ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ
ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR Επανάσταση βιοιατρική έρευνα, διαγνωστική Dr Mullis et al. 1983 ΗΠΑ 1983-92 5000 επιστημονικά άρθρα 1993 Νοbel χημείας Japan Prize Mark Hughes Υπεύθυνος National Center for Human Genome Project - ΝΙΗ PCR η πλέον ενδιαφέρουσα επιστημονική τεχνολογία των τελευταίων 100 ετών
PCR molecular photocopying Χημική ενζυμική αντίδραση Ποσοτική αύξηση Ειδικού τμήματος DNA in vitro! 3-4 ώρες >1x10 6 copies DNA Taq DNA polymerase.
Πλεονεκτήματα PCR 3S Specificity Sensitivity Speed Ειδική ανίχνευση παθογόνου σε υλικό με χλωρίδα Ευαίσθητη 1pg DNA η 10-100 μικροοργανισμοί /κλινικό υλικό Ταχεία 3-4 ώρες Ποικιλία δειγμάτων Ορός - aliquots, ΕΝΥ, Ούρα, Κύτταρα βιοψίας, επιθηλιακά Ολικό αίμα όχι ηπαρινισμένο/αιμολυμένο Πτύελα, εκκρίσεις αναπνευστικού Κόπρανα παράγοντες που αδρανοποιούν την PCR
Μειονεκτήματα PCR Επιμόλυνση από (+) δείγματα ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ FP Εκχύλιση DNA/RNA - extraction Ανιχνεύει DNA & μη ζώντων μικροοργανισμών παροδικό αποικισμό Εξειδικευμένο προσωπικό, χώροι, απόλυτη καθαριότητα
ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ Η PCR? ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ANAΓΝΩΡΙΣΗ ΑΤΟΜΩΝ γονιδιακή ταυτότητα, απόδειξη πατρότητας ΒΙΟΛΟΓΙΑ DNA, γενετική ταξινόμηση ειδών ΖΩΟΛΟΓΙΑ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΑΡΧΑΙΟΛΟΓΙΑ ΠΑΛΑΙΟΝΤΟΛΟΓΙΑ
ΧΡΗΣΕΙΣ PCR ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ & ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ - ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ - ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΕΙΣ ΠΡΟΓΕΝNHΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΩΝ ΝΟΣΩΝ ινοκυστική νόσος. ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ - ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ β-thalassemia, σύνδρομο Duchenne s, Tay-Sachs...
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ?
Όπου εμφανίζουν αδυναμία οι συμβατικές μέθοδοι ΑΜΕΣΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ / ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ δεν καλλιεργούνται εύκολα βραδεία ανάπτυξη ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΓΡΑ συγκέντρωση μικροοργανισμού συγκέντρωση ειδικών αντισωμάτων ΕΙΔΙΚΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ λήψη αντιβιοτικών τίτλους ειδικών αντισωμάτων
ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ IOI HCV, ΗBV, ΗΙV, CMV, HPV / FDA HSV, VZV, EBV, εντεροϊοί ΒΑΚΤΗΡΙΑ Μycobacterium, Chlamydia, N. gonorrhoeae / FDA Borellia, Treponema, Ricketsia, Ν. meningitidis MYKHTEΣ Pneumocystis, Cryptococcus, Aspergillus ΠΑΡΑΣΙΤΑ Plasmodium, Leishmania, Toxoplasmα / in house ποικίλη Ε, Ε FDA Food and Drug Administration approved
ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ Ιογενείς λοιμώξεις HBV, HCV, CMV, HPV Βακτηριακές λοιμώξεις Mycobacterium tuberculosis Chlamydia trachomatis Βακτηριακό 16SrRNA
ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ -Abs έμμεσοι δείκτες Ανοσοκατασταλμένοι -Ags άμεσοι δείκτες Δεν πολλαπλασιάζονται in vitro
ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΟΞΕΙΑΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΟΣ Β ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ > 20ετία ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ Μ. HBsAg anti HBs anti HBc anti HBc IgM HBeAg anti HBe ELISA
ΟΞΕΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Η ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗ ΧΡΟΝΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΩΝ ΟΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΚΑΘΟΡΙΖΕΙ ΤΗ ΦΑΣΗ ΟΞΕΙΑΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ
EΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΧΡΟΝΙΑΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΟΣ Β ΕΛΕΓΧΟΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΥΜΒΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΗΒV DNA ορού ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΗΒVDNA Ποσοτικές Μοριακές μέθοδοι - Απλός υβριδισμός - ραδιενεργό σήμανση 1991-1995 - Απλός υβριδισμός - χημειοφωταύγεια 1996-2003 Πολλαπλασιαστικές - bdna μέθοδος ενίσχυση σήματος 2000 -. -PCR μέθοδος ενίσχυση στόχου 2000 -.
