ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΧΗΜΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΧΗΜΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μελέτες του ενδοκυττάριου εντοπισμού της πρωτεΐνης La και του ρόλου της επί ρυθμιστικών μορίων RNA και γονιδίων του κυτταρικού κύκλου σε συνθήκες στρες ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΛΕΝΗ ΚΑΛΙΑΤΣΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2017

2 INTERDEPARTMENTAL PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDIES CHEMICAL BIOLOGY Studies on the intracellular localization of La protein and its role on regulatory non-coding RNAs and cell cycle genes under stress conditions MASTER OF SCIENCE ELENI KALIATSI BIOLOGIST PATRAS, GREECE 2017

3 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Διατμηματικού Μεταπτυχιακού Προγράμματος Χημικής Βιολογίας κατά το ακαδημαϊκό έτος , υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Βιοχημείας κ. Κωνσταντίνου Σταθόπουλου. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Καθηγητής Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Γεώργιος Σπυρούλιας (Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Επίκουρος Καθηγητής Γεράσιμος Ρασσιάς (Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών)

4 The present thesis was conducted at the department of Biochemistry, School of Medicine, University of Patras, Greece in the framework of the Interdepartmental Program of Postgraduate Studies Chemical Biology in the academic year under the supervision of Professor of Biochemistry Constantinos Stathopoulos. ADVISORY COMMITTEE 1. Professor Constantinos Stathopoulos (Supervisor School of Medicine, University of Patras) 2. Professor George Α. Spyroulias (Department of Pharmacy, University of Patras) 3. Assistant Professor Gerasimos Rassias (Department of Chemistry, University of Patras)

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί το επιστέγασμα των σπουδών μου στο Διατμηματικό Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Χημικής Βιολογίας. Έχοντας, λοιπόν, ολοκληρώσει την παρούσα μελέτη αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ορισμένους ανθρώπους, η συμβολή και η συμπαράσταση των οποίων ήταν πολύτιμη και καθοριστική για την διεκπεραίωση της μελέτης αυτής. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Κωνσταντίνο Σταθόπουλο που με δέχτηκε στο εργαστήριό του και μου έδωσε την ευκαιρία να δουλέψω με ένα τόσο ενδιαφέρον αντικείμενο και να εργαστώ σε ένα περιβάλλον γεμάτο ιδέες και εξαιρετικούς ανθρώπους. Του χρωστώ ένα μεγάλο ευχαριστώ τόσο για την βοήθειά του καθ όλη τη διάρκεια της χρονιάς, όσο και για τις πολύτιμες εμπειρίες που απέκτησα από της συνεργασία μας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στους Καθηγητές και μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής, κ. Γεώργιο Σπυρούλια και κ. Γεράσιμο Ρασσιά, που με την πολυετή τους πείρα κατόρθωσαν να μεταδώσουν πολύτιμες γνώσεις στις μεταπτυχιακές μου σπουδές. Στη συνέχεια, εκφράζω ένα βαθύ ευχαριστώ στην κ. Κατερίνα Γραφανάκη για το συνεχές ενδιαφέρον της κατά τη διεξαγωγή της παρούσας εργασίας και την στήριξή της. Δεν θα μπορούσα να εκφράσω εύκολα με λόγια την ευγνωμοσύνη μου, στη μεταδιδακτορική ερευνήτρια Βίκυ Σταματοπούλου για τις πολύτιμες γνώσεις και τις χρήσιμες συμβουλές που μου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης, τόσο σε πρακτικό επίπεδο όσο και για τη συγγραφή της εργασίας αυτής. Κυρίως, την ευχαριστώ, διότι μέσα από την πολυδιάστατη επιστημονική της σκέψη και τις εποικοδομητικές μας συζητήσεις, εμπλούτισε τις γνώσεις μου αλλά και με επιδέξιο τρόπο επεσήμανε τα λάθη μου. Είμαι πραγματικά ευγνώμων σε δυο ξεχωριστά για μένα άτομα, και μέλη του εργαστηρίου, τον Ηλία Σκεπαρνιά και το Νάσο Σόκατ. Η πολύτιμη καθοδήγησή τους κατά την εκτέλεση του πειραματικού μέρους, η ανοχή, η κατανόηση τους, οι χρήσιμες υποδείξεις τους αλλά και η ευγενή τους καλοσύνη να διαθέσουν τον πολύτιμο χρόνο τους διαμόρφωσαν ένα άνετο και φιλικό περιβάλλον συνεργασίας, μέσα στο οποίο μπόρεσα να εργαστώ και να επεκτείνω τις γνώσεις μου, στεκόμενη διπλά τους. Δε θα μπορούσα να παραλείψω τους συνεργάτες και φίλους μου, με όλη την σημασία της λέξης, Γιώργο Κυριακόπουλο, Νικολέτα Γιαρίμογλου και Βίκη Κατωπόδη. Τους ευχαριστώ ξεχωριστά για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφεραν, την στήριξή τους και την υπομονή τους. Το οικείο και φιλικό περιβάλλον που δημιούργησαν με τον ερχομό τους στο εργαστήριο συνέβαλλε με ξεχωριστό τρόπο στην διεκπεραίωση της εργασίας αυτής.

6 Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα και τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Κατερίνα Λαμπρινού, Γεωργία Κόκλα, Έλενα Μπουλουκου, Δαυίδ Δερμονιώτη και Χρήστο Κατσιούλα για τη βοήθεια και το φιλικό κλίμα συνεργασίας. Επιπλέον, μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Γεωργία Κουρνούτου, Γιώτα Γιαννοπούλου, Γιάννη Βλαχογιάννη, Έλενα Πλεσσά, Αντώνη Μπουγά, Γιώτα Μπατζάλη και Χριστίνα Πετροπούλου για το φιλικό κλίμα. Τέλος, θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και τους φίλους μου για την αγάπη τους και την υποστήριξή τους σε κάθε μου βήμα.

