המסחרי עבר השקעה אתנולית לצורך ניקוי וריכוז, הדוגמאות 2001) Russell, (Sambrook & דוגמאות קשיונה גדולה נשלחו לקביעת רצף RNA עיבוד וניתוח :RNA sequencing ראשוני ב-.Texas A&M University הוכנו ארבע ספריות מדוגמאות חומצה קווינית לעומת גלוקוז ונטענו בהרצה בודדת במכשיר Inc..(Illumina ההרצה הכילה 76 San Diego, CA USA) Illumina software, CASAVA 1.8 Illumina GAII sequencer מחזורים. המידע עובד בתוכנת והשוואות סטטיסטיות ב- (GWB) CLC Genomics Workbench, ועבר ניתוח נתונים Inc.) (CLC Bio. סך כל High Capacity Foster City, CA, ) הקריאות עבור ארבעת הדוגמאות היה בטווח בין 12 ל-.megabase 23 הפקת :cdna 1ug RNA בנפח 10ul הוסף ל- 10ul הכוללים את מרכיבי הריאקציה מהקיט Applied Biosystems מתוצרת cdna Reverse Transcription Kit (USA טבלה 2: פריימרים לצורך אנליזות.RNA Primer name Primer sequence Tm Technique Source BtubF TTGGATTTGCTCCTTTGACCAG 60 RealTime PCR Minkov, 2010 BtubR AGCGGCCATCATGTTCTTAGG 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos1F GGAGTCCTACCACGTCTTCC 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos1R TTTGCTAGACCCCCATGACT 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos2F CATCAAAGCGAGACTCAGCC 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos2R TTCATCCTCGTCATCTGCTG 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos3F CATTGGTATTGACATTAGCG 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos3R TGTCATCGAACCGATTTCCCGTC 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos4F GTTGCGCTGCCGCCATTATTCGTC 60 RealTime PCR Minkov, 2010 TyrPhos4R CCACTGAGACTCGAGACCTG 60 RealTime PCR Minkov, 2010 Cna1F CCTCCCACTCATGGTCTTATGTG 60 RealTime PCR Harel et al., 2006 Cna1r CGGACGTGATTGTGAATGAAGT 60 RealTime PCR Harel et al., 2006 rgbf CCCGCCTTACTCATCATGAC 60 RealTime PCR Erental et al., 2007 rgbr CATCGCTGTTCACCGAAATG 60 RealTime PCR Erental et al., 2007 ss1g02784f555 GGAAAGCCGGAACCTGATA 60 RealTime PCR Yarden et al. 2014 ss1g02784f651 TCTGACATGGCCCACATAAA 60 RealTime PCR Yarden et al. 2014 ss1g00547f207 GGTGCTGGAGCTTATGGAGA 60 RealTime PCR Yarden et al. 2014 ss1g00547r277 AGTCTTCTTGCCGACTTTGC 60 RealTime PCR Yarden et al. 2014 PTPmycR301 CTCCGGATGCAGGTACTCTT 61 semi- quantitative RT PCR This study PTPmyc-39 AGCAGGGCAACAAGATGTTC 61 semi- quantitative RT PCR This study 14

:Realtime PCR 5ul,0.3ul primers 10uM,2.4ul Ultrapure water הוספו ל- 2ul בנפח 20ng cdna.(fast SYBRGreen Master Mix Applied Biosystems) SyberGreenX5 בעבודה זו, נעשה שימוש בפריימרים בעלי טווח יעילות של 85-110%. בכל ניסוי נעשו לפחות 3 חזרות טכניות, ונבדקה חזרה ביולוגית נוספת או יותר. בניסויים השונים מוצג ההפרש בין ביטוי הגנים הנדונים ובין גן הביקורת β-tubulin וביחס להפרש זה המתקבל בטיפול הביקורת-.RQ=2 - CT מוצגת השונות בין החזרות הטכניות שנעשו בניסוי, אלא אם מפורט אחרת בטקסט. אנליזות חלבון: הפקת חלבון: רקמה נכתשה באופן דומה להפקת חומצות גרעין, בבופר 6M sorbitol,) PBS 10mM Hepes, 5mM EDTA (ph=8), 5mM EGTA, 5mM NaF, 0.1M KCl, 0.2% Roche, Mannheim, ) complete EDTA free בתוספת מעכב פרוטאזות (Triton X-100.(Germany להפקת חלבון מהקשיונה הגדולה, הוסף לבופר ההפקה.10mM -β mercaptoethanol לצורך הומוגנציה, הדוגמאות עברו וורקטס (3x2min) ולאחריו צנטריפוגציה 13000rpm).(4 C, 40min, הדוגמאות נשמרו ב-.-80 0 אנליזת :immunoprecipitation ההפקה נעשתה בדומה להפקת חלבון, אך בסיום ההמוגנציה, נעשה סבב צנטריפוגה נוסף 4500rpm),(4 C, 10min, ולאחריו 13000rpm),(4 C, 40min, לצורך הוצאתה של השכבה הליפידית. לתוצר ההפקה הוסף נוגדן בהתאם להוראות היצרן, כמפורט בטקסט, והתמיסה הועברה לטלטול (70rpm) למשך שעה בקירור 4. 0 C לאחר מכן, הוסף לתמיסה Protein 20 μl Santa Cruz Biotechnology) A/G PLUS-Agarose Immunoprecipitation Reagent,(Santa Cruz, CA, USA והמשך הטלטול באותם התנאים למשך לילה. הבידים נשטפו שלוש פעמים בבופר (0.1% NP40,10mM MgCl 2,100mM KCl, ph= 7.5 50mM Tris) IP.NaCl 0.5M לו הוסף IP השטיפות נעשו בבופר,CO-IP לצורך.4 C, 1min, 14000rpm בדיקת ריכוז חלבון ריכוז חלבון נקבע לפי שיטת ברדפורד (1976,(Bradford, תוך שימוש בתמיסה לבדיקת ריכוז חלבון.(BioRad) עקומת הסטנדרט נעשתה עם החלבון Albumin) BSA (Bovine Serum מתוצרת.Sigma-Aldrich הפרדת חלבונים בג'ל SDS-PAGE לתוצר הפקת חלבון הוסף: 7.5μl,LDS Sample Buffer (4X), - 2.5μl של Sample (NuPAGE ) Reducing Agent (10X) 15

לתוצר 20 μl :IP של תוצר הוספו ל-,LDS Sample Buffer (4X) 5 μl ול- 2ul של Sample.(Carlsbad, California) Invitrogen TM שניהם תוצרת Reducing Agent (10X) הדוגמאות הורתחו 10min),70 C). החלבונים הורצו בג'ל (NuPAGE Bis-Tris 4-12%) SDS-PAGE תוצרת.Invitrogen TM סמן הגודל:.(Fermentas) PagerulerTM prestained protein ladder ההפרדה נעשתה במערכת XCell SureLock TM Mini-Cell electrophoresis System עם בופר NuPAGE.MES SDS Running Buffer ריכוזי החלבון בהם נעשה שימוש במסגרת מחקר זה נעו בין 50 ל- 80 מ"ג חלבון לבארית (20-35ul) צביעת :Coomassie נעשתה בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי (2001 Russell, (Sambrook & אנליזת חלבונים בשיטת :western blot העברה לממברנת ניטרוצלולוז נעשתה במכשיר,iBlot Dry Blotting System תוך שימוש במערכת (Invitrogen TM ) iblot Protein Transfer Stack והתהליך בוצע בהתאם להוראות היצרן. חשיפת הממברנה לנוגדנים ופיתוח נעשו עפ"י פרוטוקל סטנדרטי 2001). הנוגדנים מצורפים בטבלה 3 אנליזה מיקרוסקופית: בחינת פנוטיפ גידול הפטרייה בתנאי עקה נבחן במיקרוסקופ Sambrook & Russell, ) אור מסוג.Zeiss Axioscope התמונות צולמו באמצעות מצלמת,(Nikon, Tokyo, Japan) Nikon DXM1200 תוך שימוש בתוכנת ACT1 לקליטה ושמירה של התמונה. טבלה 3: נוגדנים בהם נעשה שימוש לאנליזות חלבון שם הנוגדן סוג הנוגדן שימוש חברה מיהול נוגדן שניוני Anti myc ראשוני מונוקלונלי myc tag זיהוי Santa Cruz 1:5,000 anti mouse Anti β Tubulin ראשוני פוליקלונלי זיהוי בטא טובולין Abcam 1:1,000 anti rabbit Anti p Tyr(PY99) ראשוני מונוקלונלי זיהוי פוספורילציות בשיירי טירוזין Santa Cruz 1:1,000 anti mouse goat anti rabbit IgG HRP שניוני זיהוי נוגדן ראשוני שנעשה בארנבת Santa Cruz 1:10,000 goat anti mouse IgG HRP שניוני זיהוי נוגדן ראשוני שנעשה בעכבר Santa Cruz 1:10,000 16

ד. תוכנות מחשב וניתוח תוצאות: מידע גנומי על הקשיונה הגדולה התבסס על מאגר המידע: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/sclerotinia_sclerotiorum/multiho me.html תכנון פריימרים נעשה ב: http://www.bioinformatics.nl/cgi- /bin/primer3plus/primer3plus.cgi תכנון ובניית פלסמידים נעשה בתוכנת A: Plasmid Editor v2.0.47 /http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape ניתוח סטטיסטי נעשה בתוכנת.JMP 9 איסוף הנתונים נעשה ב-.Excel מדידת עיכוב גידול הפטרייה וגודל הכתם הנקרוטי בעלי עגבנייה מנותקים נעשה בתוכנת ImageJ 1.47 ניתוח תוצאות ריצוף רנ"א נעשה בתוכנת http://www.blast2go.com/b2ghome :Blast2go 17

