K31. Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης

Transcript

1 K31. Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης Η γονιδιακή έκφραση μπορεί να ελέγχεται σε πολλά (6) επίπεδα Μεταγραφή και ιστοειδική έκφραση 1 μικροσυστοιχίες

2 Μεταγραφή και ιστοειδική έκφραση 1.α) Διαφοροποιημένα κύτταρα περιέχουν το ίδιο γονιδίωμα (DNA ), αλλά διαφέρουν στην έκφραση mrna και πρωτεΐνών (ιστο-ειδική έκφραση) β) Aνάλυση μικροσυστοιχειών αποκαλύπτει το συνολικό προφιλ έκφρασης κάθε Κυτταρικού τύπου 2 το προφίλ μπορεί να αντιστραφεί

3 2. Το προφίλ έκφρασης ενός διαφοροποιημένου πυρήνα μπορεί να ανα-προγραμματισθεί από το περιβάλλον (κυτταροπλασματικό ή/και εξωκυττάριο) 3 το προφίλ μπορεί να μεταβάλλεται

4 3. Λειτουργικά όμοια κύτταρα ενός πολυκύτταρου οργανισμού μπορεί να αλλάζουν πρότυπο έκφρασης σε διάφορετικές συνθήκες, και ανάλογα, μονοκύτταροι οργανισμοί αλλάζουν πρότυπο έκφρασης αποκρινόμενοι σε αλλαγές του περιβάλλοντος Η έκφραση των πρωτεϊνών που καταβολίζουν λακτόζη στην E.coli επάγονται όταν στο περιβάλλον υπάρχει λακτόζη (και λείπει γλυκόζη). Θα συναντήσετε πολλές εκατοντάδες τέτοια παραδείγματα ρύθμισης Άμεση και μακροσκοπική ανίχνευση της β-γαλακτοσιδάσης στο εργαστήριο Οπερόνιο 4

5 Α. Tο οπερόνιο λακτόζης Ένας καταστολέας (lac repressor) και ένας ενεργοποιητής (CAP activator) καθορίζουν τη συχνότητα μεταγραφικής έναρξης RNA pol. Cap RNA starts i p o z y a CAP Lac Repressor galactosidase permease Οπερόνιο RNA transacetylase p: promoter (θέση δέσμευσης Pol) o: lac operator (θέση θ δέσμευσης lac repressor) θέση δέσμευσης Cap lac I: γονίδιο Lac Repressor (καταστολέας) Cap: γονίδιο Catabolite Activator Protein (Ενεργοποιητής καταβολικών οδών) + lactose, -glucose -> ON - lactose -> ΟFF Τι εξυπηρετεί το οπερόνιο?? Θυμηθείτε πώς μεταφράζεται ένα πολυκιστρονικό mrna!! 5 Στερεοχημική παρεμπόδιση?

6 Aπουσία λακτόζης o καταστολέας lac (lac i) δεσμεύεται στο χειριστή (lac o) και παρεμποδίζει τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης RNA pol. Στερεοχημική παρεμπόδιση δέσμευσης της Pol, ή της λειτουργίας της??? OFF - lactose i p o z y a Εξιδικευμένη πρόσδεση στο DNA απουσία λακτόζης Lac Repressor Παρουσία λακτόζης???? 6 DNA-aa interaction

7 Θυμηθείτε!! Η εξειδίκευση της δέσμευσης πρωτεϊνών στο DNA συνίσταται στην αναγνώριση - και ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου- μεταξύ συγκεκριμένων βάσεων και αμινοξέων Η έλικα-στροφή-έλικα είναι ένα κοινό,, αλλά όχι το μοναδικό, μοτίβο ειδικής αναγνώρισης DNA. 7 Διμερής μορφή

8 Η ομο-διμερής μορφή μπορεί να αναγνωρίζει παλίνδρομες αλληλουχίες DNA Παλίνδρομη αλληλουχία DNA Oμο-διμερής πρωτεΐνη που αναγνωρίζει DNA 8 Lac repressor- lac operator