7 Περίληψη 7 Summary 9 Ενότητα 1 η - Εισαγωγή Υπερ-οικογένεια La (LARPs La Related Proteins) Η πρωτεΐνη La Δομική οργάνωση της πρωτεΐνης La Λειτουργίες της πρωτεΐνης La Η La απαιτείται για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trnas Η La μια RNA Συνοδός πρωτεΐνη Η La και ο ρόλος της στα πρόδρομα μη κωδικά μόρια RNA Κυτταροπλασματική La Η La στον καρκίνο Σκοπός 41 Ενότητα 2 η - Υλικά & Μέθοδοι 43 Α. Υλικά 45 Α.2.1. Χημικά - Αντιδραστήρια 45 Α.2.2. Ένζυμα 46 Α.2.3. Θρεπτικά μέσα και Διαλύματα 46 Α.2.4. Βακτηριακά στελέχη Πλασμιδιακοί φορείς 48 Α.2.5. Εκκινητές 49 Α.2.6. Αντισώματα 50 Β. Μέθοδοι 51 Β.2.1. Μοριακή κλωνοποίηση του γονιδίου της ανθρώπινης πρωτεΐνης La 51 Β Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 51 Β Καθαρισμός και απομόνωση DNA 51 Β Πέψεις και Σύνδεση τμημάτων 53 Β Παρασκευή βακτηρίων επιδεκτικών (DH5a) προς μετασχηματισμό 54 Β Μετασχηματισμός βακτηρίων με πλασμιδιακό DNA 54 Β Ανάπτυξη υγρών καλλιεργιών βακτηρίων Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας Β Παρασκευή βακτηριακών αποθεμάτων γλυκερόλης 56 55

8 Β Ανάλυση πλασμιδίων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πέψης 56 Β.2.2. Κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια 57 Β Ανακαλλιέργεια κυττάρων 58 Β Διατήρηση των κυττάρων σε υγρό άζωτο 59 Β.2.3. Παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA 59 B.2.4. Ανοσοφθορισμός 61 Β.2.5. Απομόνωση ολικού RNA και μικρών μορίων από κύτταρα 62 Β Απομόνωση ολικού RNA 63 Β Απομόνωση μικρών μορίων RNA 65 Β Αντίστροφη μεταγραφή για τη δημιουργία cdna 66 Β.2.6. Ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο RT-qPCR 68 B.2.7. Απομόνωση και ανάλυση πρωτεϊνών 70 Β.2.8. Ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωμα κατά Western 71 Β.2.9. Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής 72 Β Wound healing assay 73 Ενότητα 3 η - Αποτελέσματα Η La εντοπίζεται στον πυρήνα στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα A Πυρηνικός εντοπισμός της La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα A549 έπειτα από επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες 3.3. Οι συνθήκες στρες επηρεάζουν την έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης La τόσο σε επίπεδο mrna όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης 3.4. Υπερέκφραση της La σε στρες επηρεάζει γονίδια που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο Υπερέκφραση της La και ο ρόλος της στην έκφραση ρυθμιστικών μορίων RNA Μεταβολές του κυτταρικού κύκλου έπειτα από υπερέκφραση της La σε φυσιολογικές και συνθήκες στρες Υπερέκφραση της La επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση in vitro 100 Ενότητα 4 η - Συζήτηση 105 Ενότητα 5 η - Βιβλιογραφία 113

9 Περίληψη Η πρωτεΐνη La είναι μία σημαντική πρωτεΐνη η οποία περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Αν και περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογες αυτής υπάρχουν σχεδόν σε όλους τους ευκαρυώτες. Η La δεσμεύεται σε μία πληθώρα σημαντικών μορίων RNA, κυρίως μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ (U6 snrna, pre-trna, pre-5s rrna) και λειτουργεί ως ικρίωμα για την ορθή αναδίπλωσή τους, προστατεύοντάς τα παράλληλα από την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Η La αναγνωρίζει και συνδέεται μέσω της χαρακτηριστικής αλληλουχίας UUU OH που υπάρχει στο 3 άκρο των μεταγράφων. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι μπορεί να δεσμεύεται σε μία πληθώρα κυτταρικών και ιϊκών mrnas ρυθμίζοντας τη μετάφρασή τους. Tα περισσότερα mrnas στα οποία προσδένεται η La περιέχουν εσωτερικές θέσεις δέσμευσης του ριβοσώματος και έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης (Internal Ribosome Entry Sites, IRES). Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει την παρέμβαση της πρωτεΐνης La στις διαδικασίες της έκφρασης των mirnas και μιας νέας κατηγορίας μικρών ρυμθιστικών μορίων RNA που προέρχονται από μόρια trnas και ονομάζονται trfs (trna- derived RNA fragments). Τα trfs προέρχονται από τη δράση ενδονουκλεασών τόσο στα ώριμα όσο και στα πρόδρομα μόρια trna. Μελέτη σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές αποκάλυψε πως η έκφραση των mirnas προάγεται από την πρωτεΐνη La, η οποία δεσμεύεται στη δομή στελέχους-βρόχου των πρόδρομων μορίων mirna (pre-mirna) και τα προστατεύει από τη νουκλεολυτική αποικοδόμηση. Ωστόσο, τα θραύσματα trna (trfs), απουσία της πρωτεΐνης La, συμμετέχουν σε σύμπλοκα με πρωτεΐνες Ago παρεμβαίνοντας στο μονοπάτι των mirnas. Έτσι, η La λειτουργεί ως φύλακας για την εξασφάλιση της σωστής ωρίμανσης του trna και την προστασία του μονοπατιού mirna από τα θραύσματα trna. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τη βιοχημική και κυτταρική συμπεριφορά της SSB/La έπειτα από επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες, τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε επίπεδο μετάφρασης, χρησιμοποιώντας τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Είναι ενδιαφέρον ότι το γονίδιο της La παρουσιάζει αυξημένη έκφραση έπειτα από στέρηση της γλυκόζης, ενώ η έκφρασή του φαίνεται να είναι μειωμένη έπειτα από επαγωγή οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, ο υποκυττάριος εντοπισμός της πρωτεΐνης La είναι κυρίως στον πυρήνα και στον πυρηνίσκο σε όλες τις συνθήκες που εξετάστηκαν. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος της, υπερ-εκφράσαμε τη La και συγκρίναμε το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την ωρίμανση και διακίνηση του trna, τη βιογένεση mirnas και συγκεκριμένα

