ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΥΠΕΡΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΟΜΩΝ ΚΑΨΙΔΙΑ ΙΩΝ ΚΑΙ ΦΑΓΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΜΑΣΤΗΓΙΝΕΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ-ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗ

Transcript

1 ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΥΠΕΡΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΟΜΩΝ ΚΑΨΙΔΙΑ ΙΩΝ ΚΑΙ ΦΑΓΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΕΣ ΜΑΣΤΗΓΙΝΕΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ-ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗ

2 Αυτοσυγκρότηση υπερμοριακων δομών Υπενθύμιση: κολλαγονο

3 ΚΑΨΙΔΙΑ (ΚΕΛΥΦΗ) ΙΩΝ ΚΑΙ ΦΑΓΩΝ Αποτελούνται από πολλά αντίγραφα ενός είδους υπομονάδας Τα οποία περικλείουν και προστατεύουν το νουκλεινικό οξύ, που είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας Δύο είδη καψιδίων: 1) ραβδόμορφα (ινώδη) 2) σχεδόν σφαιρικά

4 Αυτοσυγκροτηση υπερμοριακων δομων: Ινώδεις ιοι Ιός της μωσαϊκής του καπνού Πρωτεϊνικό κάλυμμα: αποτελείται από 2130 πανομοιότυπες πρωτεϊνικές υπομοναδες 158 αα η κάθε μια (μπλε) Γύρω από ένα μονόκλωνο μόριο RNA πού περιέχει 630 νουκλεοτίδια (κόκκινο) Μήκος=300, εξωτερική διάμετρος 18, εσωτερική 4 nm

5 Ποιος είναι ο μηχανισμός συγκρότησης του ιου της μωσαϊκής του καπνού? Σημαντικό δεδομένο: ο TMV μπορεί να διασταθεί στα συστατικά του (πρωτεΐνες και RNA) με τις κατάλληλες χημικές συνθήκες, π.χ. οξικό οξύ υψηλής συγκέντρωσης Το 1955 αποδείχθηκε ότι οι υπομονάδες του περιβλήματος και το RNA Μπορούν να επανασυνδυαστούν αυθόρμητα κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες σε ιικά σωμάτια που δεν διαφέρουν από τον αρχικό ιό ούτε σε δομή, ούτε σε μολυσματικότητα Τιμαςλέειαυτότοπείραμα?

6 Η συγκρότηση αυτή του ιου της μωσαϊκης του καπνου είναι Το πρώτο γνωστό παράδειγμα αυτό-συγκροτησης Μιας ενεργού υπερμοριακής βιολογικής δομής Ποιος όμως είναι ο μηχανισμός αυτό-συγκρότησης του ιου της μωσαϊκής του καπνού?

7 Μηχανισμός αυτό-συγκροτησης του ιου της μωσαϊκής του καπνού: Αρχίζει με την δημιουργία δομικής υπομοναδας (πρωτεϊνικού δισκου 17 μονομερών - Δίσκος δύο στρωμάτων, 34 υπομονάδες που έχουν δυνατότητα περιστροφής μεταξύ τους και να σχηματίζουν μία έλικα δυο στροφών πού λέγεται ροδέλα ασφαλείας)

8 Μηχανισμός αυτοσυγκροτησης του ιου της μωσαϊκής του καπνού: Δέσμευση μιας θηλιάς RNA στον πρώτο «πυρήνα» δυο δίσκων σχηματισμός «ροδέλας ασφαλείας» + --->

9 Μηχανισμός αυτοσυγκροτησης του ιου της μωσαϊκης του καπνου: Δέσμευση μιας θηλιάς RNA στον πρώτο «πυρήνα» δυο δίσκων σχηματισμός «ροδέλας ασφαλείας» περαιτέρω προσθήκη πρωτείνικών δίσκων (μια από τις δυο άκρες του RNA τραβιέται συνεχώς μέσω της κεντρικής οπής ώστε νa αντιδρά με τους νέους δίσκους που προστίθενται)

10 Μηχανισμός αυτοσυγκροτησης του ιου της μωσαϊκής του καπνού: Δέσμευση μιας θηλιάς RNA στον πρώτο «πυρήνα» δυο δίσκων σχηματισμός «ροδέλας ασφαλείας» περαιτέρω προσθήκη πρωτείνικών δίσκων (μια από τις δυο άκρες του RNA τραβιέται συνεχώς μέσω της κεντρικής οπής ώστε αν αντιδρά με τους νέους δισκους που προστίθενται)

