ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΜΕ ΑΛΛΟΠΟΥΡΙΝΟΛΗ ΣΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΤΙ ΑΣ ΣΤΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΠΛΕΥΡΑΚΗ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΜΕ ΑΛΛΟΠΟΥΡΙΝΟΛΗ ΣΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΤΙ ΑΣ ΣΤΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΠΛΕΥΡΑΚΗ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Α. Κουτίνας Επιβλέπων Καθηγήτρια Ε. Καλδυµίδου Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν Καθηγητής Ν. Ρουµπιές Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Τ. Ράλλης Μέλος Καθηγητής Σ. Λέκκας Μέλος Αν Καθηγήτρια Μ. Κουτσοβίτη-Παπαδοπούλου Μέλος Επ. Καθηγήτρια Μ. Παπαζαχαριάδου Μέλος

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 3 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ: ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ... 7 Η ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ... 7 Επιδηµιολογικά στοιχεία... 9 Παθογένεια Κλινική εικόνα Αιµατολογικές και βιοχηµικές διαταραχές ιαγνωστικές µέθοδοι Η ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙ Α- ΙΑΜΕΣΗ ΝΕΦΡΙΤΙ Α ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ Αιτιοπαθογένεια Κλινική εικόνα ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙ ΑΣ Εκτίµηση του βαθµού της σπειραµατικής πρωτεϊνουρίας Ρυθµός σπειραµατικής διήθησης ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΑ ΚΑΙ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ ΑΝΤΙΛΕΪΣΜΑΝΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΛΣ: θεραπεία ή ευθανασία; ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ: ΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Στοιχεία ταυτότητας και ιστορικό των ζώων ιαχωρισµός των ζώων σε οµάδες και θεραπευτική αγωγή Κλινική εξέταση Αιµατολογική και βιοχηµικές εξετάσεις Ανάλυση ούρων Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης στα ούρα Κάθαρση εξωγενούς κρεατινίνης Βιοψίες από τους νεφρούς Ιστοπαθολογική εξέταση Ορολογικές εξετάσεις για τη ΛΣ και διάφορες άλλες λοιµώξεις και παρασιτώσεις Παρασιτολογική εξέταση σε επίχρισµα από οπό λεµφογαγγλίου Παρασιτολογική εξέταση σε επίχρισµα από µυελό των οστών Εξέταση για διάφορα αιµοπαράσιτα στη στοιβάδα των λευκών αιµοσφαιρίων-αιµοπεταλίων (buffy coat)

4 Εξέταση για µικροφιλάριες Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) Χρονοδιάγραµµα των διαφόρων εξετάσεων Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Aνταπόκριση των ζώων των οµάδων Α, Β και Γ στη θεραπεία µε αλλοπουρινόλη Ευρήµατα από την εξέταση των ούρων Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης στα ούρα (Upr/cr) Βιοχηµικές παράµετροι που έχουν σχέση µε την απεκκριτική λειτουργία του νεφρού και την πρωτεϊνουρία Ρυθµός σπειραµατικής διήθησης Ιστοπαθολογικά ευρήµατα από τους νεφρούς Συσχετισµός µεταξύ του λόγου Upr/cr ή του ΡΣ και του βαθµού έντασης των νεφρικών αλλοιώσεων Παρουσία των αµαστιγοφόρων µορφών της L. infantum στις ιστολογικές τοµές του νεφρικού παρεγχύµατος Ευρήµατα από τις ορολογικές και τις παρασιτολογικές εξετάσεις και της εξέτασης µε την PCR ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMURY ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η λεϊσµανίωση (ΛΣ) είναι από τα συχνότερα πρωτοζωϊκά νοσήµατα του σκύλου όχι µόνο στην Ελλάδα αλλά και σε όλες τις παραµεσόγειες χώρες. Η κλινική της εικόνα περιλαµβάνει µεγάλο αριθµό συµπτωµάτων και αλλοιώσεων από διάφορα όργανα και συστήµατα, µεταξύ των οποίων και οι νεφροί. Η προκαλούµενη νεφροπάθεια εκδηλώνεται µε ασυµπτωµατική πρωτεϊνουρία, νεφρωσικό σύνδροµο ή/και χρόνια νεφρική ανεπάρκεια που οφείλονται σε διάφορους τύπους σπειραµατονεφρίτιδας από ανοσοσύµπλοκα και σε µικρότερο βαθµό σε διαµεσοσωληναριακή νεφρίτιδα. Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια αποτελεί το κυριότερο αίτιο θανάτου από τη ΛΣ. Για τη θεραπεία της λεϊσµανίωσης στο σκύλο έχουν χρησιµοποιηθεί και εξακολουθούν να χρησιµοποιούνται, διάφορα αντιλεϊσµανιακά φάρµακα σε δοσολογικά σχήµατα και συνδυασµούς που ποικίλλουν. Μέχρι σήµερα όµως δεν υπάρχει κάποιο φάρµακο ή θεραπευτικό πρωτόκολλο µε το οποίο να επιτυγχάνεται παρασιτολογική ίαση µε αποτέλεσµα στα περισσότερα περιστατικά η νόσος να υποτροπιάζει µετά τη διακοπή της θεραπευτικής αγωγής. Η αλλοπουρινόλη χρησιµοποιείται όλο και συχνότερα τα τελευταία χρόνια κυρίως για τον κλινικό έλεγχο της νόσου επειδή προκαλεί τις λιγότερες παρενέργειες έχει χαµηλό κόστος και χορηγείται εύκολα. Όµως παρά τις µέχρι σήµερα µελέτες αναφορικά µε την αποτελεσµατικότητα της αλλοπουρινόλης ως αντιλεϊσµανιακό φάρµακο, εξακολουθεί να παραµένει άγνωστη η επίδρασή της πάνω στην απεκκριτική λειτουργία του νεφρού και την εξέλιξη των αλλοιώσεων της χρόνιας νεφρίτιδας της λεϊσµανίωσης. Το κενό αυτό ήταν το βασικό κίνητρο για την έρευνα αυτή, που στοχεύει στη µελέτη της επίδρασης της µακροχρόνιας θεραπείας µε αλλοπουρινόλη πάνω στην εξέλιξη της 3

6 σπειραµατικής πρωτεϊνουρίας, των νεφρικών αλλοιώσεων και της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού σε σκύλους µε λεϊσµανίωση. Το πρώτο µέρος της διδακτορικής διατριβής περιλαµβάνει σύντοµη βιβλιογραφική ανασκόπηση της λεϊσµανίωσης και των σπειραµατονεφρίτιδων από ανοσοσύµπλοκα στο σκύλο. Ιδιαίτερη έµφαση δόθηκε στη θεραπεία της λεϊσµανίωσης και την ιστολογική εικόνα της χρόνιας νεφρίτιδας που προκαλεί, παράλληλα µε τις µεθόδους που χρησιµοποιούνται για την ποσοτική εκτίµησης της πρωτεϊνουρίας και το ρυθµό της σπειραµατικής διήθησης. Στο δεύτερο µέρος αναφέρονται τα υλικά και οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη και τα αποτελέσµατα των διαφόρων εξετάσεων που έγιναν σε σύνολο 40 σκύλων µε λεϊσµανίωση, πριν και µετά τη θεραπεία µε αλλοπουρινόλη. Μετά τη συζήτηση των αποτελεσµάτων, µε βάση τα δεδοµένα της παγκόσµιας βιβλιογραφίας, και την εξαγωγή των ανάλογων συµπερασµάτων, ακολουθούν οι περιλήψεις, το παράρτηµα πινάκων και η παράθεση των βιβλιογραφικών πηγών. Στην έρευνα αυτή που πραγµατοποιήθηκε στην Κλινική της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. ανεκτίµητη υπήρξε η συµπαράσταση, καθοδήγηση και κάθε είδους βοήθεια που µου πρόσφερε ο καθηγητής κ. Α.Φ. Κουτίνας, και στον οποίο θα ήθελα να εκφράσω τις πλέον θερµές µου ευχαριστίες. Θερµά θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την καθηγήτρια του Εργαστηρίου της Παθολογικής Ανατοµικής του Τµήµατος κ. Ε. Καλδρυµίδου όχι µόνο για την πολύτιµη επιστηµονική καθοδήγηση και βοήθειά της στο ιστοπαθολογικό µέρος της µελέτης, αλλά και το γενικότερο ενδιαφέρον και υποστήριξή της. Θερµές ευχαριστίες θα ήθελα επίσης να εκφράσω και στον αναπληρωτή καθηγητή του Εργαστηρίου της Κλινικής 4