10 mirnas και trfs τα οποία έχουν αυξημένη έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα, όπου η La φαίνεται να συμμετέχει ενεργά. Τέλος, αν και η ανάλυση FACS έδειξε ότι η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου παραμένει ουσιαστικά ανεπηρέαστη μετά από υπερέκφραση της La, οι επακόλουθοι προσδιορισμοί wound healing assay, έδειξαν ότι η La οδηγεί στη ταχύτερη μετανάστευση κυττάρων. Προτείνουμε ότι η La διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διεργασίες που προάγουν τον όγκο, μέσω της απορρύθμισης των βασικών συστατικών μεταγραφής του RNA pol ΙΙΙ. Λέξεις κλειδιά: La πρωτεΐνη, trna, μη-κωδικά μόρια RNA, συνθήκες στρες

11 SUMMARY RNA-binding protein La (Lupus antigen, SSB) is the major autoantigen in the sera of patients suffering from lupus erythematosus and Sjogren s syndrome. Its actual cellular role is to facilitate folding of RNA Pol III transcripts like pre-trnas, several RNA Pol III pre-mirnas and trna fragments (trfs) through binding and protection of their 3' trailer sequences. Although it was first described in human, homologs of La protein have been identified in almost all eukaryotes, raising questions on its evolutionary origin and its plausible roles. La mainly localizes in the nucleus but under specific conditions shuttles to the cytoplasm to bind on specific IRES (transacting factors), indicating a possible involvement in aberrant translation under stress, which could drive carcinogenesis. Recent studies reveal that La prevents Ago association of distinct trna fragments and its functions as gatekeeper ensuring correct trna maturation and protecting the mirna pathway from potentially functional trna fragments. In the present study, we investigated the biochemical and cellular behavior of SSB under various stress conditions, both at transcriptional and translational level, using A549 cells. Interestingly, La is overexpressed under glucose deprivation however its expression under oxidative stress seems to be downregulated. The localization of La protein under normal and stress conditions is mainly in the nucleus and nucleolus in all conditions tested. To further elucidate its role, we overexpressed La and compared the expression profile of genes implicated in cell cycle regulation, trna maturation and trafficking, mirna biogenesis and specific mirnas and trfs that are found upregulated in lung cancer, where La seems to actively participate. Finally, although FACS analysis showed that cell cycle progression remains essentially unaffected after La overexpression, subsequent wound healing assays showed that La drives faster cell migration. We propose that La plays important role in the tumor-promoting processes, through deregulation of essential RNA pol III transcription components. Key words: La protein, trna, non-coding RNAs, stress conditions

12 1. Εισαγωγή

13 Εισαγωγή 1.1. Υπερ-οικογένεια πρωτεϊνών συγγενικών με τη La (LARPs - La Related Proteins Superfamily) Οι πρωτεΐνες LARPs (La-related proteins) ανήκουν σε μια εξελικτικά διατηρημένη οικογένεια με σημαντικές λειτουργίες για τον μεταβολισμό του RNA. Κοινό δομικό χαρακτηριστικό όλων, αποτελεί το La μοτίβο (La motif- LaM), το οποίο ακολουθεί ένα κλασικό RRM μοτίβο ή ένα προσομοιάζον RRM μοτίβο (RRM-like motif). Μελέτη που βασίστηκε στις αλληλουχίες 83 ευκαρυωτικών ειδών, διάσπαρτων στο δέντρο της ζωής και αφορούσε την ύπαρξη πρωτεϊνών που περιέχουν το La motif, έδειξε πως οι πρωτεΐνες αυτές υπάρχουν σε όλους τους ευκαρυώτες (με εξαίρεση τα πρώτιστα από το γένος Plasmodium), αλλά απουσιάζουν από τα αρχαία 1. & Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση της υπερ-οικογένειας των ανθρώπινων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την La (LARPs). To LAM και το RRM μοτίβο αποτελεί κοινό δομικό στοιχείο όλων. Παρουσιάζεται η τρισδιάστατη δομή του La module και του hla RRM2α (PDBs 2VOD και 1OWX, αντίστοιχα). Όπου Ν: αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού, Ε: αλληλουχία πυρηνικής εξαγωγής, R: στοιχείο πυρηνικής συγκράτησης, S: Serine-366, SBM: μικρό βασικό μοτίβο σημαντικό για την αναγνώριση του 5'pppG πρόδρομων RNA και τον εντοπισμό στον πυρηνίσκο, DM15: περιοχή σημαντική για άμεση σύνδεση με το μοτίβο 7mGpppC-cap-5 TOP, RRM2α: RNA μοτίβο αναγνώρισης 2, PAM2: μοτίβο αλληλεπίδρασης με poly(a)-binding πρωτεΐνες, LSA: LaM και S1- σχετικό μοτίβο που συνεισφέρει στην mrna αναγνώριση. PBM: μοτίβο αλληλεπίδρασης με την PABP πρωτεΐνη, RIR: RACK1-περιοχή αλληλεπίδρασης, ΕΙ4L στη LARP1 αναφέρεται στην περιοχή που μοιάζει με την eif4. Προσαρμοσμένο από R.J. Maraia et al., Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι το LaM είναι ένα προγονικό μοτίβο το οποίο εμφανίστηκε αμέσως μετά τον διαχωρισμό αρχαίων - ευκαρυωτών. Στην υπερ-οικογένεια αυτή ανήκουν 5 οικογένειες πρωτεϊνών που προέκυψαν κατά τη διάρκεια της ευκαρυωτικής εξέλιξης με εξειδικευμένες λειτουργίες και περιλαμβάνουν τις LARP1, 13