11 Αυτοσυγκροτηση υπερμοριακων δομων: Εικοσαεδρικοιιοικαιφαγοι Τα εικοσαεδρικα καψιδια αποτελούνται από εκατοντάδες όμοιες υπομοναδες πρωτεΐνης

12 Αυτοσυγκροτηση υπερμοριακων δομων: Εικοσαεδρικοιιοικαιφαγοι Η ανάγκη διευθέτησης σε ένα σφαιρικό σχήμα πολλών πανομοιότυπων υπομονάδων που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (με τον πιο αποτελεσματικό τρόπο) Οδηγεί στην υιοθέτηση καψιδίων με εικοσαεδρική συμμετρία Άξονες συμμετρίας τάξεςως 2, 3, και 5 Στο εικοσάεδρο και το δωδεκάεδρο (και τα δύο είναι Πλατωνικά στερεά Με εικοσαεδρική συμμετρία)

13 Ιδιότητες συμμετρίας του εικοσαεδρου

14 Ένα ασύμμετρο αντικείμενο (όπως είναι οι πρωτεϊνικές υπομονάδες) που τοποθετείται σε ένα εικοσάεδρο Επαναλαμβάνεται τουλάχιστον 3χ20 = 60 φορές (τρία τουλάχιστον αντικείμενα / τριγωνική έδρα) Αρα, το κέλυφος του απλούστερου ιού αποτελείται από 60 υπομονάδες

15 Πρωτεϊνες «σκαλωσιας» είναι πολλες φορες αναγκαιες για τον Σωστο σχηματισμο των καψιδιων. Εν τη απουσια τους, οι υπομοναδες της πρωτεϊνης του καψιδιου Σχηματιζουν σπειροειδη συσσωματωματα

16 Αυτοσυγκροτηση του βακτηριοφαγου Τ4 Περίπου 40 πρωτεΐνες συμμετέχουν στην συγκρότηση της δομής

17 Αυτοσυγκροτηση του βακτηριοφαγου Τ4

18 Πολλαπλασιασμός του φαγου μέσα στα κύτταρα-λυτικος κύκλος

19 Αυτοσυγκροτηση υπερμοριακων δομων: Βακτηριακα μαστίγια

20 Αυτοσυγκροτηση υπερμορικων δομων: Βακτηριακα μαστιγια Νημάτιο: υπερμοριακή συγκρότηση υπομονάδων μιας μόνο πρωτεΐνης, της μαστιγίνης (40-60 kda)

21 Νημάτιο: υπερμοριακή συγκρότηση υπομονάδων μιας μονο πρωτεϊνης, της μαστιγίνης (40-60 kda) Μετά από θέρμανση, το νημάτιο αποδιοργανώνεται σε μόρια μαστιγίνης Τα μόρια μαστιγίνης δεν μπορούν να επανασυγκροτηθουν σε νημάτια, παρα μονον εάν στο διάλυμα προστεθούν προ-σχηματισμένα νημάτια η θραύσματα νηματίων Ο πολυμερισμός γίνεται στην άκρη του μαστιγιακου θραύσματος, που δρα ως εναρκτης κατευθυνόμενη αυτοσυγκροτηση

22 FliD (Hook associated protein 2) 49 kda Πρωτεΐνη που κατευθύνει τον πολυμερισμό της μαστιγίνης Η πληροφορία της συγκρότησης είναι αποθηκεμένη στην Τρισδιάστατη δομή του εναρκτη

23 Αυτοσυγκρότηση υπερμοριακων δομών: πρωτεϊνικοί «κλωβοί» : ΦΕΡΡΙΤΙΝΗ 24 υπομοναδες αυτο-οργανώνονται σε καψίδιο με εσωτερική κοιλότητα διαμέτρου 6 nm Χρησιμεύει για την αποθήκευση σιδήρου στον οργανισμό υπό μορφή οξειδίου υπομονάδα

24 ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ ΕΝΝΟΙΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ

25 ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ ΕΝΝΟΙΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ

26 ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ ΕΝΝΟΙΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ

27 ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ ΕΝΝΟΙΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ ΟΙ ΚΙΝΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΊΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ ΟΙ ΕΥΠΛΑΣΤΕΣ ΣΦΑΙΡΕΣ ΕΊΝΑΙ ΕΝΔΙΑΜΕΣΑ ΤΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗΣ

28 Γενικευμένο σχήμα «κινητικου ανταγωνισμου» Ανάμεσα στην σωστή πορεία αναδίπλωσης και αυτοσυγκροτησης της πρωτεΐνης και στην πορεία σχηματισμού συσσωματωμάτων Η έκβαση εξαρτάται και από την αμινοξικη ακολουθία, αλλά και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες (θερμοκρασία, ph, παρουσία μοριακών συνοδών κλπ) επίσης η έκβαση επηρεάζεται από μεταλλάξεις Και από την αποκοπή τμημάτων της πρωτεΐνης

29 Παράδειγμα φυσιολογικής αναδίπλωσης/συσσωμάτωσης: Κρύσταλλοι πρωτεϊνών Σχηματισμός κρυστάλλων με την μέθοδο της «κρεμαστής σταγόνας» Μια σταγόνα πρωτεϊνικού διαλύματος φέρεται σταδιακά σε κατάσταση υπερκορεσμού μέσω απώλειας νερού από την σταγόνα προς μια μεγαλύτερη δεξαμενή διαλύματος κατακρημνιστή

30 Κρύσταλλοι πρωτεϊνών Διαμόρφωση πρωτεΐνης στον κρύσταλλο: εγγενής Πακετάρισμα μορίων πρωτεΐνης (έγχρωμοι δίσκοι) στον πρωτεϊνικό κρύσταλλο: Τα μόρια της πρωτεΐνης έρχονται σε επαφή μεταξύ τους μόνο σε μερικές περιοχές Οι κρύσταλλοι περιέχουν μεγάλο ποσοστό διαλύτη οι δομές των πρωτεϊνών Μέσα στον κρύσταλλο είναι παρόμοιες με τις δομές τους στο διάλυμα Αναστρέψιμη διαδικασία? Ναι, με προσθήκη διαλύτη

31 Παραδείγματα ΜΗ φυσιολογικής αναδίπλωσης / συσσωμάτωσης - Συσσωματώματα αλβουμινης αυγού μετά από θέρμανση - Ζελατίνη - Σωμάτια εγκλεισμού - Συσσωματώματα πρωτεϊνών που σχετίζονται με μοριακές ασθένειες

32 Συσσωματώματα αλβουμινης αυγού μετά από θέρμανση Διαμόρφωση της πρωτεΐνης στο συσσωμάτωμα: μετουσιωμένη, μερικά δομημένη Εγγενής δομή πρωτεΐνης μετουσιωμένη, συσσωμάτωμα μερικά δομημένη πρωτεΐνη

33 Συσσωματώματα αλβουμινης αυγού μετά από θέρμανση Αναστρέψιμη διαδικασία? Οχι Είναι δυνατόν να ξαναπάρουμε εγγενή αλβουμινη από το βρασμένο αυγό, Και με ποια διαδικασία?

34 Απάντηση: με πλήρη αποδιαταξη, Χρησιμοποιώντας έναν ισχυρό μετουσιωτικο παράγοντα (π.χ. υδροχλωρική γουανιδινη) και αναδιάταξη μετά από απομάκρυνση του μετουσιωτικου παράγοντα GdnHCl διαλυση

35 Ζελατίνη Διαμόρφωση κολλαγόνου στην ζελατίνη: μερικά δομημένες τριπλές έλικες κολλαγόνου που σχηματίζουν πλέγμα

36 Είναι δυνατόν να ξαναπάρουμε Μόρια ωρίμου κολλαγόνου μετα Από διαδικασίες ολικής μετουσιωσης In vitro? Απάντηση: όχι, Γιατί η απαραίτητη πληροφορία για Σωστή ευθυγράμμιση (δηλ. τα προπεπτιδια) Δεν είναι πλέον παρούσα στα μόρια Του ωρίμου κολλαγόνου

37 «Σωμάτια εγκλεισμού» (inclusion bodies) που σχηματίζονται κατά την παραγωγή πρωτεϊνών Με τεχνικές ανασυνδυασμενου DNA Διαμόρφωση της πρωτεΐνης: μερικά δομημένες, ενδιάμεσες μορφές αναδίπλωσης Αναστρέψιμη διαδικασία? όχι Είναι δυνατόν να ξαναπάρουμε εγγενή πρωτεΐνη από σωμάτια εγκλεισμού, Και με ποια διαδικασία?