7 ιαγνωστικής και Προπαιδευτικής Παθολογίας κ. Ν. Ρουµπιέ για τη βοήθειά του προκειµένου να φέρω σε πέρας τις βιοχηµικές εξετάσεις της µελέτης αυτής. Η συµβολή του επίκουρου καθηγητή της Χειρουργικής Κλινικής κ. Λ. Παπάζογλου, στον οποίο απευθύνω ιδιαίτερες ευχαριστίες, υπήρξε ουσιαστική στις βιοψίες που πάρθηκαν από τους νεφρούς. Θα αποτελούσε παράλειψη αν δεν ευχαριστούσα το διευθυντή της Χειρουργικής Κλινικής, καθηγητή κ. Α. εσίρη για την κάθε είδους διευκόλυνση που µου παρείχε, και στον τότε διευθυντή του Εργαστηρίου Κλινικής ιαγνωστικής και Προπαιδευτικής Παθολογίας, οµότιµο καθηγητή κ Α. Παπαστεριάδη που µου έδωσε τη δυνατότητα να πραγµατοποιήσω τις αιµατολογικές και βιοχηµικές εξετάσεις. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή της Επιδηµιολογίας του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Πανεπιστηµίου Θεσσαλίας κ. Λ. Λεοντίδη για τη βοήθεια στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων και τον λέκτορα της Κτηνιατρικής του Πανεπιστηµίου Θεσσαλίας κ. Χ. Μπιλλίνη για την πραγµατοποίηση της PCR. Ευχαριστώ επίσης τον λέκτορα της Κλινικής της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. κ. Μ. Σαριδοµιχελάκη για τη βοήθεια στην πραγµατοποίηση της παρασιτολογικής εξέτασης. Θα πρέπει να ευχαριστήσω τους κτηνιάτρους και υποψήφιους διδάκτορες της Χειρουργικής Κλινικής κ. Β. Τσιώλη και Γ. Καζάκο που µε βοήθησαν στις βιοψίες από τους νεφρούς, όπως επίσης και τους κτηνιάτρους κ. Ν. Σούµπαση, διδάκτορα του Τµήµατος Κτηνιατρικής και κ. Ν. Ζαβρό, υποψήφιο διδάκτορα, τους µετεκπαιδευόµενους κτηνιάτρους της Κλινικής της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς και τους φοιτητές που µου συµπαραστάθηκαν µε κάθε τρόπο. Τους ζωοκόµους της Κλινικής της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς κ. Σ. Ζησόπουλο και Κ. Κλωνή και 5

8 του Εργαστηρίου Κλινικής ιαγνωστικής και Προπαιδευτικής Παθολογίας, κ. Ν. Ζησόπουλο, ευχαριστώ για την περιποίηση και φροντίδα των ζώων. Ευχαριστώ επίσης το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών, που µε στήριξε οικονοµικά. Τέλος, ευχαριστώ το σύζυγό µου, Γ. Σάββα, λέκτορα της Χειρουργικής Κλινικής του Τµήµατος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ., για την πολύπλευρη επιστηµονική βοήθεια και την ψυχολογική στήριξη που µου πρόσφερε σε όλο το χρονικό διάστηµα που εκπονήθηκε η διατριβή αυτή. 6

9 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Η ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ Τα πρωτόζωα του γένους Leishmania (φύλο Sarcomastigophora, τάξη Kinetoplastida, οικογένεια Trypanosomatidae) (Lainson και Shaw 1987, Kassai και συν. 1998) έχουν ενδοκυτταρική εντόπιση και δύο εξελικτικές µορφές, την αµαστιγοφόρο και την προµαστιγοφόρο (Lainson και Shaw 1987). Η Leishmania sp, που είναι το αίτιο της λεϊσµανίωσης του ανθρώπου και των ζώων, έχει διαπιστωθεί σ ολόκληρο τον κόσµο εκτός από την Ωκεανία (World Health Organization 1990). Αν και διάφορα είδη ερπετών, πτηνών και τρωκτικών, τα άγρια µέλη της οικογένειας των Canidae, το άλογο, το πρόβατο, η γάτα, και άλλα είδη ζώων µπορούν να προσβληθούν από το παράσιτο, ο άνθρωπος και ο σκύλος παρουσιάζουν το µεγαλύτερο ενδιαφέρον από κλινική και επιδηµιολογική άποψη (World Health Organization 1990, van der Lugt και συν. 1992, Barnes και συν. 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Ozon και συν. 1998). Ο σκύλος προσβάλλεται από τα είδη L. infantum, που ενδηµεί στις Μεσογειακές χώρες, την Πορτογαλία, τη Μέση Ανατολή και τη Βόρεια Αφρική, και L. chagasi, που ενδηµεί στην Κεντρική και Νότια Αµερική (Slappendel και Ferrer 1998, Diakou και Dovas 2001). Η νόσος στο σκύλο αναφερόταν και ως «σπλαχνική λεϊσµανίωση» όχι µόνο κατ αναλογία της αντίστοιχης νόσου του ανθρώπου αλλά γιατί οι περισσότερες κλινικές εκδηλώσεις προέρχονται από τα εσωτερικά όργανα (Slappendel και Ferrer 1998). Μέσα στο κυτταρόπλασµα της ωοειδούς αµαστιγοφόρου µορφής του παρασίτου, που εντοπίζεται κυρίως στα µακροφάγα κύτταρα των σπονδυλωτών ξενιστών και έχει διαστάσεις 2-5 µm Χ 1,5-2 µm, διακρίνεται ο πυρήνας και ο ραβδοειδής κινητοπλάστης, που είναι ένα µιτοχόνδριο πλούσιο σε DNA (Molyneux και Killick- 7

10 Kendrick 1987, Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998). Η προµαστιγοφόρος µορφή έχει µήκος µm, κινείται µε τη βοήθεια µαστίγιου (20 µm) και εντοπίζεται στον ενδιάµεσο ξενιστή και µεταδότη του παρασίτου που κατά κανόνα είναι οι σκνίπες των γενών Phlebotomus sp στην Ευρώπη, την Ασία και την Αφρική και Lutzomyia sp στην Αµερική (Molyneux και Killick-Kendrick 1987, World Health Organization 1990, Ferrer 1992). Στα είδη των σκνιπών που βρέθηκαν στην Ελλάδα περιλαµβάνονται τα Phlebotomus neglectus, P. perfiliewi, P. sergenti, P. tobbi, P. simici, P. papatasi, P. balcanicus, P. alexandri, P. mascitti, Sergentomyia dentate, S. minuta και S. theodori (Leger και συν. 1988, World Health Organization 1990, Chaniotis και συν. 1994, Papadopoulos και Tselentis 1994, Χαραλαµπίδης 1998) η δραστηριότητα των οποίων διαρκεί από τις αρχές Μαΐου µέχρι το τέλος Νοεµβρίου (Chaniotis και συν. 1994) Οι σπονδυλωτοί ξενιστές µολύνονται ύστερα από ενοφθαλµισµό της προµαστιγοφόρου µορφής του παρασίτου στο δέρµα από τις θηλυκές σκνίπες όταν µυζούν αίµα (Molyneux και Killick-Kendrick 1987). Η προµαστιγοφόρος µορφή φαγοκυτταρώνεται από τα µακροφάγα και τα κύτταρα του Langerhans µέσα στα οποία πολλαπλασιάζεται µε απλή διαίρεση για να προκαλέσει τελικά τη ρήξη τους (Chang και συν. 1985, Molyneux και Killick-Kendrick 1987, Bray και Alexander 1987, Alexander και Russell 1992). Τα απελευθερωµένα παράσιτα φαγοκυτταρώνονται στη συνέχεια από άλλα µακροφάγα κύτταρα τα οποία µε τη σειρά τους καταστρέφονται (Molyneux και Killick-Kendrick 1987, Bray και Alexander 1987), γεγονός που επαναλαµβάνεται κάθε 12 µε 24 ώρες (Mehlhorn και Piekarski 1985, Χαραλαµπίδης 1998). Οι θηλυκές σκνίπες µολύνονται µε την πρόσληψη των παρασιτούµενων µονοπύρηνων κυττάρων όταν µυζούν αίµα από µολυσµένους ανθρώπους ή ζώα. Στον πεπτικό σωλήνα της σκνίπας η αµαστιγοφόρος µορφή της Leishmania sp µετατρέπεται σε προµαστιγοφόρο 8

11 και πολλαπλασιάζεται µε απλή διαίρεση, για να µεταναστεύσει στη συνέχεια στο φάρυγγα και τα στοµατικά µόρια απ όπου θα µεταφερθεί στον επόµενο σπονδυλωτό ξενιστή (Killick-Kendrick 1990, Ferrer 1992). Επιδηµιολογικά στοιχεία Η λεϊσµανίωση ενδηµεί στις µεσογειακές χώρες στις οποίες έχουν αποµονωθεί τα είδη L. infantum, L. major και L. tropica (Belazzoug 1992). Στην Ελλάδα, ο άνθρωπος προσβάλλεται σποραδικά από τη σπλαχνική (L. infantum) και τη δερµατική (L tropica, ορισµένα στελέχη της L. infantum) µορφή της νόσου (Garifallou και συν. 1984, Frank και συν. 1993) χωρίς όµως να µπορεί να εκτιµηθεί η πραγµατική συχνότητά της επειδή πολλά περιστατικά δε δηλώνονται παρά τη σχετική νοµοθεσία (Σαρόγλου 2001). Στο σκύλο η λεϊσµανίωση (ΛΣ) από L. infantum είναι ίσως το συχνότερο πρωτοζωικό νόσηµα όχι µόνο στην Ελλάδα αλλά και τις άλλες µεσογειακές χώρες, στις οποίες το ποσοστό των ορολογικά θετικών ζώων στο συνολικό πληθυσµό κυµαίνεται από 1 ως 42% (Pozio και συν. 1981, Mancianti και συν. 1986, Bettini και Gradoni 1986, World Health Organization 1990, Nieto και συν. 1992a, Amela και συν. 1995, Acedo Sanchez C. και συν. 1996, Deplazes και συν. 1998, Ozensoy και συν. 1998, Fisa και συν. 1999, Zaffaroni και συν. 1999, Dereure και συν. 1999). Ανάλογα ποσοστά (1,6%-24%) έχουν αναφερθεί και στην Ελλάδα (Kontos και Spais 1989, Αργυριάδης και Λίτκε 1991, Παπαδοπούλου και συν. 1995, Sideris και συν. 1999, Χαραλαµπίδης και ιάκου 1999). Σε χώρες που δεν υπάρχουν σκνίπες, η ΛΣ εµφανίζεται κυρίως σε ζώα που έχουν γεννηθεί ή παραµείνει για κάποιο χρονικό διάστηµα σε περιοχές στις οποίες ενδηµεί (George και συν. 1976, Longstaffe και συν. 1983, Slappendel 1988, Slappendel και 9