Υβριδισμός b-dna χημειοφωταύγεια 360 IU /ml PCR - EIA / Εbiotin-avidinA χρωματομετρική 60 IU/ml εκκινητές/primers core gene WHO 2003 IU /ml
b-dna ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ -ΧΜΦ ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΑΚΛΑΔΙΖΟΜΕΝΟΥ DNA ενίσχυση σήματος Amplifier* with hybridized Label Probes* Preamplifier* ΗΒV DNA Label Extender* (LE) Capture Extender (CE) Capture Probe Microwell * components containing ΑP YΠΌΣΤΡΩΜΑ ΦΩΣ
PCR EIA HBV DNA HBV HBV DNA εκχύλιση από ορό extraction PCR Εκκινητές & DNApol Core gene Αντίγραφα(DNA) ενίσχυση στόχου amplification προσδιορισμός detection Ανιχνευτής Ε Χρώμα
ΣΕ ΠΟΙΕΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΕΙΝΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΣ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΗΒV DNA - ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ? ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β AΤΥΠΑ XΡΟΝΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΦΙΛ ΕΝΑΡΞΗ, ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ
ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β ΗΒeΑg(-) HBsAg(+) anti HBc(+) anti HBe(+) Προπυρηνικά μεταλλαγμένα στελέχη HBV HBVDNA 2000 IU/mL ενεργός πολλαπλασιασμός HBVDNA < 2000 IU/mL ανενεργός φορεία
AΤΥΠΑ XΡΟΝΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΦΙΛ πχ anti HBc(+) HBsAg HBV DNA (+) 2000 IU/mL antihbs HBV DNA (-) φορεία - ενεργός πολλαπλασιασμός < 2000 IU/mL ανενεργός φορεία
ΕΝΑΡΞΗ - ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ Αν ΗΒV DNA < 2000 IU/mL ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟI Aναστολή ενεργού πολλαπλασιασμού ΗΒV Aναστολή φλεγμονής ήπατος Επιτυχής θεραπεία μείωση πιθανότητος ανάπτυξης κίρρωσης, ΗΚΚ
Αν ΗΒV DNA > 2000 IU/mL Παράταση θεραπείας, τροποποίηση δόσης Υποτροπή λοίμωξης μετάλλαξη HBV, αντοχή επανάληψη με νέο αντιϊικό παράγοντα
Hepatitis C Virus HCV Μονόκλωνο RNA anti HCV - 1990 Χαμηλή ιαιμία Γενετική ετερογένεια
1(I) 1c(0) 1(II) 1a 3c 1b 3e 3d 1c(E) 3(III) 3(VI) 3a TD3 10a 3f 3b h 9a i 9b j 9c k 8b 8a l m NGI n g 11a e 7a c 7d 7b d f b a a d e f 6a 4e 4g 4h 4f 4d 5a 6b 7c/NGII/VII 4a(E) 4a(B) 4c c b 2(I) 1 2 5 4 3 6 * 6 γονοτύπους 1-6
1990 σήμερα, αναπτύσσονται και τελειοποιούνται οι μέθοδοι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΗC ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΕΙ EIA συμβατική μέθοδος ανίχνευση anti HCV Μοριακές μέθοδοι ανίχνευση HCV RNA μέτρηση HCV RNA τυποποίηση HCV
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ HCV RNA RT PCR Aνάστροφη μεταγραφή PCR, ενίσχυση στόχου εκκινητές 5 NCR, βιοτίνη αβιδίνη χρώμα ΤΜΑ Trancription mediated amplification Πολλαπλασιασμός δια μεταγραφής RT,T7RNApol, εκκινητές Τ7promotor, ισοθερμική αντίδραση, χημειοφωταύγεια ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HCV RNA b-dna branched DNA, Μ. διακλαδιζόμενου DNA Υβριδισμός, ειδικό ανιχνευτή 5 NCR χημειοφωταύγεια ενίσχυση σήματος