9 Δέσμευση του lac καταστολέα (lac i) στον lac χειριστή (lac o) Η μεγάλη C-περιοχή διμερίζει την πρωτεΐνη και η μικρή Ν-περιοχή αναγνωρίζει και δεσμεύεται στο DNA απουσία λακτόζης 5 TGTGTCGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA 3 3 ACACAGCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT 5 Χ Χ Ο καταστολέας lac λειτουργεί ως μοριακός διακόπτης!! Η σταθερά διάστασης (Κd) του συμπλόκου καταστολέα-dna είναι ~10-13 Μ DNA-Pr DNA + Pr Kd = [DNA] [Pr] / [DNA-Pr] 9 Σύμπλοκο καταστ. -λακτόζης

10 Ο προσδέτης (λακτόζη/αλλολακτόζη) αποδεσμεύει τον καταστολέα από το DNA και επιτρέπει τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης RNA pol. Στερεοχημική παρεμπόδιση? OFF - lactose i p o z y a Lac Repressor ON + lactose i p o z y a RNA Lac Repressor Σύμπλοκο καταστολλέα - λακτόζης 10 camp

11 Κυκλικά νουκλεοτίδια συντίθενται από τριφωσφορικούς νουκλεοζίτες και λειτουργούν ως αγγελιοφόρα μόρια ATP Αδένυλ-κυκλάση φωσφοδιεστεράση ΑΜΡ PPj + camp 11 Cap

12 H δέσμευση της RNA pol. διεγείρεται από αλληλεπιδράσεις με την Cap (catabolite activator protein, ενεργοποιητής καταβολικών γονιδίων) ) Cap RNA pol. +Gl Glucose p o z y a low camp CAP Cap Συνεργατική σχέση Cap και RNA pol - Glucose high camp CAP p o z y a RNA 12 Cap structure

13 Η πρωτεΐνη CAP 1 ο ) δεσμέυει camp, 2 ο )δεσμεύεται μ στο DNA, 3 ο ) αλληλεπιδρά με την RNA πολυμεράση Σε ποιες περιοχές της πρωτεΐνης θα προκαλούσατε ούσα σημειακές μεταλλάξεις με στόχο τις επιμέρους Λειτουργίες της πρωτεΐνης Cap?? 13 Συνολική εικόνα

14 Συνολική εικόνα ρύθμισης του οπερονίου λακτόζης + γλυκόζη cap p o z y a + λακτόζη OFF + γλυκόζη cap p o z y a - λακτόζη OFF - γλυκόζη cap p o z y a - λακτόζη OFF - γλυκόζη cap p o z y a + λακτόζη ON H CAP ενεργοποιεί πολλά οπερόνια καταβολισμού δευτερευόντων σακχάρων π.χ. αραβινόζη (regulon) W operon 14

15 Β. To οπερόνιο της Τρυπτοφάνης ένζυμα βιοσύνθεσης Τρυπτοφάνης Τα ένζυμα βιοσύνθεσης τρυπτοφάνης καταστέλλονται παρουσία τρυπτοφάνης, ενώ τα ένζυμα αποικοδόμησης λακτόζης καταστέλλονται απουσία λακτόζης 15 W καταστολλέας

16 Ρύθμιση του οπερονίου τρυπτοφάνης Ο προσδέτης (τρυπτοφάνη) ρ φ προκαλεί δέσμευση του καταστολλέα στο DNA - τρυπτοφάνη + τρυπτοφάνη 16 ευκαρυώτες

17 H ευκαρυωτική μεταγραφική ρύθμιση είναι πιο πολύπλοκη λ διεργασία 1. Aριθμός γονιδίων ~ E. coli ~ yeast ~ human 2. Aνάπτυξηδιαφοροποίηση Κύτταρο-ειδικότητα Ομοιόσταση Πληθώρα συνδυασμών ρυθμιστικών μεταγραφικών παραγόντων 3. Χρωματίνη Λειτουργία ρυθμιστικών συμπλόκων ομοιοπολικής τροποποίησης ιστονών και νουκλεοσωμικής ανάπλασης/αναδιάταξης 17 EMSA footprint chip

18 Ανίχνευση ειδικών αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών-dna στο εργαστήριο 1. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 2. DNase footprinting 18