38 Απάντηση : ναι, μετά από λύση των κυττάρων, ολική μετουσίωση Με ισχυρούς μετουσιωτικους παράγοντες και αναδιάταξη, με την προϋπόθεση να βρεθούν οι κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες Άρα, ο σχηματισμός σωματίων εγκλεισμού είναι πρόβλημα αναδίπλωσης, και όχι πρόβλημα ομοιοπολικής καταστροφής της πρωτεΐνης Σημασία για τη βιομηχανική παραγωγή των πρωτεϊνών: πάρα πολλές πρωτεΐνες βιομηχανικής και φαρμακευτικής σημασίας (πχ ινσουλίνη) παράγονται πλέον αποκλειστικά με τεχνικές ανασυνδυασμενου DNA μέσα σε βακτηρίδια. Πολλές φορές παράγονται υπό μορφή σωματίων εγκλεισμού, και Η τεχνογνωσία αναδιάταξης είναι απαραίτητη για τη παραγωγή του τελικού προϊόντος σε εγγενή μορφή

39 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΜΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΔΙΠΛΩΣΗ/ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Συσσωματώματα κρυσταλλινης στον καταρράκτη αμυλοειδη ινιδια Δρεπανοκυτταρική αναιμία

40 Συσσωματώματα κρυσταλλινης στον καταρράκτη Διαμόρφωση της πρωτεΐνης: μετουσιωμένη Αναστρέψιμη διαδικασία? όχι Μόνη θεραπευτική οδος: παρεμπόδιση της διαδικασιας Μετουσιωσης η/και πολυμερισμου

41 Τα αμυλοειδη ινιδια: προέρχονται από συσσωμάτωση ενδιάμεσων Δομών των πρωτεϊνών μη φυσιολογική αναδίπλωση Παράδειγμα: αμυλοειδη ινίδια από την τρανσθυρετίνη Με σημειακή μετάλλαξη Val ->Met

42 Τα ινίδια αυτού του τύπου λέγονται αμυλοειδή διότι είναι η χαρακτηριστική «δομική υπογραφή» των ασθενειών αμυλοειδωσης (παραδειγματα) Ασθενεια Πρωτεϊνη Alzheimer s β-amyloid,ταυ Αμυλοϊδωση λυσοζυμης λυσοζυμη Μεταδοτικές σπογγωδεις εγκεφαλοπαθειες Κuru prion protein Creutzfeld-Jacob «Scrapie (προβατα) «BSE (βοοειδη) «

43 Το β-αμυλοειδές πεπτίδιο ή Αβ, ένα πεπτίδιο από αμινοξέα είναι το κύριο συστατικό των αμυλοειδών πλακών στους εγκεφάλους των ασθενών με Alzheimer. Το Αβ, δημιουργείται ύστερα από διαδοχικό κόψιμο της αμυλοειδούς πρόδρομης πρωτεΐνης (ΑΡΡ), μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη μη-καθορισμένης λειτουργίας. Τα μόρια των πεπτιδίων που αποκόπτονται συσσωματώνονται μεταξύ τους και σχηματίζουν τα αμυλοεϊδή ινίδια, που με την σειρά τους δημιουργούν τις πλάκες

44 Τα μόρια των πεπτιδίων που αποκόπτονται συσσωματώνονται μεταξύ τους και σχηματίζουν τα αμυλοεϊδή ινίδια, που με την σειρά τους δημιουργούν τις πλάκες

45 Δρεπανοκυτταρικη αναιμία: μη φυσιολογική αναδίπλωση /συσσωμάτωση Με σημειακή μετάλλαξη Glu Val Μια απλή μετάλλαξη: Glu 6 Val Οδηγεί σε δρεπανοειδή μορφολογία των ερυθρών αιμοσφαιρίων

46 Εξήγηση σε μοριακό επίπεδο: δημιουργία υδρόφοβης εκτεθειμένης προεξοχής (βαλινη) που μπορεί να προσαρμοστεί σε μια υδρόφοβη κοιλότητα ενός άλλου μορίου αιμοσφαιρίνης, δημιουργώντας πολυμερή με μορφή ινιδίων, που παραμορφώνουν τα κύτταρα Τετραμερής δομή της φυσικής αιμοσφαιρίνης Μοντέλο των ινιδίων και ΕΜ