תוצאות בחינת ההשפעה של שינוי מקור פחמן על דפוס ביטוי הגנים ב- :S.sclerotiorum בעבודות קודמות (2010 Minkov,,(Shamir,,2012 אופיין תפקידו של הגן ptp1 תוך שימוש במוטנט antisense אינדוקטיבי, העובר שפעול במעבר למקור הפחמן חומצה קווינית וגורם להפחתה בביטוי הגן. שינוי מקור פחמן מהווה התערבות משמעותית בגידולו של האורגניזם, ולכן ישנו צורך לאפיין את ההשפעה של שינוי זה על הפטרייה באופן כללי. לצורך כך, נבדקו השינויים החלים בביטוי גנים על ידי קביעת הרצף של כלל ה- RNA של זן הבר לאחר מעבר לגידול במצע המכיל חומצה קווינית כמקור פחמן יחיד. נקבע הרצף של 3961 גנים, מתוכם 747 הראו עליה מובהקת ברמת הביטוי value<0.05),(fold change,2< p 1006 גנים הראו ירידה מובהקת ברמת הביטוי value<0.05) (Fold change,2-> p 385 גנים התבטאו באופן מוגבר בצורה ניכרת value<0.05),(fold change,5< p ו- 370 התבטאו באופן מופחת בצורה ניכרת value<0.05).(fold change <-5, p מתוך 50 גנים שנמצאו כמעורבים ישירות בתגובה לחומצה קווינית ב- Neurospora crassa (2011 al.,,(tang et ל- 34 מהם היו גנים הומולוגים מהקשיונה הגדולה. מתוכם, לתשעה ההומולוגיה הייתה נמוכה ול- 12 גנים לא נקבע רצף בניסוי הנוכחי. סך הכל, 15 גנים בעלי הומולוגיה גבוהה אותרו בתהליך הריצוף, מתוכם 10 הראו עלייה בשעתוק בתגובה למעבר לחומצה קווינית, שניים הראו ירידה, ו- 3 נותרו ללא שינוי מובהק (טבלה 4). תגובת הפטרייה למעבר לחומצה קווינית תאמה את המצופה על פי הספרות. הגנים המצוינים בטבלה, מבטאים את התגובה הספציפית המצופה במעבר לחומצה קווינית, אך אינה כוללת את כל השינויים המתרחשים בתהליך הכוללים בנוסף השפעות משניות הנובעות ממעבר בין מקורות פחמן בכלל. ישנה חשיבות בבחינת שלל ההשפעות של שינוי מקור הפחמן לחומצה קווינית בקשיונה הגדולה, והבנה של כל התהליכים המעורבים בהם יש להתחשב בניתוח ואפיון מוטנטים המתבססים על אינדוקציה זו. בבחינת שלל ההשפעות של שינוי מקור פחמן לחומצה קווינית (איור ( 2a חלה עלייה משמעותית וצפויה ברמת ביטוי גנים המעורבים במטאבוליזם תאי כללי, ובפרט של סוכרים ותרכובות חנקן, ועליה בתהליכים קטאבולים. לעומת זאת, ניתן לראות כי התהליכים שעברו השתקה ברמת הביטוי היו שונים מאוד (איור 2b). מלבד תהליכי הובלה, שירדו ועלו בשיעור זהה, שאר התהליכים היו שונים במהותם. ישנה ירידה משמעותית בתרגום חלבונים, ובסינתזה של חומצות גרעין וחומצות אמינו. לא נראתה תגובת עקה מובהקת, אך נמצאה ירידה משמעותית בתהליכים חשובים בשגרת קיומה של הפטרייה. לשינויים אלו יכולה להיות השפעה על הפיסיולוגיה והמורפולוגיה של הקשיונה הגדולה, ויש להתחשב בכך כאשר מאפיינים תבדידים טרנסגנים 18

המושתתים על השינוי האינדוסבילי בביטוי גן הנגרם כתוצאה ממעבר ממצע המכיל גלוקוז למצע המכיל חומצה קווינית. טבלה 4: גנים המעורבים בתגובה ספציפית לשינוי מקור הפחמן לחומצה קווינית. מודגשים בטבלה גנים שביטויים עלה/ ירד בצורה מובהקת. בכוכבית מסומנים גנים המעורבים בבקרת תנאי עקה. קו תחתון- גנים בעלי הומולוגיה נמוכה לגנים המקבילים ב-.N crassa SS qa gene SS1G_09183 SS1G_02776 SS1G_09187 SS1G_14177 SS1G_02281 SS1G_09188 SS1G_13506 SS1G_07630 SS1G_03642 SS1G_03491 SS1G_00782 SS1G_12031 SS1G_08921 SS1G_11418 SS1G_08235 SS1G_04425 SS1G_10617 SS1G_04841 SS1G_11046 SS1G_05792 SS1G_01904 SS1G_08425 NC homolog NCU06024 NCU04072 NCU06026 NCU06023 NCU09873 NCU06025 NCU00801 NCU01830 NCU09429 NCU07888 NCU03415 NCU06881 NCU08771 NCU00591 NCU04872 NCU09133 NCU01517 NCU05627 NCU02364 NCU06524 NCU06815 NCU10021 Score (bits) 326.635 423.705 626.32 140.58 1004.2 308.145 305.064 574.32 565.07 140.58 528.09 851.66 719.54 746.12 102.06 82.42 714.53 325.48 112.46 65.85 117.09 704.13 Description sugar porter (SP) family MFS transporter catabolic 3 dehydroquinase phosphoenolpyruvate carboxykinase shikimate 5 dehydrogenase sugar porter (SP) family MFS transporter hydroxyphenylpyruvate dioxygenase 3 oxoacid CoA transferase, B subunit pyruvate carboxylase sugar porter (SP) family MFS transporter sugar porter (SP) family MFS transporter Fold change 605.34 128.1 28.23 19.15 17.78 10.55 7.72 7.53 3.81 2.52 2.16 2.05 1.75 1.56 1.48 1.42 5.24 5.13 1.95 1.65 1.46 1.4 Regulation up up up up up up up up up up up up * down down * 19

איור 2: שינוי בביטוי גנים כתוצאה ממעבר לגידול במצע המכיל חומצה קווינית כמקור פחמן. הקשיונה הגדולה גודלה 24 שעות על מצע RNA ל- 12 שעות נוספות. נקבעו כלל רצפי ה- Joham 15mM QA על גבי נייר דיאליזה, ואז הועברה למצע,Joham 15mM glucose בשיטת.Illumina באיור מוצגים תהליכים בהם היו מעורבים לפחות 5% מהגנים להם נמצאו הומולוגים ושויכו להם Go-terms צפויים. (a) קבוצות גנים שביטויים עלה פי 2 ויותר, באופן מובהק (0.05>p). (b) קבוצות גנים שביטויים ירד לכדי מחצית או פחות, ובאופן מובהק.(p<0.05) סימון PTP1 לצורך אפיון אינטראקציות ושינויים ברמת החלבון: על מנת לבחון את רמת ביטוי החלבון בשלבי התפתחות שונים, חמצונית), ולבחון אינטראקציות עם חלבונים אחרים, באפיטופ האימונוגני.MYC הסימון נעשה בשתי דרכים עיקריות: נעשה ניסיון לסמן בתנאי עקה (ובעיקר את החלבון עקה PTP1 תחילה נעשה ניסיון לסמן את החלבון בסמן,MYC +x3 Gly x8 תחת בקרתו של הפרומוטור האינדוקטיבי של הגן,ccg-1 המתבטא בתנאי הרעבה (2009 Selker,.(Honda & סימון זה לא צלח ולא נראה ביטוי של הגן ptp1 המסומן ב-.myc לאור זאת, הוחלט להשתמש בפרומוטור אחר המתבטא קונסטיטוטיבית 2uorf Orbach, ) P cpc-1 1994), ובסמן המכיל מספר רב של חזרות- ששה שיירי MYC (איור 3b). הסימון נעשה באופן הבא: 2uorf f.pmp6r1765 תוך שימוש בפריימרים +pmp6f181 הוגבר מהפלסמיד pmp6 P cpc-1 מקטע העמידות להיגרומיצין, המכיל פרומוטור וטרמינטור,trpC וביניהם את הגן ל- HygromycinB הוגבר מהפלסמיד (Staben et al., 1989) pcsn44 תוך שימוש בפריימרים.pcsn44R3184 +pcsn44f722 20