14 Εισαγωγή LARP3 ή La protein, LARP4, LARP6 και LARP7 (Εικόνα 1). Οι πρωτεΐνες αυτές, LARPs, παρότι δεν έχουν χαρακτηριστεί επαρκώς, φέρονται να έχουν ιδιότητες πρόσδεσης σε RNA μόρια και να εμπλέκονται σε καθοριστικής σημασίας κυτταρικές λειτουργίες. Ορισμένες έχουν υιοθετήσει ειδικές λειτουργίες για περιορισμένο σύνολο RNA-στόχων, όπως για παράδειγμα, τα μέλη της LARP7, τα πιο στενά συσχετιζόμενα με την πρωτεΐνη La, όπου προσδένουν συγκεκριμένα μικρά πυρηνικά RNAs (snrnas), μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ, όπως το 7SK snrna ή το RΝΑ τελομεράσης. Οι LARPs1 εμπλέκονται με τα 5 ΤΟΡ mrnas 3-7, ενώ οι LARPs 4 και 4B φαίνεται να συντονίζουν την μετάφραση μεγαλύτερων ομάδων mrna-στόχων 2, 8.Επιπλέον, η ανθρώπινη LARP6 (hlarp6) στοχεύει ένα διατηρημένο μοτίβο stem-loop (SL) που βρίσκεται στα mrnas που κωδικοποιούν τα α-κολλαγόνα I και III για να συντονίσουν τη μετάφρασή τους 9, Η πρωτεΐνη La Η ανθρώπινη πρωτεΐνη La (Lupus antigen), γνωστή και ως Sjögren Syndrome s antigen B (SSB) ή LARP3 (La related protein 3), περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus, SLE) 11 ή σύνδρομο Sjögren 12. Είναι μια εξαιρετικά σημαντική πρωτεΐνη της οποίας η φωσφορυλιωμένη μορφή απαντάται σε αφθονία, κυρίως στους πυρήνες ευκαρυωτικών κυττάρων. O πρώτος λειτουργικός ρόλος που αποδόθηκε στην συγκεκριμένη πρωτεΐνη ήταν αυτός της συμβολής της στην ωρίμανση του 3 άκρου των πρόδρομων μορίων trna 13. Σήμερα γνωρίζουμε ότι αλληλεπιδρά και προστατεύει το 3 άκρο των πρόδρομων μικρών RNA μορίων από τη δράση εξωνουκλεασών, ενώ ταυτόχρονα διευκολύνει την σωστή αναδίπλωση όλων των νεοσυντιθέμενων μετάγραφων της RNA πολυμεράσης III. Η La συνδέεται με ένα μεγάλο αριθμό μικρών πρόδρομων μορίων RNA, τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί στον πυρήνα και περιλαμβάνουν, εκτός από πρόδρομα trna μόρια, το 5S rrna, U6 small nuclear RNA (snrna), 7SL RNA, Y RNAs, καθώς και μετάγραφα Alu αλληλουχιών Επίσης, μελέτες έχουν δείξει ότι η La πρωτεΐνη έχει την ικανότητα δέσμευσης μορίων RNA ιϊκής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων των αδενοϊών VA RNA Ι και VA RNA II 23, όπως επίσης και των EBER 1 και EBER 2 RNA (ιός Epstein- Barr) 24, 25, γεγονός που υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή της στις ιϊκές λοιμώξεις. Παρά την κύρια παρουσία της στον πυρήνα, έχει εντοπιστεί και στο κυτταρόπλασμα όπου φαίνεται να εμπλέκεται στην ρύθμιση της μετάφρασης αρκετών κυτταρικών mrnas, όπως το mrna της Cyclin D1 (CcnD1) 26, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) 27, Laminin-B1 (LaminB1) 28 και murine double minute (MDM2) 29,