12 Ferrer 1998, Trees και Shaw 1999). Τα τελευταία όµως χρόνια αυξάνονται ολοένα και περισσότερο οι αναφορές αυτόχθονων περιστατικών της νόσου στις χώρες αυτές (Anderson και συν. 1980), (Swenson και συν. 1988, Slappendel 1988, Sellon και συν. 1993, Bravo και συν. 1993, Diaz-Espineira και Slappendel 1997). Εκτός από τις σκνίπες δεν αποκλείεται η απευθείας µετάδοση του παρασίτου µέσω τραυµάτων, δερµατικών ελκών και άλλων αιµατοφάγων εξωπαρασίτων (π.χ. Rhipicephalus sanguineus), ή µε τη µετάγγιση του αίµατος (Ferrer 1992, Kontos και Koutinas 1993, Bravo και συν. 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Owens και συν. 2001). Παθογένεια Το 10% ως 50% των µολυσµένων σκύλων παραµένουν ασυµπτωµατικοί φορείς, µερικοί από τους οποίους ενδέχεται κάποια στιγµή να απαλλαγούν τελείως από το παράσιτο (Abranches και συν. 1991a, Cabral και συν. 1992, Pinelli και συν. 1994, Pinelli και συν. 1995, Slappendel και Ferrer 1998). Καθοριστική σηµασία στην εκδήλωση της ΛΣ έχει η ανοσολογική απάντηση του συγκεκριµένου ζώου και συγκεκριµένα η ενεργοποίηση της κυτταρικής ανοσίας που µπορεί να περιορίσει ή να εξουδετερώσει τη L. infantum (Cabral και συν. 1998, Slappendel και Ferrer 1998, Ferrer 1999). Aντίθετα, η ενεργοποίηση της χηµικής ανοσίας όχι µόνο δεν προστατεύει το ζώο αλλά ευθύνεται για πολλές από τις κλινικές εκδηλώσεις της νόσου (Slappendel και Ferrer 1998). Εφόσον ενεργοποιηθούν τα Th1 λεµφοκύτταρα παράγονται οι κυτταροκίνες IL-2, IFN-γ και TNF-α που φαίνεται να προλαµβάνουν την εκδήλωση των συµπτωµάτων της νόσου και στο σκύλο, όπως έχει διαπιστωθεί στα ποντίκια και τον άνθρωπο (Pinelli και συν. 1994, Pinelli και συν. 1995, Cabral και συν. 1998, Pinelli και συν. 1999, Andrade και συν. 1999). Στα παραπάνω ζωικά είδη η ενεργοποίηση των 10

13 Th-2 λεµφοκυττάρων, που παράγουν IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13 έχει βρεθεί ότι συνδέεται µε τη συµπτωµατική µορφή της νόσου (Scott 1989, Liew και O'Donnell 1993, Reiner 1994, Kemp και συν. 1996, Lehmann και Alber 1998, Pinelli και συν. 1999). Σε σκύλους που νοσούν, χωρίς να έχει εξακριβωθεί απόλυτα η ενεργοποίηση των Th-2 λεµφοκυττάρων, είναι γνωστό ότι οι IL-2, INF-γ και TNF παράγονται σε πολύ µικρότερη ποσότητα, ενώ παράλληλα παρατηρείται δραµατική µείωση των CD4+ λεµφοκυττάρων σε σύγκριση µε τα ασυµπτωµατικά ζώα (Pinelli και συν. 1994, Bourdoiseau και συν. 1997a, Bourdoiseau και συν. 1997b, Cabral και συν. 1998, Moreno και συν. 1999, Pinelli και συν. 1999). Η ανοσολογική απάντηση εξαρτάται ή καλύτερα επηρεάζεται από κληρονοµικούς παράγοντες και ενδεχοµένως από ουσίες πού ενοφθαλµίζονται στο δέρµα από τις σκνίπες (Pinelli και συν. 1999, Solano-Gallego και συν. 2000). Στα συµπτωµατικά ζώα η καταστολή της κυτταρικής ανοσίας επιτρέπει τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό του πρωτόζωου, ιδιαίτερα στα κύτταρα του συστήµατος των µονοπύρηνων-µακροφάγων κυττάρων (Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998). Παράλληλα, η διέγερση της χηµικής ανοσίας, µε την παραγωγή κυρίως ειδικών IgG αντισωµάτων, οδηγεί στο σχηµατισµό ανοσοσυµπλόκων που κυκλοφορούν στο αίµα και µπορούν να προκαλέσουν αγγειίτιδα, δερµατίτιδα, σµηγµαταδενίτιδα, πολυαρθρίτιδα, πολυµυΐτιδα, ραγοειδίτιδα, σπειραµατονεφρίτιδα κ.α. (Poli και συν. 1991, Ferrer 1992, Koutinas και συν. 1993, Molleda και συν. 1993, Koutinas και συν. 1995, Slappendel και Ferrer 1998, Vamvakidis και συν. 2000). Οι διάφορες αυτές νοσολογικές οντότητες οφείλονται στην πρόκληση φλεγµονής ύστερα από προηγούµενη εναπόθεση των κυκλοφορούντων ανοσοσυµπλόκων στα αντίστοιχα όργανα-στόχους (Ferrer 1992). 11

14 Κλινική εικόνα Οι µολυσµένοι σκύλοι που τελικά θα αρρωστήσουν µπορεί να εµφανίσουν ευρύ φάσµα συµπτωµάτων, σε διάφορους συνδυασµούς και βαθµό έντασης, ύστερα από περίοδο επώασης που διαρκεί από 3 µήνες µέχρι 7 χρόνια (Πίνακας 1) (Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν. 1999). Η νόσος έχει παρατηρηθεί σε σκύλους πολλών και διαφόρων φυλών, ανεξάρτητα από το φύλο ή την ηλικία, αλλά σπάνια σε ζώα κάτω των 6 µηνών, πιθανότατα εξαιτίας του µεγάλου χρόνου επώασης (Abranches και συν. 1991b, Ferrer 1992). Το παράσιτο έχει βρεθεί σε όλα τα όργανα και συστήµατα του οργανισµού, ακόµα και στο κεντρικό νευρικό σύστηµα (Ferrer και συν. 1988b, Nieto και συν. 1996, Slappendel και Ferrer 1998, Cortese και συν. 1999, Vinuelas και συν. 2001). Τα συχνότερα αίτια προσκόµισης στον κτηνίατρο ζώων µε ΛΣ είναι η προοδευτική απώλεια του σωµατικού βάρους, παρά τη φυσιολογική ή αυξηµένη όρεξη, η εύκολη κόπωση, η µείωση της όρεξης, οι αλλοιώσεις στο δέρµα και τους οφθαλµούς και η επίσταξη (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999). Τα προσβληµένα ζώα συνήθως εµφανίζουν κακή θρεπτική κατάσταση και όψη του τριχώµατος καθώς και µυϊκή ατροφία, που είναι ιδιαίτερα εµφανής στους µασητήριους µυς. (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999, Vamvakidis και συν. 2000). Στις δερµατικές αλλοιώσεις περιλαµβάνονται η αποφολιδωτική δερµατίτιδα, τα έλκη, τα οζίδια, η άσηπτη φλυκταινώδης δερµατίτιδα, ο αποχρωµατισµός του ακρορινίου, η υπερκεράτωση του ακρορινίου και των πελµατικών φυµάτων, η παρωνυχία και η ονυχογρύπωση που συχνά επιπλέκονται από τον Staphylococcus intermedius (Ferrer και συν. 1988a, Koutinas και συν. 1993, Koutinas και συν. 1999). 12