הפריימרים המצוינים מכילים לינקרים המשלימים את הרצף האחד של השני ושל הפלסמיד המסחרי puc19 כמו גם רצפים המתאימים לחיתוך על ידי אנזימי רסטריקציה. בריאקציית התוצרים המוגברים עברו חיבור לפלסמיד,pUC19,(Szewczyk et al., 2006) Fusion PCR ליצירת הפלסמיד.pAZ18 בסיסים, 264,BstBI ונוקה מג'ל אגרוז מקטע בגודל נחתך באנזים הרסטריקציה pme18 טופל ב- נחתך באתר יחיד באותו האנזים, paz18.myc המכיל שש חזרות של הסמן,Shrimp alkaline phosphatase ועבר ליגאציה עם המקטע המקודד לסמן,myc ליצירת הפלסמיד.pAZ19 בודד והוגבר מהקשיונה הגדולה על ידי הפריימרים PTP1+PTPR3111 ונחתך באנזימי ptp1 שנחתך באותם,pAZ19.Apa1+ Sph1 תוצר זה עבר ליגאציה לפלסמיד הרסטריקציה האנזימים, ליצירת הפלסמיד -paz20 המכיל את ptp1 המסומן ב-,myc תחת בקרתו של 3a). סימון הגן (איור 2uorf cpc-1 P, בנוסף למקטע המקודד לעמידות להיגרומיצין הפרומוטור מאפשר לבחון את רמת ביטויו ב- western blot בתנאים שונים, ולבחון האם קיימים חלבונים נוספים הקשורים ל- PTP1 בקומפלקס חלבוני על ידי ביצוע.Co- IP פעולת הפוספטאז מצריכה קישור רגעי בלבד בין הפוספטאז לבין חלבון המטרה. על מנת לזהות את חלבוני המטרה להם PTP1 מבצע דה- פוספורילציה, יש צורך ביצירת שינוי במבנה החלבון. מוטציה בציסטאין הפעיל,(Cys->Ser) או בדומיין קטליטי,(Ser->Ala) WPD loop גורמים ליצירה של קשר קוולנטי בלתי הפיך עם הסובסטרט (1997 al.,.(flint et סימון ה- PTP מבצע דה- PTP בתוספת המוטציות הנ"ל, מאפשר לבחון את חלבוני המטרה להם ה-,CO-IP ושליחה לריצוף של החלבונים שהושקעו ביחד עם ה- PTP פוספורילציה על ידי ביצוע C->S מוטציות נקודתיות בגן- 2,pDRIVE בו נעשו שובט ל- ptp1 המסומן. לצורך כך, paz15 ו- ליצירת הפלסמידים paz14,(ptp2133dtoaf+r) D->A ו-,(PTP2277CtoSf+r) בהתאמה. מפלסמידים אלו נחתך הגן ptp1 המכיל את המוטציות הנקודתיות, על ידי האנזימים paz22 ו-,pAZ21 (PTP1MYC C->S) ליצירת,pAZ19 ושובט ל-,Apa1 Sph1.(PTP1MYC D->A) היות והסימון לא צלח בניסיון הראשון, ושהליך הטרנספורמציה והפקת החלבון פשוט יותר לביצוע ב-.N, crassa הוחלט לבחון ראשית כל את הסימון באורגניזם זה. בניגוד למצוין בספרות, הגן תחת בקרתו של P cpc-1 2uorf התבטא, אך לא ברמה גבוהה (איור western באנליזת MYC בנוסף, חרף ניסיונות חוזרים ונשנים, לא אותר חלבון המסומן ב- 3b)..blot בביצוע IP לריכוז גבוה של חלבון, התקבל תוצר גדול מעט מהצפוי ) +100Kda בהשוואה ל- 94Kda צפויים, איור 3c). נקבע הרצף לתוצר זה, אך לא נראה דמיון ל- PTP1 או ל- MYC 21

כלל. ככל הנראה היה זה תוצר קישור לא ספציפי לנוגדן.αMYC סימון PTP ב- MYC לא צלח במסגרת עבודה זו. איור 3: סימון.pAZ20 (a).ptp-myc מסומנים אתרי המוטציות הנקודתיות, ואתרי החיתוך בהם נעשה שימוש לצורך יצירת הפלסמידים. (b) semi-quantative RT PCR לביטוי ptp המסומן ב-.myc נבדקו שלושה מוטנטים מאירועי טרנספורמציה שונים, זן הבר וביקורת. (c) ביטוי החלבון PTP המסומן ב- MYC נבדק ב- western blot על ידי הנוגדן.anti-MYC תבדיד MYC-COT שימש כביקורת חיובית לבדיקת הנוגדן. בנוסף, נבדק החלבון המסומן על ידי -Immunoprecipitation עם הנוגדן,anti- MYC ולאחריה הגבה עם אותו הנוגדן. חץ מציין תוצר שהגיב עם הנוגדן הנבדק. שתי הממברנות תועדו לאחר 10 דקות חשיפה. פוספורילציה של שיירי טירוזין בשלבי התפתחות שונים לאחר שלא צלח נסיון סימון החלבון,PTP1 הוחלט לבחון את פעילות כלל הטירוזין פוספטאזות in vivo במהלך התפתחות הקשיון. רמת השעתוק של טירוזין פוספטאזות בכלל, ו- ptp1 בפרט עולה באופן משמעותי בשלב האיניציאל (שלב ראשוני) של התפתחות הקשיון (2010.(Minkov, ניתן לצפות כי עלייה זו תהיה מלווה בדה פוספורילציה כללית של טירוזין. באיור 4 ניתן לראות כי חלה עליה 22

משמעותית בכמות החלבונים העוברים פוספורילציה בשיירי טירוזין בשלב האיניציאל, בהשוואה לקורים או לקישיון בוגר. קיימת מגמה הופכית בה התפתחות הקישיון מלווה בעליה ברמת השעתוק של טירוזין פוספטאזות, אך חלה עליה בפוספורילציה של טירוזין. איור 4: פוספורילציה של טירוזין בשלבי התפתחות שונים. 65 מ"ג חלבון הופק מקורים (בני יומיים), איניציאלים של קשיונות (5 ימים) וקשיונות בוגרים (10 ימים) והורץ בג'ל.SDS-PAGE הממברנה עברה הגבה עם נוגדן α. P-Tyr זמן חשיפה- 10 דקות השפעתה של עקה חמצונית קבועה על רמת ביטוי :ptps התפתחות הקשיון מלווה בעליה ברמת ביטוי הגנים המקודדים לטירוזין פוספטאזות מחד, אך עליה כללית בפוספורילציה של טירוזין מאידך. עליה בפוספורילציה יכולה להעיד על עיכוב פעילות הטירוזין פוספטאזות. יתכן כי השתקת פעילות החלבון מובילה להעלאת רמת השעתוק כמנגנון בקרה. כדי לבחון היפותזה זו נבדקה ההשפעה של עקה חמצונית, הגורמת להשתקה זמנית של האתר הפעיל בטירוזין פוספטאזות 1998) al.,,(meng et al., 2002, Lee et על רמת ביטוי הגנים המקודדים לטירוזין פוספטאזות. כביקורת בחנו גם עקה אוסמוטית- סורביטול, ומליחות-.NaCl כל הנ"ל גורמים לעיכוב משמעותי בגידול הפטרייה (איור 5, c,a).,b תחת עקה קבועה, סורביטול גורם לעלייה ברמת ביטוי ptp1 ו-. ptp4 ב- NaCl ישנה ירידה ב,ptp1 אך עלייה ב-,ptp4 ומגמה זו נמצאה כתלוית ריכוז. בגידול תחת עקה חמצונית, לא חל שינוי משמעותי ברמת ביטוי הטירוזין פוספטאזות השונות (איור 5d). מכיוון שמדובר בבדיקה ראשונית, ולא נראו הבדלים משמעותיים, ניסוי זה נערך ללא חזרות. 23

איור 5: השפעת תנאי עקה על גידול הקשיונה הגדולה ועל דפוס ביטוי.ptps נבדק אחוז גידול הפטרייה על גבי מצע Joham Glucose למשך 48 שעות בתוספת ריכוזים שונים של (a) סורביטול, (b),nacl (c),h 2 O 2 בהשוואה לגידול על מצע Joham Glucose בלבד. (d) ביטויים היחסי של ארבעה ptps בתנאי העקה השונים לעומת ביטויים במצע ללא עקה כפי שנמדד ב-. RealTime PCR ביטוי ptps עולה כתוצאה מהשראת עקה חמצונית: מדידת השינויים המתרחשים לאחר השראת העקה הובילה לדפוס שונה בהשוואה לעקה קבועה. תחילה הפטרייה גדלה על מצע Joham סטנדרטי למשך 48 שעות, ולאחר מכן הועברה לתנאי העקה השונים למשך שעתיים ושש שעות. תחת עקה אוסמוטית, NaCl וסורביטול, הייתה עלייה כללית ברמת ביטוי טירוזין פוספטאזות. נבדקה רמת ביטוי הגנים המקודדים לשתי סרין תריאונין פוספטאזות- (pp2b) cna ו-.(pp2a) rgb עליה בביטוי של גנים אלו הייתה דומה לעליה שחלה בטירוזין פוספטאזות (איור 6). עקה חמצונית הובילה לעלייה משמעותית ברמת ביטוי כל הפוספטאזות, בעיקר ב- ptp1 לאחר שש שעות. ההבדל בביטוי ptp1 ה הי גדול באופן מובהק לעומת העלייה בביטוי can 24

.(ptp4 (מלבד ptps אך לא מיתר ה- (student t,p value=0.034) rgb ו- (p value=0.02) בנוסף, נבחנו ביטויים של שתי קטאלזות,,(Yarden et al., (2014 Scat1, Scat2 לצורך בחינת התגובה הכללית הצפויה לעקה החמצונית. למרות שביטויים עלה כתוצאה מעקה אוסמוטית (איור 6b), עקה חמצונית גרמה לעלייה משמעותית ומהירה ביותר ברמת ביטוי- Scat2 (למעלה מפי 20 לאחר שעתיים, איור 6a). ככל הנראה, קטאלאז זה משמעותי בהתמודדות הפטרייה עם עקה חמצונית סביבתית, ומגיב אליה באופן מהיר ביותר. מכאן עולה השאלה האם עיכוב טירוזין פוספטאזות הוא המוביל לעיכוב הגידול ולעליה בביטוי הגנים המקודדדים לטירוזין פוספטאזות, או שמה מדובר במנגנון אחר המופעל בעקה חמצונית ואינו תלוי בפעילות טירוזין פוספטאזות כלל? 25

* איור 6: השפעה של השראת עקה על רמת ביטוי גנים המקודדים לפוספטאזות וקטלאזות. ביטויים היחסי ב- RealTime PCR של (c) סורביטול, (b) עקה חמצונית, (a) סרין/ תריאונין פוספטאזות, וקטלאזות שעתיים ושש שעות לאחר מעבר לתנאי עקה-,ptps,NaCl בהשוואה למעבר ממצע סטנדרטי ללא עקה למצע זהה. על גבי הגרף מוצגות שגיאות התקן. מסומן בכוכבית- ביטוי הגן המקודד ל- ptp1 שונה באופן מובהק סטטיסטית במבחן student T ברמת מובהקות >α 0.05 מהביטוי שהתקבל באותו הטיפול 26 לגנים המקודדים לסרין/ תריאונין פוספטאזות.