15 Εισαγωγή 1.3. Δομική οργάνωση της La πρωτεΐνης Η La χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ωστόσο, ομόλογες πρωτεΐνες έχουν εντοπιστεί σε μία ποικιλία ανώτερων και κατώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών συμπεριλαμβανομένων των Μ. musculus 31, X. laevis 32, D. melanogaster 33, S. pombe 34, S. cerevisiae 35 και T. brucei 36. Σε όλους αυτούς τους οργανισμούς η πρωτεΐνη παρουσιάζει μία κοινή οργάνωση επικρατειών, την Ν-τελική περιοχή (N-terminal Domain, NTD) που περιλαμβάνει το La motif (La motif, LAM) και το RRM1 (RNA Recognition Motif, RRM), τα οποία και τα δυο μαζί αναφέρονται ως La module, καθώς και τη C-τελική περιοχή (C-terminal Domain, CTD) που περιλαμβάνει μια ελάχιστα συντηρημένη αλληλουχία 37, 38. Το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης κυμαίνεται από 50 kda στα σπονδυλωτά έως 32 kda στη ζύμη Saccharomyces cerevisiae (Εικόνα 2). Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες μελέτες πραγματοποιούνται για την αποκάλυψη της τριτοταγούς διαμόρφωσης της La. Μπορεί ο δομικός χαρακτηρισμός ολόκληρης της πρωτεΐνης να μην έχει ακόμα επιτευχθεί, ωστόσο τμηματικές μελέτες έχουν αποκαλύψει σημαντικά δομικά χαρακτηριστικά τόσο της πρωτεΐνης, όσο και του συμπλόκου αυτής με το RNA. Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της οργάνωσης των επικρατειών των πρωτεϊνών La σε ευκαρυώτες. Στοίχιση των ομόλογων La πρωτεΐνών από τους οργανισμούς Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae και Trypanosoma brucei. Όλες οι πρωτεϊνες διαθέτουν το συντηρημένο NTD, στο οποίο περιλαμβάνεται το LAM και το RRM1. Το CTD είναι λιγότερο συντηρημένο και αποτελείται από το RRM2, το στοιχείο πυρηνικής συγκράτησης (NRE), ένα μικρό βασικό μοτίβο (SBM) και το σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS). Προσαρμοσμένο από την Wolin & Cedervall,

16 Εισαγωγή Η NTD της πρωτεΐνης, η οποία περιλαμβάνει το La motif και το RRM1 μοτίβο, έχει μελετηθεί καλύτερα από την υπόλοιπη πρωτεΐνη και καθοριστεί με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR 40 (Εικόνα 3). Είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη επικράτεια της πρωτεΐνης La, από την οποία πήρε και το όνομά του 1. Το La motif, μια αλληλουχία 70 αμινοξέων, υιοθετεί μία αναδίπλωση παρόμοια με τη δομή winged-helix, που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα, και περιέχει τρεις επιπρόσθετες α-έλικες: α1, α2 και α4 (Εικόνα 4) που σχηματίζουν μια υδρόφοβη κοιλότητα για την πρόσδεση του RNA 2, Το RRM1 είναι μία από τις πιο κοινές πρωτεϊνικές επικράτειες μέσα στα κύτταρα των ευκαρυωτών. Είναι παρόν σε μία πληθώρα πρωτεϊνών που προσδένουν μονόκλωνο RNA και επιτελούν ποικίλες λειτουργίες. Αποτελείται από περίπου 80 αμινοξέα που υιοθετούν την τυπική πτυχή β 1α 1β 2β 3α 2β 4 (β: βήτα-φύλλο, α: άλφα-έλικα) όπως όλα τα RRM μοτίβα, τα οποία συνήθως σχηματίζουν μια επιφάνεια β-φύλλου που εμπλέκεται άμεσα στη σύνδεση του RNA. Ειδικότερα, τα υψηλά συντηρημένα και βασικά φορτισμένα κατάλοιπα στην περιοχή μεταξύ των φύλλων β2 και β3 (βρόχος 3) έχουν αποδειχθεί ότι είναι υπεύθυνα για αλληλεπιδράσεις με τα πρόδρομα μόρια trna (pre-trna) 40, Τόσο το LaM, όσο και το RRM1 μοτίβο της ανθρώπινης πρωτεΐνης φαίνεται να παίζουν καθοριστικό ρόλο στη δέσμευση στο RNA. Συνδέονται μεταξύ τους με έναν εύκαμπτο συνδέτη (linker) και απουσία RNA κινούνται το ένα με το άλλο ανεξάρτητα. Ωστόσο, παρουσία RNA, o linker υιοθετεί ελικοειδή διαμόρφωση βοηθώντας τη σωστή τοποθέτηση των δύο μοτίβων, ώστε να δράσουν ως ενιαία λειτουργική ομάδα 2. Εικόνα 3. Δομή του La motif και του RRM1. Δομή του La motif (αριστερά) και του RRM1 (δεξιά) της ανθρώπινης πρωτεΐνης La από φασματοσκοπία NMR. Με μπλε φαίνονται οι επιπρόσθετες έλικες στις κλασικές αναδιπλώσεις winged helix