19 3. Chromatin Immunoprecipitation (Chip), Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης: H μέθοδος που ανιχνεύει In vivo και σε αληθινό χρόνο πρωτεΐνες που δεσμεύονται στο DNA, νουκλεοσωμικές διαμορφώσεις, ομοιοπολικές τροποποιήσεις ιστονών.. Μονιμοποίηση Α Β (cross link) γονίδιο 1 γονίδιο 2 Λύση κυττάρων Τεμαχισμός (μηχανικά ά ή ενζυμικά μέσα) ) Α Β Ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη Α Α Απομάκρυνση των συμπλόκων Β-DNA και του ελεύθερου DNA Β Πρωτεόλυση PCR με εκκινητές ειδικούς για τον υποκινητή του γονιδίου 1( (+) ή του γονιδίου 2() (-)!! Απομάκρυνση πρωτεϊνών 19 Μοντέλα συστήματα

20 Μοντέλα-συστήματα ρύθμισης π.χ. τα γονίδια GAL που μετατρέπουν γαλακτόζη σε γλυκόζη στη ζύμη συνέβαλαν στην ανάλυση ενισχυτών και προαγωγέων, ειδικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών και γενικών μεταγραφικών παραγόντων/rna pol II ΤΒΡ Gal4: Συνίσταται από περιοχή (domain) δέσμευσης στο DNA και περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης Εφαρμόστε την μέθοδο Chip για να ελέγξετε την δέσμευση των Gal4 και ΤΒΡ στο DNA!! Ενισχυτές 20 Συνδυαστικό μοντέλο

21 Συνδυαστικός έλεγχος: Oι ενισχυτές διεγείρουν εξειδικευμένα τη μεταγραφή γιατί αναγνωρίζονται από συγκεκριμένους συνδυασμούς ενεργοποιητών και συν-ενεργοποιητών Kυτταρικός τύπος Α TATAA 1 Kυτταρικός τύπος Β Kυτταρικός τύπος Γ TATAA 2 Χρωματίνη RNA Pol II TATAA 100 Αθροιστικό vs συνεργατικό (πολλαπλασιαστικό) αποτέλεσμα: = 100!!! Μια από τις λειτουργίες των συν-ενεργοποιητών, πέρα από αλληλεπιδράσεις με την RNA πολυμεράση, μπορεί να είναι η τροποποίηση των αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών και η αναδιάταξη της χρωματινικής δομής 21 Histones Νουκλεόσωμα

22 Ιστόνες (histones) και νουκλεοσωμική συγκρότηση Οι αμινοτελικές ουρές ιστονών προβάλλουν από τον νουκλεοσωμικό πυρήνα Βρείτε την ομολογία (% identity, % similarity) μεταξύ της Η3 του σακχαρομύκητα και της Η3 του ανθρώπου. 22 Ακετυλίωση

23 Η χρωματινική δομή επηρεάζεται απο χημικές τροποποιήσεις (ακετυλιώσεις, μεθυλιώσεις κ.α.) ) πλευρικών ομάδων αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών H αφόρτιστη αμιδική ομάδα, σε αντίθεση με την θετικά φορτισμένη αμινική, μπορεί να συμβάλλει στην χαλάρωση των αλληλεπιδράσεων ιστονών και DNA. Αφόρτιστη αμιδική ομάδα Αμινοτελικές ουρές ιστονών μπορεί να υφίσταται επίσης πολλαπλές μεθυλιώσεις καταλυόμενες από Μέθυλ- μεταφοράσες ιστονών και απόμεθυλιώσεις καταλυόμενες από ειδικές από- μεθυλάσες. Ποιά αντίδραση καταλύεται από μια απο-ακετυλάση ιστονών (HDAC) και ποιό το προβλεπόμενο αποτέλεσμα στη μεταγραφή?? 23 Ανάπλαση-δέσμευση πρωτείνης

24 H μεταγραφική ενεργοποίηση συχνά χρειάζεται ανάπλαση της χρωματίνης Τι δυνατότητα έχει μια ρυθμιστική πρωτεΐνη να δεσμευτεί ειδικά σε νουκλεοσωμικό DNA?? msec msec 250 msec Η ανάπλαση της χρωματίνης συντελείται με Σύμπλοκα ανάπλασης της χρωματινικής δομής που ξοδεύοντας ΑΤΡ προκαλούν είτε α) Νουκλεοσωμική ολίσθηση, είτε β) Αποσυγκρότηση και ανασυγκρότηση νουκλεοσωμάτων σε νέα θέσεις Οι ομοιοπολικές τροποποιήσεις αμινοτελικών αμινοξέων ιστονών (ακετυλίωση, μεθυλίωση κ.α.) μπορεί να προηγούνται της δράσης των συμπλόκων ανάπλασης της νουκλεοσομικής δομής. Οι «συσκευές» τροποποίησης ιστονών και ανάπλασης χρωματίνης καθοδηγούνται σε διάφορές χρωμοσωμικές θέσεις από μεταγραφικούς ενεργοποιητές στους ενισχυτές των αντιστοίχων γονιδίων 24 brahma