Pervanadate מעכב את גידול הקשיונה הגדולה, ומוביל להתמיינות קשיונות: כדי לבחון את ההשפעה הישירה של עיכוב טירוזין פוספטאזות, ללא השפעות משניות של עקה חמצונית, נבדקה ההשפעה של מעכב טירוזין פוספטאזות- pervanadate על הגידול והמורפולוגיה של הקשיונה הגדולה. מעכב זה גורם לחמצון בלתי הפיך של האתר הפעיל בטירוזין פוספטאזות. חמצון האתר הפעיל גורם להשתקת הפעילות של החלבון וכתוצאה מכך, לזרחון יתר של שיירי טירוזין (1997 al.,.(huyer et מעבר לעקה חמצונית גרם להתפצלויות יתר של קורי הקשיונה הגדולה, בהשוואה לגידול סטנדרטי (איור 7b לעומת 7a). העברת הפטרייה ל-,pervanadate גרם לעלייה משמעותית בהתפצלויות, כמו גם להופעה מוקדמת של איניציאלים- השלבים הראשונים בהתפתחות קשיונות (איור 7c). באיור 7d ניתן לראות כי גידול בנוכחות- pervanadate בריכוזים של 0.25-1 mm גרם לעיכוב דומה לזה הנוצר כתוצאה מגידול הפטרייה בעקה חמצונית 4mM) ( H 2 O 2. שילוב של מי חמצן עם pervanadate 0.5mM הוביל לעיכוב מוגבר, באופן אדטיבי. pervanadate 1mM בשילוב עם מי חמצן, גרם לעיכוב מוחלט של גידול הפטרייה, כך שלא חל גידול משמעותי מעבר לאינוקולום הראשוני. עיכוב טירוזין פוספטאזות מוביל לירידה בקצב גידול הקשיונה הגדולה בנפרד מהעיכוב הנגרם מנזקי עקה חמצונית, ומוביל להתמיינות קשיונות. a d 20 A A 15 b Growth (cm 2 ) 10 B B B B 5 C C c 0 DDW DDW+ H 2 O 2 1mM DDW+ H 2 O 2 איור 7: השפעתו של pervanadate על גידול הקשיונה הגדולה. זן הבר גודל במצע סטנדרטי למשך 36 שעות, והועבר ל- 12 שעות גידול נוספות ( a ),במצע Joham סטנדרטי זהה (b) מצע המכיל מי חמצן 4mM או (c).1mm pervanadate חץ איניציאל, השלב ההתפתחותי הראשון ביצירת קישיון. (d) שטח המושבה הגדלה בריכוזים משתנים של H 2 O 2 או B A,.pervanadate ו- C מסמנות שלוש 27 קבוצות הנבדלות בניהן באופן מובהק סטטיסטית במבחן student T ברמת מובהקות >α. 0.05 על גבי העמודות מוצגות שגיאות התקן. 4mM perv 0.25mM Treatment perv 0.5mM perv 1 mm perv 0.5mM + H 2 O 2 4mM perv 1mM + H 2 O 2 4mM

אך מוביל לעלייה בביטוי :Scat2 אינו גורם לעלייה ברמת ביטוי הגן,ptp1 Pervanadate גידול הפטרייה על מצע המכיל,pervanadate 1mM לא הוביל לעלייה ברמת ביטוי הגן ptp1 (איור 8). לעומת זאת, ביטוי הקטלאז,Scat2 שביטויו עולה בעקה חמצונית סביבתית, עלה באופן ניכר לאחר טיפול ב-.pervanadate שילוב של מי חמצן עם,pervanadate גרם לעלייה מוגברת ברמת ביטוי הגן המקודד ל-.Scat2 טיפול מוקדם ב-,pervanadate ולאחריו מעבר למי חמצן, גרם לעליה פחותה בביטוי הקטלאז בהשוואה לגידול על מי חמצן בלבד. Treatment איור 8: ביטוי ptp1 וקטלאזות בעיכוב טירוזין פוספטאזות. זן הבר גודל על מצע Joham סטנדרטי למשך 48 שעות, ואז הועבר למצע Joham בתוספת מי חמצן או 1mM pervanadate או שניהם, בריכוזים המצוינים בגרף. הופק,RNA ונבדק ביטוי הגנים ב-,RealTime PCR לאחר (a) שעתיים, (b) ולאחר שש שעות. -perv >H 2 O 2 טיפול בו זן הבר גודל על מצע סטנדרטי למשך 36 שעות, הועבר למצע המכיל,1mM pervanadate למשך 12 שעות, והועבר פעם נוספת למצע המכיל 4 mm H 2 O 2 לשעתיים או שש שעות נוספות. על גבי העמודות מוצגות שגיאות התקן. 28

הפרץ חמצוני ומעורבותם של קטלאזות בהתבססות הקשיונה הגדולה: הפתוגנזה מושפעת מגורמים סביבתיים רבים כדי לבחון את הפתוגנזה, ומעורבותם של טירוזין פוספטאזות בתהליך, נסרקו כ- 11 זני עגבנייה שונים, הנבדלים ביניהם בתכונות כגון גודל, אורך הפרי והעלה. מטרת הסריקה הייתה לאתר זנים רגישים/ עמידים יותר לקשיונה הגדולה. על ידי אבחון הבדלים ברגישות הצמח, הנובעים מתגובה נבדלת בשלבים שונים בפתוגנזה, ניתן היה לאבחן את נקודת הפגיעה למוטנטים שונים בקשיונה הגדולה המציגים דפוסי פתוגנזה שונים מזן הבר. בנוסף, ניתן לבחון את ההשפעה של ההבדלים בפתוגנזה על ביטוי גנים או חלבונים החשודים כמעורבים וחיוניים לתהליך. זני העגבנייה השונים נבדלו ברגישותם להדבקה בקשיונה הגדולה. בסריקה ראשונית שנערכה, מספר זנים היו רגישים יותר, בהם המחלה התפתחה באופן מהיר מאוד, לעומת זנים שבהם המחלה התפתחה באופן איטי יחסית. באחד הזנים אף היה הבדל משמעותי בין צמחים שהושקו במי קולחין לצמחים שהושקו במים שפירים. למרות ההבדלים ברגישות הזנים השונים להדבקה בקשיונה הגדולה, ההבדלים לא היו עקביים. בכל חזרה התקבלו מספר זנים רגישים או עמידים אחרים, על אף שבכל ניסוי התוצאות היו מובהקות ובעלות שונות קטנה עבור כל זן. הניסוי נערך בחממה, ואף בתנאים מבוקרים- בתאי גידול בעלי תנאי אור וטמפרטורה קבועים. לא ניתן לקבוע האם קיימים הבדלים בפתוגנזה בתנאים שנבחנו. הזנים אכן מאופיינים בתגובות נבדלות לאילוח בקשיונה הגדולה, אך באופן התלוי בתנאי הסביבה המשתנים ולא באופן יחסי בין הזנים השונים. מדידת תגובת הצמח לאילוח בקשיונה הגדולה: מכיוון שלא היה ניתן להבדיל בין הזנים השונים ברגישות לקשיונה הגדולה, הוחלט לבחון האם הזנים השונים נבדלים בתגובתם לפטרייה, אף אם שוני זה לא בא לידי ביטוי ברגישות הצמח למחלה. נבחן הפרץ החמצוני הנוצר בעת הדבקת הצמח בקשיונה הגדולה. ראשית כל, נבדקה ההפרשה של מי חמצן על ידי הצמח לאורך זמן מהאילוח (איור 9). לאחר 24 שעות, ניתן לראות הפרשה מרוכזת של מי חמצן בעלה, קרוב לאזור האילוח. לאחר 36 שעות התגובה מקיפה יותר וכוללת אזורים נרחבים בעלה. לאחר 56 שעות, העלה כוסה ברובו בכתם נקרוטי, וחלה הפחתה משמעותית בהפרשה מרוכזת של מי חמצן. לאור זאת, 36 שעות לאחר האילוח נבחר כזמן מתאים לאבחון עוצמת הפרץ החמצוני בזנים השונים. 29