17 Εισαγωγή Το LAM:RRM1 αναδιπλώνεται γύρω από τα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ που περιέχουν το χαρακτηριστικό UUU-3 OH, υιοθετώντας μια σταθερή διαμόρφωση "σχήματος" V (Εικόνα 4). Σε πειράματα δομικού χαρακτηρισμού του συμπλόκου LΑΜ- RRM1:RNA φάνηκε πως οι επαφές με τις τερματικές ουριδίνες γίνονται μέσω του La motif, ενώ το RRM1 συμμετέχει στη δέσμευση, μέσω μη ειδικής αλληλεπίδρασης, με τον φωσφορικό σκελετό του RNA 46. Συγκεκριμένα, η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου της ανθρώπινης La NTD με το 9μερές RNA UGCUGUUUUOH, κατέρριψε τη θεωρία που ήθελε το συντηρημένο RRM1 μοτίβο να ευθύνεται για την αναγνώριση της αλληλουχίας UUU-OH. Αποκάλυψε πως η ανθρώπινη πρωτεΐνη δεν χρησιμοποιεί το RRM1 για την εξειδικευμένη αναγνώριση της αλληλουχίας 3 UUUOH, παρά μόνο για να δημιουργήσει μία σχισμή μεταξύ της β πτυχωτής επιφάνειας και της δομής winged helix, στην οποία θα εγκολπωθεί το συγκεκριμένο RNA. Τα παραπάνω παρέχουν πληροφορίες για το πώς η La μπορεί να παρουσιάσει ευελιξία για τη δέσμευσή της σε διαφορετικά μόρια RNA. Εικόνα 4. Δομή του La module της ανθρώπινης πρωτεΐνης La σε σύμπλοκο με UUU 3 OH RNA. A) To La module της La (PDB 2VOS), αποτελείται από το LAM (με το κίτρινο χρώμα), ένα τομέα σύνδεσης (με πράσινο) και το RRM1 (με καφέ). Το UUU 3'OH RNA παρουσιάζεται με sticks, με διαφορετικά χρώματα (C: πράσινο, Ο: κόκκινο, Ν: μπλε, P: πορτοκαλί). Β) Απεικόνιση μοντέλου "σχήματος" V με U-2 στη σχισμή μεταξύ του La motif και του RRM1. Προσαρμοσμένο από Richard J Maraia et al Η CTD της πρωτεΐνης, ποικίλλει από οργανισμό σε οργανισμό μιας και είναι λιγότερο συντηρημένη (Εικόνα 2). Το τμήμα αυτό της πρωτεΐνης είναι πιο μεγάλο και πολύπλοκο στα θηλαστικά. Συχνά αναφέρεται ως στοιχείο ρύθμισης που αποκτήθηκε από τα μετάζωα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Περιλαμβάνει ένα ασυνήθιστο RRM (RRM2α) 47, ένα πυρηνικό στοιχείο συγκράτησης (NRE) 48, 49, μια φορτισμένη, μη διαμορφωμένη περιοχή, γνωστή ως βραχύ βασικό μοτίβο (SBM) 50-52, το οποίο ενσωματώνει ένα Walker A μοτίβο 31, μια θέση φωσφορυλίωσης από την καζεϊνική κινάση II (S366) 53, 54, ένα πιθανό 17

18 Εισαγωγή σημείο διάσπασης από κασπάση 55, μία πιθανή περιοχή διμερισμού 56 καθώς και την αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού (ΝLS) Το άτυπο αυτό RRM2α εμφανίζεται εξελικτικά νωρίς στις ευκαρυωτικές La πρωτεΐνες, όπως βρέθηκε από την εξέταση της δευτερογενούς δομής της πρωτεΐνης La από τον οργανισμό Dictyostelium discoideum 62, 63 (Εικόνα 5). Παρότι ο διαχωρισμός του D. discoideum από τους υπόλοιπους ευκαρυώτες συνέβη νωρίς στην φυλογενετική ιστορία των ευκαρυωτικών οργανισμών, πολλές από τις πρωτεΐνες του παρουσιάζουν μεγαλύτερη ομολογία με τις ορθόλογες του ανθρώπου παρά των υπόλοιπων μονοκύτταρων ευκαρυωτών 64. Η πρωτεΐνη La του D. discoideum περιέχει ένα τυπικό La module, καθώς και ένα RRM2α με ένα βραχύ β4 φύλλο ακολουθούμενο από μια α3 έλικα 62, 63. Η α3 έλικα, όπως δείχθηκε από τη δομή του RRM2a της hla, περιλαμβάνει συντηρημένα κατάλοιπα που σύμφωνα με άλλες μελέτες ευθύνονται για την πυρηνική παρακράτηση (NRE) 47, 48 (Εικόνα 5). Έχει προταθεί ότι το CTD παίζει ρόλο στην αναγνώριση μη-πολυ (U) αλληλουχιών, μολονότι ο μηχανισμός δέσμευσης των RNA μορίων παραμένει ασαφής. Μελέτες φανερώνουν ότι το RRM2a έχει μικρή ικανότητα δέσμευσης του RNA, ενώ φαίνεται να συνεισφέρει στην δέσμευση του RNA μόνο συνεργιστικά με το La module, αναγνωρίζοντας stem-loop δομές, όπως τις IRES αλληλουχίες των ιών ( 1.4.4) και τα pre-mirnas 65, 66. Συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι τα RRM1 και RRM2 είναι επαρκή για να δεσμεύσουν εσωτερικά στοιχεία RNA που βρίσκονται στο mrna του HCV, HBV και κυκλίνης D1 (CCND1) 26, Επίσης, είναι ενδιαφέρον ότι η C-τελική περιοχή φαίνεται να είναι σημαντική για την προαγωγή της μετάφρασης μέσω IRES αλληλουχιών, καθώς δείχθηκε πως μετάλλαξή της δεν επιτρέπει την έκφραση γονιδίων του ιού της πολιομυελίτιδας 69. Επιπρόσθετα, φάνηκε πως η προσθήκη περίπου 20 καταλοίπων καθοδικά της α3 έλικας, τα οποία περιλαμβάνουν το SBM μοτίβο, αυξάνουν την ικανότητα δέσμευσης RNA μορίων 47, 50, 70 και πιθανώς συμβάλλουν στην αναγνώριση του 5 ppp των μεταγράφων της RNA pol III 40, 50, 71. Ένα επιπλέον χαρακτηριστικό της CTD περιοχής είναι οι θέσεις φωσφορυλίωσής της 72. Οι θέσεις αυτές περιλαμβάνουν τα κατάλοιπα Thr-301, Ser-325, Thr-362, Thr-389 και Ser , 53, 73, εκ των οποίων η πιο συχνή είναι αυτή της Ser-366, η οποία πραγματοποιείται από την κινάσης CKII 58, Ενώ η φωσφορυλίωση του S366 έχει περιγραφεί μόνο για την hla, άλλες αντισταθμιστικές τροποποιήσεις προσδίδουν συγκρίσιμες λειτουργίες σε άλλα είδη 78. Για παράδειγμα, η Τ301, προάγει την πυρηνική εξαγωγή και την δέσμευση της mla σε πολυσώματα ως απόκριση στην κινάση Akt 74. Έχει παρατηρηθεί ότι η φωσφορυλίωση της La πραγματοποιείται σε διαφορετικό βαθμό, διαφορετικές θέσεις και από διαφορετικές κινάσες σε διαφορετικούς οργανισμούς 43,