15 Η υπερπλαστικού τύπου περιφερική λεµφαδενοπάθεια και ηπατοσπληνοµεγαλία διαπιστώνονται συχνά στην πράξη, αν και δεν είναι λίγα τα ζώα εκείνα στα οποία δεν γίνονται αντιληπτές κατά την κλινική εξέταση, ιδιαίτερα η τελευταία (Kontos και Koutinas 1993, Koutinas και συν. 1999). Στους οφθαλµούς η ΛΣ µπορεί να προκαλέσει ελκώδη βλεφαρίτιδα, επιπεφυκίτιδα, κερατίτιδα, ξηρή κερατοεπιπεφυκίτιδα, ιριδοκυκλίτιδα, γλαύκωµα κλειστής γωνίας, χοριοαµφιβληστροειδίτιδα, αποκόλληση και ατροφία του αµφιβληστροειδή χιτώνα, και πανοφθαλµίτιδα (Ferrer 1992, Molleda και συν. 1993, Koutinas και συν. 1999, Roze 2002). Οι αλλοιώσεις αυτές προκαλούνται όχι µόνο από την άµεση δράση του παρασίτου αλλά κυρίως από την εναπόθεση των ανοσοσυµπλόκων στα διάφορα ανατοµικά στοιχεία του οφθαλµού (Slappendel 1988, Ferrer 1992, Garcia-Alonso και συν. 1996). Ορισµένοι σκύλοι παρουσιάζουν διαφόρου βαθµού χωλότητα και δυσκολία για ανέγερση και µετακίνηση εξαιτίας της µη ελκώδους πολυαρθρίτιδας, της οστεοµυελίτιδας, της έντονης ονυχογρύπωσης-παρωνυχίας ή/και της υπερκεράτωσηςεξέλκωσης των πελµατικών φυµάτων (Slappendel 1988, Koutinas και συν. 1993, Spreng 1993, Wolschrijn και συν. 1996, Buracco και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999). Η ατροφία των µασητήριων µυών, που είναι αρκετά συχνή, ενώ στο παρελθόν είχε αποδοθεί στον καταβολικό χαρακτήρα της νόσου (Dedet και Belazzoung 1985) σε πρόσφατη έρευνα διαπιστώθηκε ότι οφείλεται σε δευτερογενή ανοσολογική πολυµυΐτιδα (Vamvakidis και συν. 2000). Αν και δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόµη η παθογένεια της αµφοτερόπλευρης ή ετερόπλευρης επίσταξης, υποστηρίζεται ότι οφείλεται στην ελκώδη ρινίτιδα σε συνδυασµό µε τη θροµβοκυτταροπενία, την αγγειίτιδα από ανοσοσύµπλοκα ή/και τη θροµβοκυτταροπάθεια (Pumarola και συν. 1991, Ferrer 1992, Juttner και συν. 2001). 13

16 Η χρόνια ηπατίτιδα η χρόνια κολίτιδα και η εστιακή εντερίτιδα, που εµφανίζονται σπάνια στην πράξη, πιθανότατα προκαλούνται από την άµεση δράση του παρασίτου στα µακροφάγα κύτταρα του ήπατος και τα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου του εντέρου (Ferrer και συν. 1991, Ferrer 1992, Valladares και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999). Στις ακόµα σπανιότερες κλινικές εκδηλώσεις της ΛΣ περιλαµβάνονται ο καρδιακός επιπωµατισµός (Font και συν. 1993), η φυλλώδης πέµφιγα (Ginel και συν. 1993), η οξεία παγκρεατίτιδα (Carrasco και συν. 1997), τα κοκκιωµατώδη οζίδια στους βλεννογόνους (Font και συν. 1996) και ο υποθυρεοειδισµός (Font και Closa 1997, Cortese και συν. 1999). Τέλος, µπορεί να εµφανιστεί, αν και σχετικά σπάνια, και η οξεία µορφή της νόσου που εκδηλώνεται µε πυρετό και έντονη περιφερική λεµφαδενοπάθεια όπως συµβαίνει στην οξεία µονοκυτταρική ερλιχίωση (Ehrlichia. canis) και την πιροπλάσµωση (Babesia canis) µε τις οποίες συγχέεται διαγνωστικά ή ενδέχεται να συνυπάρχει (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999, Mylonakis και συν. 2003). 14

17 Πίνακας 1: Οι κυριότερες κλινικές εκδηλώσεις της λεϊσµανίωσης του σκύλου σε φθίνουσα συχνότητα (Slappendel 1988, Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999). Σύµπτωµα ή παθολογική κατάσταση Εκατοστιαία αναλογία Περιφερική λεµφαδενοπάθεια 65,2-96,1 ερµατικές αλλοιώσεις Εύκολη κόπωση 10,8-67,5 Απώλεια του σωµατικού βάρους 25,3-64 Κατάπτωση 8,2-60 Σπληνοµεγαλία 9,5-53,3 Πολυουρία-πολυδιψία 3,8-40 Χωλότητα 1,3-37,5 Ανορεξία 16,5-36,5 Πυρετός 4-36 Οφθαλµικές αλλοιώσεις 16-32,5 Πολυφαγία 15-30,7 Έµετοι-διάρροια 3,8-30 Ατροφία των µασητήριων µυών 24,7 Επίσταξη 6,3-15 Ελκώδης στοµατίτιδα 5,7 Ασκίτης-υποδόρια οιδήµατα 1,9 15

18 Αιµατολογικές και βιοχηµικές διαταραχές Το συχνότερο εργαστηριακό εύρηµα στη ΛΣ είναι η πολυκλωνική και αρκετά σπανιότερα η µονοκλωνική β και γ υπερσφαιριναιµία που συνήθως συνοδεύεται από υπολευκωµατιναιµία εξαιτίας της απώλειας λευκωµατινών µε τα ούρα (σπειραµατονεφρίτιδα), της προσβολής του ήπατος ή/και της µειωµένης όρεξης (Groulade και Person 1987, Slappendel 1988, Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999). Η συχνά παρατηρούµενη ορθόχρωµη-ορθοκυτταρική αναιµία, που δεν είναι αναγεννητική (Slappendel 1988, Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999) πιθανότατα οφείλεται στη χρόνια φλεγµονή, τη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, την απώλεια αίµατος (επίσταξη, αιµορραγίες από τον πεπτικό σωλήνα) και πολύ σπανιότερα στη µυελοκαταστολή (Ferrer 1992, Koutinas και συν. 1999, Lobetti 2002). Στην παθογένειά της είναι πιθανό να υπεισέρχονται και ανοσολογικοί µηχανισµοί αφού σε µεγάλο αριθµό περιστατικών ανιχνεύτηκαν αντιπυρηνικά αντισώµατα στο αίµα και η δοκιµή Coombs ήταν θετική (Slappendel 1988, Koutinas και συν. 1993, Koutinas και συν. 1999). Η θροµβοκυτταροπενία, που διαπιστώνεται σε αρκετά περιστατικά, πιθανότατα οφείλεται στα κυκλοφορούντα ανοσοσύµπλοκα, τα αντιαιµοπεταλιακά αντισώµατα, τον εγκλωβισµό των αιµοπεταλίων στο σπλήνα ή ενδεχοµένως την µυελοκαταστολή (Slappendel και Ferrer 1998). Σπανιότερα µπορεί να εµφανιστεί λευκοκυττάρωση ή λευκοπενία (Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998). Η σπειραµατική πρωτεϊνουρία, που είναι συχνό εύρηµα της ανάλυσης των ούρων προέρχεται από τη σπειραµατονεφρίτιδα. Στα ζώα αυτά, η αύξηση της συγκέντρωσης των µη πρωτεϊνικών αζωτούχων ουσιών στο αίµα, οι ηλεκτολυτικές διαταραχές και το 16

19 χαµηλό ειδικό βάρος των ούρων υποδηλώνουν την εγκατάσταση χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν. 1999). Αύξηση της δραστηριότητας των ηπατικών ενζύµων στον ορό του αίµατος παρατηρείται σπανιότερα (Ciaramella και συν. 1997) (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Οι κυριότερες αιµατολογικές και βιοχηµικές διαταραχές στη λεϊσµανίωση του σκύλου σε φθίνουσα συχνότητα (Slappendel 1988, Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν. 1999). Εργαστηριακό εύρηµα Εκατοστιαία αναλογία Υπερσφαιριναιµία 100 Μη αναγεννητική αναιµία 60-94,2 Υπολευκωµατιναιµία Πρωτεϊνουρία 67,7-85 Θετική δοκιµή Coombs Αυξηµένη δραστηριότητα των ηπατικών ενζύµων Θροµβοκυτταροπενία 29,3-50 Αυξηµένος τίτλος των αντιπυρηνικών αντισωµάτων στο αίµα (ΑΝΑ Test) Αζωθαιµία Λευκοκυττάρωση 8-24 Λευκοπενία 5,

20 ιαγνωστικές µέθοδοι Η διάγνωση της ΛΣ δεν µπορεί να βασιστεί στην κλινική της εικόνα επειδή κανένα από τα συµπτώµατα δεν έχει παθογνωµονικό χαρακτήρα και επιπλέον στις ενδηµικές περιοχές ο αριθµός των ασυµπτωµατικών ζώων είναι πολύ µεγάλος (Berrahal και συν. 1996, Saridomichelakis και συν. 2000, Solano-Gallego και συν. 2001). Από τις παρασιτολογικές, ορολογικές, µοριακές, ξενοδιαγνωστικές, ιστοπαθολογικές, ανοσοϊστοχηµικές και ανοσολογικές µεθόδους και τις καλλιέργειες, µόνο οι τρεις πρώτες χρησιµοποιούνται κατά κύριο λόγο στην κλινική πράξη (Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας 2002). Η αξιολόγηση της καθεµιάς από τις µεθόδους αυτές βασίζεται στην ευαισθησία και την ειδικότητά της (Χαραλαµπίδης 1994, Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας 2002). Παρασιτολογική Με την εξέταση αυτή επιδιώκεται η ανεύρεση των αµαστιγοφόρων µορφών του παρασίτου σε επιχρίσµατα από τα λεµφογάγγλια, το µυελό των οστών, το σπλήνα, το ήπαρ ή το αρθρικό υγρό. Αν και η ειδικότητα της παρασιτολογικής εξέτασης είναι απόλυτη, ο χρονοβόρος χαρακτήρας της και η εµπειρία που απαιτείται από τον εξεταστή περιορίζουν την ευρεία χρησιµοποίησή της στην πράξη (Slappendel και Ferrer 1998). Η ευαισθησία της µεθόδου αυτής κυµαίνεται από 30-93% για τα λεµφογάγγλια (Abranches και συν. 1991b, Ferrer 1997, Koutinas και συν. 1999, Ferrer 1999, Saridomichelakis και συν. 2000, Koutinas και συν. 2001) 50-88% για το µυελό των οστών (Ferrer 1997, Ferrer 1999, Saridomichelakis και συν. 2000, Koutinas και συν. 2001) και 0-4,2% για το περιφερικό αίµα (Abranches και συν. 1991b). Οι µεγάλες αυτές διαφορές προφανώς οφείλονται στην ποιότητα των επιχρισµάτων, την εµπειρία του εξεταστή και τον αριθµό των οπτικών πεδίων που εξετάστηκαν. Η ευαισθησία της 18