איור 9: פיזור מי חמצן בעלה מאולח בקשיונה הגדולה לאורך זמן. צביעת DAB והלבנה לעלים בני חודשיים מזן 427, מזמן האילוח עד ל- 56 שעות לאחריו. DAB הלבנת העלים ללא צביעת.DAB ביטוי הקטלאזות Scat2,Scat1 מצוי בקשר ישיר עם רמת מי החמצן המופרשת מהעלה נסרקו 11 הזנים השונים לצורך בחינת הפרץ החמצוני לאחר האילוח בקשיונה הגדולה. הזנים השונים נבדלו בתגובתם לאילוח בפטרייה (איור 10b). זן 535 ו- 33 הראו באופן עקבי תגובה חזקה יותר, המתבטאת בהפרשה מסיבית של מי חמצן לאחר 36 שעות מזמן האילוח. זן 369 היה עקבי בתגובתו החלשה לפטרייה, ובו לא נראו ריכוזים משמעותיים של מי חמצן על גבי העלה. נבדקה רמת הביטוי של הגנים- Scat1, Scat2 בעלים (איור 10a). ביטוי הקטלאזות היה במתאם לרמת מי החמצן בעלה. בזנים בהם הייתה הפרשה משמעותית של מי חמצן, ניתן היה לראות ביטוי גבוה של הגנים המקודדים לקטאלזות. רמת ביטוי הגן ptp1 לא הושפעה מרמת מי החמצן בעלה, וביטויו היה ברמה קבועה (אינו מוצג). 30

a b איור 10: סריקת הפרץ החמצוני בעלי עגבנייה מזנים שונים, וההשפעה על ביטוי קטלאזות מהקשיונה הגדולה. (b) צביעת DAB לעלי העגבנייה משבעה זנים השונים, (a) וביטוי Scat1, Scat2 ב- RealTime.PCR בכוכבית מסומנות שתי קבוצות הנבדלות זו מזו באופן מובהק סטטיסטית במבחן student T ברמת מובהקות >α. 0.05 מוצגות שגיאות התקן 31

על הבקרה ההדדית של תהליכי זרחון ורדיקלים חופשיים של חמצן דיון ומסקנות: בעבודה זו נבחנה ביטוי גנים מושפעת על פעילות ורמות הבקרה החמצונית ההתפתחות בקשיונה הגדולה. מאקלים חמצוני מקומי ומעקות חמצוניות רחבות היקף. השינויים החלים בפעילות חלבונים, כדוגמת הטירוזין פוספטאזות, יכולים להיות בעלי משמעות רבה להתפתחות התקינה וליצירת המחלה האופיינית בקשיונה הגדולה. הבנת המנגנונים ומעברי הסיגנאל המבקרים תהליך התפתחותי זה, משמשת כמודל להבנה של תהליכי בקרה מורכבים יותר, ובידיה לסייע לחקלאות בהתמודדותה עם מחלות צמחים הנגרמות מאורגניזמים המייצרים קשיונות. שינוי מקור פחמן: מחקרים שונים הנוגעים לבקרה פוספורלטיבית על התפתחות הקשיונה הגדולה נעשו תוך שימוש בחומצה קווינית להשראת ביטוי גנים. חומצה קווינית היא מטאבוליט צמחי נפוץ, המצוי בריכוזים גבוהים בעיקר בצמחים מעוצים (1975 al.,.(yoshida et במחסור של מקור פחמן אחר, מספר פטריות יכולות להשתמש בחומצה קווינית כמקור אנרגיה. הגנים הדרושים לצורך ניצול החומצה הקווינית מאוגדים בלוקוס גנטי יחיד. באתר זה קיימים שני גנים רגולטורים וחמישה גנים מבניים. הגנים הרגולטורים כוללים אקטיבטור (qa-1f) המפעיל את שאר הגנים בלוקוס, ורפרסור (qa-1s) המעכב את פעולתו של האקטיבטור. במחסור בגלוקוז או סוכרוז, ובנוכחות חומצה קווינית, מוסר העיכוב החל על ידי הרפרסור, וכתוצאה מכך, חלה הפעלה של הגנים בלוקוס. הגנים המבניים כוללים שלושה גנים המשתתפים בקטאבוליזם של חומצה קווינית לצורך הפקת אנרגיה במעגל קרבס qa-4),(qa-2, qa-,3 גן המקודד ל-,(qa-y) permease החיוני להכנסת החומצה הקווינית לתא, וגן ללא תפקיד ידוע (qa-x) Logan et al.,,2007 ) (Giles et al., 1991, Battogtokh et al., 2002 מנגנון ההפעלה של הגנים הדרושים לקטאבוליזם של חומצה קווינית הינו ספציפי ולכן נעשה בו שימוש במחקר. החלפת מקור הפחמן לחומצה קווינית גורמת להפעלת ביטויו של גן נבחן תחת בקרתו של הפרומוטור,qa-2 לדוגמא ב.(Dong et al., (2008.N crassa בקשיונה הגדולה, נעשה שימוש בוקטור,pSO-1 להשתקת ביטוי גנים מושרה, במנגנון של RNA antisense בצמידות לפרומוטור qa-2 Erental et al., 2007, Chen et al., 2004, Harel et al., 2006, ).(Minkov, 2010 מלבד הפעלתו של גן מהונדס תחת בקרתו של הפרומוטור,qa-2 חלים שינויים רבים נוספים. שינוי מקור פחמן משפיע רבות על הפיסיולוגיה של האורגניזם, שינוי המתבטא בין היתר גם בהבדלים החלים בביטוי גנים נוספים. מעבר ממצע גידול המכיל סוכרוז 32

למצע המכיל חומצה קווינית כמקור פחמן יחיד ב-.N crassa הוביל לירידה ברמת ביטוי הגנים המובילים לפירוק חלבונים, סינתזה של ריבוזומים ומטאבוליזם של חומצות אמינו. לעומתם, חלה עליה בביטוי גנים המאופיינים כמעורבים במטבוליזם של סוכרים, וגנים הקשורים לתהליכי הפקת אנרגיה 2007) al.,.(logan et בקשיונה הגדולה, חלה עלייה ברמת ביטוי גנים המשויכים לאותם קבוצות תפקודיות, ובעיקרם- תהליכי מטבוליזם של סוכרים והפקת אנרגיה. בדומה, חלה ירידה בביטוי גנים המשויכים לסינתזה של חומצות אמיניות ונראתה ירידה בגנים הקשורים לתרגום חלבונים. ירידה בביטוי גנים המשויכים לתהליכים מהותיים אלו בשגרת קיומה של הפטרייה מעידה כי הגידול על בסיס חומצה קווינית דורש משאבים רבים יותר בהשוואה לגידול בתרבית על בסיס סוכר זמין יותר (כגון גלוקוז וסוכרוז), ולכן חלה הסתה של המשאבים והפחתה בתהליכים מטבוליים כלליים אחרים (חומצות גרעין וחומצות אמינו). למרות זאת, יש לציין כי Erental וחובריו מצאו שחומצה קווינית מגבירה במעט את קצב הגידול של הקשיונה הגדולה (2007 al.,.(erental et שיעורים גבוהים של שינויים ברמת ביטוי גנים לגורמי טרנספורט תועדו כתוצאה ממעבר מגלוקוז כמקור פחמן לחומצה קווינית. ביטויים של גנים רבים המקודדים לגורמי טרנספורט הוגבר משמעותית, בעוד ששיעור דומה של ביטוי גנים ירד משמעותית. בקרה על הובלה של מולקולות אל ומחוץ לתא היא משמעותית ביותר, ושינוי מקור הפחמן צפוי להניב הבדלים משמעותיים בזהות גורמי הטרנספורט. ב- (dehydroquinase) qa-2,n.crassa הוא הגן המתבטא ברמה הגבוהה ביותר בתגובה למעבר לחומצה קווינית (בנוסף ל-,(qa-3 אך ביטויו אינו מעוכב לחלוטין ללא חומצה קווינית לכן, צפוי כי וקטור המכיל גן המתבטא תחת בקרתו של הפרומוטור qa-2.(tang et al., (2011 יתבטא מעט גם ללא חומצה קווינית, כפי שנרמז בעדויות קודמות (2006 al.,.(harel et במעבר לחומצה קווינית, ביטוי הגן ההומולוג ל- qa-2 בקשיונה הגדולה (SS1G_14177) עלה פי 19, בעוד שההומולוג ל- qa-4 (SS1G_09183) עלה פי 605. בדיקת השינוי בביטוי הגנים נעשתה 12 שעות לאחר המעבר למצע המכיל חומצה קווינית. התגובה הנצפית בשיעור השינוי שחל בביטוי גנים אינה מייצגת את התגובה הראשונית לשינוי מקור פחמן, אלא לאחר הפעלת המסלול המטאבולי והתבססות של חומצה קווינית כמקור אנרגיה. Shikimic acid הוא מטאבוליט נפוץ בצמחים ומיקרואורגניזמים המשמש כפרקורסור לסינתזה של תרכובות ארומטיות, בין היתר, לסינתזה של חומצות אמינו ארומטיות (טירוזין, פנילאלנין וטריפטופן). ישנה חפיפה תפקודית בין גנים המעורבים בקטאבוליזם של חומצה קווינית למסלול הביוסנתזה של חומצות אמינו ארומטיות במסלול ה- Yoshida,,1969 Davis, ) Shikimate 1951). באיור 11 ניתן לראות כי ביטויים של מספר גנים במסלול הביוסינתזה של חומצות אמינו 33