19 Εισαγωγή Εκτός από το προφίλ φωσφορυλίωσης έχει προταθεί τροποποίηση της πρωτεΐνης hla και σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Η τροποποίηση αυτή είναι η σουμοϋλίωση (Small Ubiquitin-like MOdifier - SUMO), ωστόσο το λειτουργικό αποτέλεσμα αυτής δεν έχει προσδιοριστεί. Γενικά, οι SUMO είναι μικρές πρωτεΐνες (12 kda) που τροποποιούν ομοιοπολικά και αναστρέψιμα κυτταρικές πρωτεΐνες. Η σουμοϋλίωση των πρωτεϊνών παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες που περιλαμβάνουν μεταγραφή, επεξεργασία RNA, εξέλιξη κυτταρικού κύκλου και αντίδραση σε στρες Στη hla έχουν πρόσφατα εντοπιστεί δύο θέσεις σουμοϋλίωσης ανάμεσα στο μοτίβο RRM1 και RRM2, οι οποίες φαίνεται να διευκολύνουν τη δέσμευση της La σε αλληλουχίες IRES και 5 ολιγοπυριμιδικά στοιχεία (ΤΟP mrnas) ( 1.4.4). Επίσης, παλιότερα είχε γίνει αναφορά ότι η σουμοϋλίωση της mla στο κατάλοιπο Κ41, ρυθμίζει την μεταφορά της στους άξονες των αισθητικών νευρώνων 84. Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση των επικρατειών της πρωτεΐνης La σε ευκαρυώτες. Στοίχιση των ορθόλογων La πρωτεϊνών από τους οργανισμούς Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae και Trypanosoma brucei και Dictyostelium discoideum. Παρουσιάζεται η τρισδιάστατη δομή του RRM2a (κατάλοιπα ) της ανθρώπινης πρωτεΐνης καθώς και τo LAM και RRM1 μοτίβο, κοινό χαρακτηριστικό όλων των πρωτεϊνών. Ν: αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού, Ε: αλληλουχία πυρηνικής εξαγωγής, R: στοιχείο πυρηνικής συγκράτησης, S: Serine-366, SBM: βραχύ βασικό μοτίβο. Προσαρμοσμένο από R.J Maraia et al και Αlfano C et al , 40 19

20 Εισαγωγή 1.4. Λειτουργίες της πρωτεΐνης La H πρωτεΐνη La είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει RNA και εμπλέκεται σε διάφορα στάδια του μεταβολισμού του 39, 43. Η μεσολάβηση της La έχει διαφορετικές συνέπειες για τα διάφορα RNA που συνδέονται μ αυτήν. Η πρωτεΐνη La συνδέεται κυρίως με πρόδρομα μετάγραφα μορίων RNA, καθώς αποδείχθηκε ότι η ελάχιστη αλληλουχία αναγνώρισης για την πρωτεΐνη είναι η UUU-OH, που βρίσκεται στο 3 άκρο σχεδόν όλων των πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ 21, 46. Για τον λόγο αυτό, αρχικά θεωρήθηκε πως η πρωτεΐνη La αποτελεί έναν παράγοντα λήξης της μεταγραφής από την RNA pol III. Ωστόσο, σύντομα αυτή η θεωρία καταρρίφθηκε, εφόσον η μεταγραφή από την εν λόγω πολυμεράση ολοκληρωνόταν χωρίς κανένα πρόβλημα σε κυτταρικά εκχυλίσματα από τα οποία απουσίαζε η La 35. Αυτές οι τερματικές ουριδίνες συνήθως αφαιρούνται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του RNA μορίου, καταργώντας έτσι το σημείο δέσμευσης της La. H δέσμευση αυτή, λειτουργεί ως προστασία των πρόδρομων μεταγράφων από την δράση εξωνουκλεασών, διευκολύνοντας έτσι την επεξεργασία και την ωρίμανση τους. Ωστόσο, πέραν της 3 προστατευτικής ιδιότητάς της, η La παρουσιάζει ρόλο RNA συνοδού πρωτεΐνης (chaperone), εμποδίζοντας την λανθασμένη αναδίπλωση των μεταγράφων της. Ένα ευρύ φάσμα RNA μορίων αλληλεπιδρούν με τη La, συμπεριλαμβάνοντας εκτός των pre-trnas και άλλα μη κωδικά RNA μόρια, όπως snrnas και micrornas, mrnas, αλλά και RNA μόρια ιικής προέλευσης 39, 43, 85, 86. Μεταφορικό RNA (trna) Τo trna, ένα από τα τρία βασικά μόρια RNA μαζί με το ριβοσωμικό (ribosomal RNA, rrna) και το αγγελιοφόρο RNA (messenger RNA, mrna), είναι μόριο κομβικής σημασίας για τη βιολογία του κυττάρου, καθώς αποκωδικοποιεί τη γενετική πληροφορία από τη γλώσσα των τεσσάρων βάσεων του mrna στη γλώσσα των είκοσι αμινοξέων των πρωτεϊνών. Όπως αναφέρθηκε, τα trna μεταγράφονται από την RNA Pol III ως πρόδρομα μετάγραφα (pre-trna), τα οποία φέρουν επιπρόσθετες αλληλουχίες στα 5 και 3 άκρα τους, καθώς και εσωτερικά παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες, τα ιντρόνια. Στη συνέχεια τα μετάγραφα αυτά υφίστανται μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, ώστε τα λειτουργικά πλέον μόρια να συμμετάσχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση. Οι τροποποιήσεις αυτές περιλαμβάνουν: την αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας (5 leader), την επεξεργασία του 3 άκρου (3 trailer), την προσθήκη της 3 CCA αλληλουχίας με την μεσολάβηση του κατάλληλου ενζύμου (CCA-adding enzyme), το μάτισμα των ιντρονίων και την ομοιοπολική μετα-μεταγραφική τροποποίηση ορισμένων ριβονουκλεοτιδίων 87,