21 παρασιτολογικής µεθόδου είναι µεγαλύτερη στα συµπτωµατικά απ ό,τι στα ασυµπτωµατικά ζώα (Slappendel και Ferrer 1998). Ορολογικές Πρόκειται για τις απλούστερες και περισσότερο χρησιµοποιούµενες στην πράξη διαγνωστικές µεθόδους, µε τις οποίες ανιχνεύονται τα ειδικά κατά της L. infantum αντισώµατα, στον ορό του αίµατος (Gradoni 1999). Αν και στις µεθόδους αυτές περιλαµβάνονται ο έµµεσος ανοσοφθορισµός (IFA), η ανοσοενζυµική δοκιµή (ELISA), η άµεση συγκόλληση (DAT), η έµµεση αιµοσυγκόλληση (IHAT), και το ανοσοαποτύπωµα Western, στην κλινική πράξη ουσιαστικά χρησιµοποιούνται οι δύο πρώτες (Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας 2002). Στην IFA η ευαισθησία της κυµαίνεται από 64,3 ως 100% και η ειδικότητα από 93 ως 100% (Ashford και συν. 1993, Mancianti και συν. 1995, Mancianti και συν. 1996, Vercammen και συν. 1997, Saridomichelakis και συν. 2000, Koutinas και συν. 2001), ενώ οι αντίστοιχες τιµές για την ELISA είναι από 60,9 ως 100% και από 68 ως 100% (Ashford και συν. 1993, Ashford και συν. 1995, Mancianti και συν. 1995, Dietze και συν. 1995, Mancianti και συν. 1996, Vercammen και συν. 1997, Fisa και συν. 1997, Saridomichelakis και συν. 2000, Koutinas και συν. 2001). Οι µεγάλες αυτές αποκλίσεις αποδίδονται, τουλάχιστον ως προς ένα µέρος, στα διαφορετικά αντιγόνα και αντισώµατα που χρησιµοποιεί κάθε εργαστήριο και τη θέσπιση του κατώτερου θετικού τίτλου αντισωµάτων (Gradoni 1999). Σηµασία έχει επίσης η εποχή και η παρουσία ή όχι των συµπτωµάτων αφού είναι γνωστό ότι το ποσοστό των ορολογικά θετικών σκύλων φτάνει στο ζενίθ τον Μάρτιο και Απρίλιο (Dye και συν. 1993) και το θετικό αποτέλεσµα στα συµπτωµατικά ζώα είναι σαφώς υψηλότερο (Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας 2002). Με βάση το θετικό αποτέλεσµα µε 19

22 την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), η ευαισθησία της ELISA φτάνει το 10,7% και της IFA το14,3% (Saridomichelakis και συν. 2000). Τα τελευταία χρόνια έχουν κυκλοφορήσει στο εµπόριο διάφορες ταχείες και φθηνές διαγνωστικές µέθοδοι που χρησιµοποιούνται ευρέως από τους κτηνιάτρους, χωρίς όµως να υπάρχουν εµπεριστατωµένες και ανεξάρτητες µελέτες αναφορικά µε την ευαισθησία και την ειδικότητά τους. Τα αποτελέσµατα αυτά θα πρέπει ως εκ τούτου να αξιολογούνται µε βάση τις καθιερωµένες ορολογικές εξετάσεις που γίνονται σε αξιόπιστα εργαστήρια και οπωσδήποτε µε την παρασιτολογική εξέταση (Σαριδοµιχελάκης και Κουτίνας 2002). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Για την ανίχνευση της L. infantum µε τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιείται κυρίως αίµα, δέρµα, οπός λεµφογαγγλίου ή µυελός των οστών που φαίνεται ότι επηρεάζουν σηµαντικά την ευαισθησία της (Cavaliero και συν. 1999, Roura και συν. 1999a, Reithinger και συν. 2000, Lachaud και συν. 2001, Solano-Gallego και συν. 2001). Το ολικό αίµα έχει τη χαµηλότερη ευαισθησία λόγω της παρουσίας µικρού αριθµού παρασίτων (Reithinger και συν. 2000, Lachaud και συν. 2001), ενώ όταν χρησιµοποιείται µυελός των οστών ή οπός λεµφογαγγλίου αυτή κυµαίνεται από 98,7 ως 100% και 63,6 ως 100%, αντίστοιχα (Ashford και συν. 1995, Mathis και Deplazes 1995, Deplazes και συν. 1998, Roura και συν. 1999b, Koutinas και συν. 2001). Η ευαισθησία της PCR είναι ιδιαίτερα υψηλή στα ιστοτεµάχια από το δέρµα ή τον επιπεφυκότα (Berrahal και συν. 1996, Roura και συν. 1999a, Solano-Gallego και συν. 2001), αν και επηρεάζεται σε µεγάλο βαθµό από τη µεθοδολογία που ακολουθείται και ιδιαίτερα από τον τρόπο εξαγωγής του DNA και το είδος των αντιδραστηρίων 20

23 (Reithinger και συν. 2000, Lachaud και συν. 2001). Η ειδικότητα της µεθόδου θεωρητικά φτάνει το 100% αφού δεν έχουν διαπιστωθεί διασταυρούµενες αντιδράσεις, και µε την προϋπόθεση ότι το δείγµα δεν έχει επιµολυνθεί κατά τη λήψη ή την παραµονή στο εργαστήριο (Ashford και συν. 1995, Reale και συν. 1999, Roura και συν. 1999b). H PCR αποτελεί την πλέον αξιόπιστη µέθοδο όχι µόνο για τον εντοπισµό των ασυµπτωµατικών σκύλων, αλλά και την επιβεβαίωση της διάγνωσης της ΛΣ σε ζώα µε συµβατή κλινική εικόνα στα οποία το αποτέλεσµα µε άλλες διαγνωστικές µεθόδους ήταν αρνητικό (Saridomichelakis και συν. 2000, Solano-Gallego και συν. 2001). Άλλες διαγνωστικές µέθοδοι Η καλλιέργεια του παρασίτου σε ειδικά υποστρώµατα ύστερα από τη λήψη δείγµατος από το µυελό των οστών, τον οπό λεµφογαγγλίου, ή το σπληνικό πολφό ή βιοψιών από το δέρµα, έχει υψηλή ειδικότητα αλλά µειονεκτεί ως προς το κόστος, το χρονοβόρο της διαδικασίας, τις τεχνικές δυσκολίες και τις συχνές επιµολύνσεις από άλλους µικροοργανισµούς που ενδέχεται να δώσουν ψευδώς θετικό αποτέλεσµα (Ferrer 1997, Gradoni 1999). Ο ενοφθαλµισµός σε ποντίκια είναι επίσης χρονοβόρος, δαπανηρός και έχει µικρή ευαισθησία (Ashford και συν. 1995). Η ανίχνευση του παρασίτου µε την ιστοπαθολογική ή την ανοσοϊστοχηµική εξέταση σε βιοψίες από το δέρµα ή άλλους ιστούς δεν είναι ευκολότερη από την παρασιτολογική (Ferrer και συν. 1988b, Wunderlin και Pospischil 1992, Bourdoiseau και συν. 1998). Τέλος, η ενδοδερµική δοκιµή µε λεϊσµανίνη και ο in vitro πολλαπλασιασµός των λεµφοκυττάρων του περιφερικού αίµατος χρησιµοποιούνται για την εκτίµηση της κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης των µολυσµένων σκύλων στη 21