ארומטיות עלה כתוצאה משימוש בחומצה קווינית כמקור פחמן. זהו חיזוק נוסף, המתאר כי התגובה המתקבלת תואמת את הידוע מהספרות. בבדיקת ההבדלים החלים כתוצאה ממעבר לחומצה קווינית כמקור פחמן יחיד, נקבע הרצף של 3961 גנים בלבד (מתוך 14522 משוערים). מספר זה נמוך יחסית, ויתכן כי הוא נובע ממחסור בחזרות שהיה יכול לשפר את אנליזת ה- assembly למציאת מספר רב יותר של גנים. מתוך אותם גנים להם נקבע רצף, רמתם של 747 עלתה, בעוד שרמת ביטויים של- 1006 ירדה. כלומר, כ- 44% מהגנים להם נקבע הרצף, הראו שינוי מובהק ברמת הביטוי במעבר לחומצה קוונית. התגובה המתקבלת הינה כוללנית מאוד וצפויה להשפיע רבות על הפיסיולוגיה של הקשיונה הגדולה. למרות זאת, ולמרות שחלה הסתת משאבים לצורך תהליכי המטבוליזם, על בסיס המופע הפנוטיפי, ועל כך שלא עלתה רמת ביטוי גנים הקשורים למצבי עקה בבחינת ה-,RNAseq לא נראה כי הפטרייה מצויה בעקה משמעותית. בחינת ההשפעה של עליה או ירידה ברמת ביטוי גן נבחן בשל המעבר למצע המכיל חומצה קווינית, מאפשרת ללמוד רבות על תהליכי התפתחות וההשפעה של ביטוי גנים עליהם. הפיסיולוגיה של הפטרייה עלולה להיות שונה בין מקורות פחמן שונים, אך בשימוש בביקורות נכונות, ניתן להסיק מסקנות חשובות בבחינת ההשפעה של שינויים ברמות ביטוי גנים על התפתחות בקשיונה הגדולה. איור 11: גנים שביטויים עלה באופן מובהק כתוצאה ממעבר לחומצה קווינית כמקור פחמן יחיד, המשתתפים במסלול ה- Shikimate לביוסינתזה של חומצות אמינו ארומטיות. צבועים במסלול הביוסינתזה- אנזימים המשתתפים במעבר מקווינאט ל-,Shikimate בהם חלה עליה ברמת ביטוי הגנים. בתחתית האיור טבלה המציינת את ההומולוגים לאנזימים בקשיונה הגדולה 34

זיהוי החלבונים להם PTP1 מבצע דה- פוספורילציה: לאור ההתקדמות שחלה בטכנולוגיות קביעת רצף גנטי, המידע המצטבר בתחום זה רב. יחד עם זאת, לא חלה התקדמות בשיעור דומה בהבנת האינטראקציות בין תוצרי אותם גנים- החלבונים. חלבונים חיוניים לביצוע תהליכים ביולוגים רבים דרך אינטראקציות עם חלבונים אחרים, דנ"א, רנ"א, ומולקולות אחרות מחוץ ובתוך התא. דרך נפוצה לבחון אינטראקציות בין חלבונים in- vivo היא על ידי שימוש בנוגדנים. סינתזה של נוגדנים ספציפיים לחלבון מטרה מסוים עלולה להיות יקרה ואינה בהכרח מוצלחת. כדי להימנע מצורך זה, ניתן לסמן את החלבון אותו נרצה לחקור בסמן חלבוני לו קיימים נוגדנים מסחריים מוכרים, זולים ומוצלחים (2009 Selker,.(Honda & בעבודה זו נעשו שני ניסיונות לסמן את החלבון PTP1 בסמן.MYC תחילה, נבנה וקטור המכיל את הפרומוטור של הגן ccg-1 מ-.N, crassa שלושה אפיטופים של,MYC זנב של 8 גליצין, ולאחריו את הגן המקודד ל-.ptp1 הפרומוטור P ccg-1 מתבטא ביתר בעת הרעבה (מחסור בגלוקוז). דקות לאחר הוצאת הגלוקוז ממצע הגידול ביטוי הגן גדל באופן משמעותי, ולאחר 90 דקות רמתו גבוהה פי 50 מרמתו לפני ההרעבה (1988 Free,.(McNally & הוספה של לינקר כדוגמת פולי- גליצין בין החלבון לסמן, יכולה לשפר את סיכויי ההצלחה של הסימון על ידי מניעת הפרעות למבנה החלבון ושיפור הנגישות של הנוגדן לאפיטופ בסמן. גליצין היא חומצה אמינית ללא קבוצת צד, ולכן הסמן שנוצר מתפקד כקבוצה חיצונית גמישה במרחב החלבון ) & Honda (Selker, 2009 ככל הידוע לנו, זהו ניסיון ראשון לסמן חלבון בקשיונה הגדולה תוך שימוש בסמן MYC תחת בקרת הפרומוטור ccg-1 P. הגן ptp1 המסומן ב- myc לא התבטא, ויתכן כי בקשיונה הגדולה הבקרה על הפרומוטור שונה מ-.N. crassa ניסיון נוסף נעשה לסמן את החלבון PTP1 בשש חזרות של הסמן,MYC תחת בקרתו של הפרומוטור P cpc-1 2uorf f ב- CPC1.N. crassa מפעיל את המסלול לביוסינתזה של חומצות אמיניות כאשר אלו לא מצויות במצע המזון (1988 al.,.(paluh et בפרומוטור של הגן cpc1 שתי מסגרות קריאה נוספות, כאשר הן מוסרות, ביטוי הגן קבוע וגבוה מאוד (1994.(Orbach, פרומוטור זה נוסה בהצלחה גם בקשיונה הגדולה (2008 al.,.(levy et למרות זאת, הגן ptp1 המסומן בששה שיירי myc תחת בקרתו של הפרומוטור P cpc-1 2uorf שועתק, אך לא התקבל תוצר חלבוני. מספר סיבות יכולות להסביר תוצאה זו: תהליך הסימון עלול לפגוע בקיפול החלבון, לפגוע בתפקוד דומיינים מסוימים, להפריע למיקום החלבון על ידי הסתרת רצף סיגנאל, לעכב עיבוד החלבון או לפגוע במודיפיקציות על גבי החלבון ובעקבות כך להוביל לפירוקו ) & Honda.(Selker, 2009 יתכן כי לא נוצר בווקטור רצף קוזאק מתאים החיוני לקשירת הריבוזום לצורך תרגום מולקולת הרנ"א- שליח לחלבון (1987.(Kozak, שני הסימונים נעשו בקצה ה- 'N של 35

החלבון, מכיוון שהאתר הפעיל של PTP1 קרוב לקצה ה- 'C. במידה והיה ניתן במסגרת הזמן הקיימת עבור מחקר זה, אפשר היה לנסות לסמן את PTP1 בקצה ה- 'C. אפשרות נוספת היא שימוש בסמנים אחרים כדוגמת HA או, flag שהוכחו ב-.N crassa כיעילים יותר. ניתן גם לנסות לסמן את החלבון האנדוגני תחת בקרתו הטבעית על ידי החדרת וקטור מפוצל ) split- (marker להבטחת הרקומבינציה ההומולוגית (2010 Hoff, (Kueck & כפי שנעשה בעבר בקשיונה הגדולה 2011) al.,.(jurick & Rollins, 2007, Li & Rollins, 2010, Williams et פרומוטור של גן אחר מהקשיונה הגדולה המתבטא באופן קבוע כדוגמת אקטין או בטא טובולין, יכול גם לאפשר סימון מוצלח יותר. ניתן לאבחן אינטראקציות בין חלבונים בשיטות אחרות. (Y2H) Yeast two hybrid נוסתה רבות בפטריות חוטיות, והותאמה גם לבחינת סובסטרטים של טירוזין פוספטאזות ) al., Fukada et 2005). לשיטה זו מספר חסרונות: Y2H צורכת זמן רב, ניתן לראות אינטראקציה בין שני חלבונים בלבד, ולא ניתן לאבחן קישור בין חלבונים במידה ואתר הקישור נוצר רק לאחר מודיפיקציה של החלבון לאחר תרגום (2009 Selker,.(Honda & מוטנט הפגוע ב- ptp1 יכול לרמז לנו על סובסטרטים אפשריים להם PTP1 מבצע דה פוספורילציה. בהשקעת כלל החלבונים בתא עם הנוגדן,pTyr יתקבל דפוס כללי של החלבונים העיקריים שעוברים פוספורילציה בטירוזין. השוואה של ההבדלים בין זן הבר לבין מוטנט הפגוע ב- ptp1 יכול לרמז על תפקידו של הפוספטאז בזרחון חלבון מסוים, אותו ניתן לבודד ולקבוע את רצפו. השפעתה של עקה חמצונית על פעילות וביטוי טירוזין פוספטאזות: מטרת מחקר זה הינה לבחון את הקשר שבין רדיקלים חופשיים של חמצן לבין בקרה פוספורלטיבית והתפתחות הקשיון. תוארו ארבע טירוזין פוספטאזות בקשיונה הגדולה. במסגרת מחקר זה נמצאו שלוש טירוזין פוספטאזות נוספות שלא תוארו עד כה,SS1G_13241),SS1G_11340,(SS1G_12669 על סמך קיום המוטיב השמור לטירוזין פוספטאזות ודמיון ברצף החלבון לטירוזין פוספטאזות ידועות. בעבודתו, מצא (2010) Minkov כי רמת ביטוי ארבעת הגנים המקודדים לטירוזין פוספטאזות בקשיונה הגדולה, עולה בקשיון המתפתח לעומת שלב התפטיר והקשיון הבוגר. פעילות כלל הטירוזין פוספטאזות vitro) (in עולה אף היא במהלך התמיינות הקשיון. בנוסף, נמצא כי פעילות הטירוזין פוספטאזות נמצאת בהתאמה לאקלים החמצוני - ריכוזים גדלים של H 2 O 2 גורמים לעיכוב,PTPs בעוד שריכוזים גדלים של האנטיאוקסידנט DPI מעודדים פעילות טירוזין פוספטאזות (2010.(Minkov, בעבודות קודמות בוסס הקשר בין עליה ב- ROS לבין התמיינות 36