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HCV RNA HCV HCV RNA TMA PCR bdna Εκκινητές & RT,RNApol Εκκινητές & RT,DNApol Ανιχνευτής με Αντίγραφα (RNA) Αντίγραφα (DNA) Διακλαδιζόμενο DNA Ανιχνευτής Ε Α Χημειοφωταύγεια Ανιχνευτής Ε Χρώμα Ανιχνευτής Α Φ Χημειοφωταύγεια
HCV RNA ποιοτικές μέθοδοι RT PCR TMA 50 IU/ml 5 IU/ml ποσοτικές μέθοδοι bdna 615 IU/ml WHO 2000 IU/ml
ΓΟΝΟΤΥΠΙΑ HCV Το HCV προϊόν PCR ή TMA, τμήμα 5 NCR Υβριδίζεται με ειδικούς DNA ανιχνευτές 5 NCR σε ταινία νιτροκυτταρίνης Ο συνδυασμός των ανιχνευτών που υβριδίζονται καθορίζει το γονότυπο του HCV
HCV ΓΟΝΟΤΥΠΟΣ Ανάστροφος υβριδισμός σε ταινία νιτροκυτταρίνης Ειδικός DNA ανιχνευτής 5 NCR
anti HCV συμβατική μ. HCV RNA μοριακή μ. ALT
ΕΝΑΡΞΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΧΡΟΝΙΑΣ HC ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΘΟΔΟ HCV RNA Επιτυχής πορεία 1/10 ιϊκό φορτίο ή RT PCR, TMA (-) α τρίμηνο Ίαση RT PCR, TMA (-) μετά τη θεραπεία και για > 6 μήνες ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ 24 η 48 εβδ ΜΟΡΙΑΚΗ Μ. Γονότυπος -LiPA
Έλεγχος HCV λοίμωξης σε ασυμπτωματικά άτομα συμβατική μέθοδος - Screening test anti-hcv EIA anti HCV (+) HCV RNA (+/-) anti HCV (-) STOP
Πότε σε άτομο anti HCV(-) συστήνεται έλεγχος HCV RNA? ΑΔΥΝΑΜΙΑ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ! Yποψία οξείας HC ALT - άτομο ομάδος υψηλού κινδύνου Ανοσοκατασταλμένος HIV+, νεφροπαθής, μεταμοσχευμένος Ασθενής με μεικτού τύπου κρυοσφαιριναιμία Προσωπικό νοσοκομείου τρύπημα με HCV μολυσμένη βελόνα
Πότε μπορεί να βρίσκουμε Anti HCV (+) HCVRNA (-)? παλαιά αυτοιαθείσα ΗC ιαθείσα HC μετά από θεραπεία νεογνό μητέρας με HC
CMV Real time PCR ΠΟΣΟΤΙΚΗ Μ. CMV PMNs κύρια πηγή CMV στην οξεία λοίμωξη ολικό αίμα ΕDTA η citrate, όχι ηπαρίνη ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ anti CMV IgG / IgM CMV Ag pp65 συμβατικές μέθοδοι καθυστερούν EIA ανοσοκατασταλμένοι, μεταμοσχευμένοι RLΤΜ -PCR ευαισθησία, 500 cop/ ml ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ CMVΑg IF Real time PCR-F CMV DNA(+) πρωιμότερα στην CMV λοίμωξη από CMVΑg ΕΓΚΑΙΡΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ παραμένει θετικό 1/10 ιϊκού φορτίου επιτυχής θεραπεία
HPV HPV PCR (13) Yψηλού κινδύνου γονότυπoι HR-HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 Ογκογόνος ιός CA τράχηλου της μήτρας 12 HPV primers από 13 ΗR HPV L1 polymorphic region - 165 bp Τραχηλικό επίχρισμα screening Test ευαισθησία 240 cop/ml εκχύλιση extraction ενίσχυση προσδιορισμός amplification detection Ευαισθησία PCR 95% κυτταρολογικής/pap 55% Ειδικότητα PCR 94% /PAP 97%
Έλεγχος επίμονων λοιμώξεων με High Risk HPV Αδιευκρίνιστα αποτελέσματα PAP Test PCR Κυτταρολογική εξέταση PAP Test / PCR HPV διάγνωση παρακολούθηση HPV λοίμωξης PCR (37) γονοτυπία LiPA HR / LR γονότυποι συνλοιμώξεις
BAKTHΡΙΑΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Μycobacterium tuberculosis Mycobacterium spp.
ΣΥΜΒΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΜΕΣΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ Ziehl Neelsen, Kinyoun, φθορίζουσα auramine O ειδικότητα 99 % ευαισθησία 25 75 % > 5000 βακτήρια / ml δείγματος (+) αποτέλεσμα
ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Loewenstein-Jensen, Middlebrook 7H10, 7H11, Broth 7H9 Χρόνος επώασης 7-8 εβδ. Ταυτοποίηση γένος / είδος 2-4 εβδ. Αυτόματο σύστημα 9000ΜΒ (Broth 7H9) Ημιαυτόματο σύστημα μέτρηση χημειοφωταύγειας Myco/F-sputa Myco/F-lytic
PCR Δείγματα αναπνευστικού και ούρα μετά από ρευστοποίηση Άλλα υγρά μετά από φυγοκέντρηση Πολλαπλασιασμός τμήματος 584 βάσεων στο 16SrDNA Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα
Αξιολόγηση αποτελέσματος PCR Αποτέλεσμα μετά από 6-8 ώρες ταχέως! Θετικά αποτελέσματα με ευαισθησία! > 40 κύτταρα / PCR ή > 1600 cfu/ml Θετικά αποτελέσματα και με νεκρά βακτήρια? Δεν έχει εφαρμογή στη παρακολούθηση της θεραπείας?
Αναστολή της PCR Μη καλή ρευστοποίηση Αναστολείς του ενζύμου (αιμοσφαιρίνη) Συγκολλήσεις βακτηρίων Βλέννη (πτύελα) Υψηλότερη ευαισθησία PCR ΜΤΒ πτύελα
Ταυτοποίηση ειδών Mycobacterium με PCR και υβριδισμό LiPA MTB
Ταυτοποίηση M. tuberculosis με PCR και υβριδισμό
Chlamydia trachomatis PCR Δείγματα : α ρεύμα ούρησης/ ουρηθρικό τραχηλικό επίχρισμα Μ4ΡΤ culture transport medium Aνίχνευση Αg συμβατική μέθοδος ΕΙΑ Πολλαπλασιασμός τμήματος 207 b, cryptic plasmid, primers CP102, CP103 μοριακή μέθοδος Ευαισθησία PCR
Ευρέως φάσματος PCR 16 SrRNA Ανίχνευση κοινού βακτηριακού 16SrDNA σε κλινικά υλικά Εκκινητές κοινές περιοχές του DNA όλων των βακτηρίων Σε 4 h ανιχνεύεται η παρουσία βακτηριακού DNA η όχι! Ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σύγκριση με γνωστές αλληλουχίες, ταυτοποίηση 48 h GenBank - Blast - National Center for Biotechnology Information
Χρήσιμη σε στείρα υλικά αίμα, ΕΝΥ, αρθρικό, οφθαλμικό Ταχεία! Απαιτητικά βακτήρια! Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών! Ανιχνεύει και DNA μη ζώντων βακτηρίων??? Χαμηλή ευαισθησία, 500-1000 βακτήρια/ ml??? Επιμόλυνση κλινικών υλικών υλικά με χλωρίδα???
Νέα αύρα πνέει στα διαγνωστικά εργαστήρια Μοριακές Τεχνικές Χρησιμοποιώντας τις με περίσκεψη, σε κάθε ειδική περίπτωση Συνδυάζοντας τις πάντα με τις Συμβατικές Μεθόδους κλινική εικόνα, ιστορικό, ιδιαιτερότητες ασθενούς, βιολογικού υλικού,μικροοργανισμού Έχουμε μια νέα σημαντική βοήθεια στη διάγνωση & θεραπεία των λοιμώξεων
ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ Μ.Χριστοφίδου,Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας,Ιατρικό Τμήμα Πανεπιστημίου Πατρών