24 Leishmania sp. Αυτές συνήθως είναι θετικές στα ασυµπτωµατικά και αρνητικές στα συµπτωµατικά ζώα (Pinelli και συν. 1994, Cardoso και συν. 1998, Gradoni 1999). Η ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙ Α- ΙΑΜΕΣΗ ΝΕΦΡΙΤΙ Α ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ Αιτιοπαθογένεια Στη σπειραµατονεφρίτιδα η φλεγµονή επικεντρώνεται στα αγγειώδη σπειράµατα, χωρίς όµως να αποκλείεται µελλοντική της επέκταση στα ουροφόρα σωληνάρια και το διάµεσο ιστό (Jergens 1987, Wardle 1996). Σπειραµατονεφρίτιδα µπορεί να προκληθεί όταν σχηµατιστούν αντισώµατα κατά των αντιγόνων της βασικού πετάλου των τριχοειδών αγγείων του σπειράµατος (αντιµεµβρανώδης σπειραµατονεφρίτιδα), ή όταν εναποτεθούν ανοσοσύµπλοκα σ αυτό (σπειραµατονεφρίτιδα από ανοσοσύµπλοκα) (DiBartola και συν. 1980b, Lewis και Picut 1989, Brown 1995, Gershwin και συν. 1995, Grauer και DiBartola 2000, Tizard 2000). Και στις δύο περιπτώσεις η προκαλούµενη στη συνέχεια φλεγµονή οφείλεται σε αντίδραση υπερευαισθησίας τύπου ΙΙΙ, που τελικά οδηγεί σε διαταραχές της λειτουργίας του νεφρικού σωµατίου (Lewis και Picut 1989, Brown 1995, Gershwin και συν. 1995, Tizard 2000). Η αντιµεµβρανώδης σπειραµατονεφρίτιδα είναι πολύ σπάνια στο σκύλο σε αντίθεση µε τη σπειραµατονεφρίτιδα από ανοσοσύµπλοκα που διαπιστώνεται σε πληθώρα νοσηµάτων µεταξύ των οποίων και η Λ.Σ. (Πίνακας 3) (Murray και Wright 1974, Casey και Splitter 1975, Bown 1977, Slauson και Lewis 1979, DiBartola και συν. 1980b, Center και συν. 1987, Poli και συν. 1991, Codner και συν. 1992, Nieto και συν. 1992b, Vilafranca και συν. 1994, Koutinas και συν. 1995, Brown 1995, Grauer και DiBartola 2000). 22

25 Πίνακας 3: Τα συνηθέστερα λοιµώδη και κοινά νοσήµατα που µπορούν να προκαλέσουν σπειραµατονεφρίτιδα από ανοσοσύµπλοκα στο σκύλο (Grauer και DiBartola 2000). Λεϊσµανίωση Λοιµώδης ηπατίτιδα Βρουκέλλωση ιροφιλαρίωση Ερλιχίωση Πιροπλάσµωση Πυοµήτρα Ιδιοπαθής και αντιδραστική µη ελκώδης πολυαρθρίτιδα Χρόνια ηπατίτιδα Χρόνια φλεγµονώδης νόσος του εντέρου Αυτοάνοση αιµολυτική αναιµία Συστηµατικός ερυθηµατώδης λύκος Οξεία ή χρόνια παγκρεατίτιδα ιάφορα νεοπλάσµατα Κληρονοµικές και συγγενείς νεφροπάθειες Ιδιοπαθής µορφή Χρόνιες ή υποτροπιάζουσες βακτηριδιακές λοιµώξεις 23

26 Στη σπειραµατονεφρίτιδα από ανοσοσύµπλοκα τα ειδικά αντισώµατα που κυκλοφορούν στο αίµα, µετά την είσοδο τους στο αγγειώδες σπείραµα συνδέονται µε τα αντίστοιχα αντιγόνα για να σχηµατίσουν in situ ανοσοσύµπλοκα που συνήθως επικάθονται στον υποεπιθηλιακό χώρο, ενώ τα κυκλοφορούντα ανοσοσύµπλοκα στον υπενδοθηλιακό και το µεσαγγειακό χώρο (Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Grauer και DiBartola 2000, Tizard 2000). Τα κυκλοφορούντα ανοσοσύµπλοκα διατηρούνται όταν υπάρχει ισοδυναµία µεταξύ αντιγόνου-αντισώµατος ή ελαφρά υπεροχή του πρώτου (Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Grauer και DiBartola 2000). Όταν όµως υπερτερούν τα αντισώµατα τα µεγαλοµοριακά και αδιάλυτα ανοσοσύµπλοκα αποµακρύνονται γρήγορα από την κυκλοφορία του αίµατος αφού προηγουµένως φαγοκυτταροθούν από τα µονοπύρηνα κύτταρα (Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Wardle 1996, Grauer και DiBartola 2000). Επειδή το σηµείο εναπόθεσης των ανοσοσυµπλόκων βασικά εξαρτάται από το µέγεθος και το ηλεκτρικό φορτίο τους τα υπενδοθηλιακά προκαλούν εντονότερη φλεγµονή απ ό,τι τα υποεπιθηλιακά (Roberston 1984, Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Cotran και συν. 2002). Μετά την εναπόθεση των ανοσοσυµπλόκων στα τριχοειδή του αγγειώδους σπειράµατος η φλεγµονή που ακολουθεί οφείλεται στην ενεργοποίηση του συµπληρώµατος, την προσέλκυση ουδετερόφιλων, µακροφάγων και αιµοπεταλίων και την εναπόθεση ινικής µέσω της ενεργοποίησης του µηχανισµού πήξης του αίµατος (Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Grauer και DiBartola 2000). Η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος, και ιδιαίτερα του χηµειοτακτικού κλάσµατος C5a, προσελκύει ουδετερόφιλα και µακροφάγα κύτταρα που απελευθερώνουν λυσοσωµατικά ένζυµα, κυτταροκίνες, προσταγλανδίνες, αραχιδονικό 24

27 οξύ και µεταβολίτες του, ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, παράγοντες που ενεργοποιούν τα αιµοπετάλια και άλλες βιολογικά ενεργές ουσίες που µεταβάλλουν τη διαπερατότητά του τοιχώµατος των τριχοειδών αγγείων (Lewis και Picut 1989, Tizard 2000, Cotran και συν. 2002). Στο ίδιο αποτέλεσµα µπορούν να καταλήξουν τα κλάσµατα C5b-C9 του συµπληρώµατος ύστερα από την ενεργοποίηση των µεσαγγειακών κυττάρων και την παραγωγή πρωτεασών και ελεύθερων ριζών Ο 2 (Cotran και συν. 2002). Με την ενεργοποίηση των κλασµάτων C3a και C5a απελευθερώνεται ισταµίνη και σεροτονίνη από τα σιτευτικά κύτταρα και τα βασίφιλα λευκοκύτταρα, που αυξάνουν ακόµη περισσότερο τη διαπερατότητα των τριχοειδών του αγγειώδους σπειράµατος (Lewis και Picut 1989, Cotran και συν. 2002). Οι ουσίες που εκλύονται από τα φλεγµονικά κύτταρα προσελκύουν τα αιµοπετάλια και ενεργοποιούν τον µηχανισµό πήξης του αίµατος µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό των µικροθρόµβων και την εναπόθεση ινικής (Lewis και Picut 1989, Gershwin και συν. 1995, Cotran και συν. 2002). Οι εξεργασίες αυτές έχουν ως αποτέλεσµα την υπερπλασία των µεσαγγειακών κυττάρων, την πάχυνση του βασικού πετάλου και τη διαταραχή του ηλεκτρικού του φορτίου. Με τον τρόπο αυτό οι λευκωµατίνες περνούν στα ούρα στην ανάλυση των οποίων εµφανίζονται ως σπειραµατική πρωτεϊνουρία (Grauer και DiBartola 2000, Brown 1995,Brenner και συν. 1978, Jergens 1987, Center και συν. 1987) Τα τριχοειδή του αγγειώδους σπειράµατος συµπιέζονται από τα υπερπλαστικά κύτταρα του µεσαγγειακού χώρου µε αποτέλεσµα τη µείωση του ρυθµού σπειραµατικής διήθησης (ΡΣ ) (Jergens 1987, Lewis και Picut 1989). Στην παθογένεια της διαµεσοσωληναριακής νεφρίτιδας, που τις περισσότερες φορές συνοδεύει τη σπειραµατονεφρίτιδα, φαίνεται ότι υπεισέρχονται η ισχαιµία στο αγγειώδες σπείραµα, τα ειδικά αντισώµατα, τα λυσοσωµατικά ένζυµα, οι ελεύθερες 25

28 ρίζες Ο 2, και η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος (Eddy 1994, Morita και συν. 1997, Grauer και DiBartola 2000, Cotran και συν. 2002). Τελευταία διαπιστώθηκε ότι η ίδια η πρωτεϊνουρία µπορεί να προκαλέσει άµεσα αλλοιώσεις στα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων ενεργοποιώντας την απελευθέρωση διαφόρων βιολογικά ενεργών ουσιών (Remuzzi και συν. 1997a, Grauer και DiBartola 2000, Cotran και συν. 2002). Ανεξάρτητα από το αν οι αλλοιώσεις αφορούν στο αγγειώδες σπείραµα ή το αντίστοιχο ουροφόρο σωληνάριο, το τελικό αποτέλεσµα είναι η καταστροφή ολόκληρου του νεφρώνα (Brown 1995, Grauer και DiBartola 2000). Επειδή στους νεφρώνες που εξακολουθούν να λειτουργούν αυξάνει αντισταθµιστικά ο ΡΣ η πρωτεϊνουρία συνήθως επιδεινώνεται και τελικά προκαλείται σπειραµατοσκλήρυνση (Brown 1995, Remuzzi και συν. 1997a, Grauer και DiBartola 2000, Cotran και συν. 2002). Η ταξινόµηση των σπειραµατονεφρίτιδων του σκύλου βασίζεται στα κριτήρια που έχουν θεσπιστεί για τον άνθρωπο (Vilafranca και συν. 1994, Brown 1995, Grauer και DiBartola 2000, Trautwein και Hewicker-Trautwein 2000). Σ αυτά περιλαµβάνονται η πάχυνση του βασικού πετάλου των τριχοειδών αγγείων του σπειράµατος, η υπερπλασία των κυττάρων του µεσαγγειακού χώρου και η ανάπτυξη συνδετικού ιστού. Η σπειραµατονεφρίτιδα χαρακτηρίζεται µεµβρανώδης, µεσαγγειοϋπερπλαστική, µεµβρανοϋπερπλαστική ή σπειραµατοπάθεια των ελάχιστων αλλοιώσεων (minimal change glomerulopathy) (Jergens 1987, Brown 1995, Jones και συν. 1997, Grauer και DiBartola 2000, Trautwein και Hewicker-Trautwein 2000). Εφόσον οι αλλοιώσεις αφορούν στο 80% και πάνω του συνόλου των αγγειωδών σπειραµάτων αυτή θεωρείται γενικευµένη ενώ σε διαφορετική περίπτωση εστιακή. Στην περίπτωση που οι αλλοιώσεις καταλαµβάνουν ολόκληρο το αγγειώδες σπείραµα 26