הקורים ליצירת קשיונות 2011) al.,.(georgiou et al., 2006, Kim et קיימת לכאורה סתירה בין הממצאים בקשיונה הגדולה, בהם חלה עלייה ב- ROS המלווה בעליה בפעילות וביטוי.PTPs על מנת ליישב סתירה זו, נבדק פרופיל החלבונים שעוברים פוספורילציה בשיירי טירוזין בשלבי התפתחות שונים על גבי.western blot בניגוד לעבודתו של,Minkov התקבלה עלייה כללית בפוספורילציה של טירוזין בקשיון המתפתח, כלומר חלה ירידה בפעילות טירוזין פוספטאזות. הוספת מי חמצן למצע הגידול גרמה לעליה ברמת ביטוי הגנים המקודדים לפוספטאזות באופן כללי, ובפרט ל-.ptp1 יתכן כי קיים מנגנון היזון חוזר, בו עליה ב- ROS מובילה לירידה בפעילות PTPs וכתוצאה מכך, חלה עליה בביטוי הגנים ל-.ptps יתכן כי היפרפוספורילציה של טירוזין בתא, מובילה בין היתר לעליה כללית בביטוי הגנים המקודדים לטירוזין פוספטאזות כפיצוי לירידה בתפקודם. אם כך, צפוי כי כמות ה- PTPs בתא תגדל, אך פעילותם צפויה להיות נמוכה יותר. בעבודתו, הוסיף DTT Minkov לבופר הפקת החלבון לבדיקת פעילות טירוזין פוספטאזות. DTT מחזר את הציסטאין הלא פעיל של טירוזין פוספטאז לאחר חשיפה למי חמצן ומשחזר את פעילותו (2002 al.,.(meng et יתכן כי הוספת DTT לבופר ההפקה גרמה להפעלה מחדש של הטירוזין פוספטאזות הלא פעילות בקשיון המתפתח, ולכן נתקבלה עליה בפעילותם.in vitro על מנת לאשר כי עקה חמצונית מובילה לעליה ברמת ביטוי הגנים המקודדים לטירוזין פוספטאזות, מדדנו את רמתם תחת עקה חמצונית קבועה. ב- Cryptococcus neoformans נראתה עליה בביטוי גנים המקודדים לשתי טירוזין פוספטאזות כתוצאה מעקה חמצונית, אך גם כתוצאה מעקה אוסמוטית. עליה זו הייתה תלויה ב- HOG1 MAPK).(High Osmolarity Glycerol response בדומה לתגובות עקה רבות, גן המעורב בבקרה על עקה החמצונית עולה, אך לאורך זמן מושג מצב יציב וביטויו יורד לרמה נורמאלית (2014 al.,.(lee et בהתאמה, תחת עקה חמצונית קבועה, לא נמדדה השפעה על רמת ביטוי הגנים. לעומת זאת, עליה בביטוי ptps חלה כ- 6 שעות לאחר המעבר למצע המכיל מי חמצן. רמת ביטוי הגן ptp1 עלתה בצורה נכרת בהשוואה לשאר הפוספטאזות. חשוב לציין כי בעבודה זו מוצג הביטוי היחסי של הגן ptp1 לעומת ביטוי β-tubulin בקורים שגדלו על מצע המכיל מי חמצן בהשוואה לביקורת.(ΔΔCt) באופן אבסולוטי, ביטוי הגן ptp1 גבוה פי- 180 14, ו- 130 בהשוואה לביטוי ptp2, ptp3, ptp4 בהתאמה. מבחינת רמת הביטוי, ptp1 הוא הטירוזין פ סו פטאז המשמעותי מבין אלו שנבחנו במחקר זה. פוספטאזות אחרות חיוניות אף הן להתפתחות הקשיון. ביטוי הגן ל- Calcineurin עולה במהלך התפתחות הקשיון, אך ההפרשים בביטוי הגן כמו גם דפוס העלייה שונים. ביטוי הגן המקודד ל- Calcineurin נמוך בתפטיר לא ממויין, עולה בהתפתחות הקשיון, ונמצא ברמתו הגבוהה ביותר בקשיון הבוגר- פי 2.5 בהשוואה לתפטיר (2006 al.,.(harel et לעומתו, ביטוי,rgb1 תת 37

היחידה הרגולטורית של,pp2a עולה לשיא של פי 3.5 בעיקר בשלב הקשיון הבוגר ) et Erental.(al., 2007 העלייה החלה בביטוי הגן ptp1 היא משמעותית הרבה יותר (פי 30), ועיקרה בשלבים המוקדמים יותר של התפתחות הקשיון. עובדה זו מחזקת את ההיפותזה כי ptp1 מעורב בבקרת ההתמיינות לקשיון, ולא רק בבקרת הקשיון המתפתח. בשמר האפייה-,(DSPs סרין/ תריאונין וטירוזין פוספטאזות (ובכללם גם-,Saccharomyces cerevisiae מבקרות בין היתר את פעילותם של ה-.MAPKs במערכת משוב שלילי בשמרים, נמצא כי MAPKs מסוימים, מפעילים פוספטאזות על ידי זרחון או על ידי הפעלה של ביטוי הגנים לאותם פוספטאזות (2005 al.,.(martin et בעבודות קודמות נרמז כי MAPKs יכולים לשמש כחלבוני מטרה לדה פוספורילציה על ידי.(Minkov,,2010 Shamir (2012 PTP1 ביטוי הגן המקודד ל- MAPK,smk1 שאופיין בקשיונה הגדולה, גדל באופן משמעותי בשלב הראשוני של התפתחות הקשיון. בנוסף לביטוי הגן, ריכוז ה- MAPKs הפעילים גדל אף הוא בשלב הראשוני של התפתחות קשיון 2004) al.,.(chen et נדרשת עבודה נוספת על מנת למצוא את החלבונים להם PTP1 מבצע דה פוספורילציה, והבנת המנגנונים המעורבים בבקרה הזרחונית המתבצעת על ידי PTPs ו- SMK1 בקשיונה הגדולה. על מנת לבחון את ההשפעה של היפרפוספורילציה בשיירי טירוזין הנובעת מעיכוב כלל הטירוזין פוספטאזות, נבדקה ההשפעה של pervanadate על גידול הקשיונה הגדולה והתפתחות קשיונות. שימוש במעכב מאפשר לבחון את ההשפעה הישירה של עיכוב,PTPs ללא ההשפעות המשניות הנובעות ממי החמצן. Vanadate הוא אנלוג של פוספאט, המעכב פעילות של טירוזין פוספטאזות באופן תחרותי. Vanadate נקשר לציסטאין הפעיל בדומה לפוספאט, וקישור תחרותי זה פוגם בפעילות החלבון. Vanadate מעכב גם סרין/ תריאונין פוספטאזות, ATPases וריבונוקלאזות, אך עיקר השפעתו נובעת מעיכוב טירוזין פוספטאזות (2004 al.,.(crans et Pervanadate הוא שם כולל לתרכובות כימיות המתקבלות מתגובה של מי חמצן עם.vanadate השפעתו של pervanadate על עיכוב טירוזין פוספטאזות משמעותית יותר, וטיפול ב- pervanadate גורם לעליה כללית בפוספורילציה של טירוזין באופן ניכר בהשוואה ל- Pervanadate.vanadate גורם לעיכוב לא תחרותי ובלתי הפיך על ידי חמצון האתר הפעיל בטירוזין פוספטאזות (1997 al.,.(huyer et כמצופה, pervanadate גרם לעיכוב בגידול הקשיונה הגדולה, ונמצא כגורם המעודד היווצרות קשיונות. 12 שעות לאחר המעבר למצע המכיל,pervanadate נראו איניציאלים בעין בלתי מזוינת. בעבודה זו נבחנו מספר עקות- מי חמצן, סורביטול ו-,NaCl וההשפעה שלהם על גידול הקשיונה הגדולה ועל התמיינות הקשיונות. מי חמצן עודדו היווצרות קשיונות, אך לא באופן מיידי כמו לאחר הוספת.pervanadate הקשיונות נוצרו באופן מסונכרן בקצוות הקורים בעת העברת הפטרייה למצע המכיל 38