25 Οι «συσκευές» τροποποίησης ιστονών και ανάπλασης χρωματίνης καθοδηγούνται σε διάφορές χρωμοσωμικές θέσεις από μεταγραφικούς ενεργοποιητές στους ενισχυτές των αντιστοίχων γονιδίων Επιπλέον, ακετυλιωμένες λυσίνες μπορούν να αναγνωρισθούν από υπομονάδες των συμπλόκων αναδιάταξης χρωματίνης, αλλά και από άλλους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες (πχ TAF250) μέσω του μοτίβου brahma. Ενδέχεται αυτές οι αλληλεπιδράσεις να σταθεροποιούν/κατευθύνουν τα σύμπλοκα αναδιάταξης χρωματίνης στα σημεία εκείνα των υποκινητών που η νουκλεοσωμική δομή χρειάζεται αναδιάταξη!!! μοτίβο brahma Estrogen 25

26 Παραδείγματα ρύθμισης μεταγραφικών ενεργοποιητών 1. Τα οιστρογόνα (πχ η οιστρόνη), οι θυροειδικές ορμόνες, τα ρετινοειδή κλπ στεροειδή κ.α. δεσμεύονται και ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες γνωστούς ως πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών 26 ERE

27 Οι πυρηνικοί υποδοχείς στεροειδών ορμονών αναγνωρίζουν και δεσμεύονται σε αλληλουχίες DNA γνωστές ως «στοιχεία χ απόκρισης σε οιστρογόνα» ERE (estrogen response element) ΕRE: παλλίνδρομη αλληλουχία AGGTCANNNGACCT Οι πυρηνικοί υποδοχείς στεροειδών ορμονών συνίστανται από περισσότερες από δυο δομικά και λειτουργικά δικριτές περιοχές Zn 27 Δομικές αλλαγές

28 Η σύνδεση του προσδέματος (οιστραδιόλη) προκαλεί δομικές αλλαγές στον πυρηνικό υποδοχέα οιστρογόνου 28 SRC-1

29 Ο πυρηνικός υποδοχέας στεροειδών ορμονών- μετά τη σύνδεση του οιστρογόνου-μπορεί να «στρατολογεί» μεταγραφικούς συν-ενεργοποιητές Ανταγωνιστές και αγωνιστές Ο συν-ενεργοποιητής εργο ο SRC-1 (steroid receptor co-activator) ato συνδέεται με τον υποδοχέα στερεοειδών ορμονών μέσω επαναλήψεων L-X-X-L-L 29

30 Ανταγωνιστές και αγωνιστές πυρηνικών υποδοχέων ορμονών Ανταγωνιστές πχ αντικαρκινικά Φάρμακα, που χρησιμοποιούνται στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού Αγωνιστές πχ αναβολικά που χρησιμοποιούνται ο ού!!!! στο doping αθλητών!!! 30 ταμοξιφαίνη

31 Η δομική αλλαγή με τη σύνδεση ταμοξιφαίνης (αντί για οιστραδιόλη) αποτρέπει τη σύνδεση του συν-ενεργοποιητή και αναστέλλει (πώς?) τη μεταγραφή 31 Επινεφρίνη

32 2. Δέσμευση προσδεμάτων (πχ επινεφρίνη) σε μεμβρανικούς υποδοχείς καταλήγει σε φωσφορυλίωση φ μεταγραφικών ενεργοποιητών (πχ χ CREB) και στρατολόγηση συν-ενεργοποιητών (πχ CBP) Επινεφρίνη 7ΤΜ Πρωτείνη G Αδενυλική κυκλάση camp Ενεργοποίηση ΡΚΑ Leucine Zipper Ser 192 Φωσφορυλίωση CREB Στρατολόγηση CBP Μεταγραφική ενεργοποίηση CREB PKA: Protein Kinase A CREB: camp Response Element Binding protein CBP: CREB Binding Protein 32 CBP