29 ονοµάζεται διάχυτη ενώ όταν περιορίζονται σε ένα µόνο µέρος τµηµατική (Vilafranca και συν. 1994, Schwartz 1998b). Η µεµβρανώδης σπειραµατονεφρίτιδα χαρακτηρίζεται από διάχυτη, οµοιογενή ή ανοµοιογενή πάχυνση του βασικού πετάλου των τριχοειδών αγγείων του αγγειώδους σπειράµατος, που είναι ιδιαίτερα εµφανής όταν οι τοµές βάφονται µε Periodic Acid- Schiff (PAS). Στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο επιπλέον φαίνεται η ατροφία και η παραµόρφωση των ποδίσκων των ποδοκυττάρων και η υποεπιθηλιακή εναπόθεση των ανοσοσυµπλόκων και στον άµεσο ανοσοφθορισµό η κοκκώδης όψη του βασικού πετάλου (Brown 1995, Jones και συν. 1997, Schwartz 1998a). Στην µεσαγγειοϋπερπλαστική σπειραµατονεφρίτιδα παρατηρείται αύξηση της µεσαγγειακής ουσίας και του αριθµού των µεσαγγειακών, των επιθηλιακών και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο τα ανοσοσύµπλοκα παρατηρούνται στο µεσαγγειακό χώρο και ιδιαίτερα στην επιθηλιακή πλευρά του βασικού πετάλου των τριχοειδών αγγείων. Επιπλέον, η υπερπλασία των επιθηλιακών κυττάρων του εξωτερικού τοιχώµατος του ελύτρου του Bowman ενδέχεται να προκαλέσει την εµφάνιση ηµισελινοειδών σχηµατισµών (Lewis και Picut 1989, Jones και συν. 1997, Silva 1998b, Trautwein και Hewicker-Trautwein 2000, Cotran και συν. 2002). Στη µεµβρανοϋπερπλαστική σπειραµατονεφρίτιδα, που ουσιαστικά αποτελεί συνδυασµό των αλλοιώσεων των προηγούµενων τύπων, η υπερπλασία των κυττάρων του µεσαγγειακού χώρου συνοδεύεται από πάχυνση του βασικού πετάλου των τριχοειδών αγγείων, που συχνά παίρνει τη µορφή των γραµµών τραίνου (Lewis και Picut 1989, Jones και συν. 1997, Silva 1998a, Trautwein και Hewicker-Trautwein 2000). Με το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο οι κοκκώδεις εναποθέσεις των 27

30 ανοσοσυµπλόκων εντοπίζονται υπενδοθηλιακά ή µέσα στο ίδιο το βασικό πέταλο των τριχοειδών αγγείων (Lewis και Picut 1989, Jones και συν. 1997, Trautwein και Hewicker-Trautwein 2000). Στη σπειραµατοπάθεια των ελάχιστων αλλοιώσεων η υπερπλασία της µεσαγγειακής ουσίας και των κυττάρων του οµώνυµου χώρου είναι µικρού βαθµού, χωρίς να συνοδεύεται από άλλου είδους αλλοιώσεις. Στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο παρατηρείται έντονη ατροφία ή απουσία των ποδίσκων των ποδοκυττάρων στο έλυτρο του Bowman (Brown 1995, Olson και Schwartz 1998, Trautwein και Hewicker- Trautwein 2000). Στη σπειραµατοσκλήρυνση, στην οποία καταλήγουν όλοι οι τύποι της σπειραµατονεφρίτιδας, διαπιστώνονται απώλεια της αρχιτεκτονικής δοµής του αγγειώδους σπειράµατος, έντονη πάχυνση του ελύτρου του Bowman µε παρουσία ηµισεληνοειδών σχηµατισµών και συµφύσεις µε το αγγειώδες σπείραµα που τελικά µετατρέπεται σε άµορφη µάζα (Lewis και Picut 1989, Vilafranca και συν. 1994, Jones και συν. 1997). Τις περισσότερες φορές οι αλλοιώσεις αυτές συνοδεύονται από έντονου βαθµού διαµεσοσωληναριακή νεφρίτιδα στην οποία, εκτός από την ανάπτυξη του συνδετικού ιστού, παρατηρείται ατροφία των ουροφόρων σωληναρίων (Vilafranca και συν. 1994, Jones και συν. 1997). Στην εξέταση µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο οι ποδίσκοι των ποδοκυττάρων του ελύτρου του Bowman συνήθως δεν διακρίνονται, τα τριχοειδή αγγεία αντικαθίστανται από κολλαγόνες ίνες και τα ανοσοσύµπλοκα εναποτίθενται στο βασικό πέταλο και το µεσαγγειακό χώρο (Lewis και Picut 1989). 28

31 Κλινική εικόνα Στη σπειραµατονεφρίτιδα η πρωτεϊνουρία τις περισσότερες φορές δε συνοδεύεται από συµπτώµατα και συνήθως είναι τυχαίο εύρηµα στην ανάλυση των ούρων. Η ένταση της πρωτεϊνουρίας εξαρτάται από τη διαπερατότητα των αγγειωδών σπειραµάτων, το ΡΣ, τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο πλάσµα του αίµατος και την περιεκτικότητα της τροφής σε πρωτεΐνες (Brown 1995). Η πρωτεϊνουρία συνήθως συνοδεύεται από υπολευκωµατιναιµία, η οποία όταν είναι έντονου βαθµού (λευκωµατίνες ορού αίµατος: 1,2 g/dl) µπορεί να οδηγήσει στην εµφάνιση νεφρωσικού συνδρόµου που κλινικά εκδηλώνεται µε υποδόρια οιδήµατα ή/και ασκίτη, ενώ η συνυπάρχουσα υπερχολοστερολαιµία αντισταθµίζει την πτώση της κολλοειδοσµωτικής πίεσης στο πλάσµα του αίµατος (Lewis και Picut 1989, Brown 1995, Grauer και DiBartola 2000). Τα συµπτώµατα επιδεινώνονται από την κατακράτηση νερού και νατρίου που θα προκληθεί αντισταθµιστικά λόγω της µείωσης του ΚΛΟΑ (Lewis και Picut 1989). Η παραγωγή της χοληστερόλης αυξάνει στο ήπαρ ταυτόχρονα µε τη µείωση του καταβολισµού της που συνδυάζεται µε την απώλεια µιας ρυθµιστικής πρωτεΐνης µε τα ούρα (Lewis και Picut 1989, Brown 1995). Σε ζώα µε νεφρωσικό σύνδροµο ενδέχεται να εµφανιστεί αιφνίδια δύσπνοια ή χωλότητα λόγω θροµβοεµβολής των κλάδων της πνευµονικής αρτηρίας ή των αρτηριών των άκρων, αντίστοιχα, επειδή µε τα ούρα, εκτός από τις λευκωµατίνες, αποβάλλεται σε µεγάλες ποσότητες και η αντιθροµβίνη ΙΙΙ (Lewis και Picut 1989, Brown 1995). Στη χρόνια σπειραµατονεφρίτιδα µπορεί επίσης να προκληθεί αρτηριακή υπέρταση που συνήθως εκδηλώνεται µε απότοµη τύφλωση ή επίσταξη. (Brown 1995, Ross 1995, Grauer και DiBartola 2000). Στο µηχανισµό πρόκλησης της αρτηριακής 29