.pervanadate ככל הידוע לנו, זהו הדיווח הראשון המתאר יצירה של קשיונות כתוצאה מעיכוב ישיר של.PTPs גם ל- pervanadate השפעות משניות, חלקם נובעות מרכיבי הבסיס מהם נוצרת התרכובת vanadate -pervanadate ומי- חמצן. הריכוז המקסימאלי של מי החמצן בתמיסת pervanadate נמוך פי ארבעה לפחות בהשוואה לריכוז שנבדק בעקה חמצונית, בהנחה שמי החמצן לא הגיבו כלל עם ה-.vanadate ניתן לחזק את הטענה כי עיכוב ה- PTPs הוא שמוביל להתמיינות הקורים ליצירת קשיונות במספר אופנים: ניתן לבחון מעכבים שונים של טירוזין פוספטאזות הפועלים במסלולים שונים. ניתן לבחון השפעה משותפת של pervanadate ומעכבי טירוזין קינאזות. במידה ולמרות עיכוב הפוספורילציה של טירוזין תחול ההתמיינות מסונכרנת ליצירת קשיונות, אזי התמיינות זו נובעת מהשפעה משנית של pervanadate ואינה מונעת על ידי היפרפוספורילציה של טירוזין. נבחנה גם הבקרה על העלייה המתקבלת בביטוי הגן ptp1 כתוצאה מטיפול במי חמצן. כדי לבחון האם עליה זו נובעת מההיפרפוספורילציה בשיירי טירוזין הנגרמת כתוצאה מהטיפול במי חמצן, נבדקה ההשפעה של pervanadate על ביטוי הגנים. עיכוב PTPs על ידי,pervanadate לא הוביל לעליה בביטוי הגנים המקודדים ל-.ptps ל- ROS השפעות רבות נוספות, ויתכן כי עקה חמצונית גורמת לעליה בביטוי ptps במנגנון שאינו תלוי בפוספורילציה של טירוזין. אפשרות נוספת הינה כי שימוש ב- pervanadate גורם לעיכוב PTPs בדינמיקה אחרת בהשוואה ל-,ROS ולכן בזמנים שנבדקו מושג מצב יציב וביטוי ptps חוזר לרמתו הקבועה. בהשוואה לניסוי בו נבדקה ההשפעה של עקות שונות על ביטוי,ptps העלייה שהתקבלה בבחינת ההשפעה של pervanadate הייתה צנועה משמעותית. ביטוי ptp1 עלה רק פי 2 בטיפול הביקורת 4mM) H). 2 O 2 הבדלים אלו יכולים לנבוע מכך שהתבדיד בו נעשה שימוש במעבדה עובר תהליכי חידוש באופן שגרתי. הקשיונה הגדולה גדלה מספר דורות על גבי מצע אגר סינטטי, ואחת לחודש ומחצה, נעשה חידוש של הפטריה מקשיונות שנאספו על גבי צמח מאולח. גם בזן מעבדתי זה, יתכנו הבדלים בין טיפוסי תבדידים, על אף מקורם המשותף. כדי לדייק בתוצאות, יש לבצע חזרות רבות ככל הניתן לאורך תקופות שונות. שני אנזימים השייכים למשפחת ה- NADPH oxidase זוהו ונחקרו בקשיונה הגדולה. Ssnox2 מתבטא בכל שלבי הגידול, בעוד ש- Ssnox1 מתבטא ביתר במהלך התפתחות קשיונות ובזמן הדבקת צמח (2011 al.,.(kim et לא מצאנו השפעה של העקות השונות שנבדקו בעבודה זו על ביטוי.Ssnox1, Ssnox2 לעומת זאת, ביטוי קטלאזות מגיב לתנאי הסביבה המשתנים. שרשרת מעבר הסיגנאל החמצוני מובילה להתפתחות ומבקרת את רמת הסיגנאל, בין היתר על ידי בקרה על ביטוי ופעולת קטלאזות. בקשיונה הגדולה זוהו שבעה גנים המקודדים לקטלאזות. אנו בחנו ביטוי של שניים 39

מתוך אותם הגנים: (SS1G_02784),Scat1 מתבטא בעיקר בצמח, אך גם בעת היווצרות קשיונות. קטלאז זה נמצא כמגיב לעקות סביבתיות שונות- ובכללם עקה חמצונית ועקה אוסמוטית. ) (SS1G_00547 Scat2 הוא קטלאז המצוי בפרוקסיזום, וביטויו קבוע בקורים, בקשיון המתפתח ובצמח (2014 al.,.(yarden et אנו מצאנו כי Scat2 מגיב ביתר לעקה חמצונית. ביטוי הגן המקודד ל- Scat2 עולה למעלה מפי 20 לעומת Scat1 שביטויו עולה פי שלושה. בדומה למדווח בספרות (2014 al.,,(yarden et עקה אוסמוטית מעלה אף היא את פעילות הקטלאזות. באופן מפתיע, התקבלה עליה משמעותית בביטוי Scat2 כתוצאה מטיפול ב-.pervanadate בשילוב של מי חמצן ו-,pervanadate ביטוי scat2 עלה באופן ניכר. יתכן כי הבקרה השלילית על ריכוז ה-,ROS מופעלת בין היתר על ידי השתקת ה- PTPs ויצירת היפרפוספורילציה שיירי טירוזין, אף ללא העקה החמצונית. כפי שכבר צוין, למי חמצן השפעות רבות. סביר להניח כי הבקרה על רמת ביטוי הקטלאזות במסלול ההיפרפוספורילציה של טירוזין, הוא רק אחד מיני רבים. התגובה המתקבלת ממי חמצן מהירה יותר, ויתכן כי היא מערבת מנגנוני בקרה נוספים. מעניין לציין כי טיפול קודם ב,pervanadate ולאחריו מעבר למצע המכיל מי חמצן, הפחית משמעותית בעלייה הנצפית ברמת ביטוי הגן ל- Scat2 תחת עקה חמצונית. אנו משערים כי pervanadate הובילו לעליה ברמת ביטוי הגנים המקודדים לקטלאזות בטרם הקורים הועברו למצע המכיל מי חמצן, וכי עליה זו מנעה את העלייה המתקבלת מעיכוב ה- PTPs בעקה החמצונית. יש לבחון תיאוריה זו גם בבדיקה של חשיפה מוקדמת למי חמצן, ולאחריה חשיפה שנייה למי חמצן, או חשיפה מוקדמת למי חמצן ולאחריה חשיפה ל-.pervanadate מעבר סיגנאל בתא אינה פעולה לינארית לרוב, בה סיגנאל מוביל בהכרח לתגובה תאית קבועה. שרשרת העברת האותות היא פעולה מורכבת ודינאמית, בה משתתפים מספר רב של רכיבים תאים המגיבים באופן תנודתי, וישנה חשיבות למשך ועצמת הסיגנאל. נוצרים הבדלים בקצבי העברת הסיגנאל בשלביו השונים, דבר היוצר גראדיאנט מרחבי, ומוביל לתגובה תאית מורכבת ומבוקרת היטב (2006.(Kholodenko, רב הנסתר על הגלוי במנגנון מורכב כמו התמיינות הקורים ליצירת קשיונות. על פי התוצאות שהתקבלו לא ניתן לדעת מהם חלבוני המטרה להם PTP1 מבצע דה- פוספורילציה. אלו יכולים להיות חלבונים מכל סוג שהוא, כגון: פקטורי שעתוק, טרנספורטים ואף פוספטאזות או קינאזות נוספות (כדוגמת ה-.(MAPK על פי התוצאות לא ניתן גם לקבוע האם חלבוני המטרה מעוכבים או מופעלים כתוצאה מהזרחון. באופן כללי ניתן להסיק כי פוספורילציה של טירוזין בקשיונה הגדולה מקדמת התמיינות קשיונות, בעוד שדה פוספורילציה מעודדת גידול תפטירי. פעילות PTPs מעוכבת על ידי רדיקלים חופשיים של חמצן, המעודדים שעתוק של הגנים המקודדים ל-.ptps עקה חמצונית מעלה את רמת השעתוק של 40

הגן המקודד ל-,Scat2 המשמש לנטרול הרדיקלים החופשיים. רמת ביטוי הגן Scat2 גדלה גם בעקבות עיכוב טירוזין פוספטאזות, ללא תוספת חיצונית של עקה חמצונית (איור 12). לא ניתן לקבוע האם הבקרה הזרחונית על שעתוק הגן ל- Scat2 לא מערבת.ROS יתכן ועיכוב PTPs מוביל ליצירה של רדיקלים חופשיים בתא. תוספת של אנטיאוקסידנטים למצע, או צביעה של רדיקלים חופשיים בקורים לאחר עיכוב ה- PTPs יחזקו את הטענה כי הבקרה הזרחונית על ביטוי Scat2 אינה מערבת.ROS ניתן גם לבחון את ביטוי Scat2 במוטנטים בגנים המקודדים ל-,nox אחד מהמקורות העיקרים ליצירת ROS באופן מכוון בתא. איור 12: שרשרת העברת הסיגנאל החמצוני ליצירת הקשיון ומעורבות הזירחון הפיך. חלבוני מטרה תאיים (R), עוברים זרחון (p) על ידי טירוזין קינאזות.(PTKs) הפוספאט מוסר על ידי טירוזין פוספטאזות.(PTPs) הזרחון באופן כללי מוביל להתפתחות קשיונות, והסרת הזרחן על ידי עיכוב,PTPs מוביל לגדילת הקורים. ROS מעכבים את פעילות,PTPs אך מעודדים את ביטוי הגנים המקודדים להם. ROS גם מקדמים שעתוק של קטלאזות,(cat) המנטרל את הרדיקלים החופשיים. ביטוי הקטלאז מוגבר גם על ידי פוספורילציה של טירוזין. הפרץ החמצוני ומעורבותו בהתבססות הקשיונה הגדולה: הפרץ החמצוני מהווה תגובה אוניברסאלית של צמחים המאופיינת בהפרשה מסיבית של רדיקלים חופשיים על ידי הצמח כתגובה מקומית ראשונית לפגיעה חיצונית. הפגיעה יכולה לנבוע מגורמ םי ביוטיים כגון וירוסים, חיידקים ופטריות או גורמים א- ביוטיים כדוגמת לחץ מכני או פציעה. בנוסף לפרץ החמצוני, מתרחשות תגובות נוספות הכוללות בין היתר שינויים ברמת החומציות בסביבת הצמח, בפוטנציאל הממברנה, בשטפי יונים מחוץ ואל תוך התא. נוצרים קשרים קוולנטים בין חלבונים ממברנאלים וחלה פוספורילציה כללית של חלבונים בתא הצמח. 41