33 O συνενεργοποιητής CBP, ο οποίος συνδέεται με την φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB, φέρει ενεργότητα ακετυλ-μεταφοράσης ιστονών (HAT), αλλά και περιοχή δέσμευσης ακετυλιωμένων ιστονών (περιοχή brm) 192 Μετα-μεταγραφική Ρύθμιση attenuation 33

34 Ρύθμιση σε μετα-μεταγραφικά στάδια-σίγαση (attenuation) Δομή μη τερματισμού Δομή τερματισμού Μηχανισμός εξασθένησης (attenuation) στο οπερόνιο τρυπτοφάνης (Ε. Coli) Έλλειψη W ακινητοποιεί το ριβόσωμα δίνοντας στο mrna δομή που επιτρέπει κίνηση της RNA πολ. 34 και σε άλλα οπερόνια

35 Aνάλογοι μηχανισμοί λειτουργούν και σε άλλα οπερόνια. 35 Fe

36 Μηχανισμός μεταφραστικής ρύθμισης στην ομοιόσταση Fe στα ζώα Ο Fe μεταφέρεται στον ορό από την Τρασφερρίνη Ο υποδοχέας τρασφερρίνης είναι μεμβρανική πρωτεΐνη που εισάγει τρανσφερρίνη-fe F μέσα στα κύτταρα Η φερριτίνη αποθηκεύει ενδοκυττάρια Fe (24 μόρια φρρ φερριτίνης-2400 Fe) Ρύθμιση: Χαμηλές συγκεντρώσεις Fe ελαττώνουν τα επίπεδα φερριτίνης (και αυξάνουν τα επίπεδα του υποδοχέα τρανσφερρίνης) και, αντιστρόφως ) 36 ΙRE-Binding Protein

37 Το ΙRE (Iron Response Element - Στοιχείο απόκρισης στον σίδηρο) στην 5 UTR (5 μη μεταφράσιμη περιοχή) του mrna της φερριτίνης ευθύνεται για την μεταφραστική ρύθμιση του γονιδίου της φερριτίνης Το ΙRE έχει δομή στελέχους-θηλιάς Το ΙRE δεσμεύεται από την IRE-BP (ΙRE-Binding Protein) η οποία εμποδίζει την έναρξη της μετάφρασης του mrna της φερριτίνης. Παρεμποδίζεται η σάρωση της μη μεταφράσιμης περιοχής του mrna από την 40S ριβοσωμική υπομονάδα?? 37 ΙRE-Binding Protein

38 Σε υψηλές συγκεντρώσεις Fe, η IRE-Binding Protein δεσμεύει Fe, με τη μορφή συμπλόκου 4Fe-4S (iron-sulfur cluster). Η θέση δέσμευσης 4Fe-4S 4S επικαλύπτεται με τη θέση δέσμευσης RNA, επομένως σε υψηλές συγκεντρώσεις Fe η IRE-BP αποδεσμεύεται από το IRE και επιτρέπει τη μετάφραση του mrna φερριτίνης Η ΙRE-Binding Protein είναι ομόλογη και έχει ενζυμική ενεργότηταμιτοχονδριακής ακονιτάσης, δηλ. το ενζυμο πού συμμετέχει στον Κύκλο του Krebs καταλύοντας την ισομερίωση τουυ κιτρικού σε ισοκιτρικό μέσω ακονιτικού!!! 4Fe-4S (iron-sulfur cluster) 38

39 Stryer Σλ1005 Σελ Ερωτήσεις: 2, 3, 5, 8, 10, 12. Lehninger Kεφ. 28 1, 2, 3, 4, 9. Σκεφθείτε όλες τις δυνατές σημειακές μεταλλάξεις που θα επηρέαζαν τη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης Cap στο οπερόνιο λακτόζης. Σκεφθείτε τι θα συνέβαινε στο οπερόνιο της τρυπτοφάνης αν απουσίαζαν από το κύτταρο τα σύμπλοκα νουκλεοσωμικής αναδιάταξης. δά Εξηγείστε τα πλεονεκτήματα που εξασφαλίζει η παρουσία ακετυλομεταφοράσης ιστονών και περιοχής brahma στο ίδιο μόριο μεταγραφικού συνενεργοποιητή. 39