32 υπέρτασης, που δεν έχει διευκρινιστεί απόλυτα, φαίνεται ότι υπεισέρχονται πολλοί παράγοντες (Ross 1995). Στη σπειραµατονεφρίτιδα, η καταστροφή των νεφρώνων σε ποσοστό πάνω από 75% µειώνει σε τέτοιο βαθµό το ΡΣ ώστε προοδευτικά να προκαλείται 1 ου, 2 ου και 3 ου σταδίου χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Σε ζώα που εµφανίζουν ταυτόχρονα νεφρική ανεπάρκεια και νεφρωσικό σύνδροµο η πρόγνωση είναι σαφώς δυσµενέστερη (Brown 1995, Grauer και DiBartola 2000). ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙ ΑΣ Εκτίµηση του βαθµού της σπειραµατικής πρωτεϊνουρίας Οι πρωτεΐνες στα ούρα των φυσιολογικών σκύλων δεν ανιχνεύονται µε τις συνήθεις µεθόδους (χρωµατοµετρικές ταινίες, θολωσιµετρική µέθοδος Ηeller). Αυτές αποτελούνται από τις µικρού µοριακού βάρους λευκωµατίνες του πλάσµατος (40-60%), τη βλεννοπρωτεΐνη Tamm-Horsfall που εκκρίνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων και τις ανοσοσφαιρίνες που εκκρίνονται από το βλεννογόνο της ουροφόρου οδού (Barsanti και Finco 1979, Biewenga 1982, Lulich και Osborne 1990, Finco 1995c). Η πρωτεϊνουρία, που διαπιστώνεται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις διακρίνεται σε προσπειραµατική, σπειραµατική και µετασπειραµατική (Lulich και Osborne 1990, Hurley και Vaden 1995). Η σπειραµατική, που είναι συνηθέστερη και εντονότερη στο σκύλο, οφείλεται στις αλλοιώσεις του αγγειώδους σπειράµατος (σπειραµατονεφρίτιδα, σπειραµατοπάθεια, αµυλοείδωση) που επιτρέπουν την δίοδο µεγαλοµοριακών πρωτεϊνών στο πρόουρο (DiBartola και συν. 1980a, Lulich και Osborne 1990, Hurley και Vaden 1995, Finco 1995c). 30

33 Η ποσοτική εκτίµηση της πρωτεϊνουρίας στο σκύλο γίνεται µε τον προσδιορισµό του λόγου πρωτεϊνών/κρεατινίνης (Upr/cr) σε τυχαίο δείγµα ούρων ή τη µέτρηση των πρωτεϊνών στα ούρα του 24ώρου (Hurley και Vaden 1995, Finco 1995c). Η πρώτη µέθοδος, που είναι ευαίσθητη, γρήγορη και αξιόπιστη, βασίζεται στο συσχετισµό της ποσότητας των πρωτεϊνών και της κρεατινίνης των ούρων που επηρεάζονται στον ίδιο βαθµό από το ΡΣ και τη σωληναριακή επαναρρόφηση, µε την προϋπόθεση ότι η απεκκριτική λειτουργία του νεφρού παραµένει σταθερή (White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985, Lulich και Osborne 1990). Ο λόγος Upr/cr δεν επηρεάζεται από τον όγκο, το ειδικό βάρος και το ph των ούρων, την ώρα της ηµέρας που συλλέχθηκε το δείγµα, τη διάρκεια της νηστείας που προηγήθηκε, το είδος του σιτηρεσίου και το φύλο του ζώου, εφόσον το δείγµα λαµβάνεται µε κυστοκέντηση (White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985, McCaw και συν. 1985, Jergens και συν. 1987, Lulich και Osborne 1990). Με τον τρόπο αυτό µπορούν να υπολογιστούν οι απώλειες των πρωτεϊνών µε τα ούρα κατά τη διάρκεια του 24ώρου, µε βάση συγκεκριµένους υπολογισµούς, που εξαρτώνται από την µέθοδο µέτρησής τους (White και συν. 1984, Grauer και συν. 1985, Lulich και Osborne 1990). Η εκτίµηση του βαθµού πρωτεϊνουρίας θεωρείται αξιόπιστη στους κλινικά υγιείς και τους σκύλους µε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (Lulich και Osborne 1990), αλλά όχι στην οξεία νεφρική ανεπάρκεια όταν οι απότοµες µεταβολές του ΡΣ φαίνεται να επηρεάζουν τον λόγο Upr/cr (Lulich και Osborne 1990). Για το σκύλο όταν η τιµή του τελευταίου είναι κάτω από 0,5 θεωρείται φυσιολογική, όταν βρίσκεται µεταξύ 0,5 και 1 χρειάζεται να γίνει επανεξέταση ύστερα από µερικές εβδοµάδες και όταν είναι πάνω από 1 παθολογική (White και συν. 1984, Grauer και συν. 1985, Lulich και Osborne 1990). Όταν αναληφθεί θεραπευτική προσπάθεια ο λόγος µπορεί να χρησιµοποιηθεί και 31

34 για τον έλεγχο της ανταπόκρισης στο συγκεκριµένο φάρµακο (Lulich και Osborne 1990). Η µείωση όµως της τιµής του δεν σηµαίνει αυτόµατα και τη βελτίωση της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού, ιδιαίτερα όταν συνοδεύεται από υπερκρεατινιναιµία (Jaenke και Allen 1986, Lulich και Osborne 1990). Η µέτρηση των πρωτεϊνών σε ούρα του 24ώρου είναι ίσως η καλύτερη µέθοδος εκτίµησης της πρωτεϊνουρίας (Adams και συν. 1992, Finco 1995c), αν και απαιτεί τη συλλογή όλων των ούρων του 24ώρου µε την τοποθέτηση του ζώου σε µεταβολικό κλωβό ή µε πολλαπλούς καθετηριασµούς της ουροδόχου κύστης (Grauer και συν. 1985, Finco 1995c). Οι παραπάνω προϋποθέσεις κάνουν τη µέθοδο αυτή δαπανηρή, χρονοβόρα και κοπιώδη, ενώ παράλληλα αυξάνουν τον κίνδυνο πρόκλησης ουρολοιµώξεων (Grauer και συν. 1985, Finco 1995c). Παρά την ύπαρξη διαφωνιών µεταξύ των ερευνητών και της διαφορετικής µεθοδολογίας που κατά καιρούς έχει χρησιµοποιηθεί, γενική πεποίθηση είναι ότι η 24ωρη απώλεια πρωτεϊνών µε τα ούρα σε κλινικά υγιείς σκύλους δεν πρέπει να ξεπερνά τα 20 mg/kg ΣΒ (Barsanti και Finco 1979, Biewenga 1982, White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985, McCaw και συν. 1985, Lulich και Osborne 1990). Ρυθµός σπειραµατικής διήθησης Ο ΡΣ είναι ίσως ο καλύτερος τρόπος εκτίµησης της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού, αν και οι διάφορες µέθοδοι προσδιορισµού του είναι χρονοβόρες, δαπανηρές και µε αρκετές τεχνικές δυσκολίες που περιορίζουν σηµαντικά τη χρησιµοποίησή του στην κλινική πράξη (Finco 1995b, DiBartola 2000). Ο ΡΣ µπορεί να εκτιµηθεί έµµεσα µε τη µέτρηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης και του BUN στον ορό του αίµατος επειδή αποµακρύνονται µε τα ούρα 32

35 ύστερα από τη διήθηση του αίµατος στα αγγειώδη σπειράµατα του νεφρού (Bovee και Joyce 1979, Finco 1995b, DiBartola 2000). Συνεπώς, η συγκέντρωσή τους στο αίµα αυξάνει όταν καταστραφεί πάνω από το 75% των νεφρώνων (Finco 1971, Bovee και Joyce 1979, Finco και συν. 1981, Finco 1995b) και οπωσδήποτε, επηρεάζονται από παράγοντες που δεν έχουν σχέση µε το ΡΣ (Bush 1993, Finco 1995b, DiBartola 2000). Για να ξεπεραστεί το πρόβληµα αυτό επινοήθηκαν µέθοδοι που στηρίζονται στην κάθαρση διαφόρων ουσιών από τους νεφρούς (Finco 1995b, Verlander 1997, DiBartola 2000). Η κάθαρση αντιπροσωπεύει τον όγκο του πλάσµατος του αίµατος από τον οποίο οι νεφροί θα αποµακρύνουν πλήρως τη συγκεκριµένη ουσία στη µονάδα του χρόνου (Finco 1995a, DiBartola 2000). Για τον προσδιορισµό του ΡΣ (σε ml πλάσµατος /min) πρέπει να είναι γνωστή η συγκέντρωση της ουσίας-δείκτη στο πλάσµα του αίµατος (PC: mg/ml), στα ούρα (UC: mg/ml) καθώς και ο όγκος των ούρων που παράγονται στη µονάδα του χρόνου (UV: ml/min). Με βάση τα αποτελέσµατα ο ΡΣ υπολογίζεται από τον τύπο: ΡΣ = UV x UC/PC (Finco 1995b, Verlander 1997, DiBartola 2000). Οι ουσίες-δείκτες πρέπει να διηθούνται από τα νεφρικά σωµάτια, να µην επαναρροφούνται και να µην εκκρίνονται από τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων, να µην επηρεάζουν την ταχύτητα διήθησης, να µη µεταβολίζονται και να µη συγκεντρώνονται στους νεφρούς, να µη δεσµεύονται από πρωτεΐνες του πλάσµατος και να µην είναι τοξικές (Finco 1995a, Verlander 1997). Όλες τις παραπάνω προϋποθέσεις φαίνεται ότι εκπληρώνει η ινουλίνη (Finco και συν. 1991, Finco και συν. 1993, Gleadhill και συν. 1995, DiBartola 2000) παρά τις τεχνικές δυσκολίες αναφορικά µε τη µέτρηση της (Finco και συν. 1993, Gleadhill και συν. 1995). Καλή εναλλακτική λύση είναι η ενδογενής κρεατινίνη επειδή η συγκέντρωσή της στον ορό του αίµατος παραµένει σχετικά σταθερή κατά τη διάρκεια του 24ώρου (Bovee και Joyce 1979, 33