21 Εισαγωγή Επεξεργασία 5 άκρου του πρόδρομου trna H 5 επιπρόσθετη οδηγός αλληλουχία των pre-trnas αποκόπτεται από την ριβονουκλεάση P (RNase P), η οποία δρα ενδονουκλεολυτικά προκαλώντας τη θραύση (Εικόνα 6). Η ανθρώπινη RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA (RPPH1) και 10 πρωτεϊνικές υπομονάδες. Το σύμπλοκο αυτό αποτελεί ένα ριβοένζυμο, καθώς η καταλυτική του ενεργότητα εντοπίζεται στην RNA και όχι σε κάποια πρωτεϊνική υπομονάδα του 89, 90. Εικόνα 6. Σχηματική απεικόνιση ωρίμανσης 5 άκρου των trnas από την ριβονουκλεάση P. Η αντίδραση της ωρίμανσης του 5 άκρου του trna από την RNase P οδηγεί σε προϊόντα με 3 - ΟΗ και 5 -Ρ άκρα. To σημείο δράσης της RNase P σημειώνεται με την κόκκινη κουκίδα. To ριβοένζυμο της RNase P απαιτεί ιόντα Mg 2+ για την κατάλυση 91. Επεξεργασία του 3 άκρου (3 trailer) του πρόδρομου trna Η ωρίμανση των pre-trna των ευκαρυωτών απαιτεί και την ενδονουκλεολυτική αφαίρεση του 3 άκρου (3 -trailer) από το ένζυμο ριβονουκλεάση Ζ (RNase Z). Η διάσπαση πραγματοποιείται αμέσως μετά το ριβονουκλεοτίδιο-διάκρισης (discriminator base), το οποίο βρίσκεται ακριβώς πριν την 3 -CCA αλληλουχία στο ώριμο trna. Η εν λόγω διάσπαση ακολουθείται από την προσθήκη της 3 -CCA αλληλουχίας μέσω μιας trna νουκλεοτίδυλοτρανσφεράσης (CCA-adding enzymes) 92. Η RNase Z είναι μία ενδονουκλεάση, η οποία ανήκει στην οικογένεια β-λακταμασών 93. Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί δύο ισομορφές: μια μεγάλου μεγέθους, την RNase Z L που κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC2 και μία μικρότερου μεγέθους, την RNAse Z S που κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC1. Η RNase Z S εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ η RNase Z L στον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια. Η εναλλακτική έναρξη της μετάφρασης είναι υπεύθυνη για τον διπλό υποκυττάριο εντοπισμό της RNase Z L. Έτσι, λόγω δυσμενούς αναγνωστικού πλαισίου του πρώτου κωδικονίου έναρξης AUG, η μετάφραση φαίνεται να ξεκινά και από το δεύτερο κωδικόνιο έναρξης, όπου η αλληλουχία στόχευσης προς τα μιτοχόνδρια χάνεται και η πρωτεΐνη δρομολογείται προς τον πυρήνα 94,

22 Εισαγωγή Το μάτισμα των ιντρονίων του πρόδρομου trna Η θέση των ιντρονίων των ευκαρυωτικών pre-trnas είναι εξαιρετικά συντηρημένη. Τα ιντρόνια αρχίζουν από το δεύτερο νουκλεοτίδιο από την 3' αλληλουχία του αντικωδικονίου (Εικόνα 7). Η απομάκρυνση των ιντρονίων από τα πρόδρομα trna, στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, γίνεται με το σύμπλοκο TSEN (trna-splicing endonuclease complex), το οποίο είναι ένα ετεροτετραμερές που αποτελείται από τις υπομονάδες Sen2, Sen34, Sen54 και Sen15, εκ των οποίων οι Sen2 και Sen34 είναι καταλυτικά δραστικές 96, 97. Εικόνα 7. Δευτεροταγής δομή πρόδρομων και ώριμων trna μορίων. Δευτεροταγής δομή pre-trna με το ιντρόνιο (αριστερά) και ώριμο trna (δεξιά). Με λευκό και μαύρο παρουσιάζεται το 5'-εξώνιο (αριστερά), με μπλε και ανοικτό γκρι παρουσιάζεται το ιντρόνιο και 3 'εξώνιο των pretrnas, αντίστοιχα. Στο ώριμο trna, το αντικωδικόνιο παριστάνεται με μαύρο, ενώ το CCA στο 3'-άκρο του trna με σκούρο γκρι. Τα βελάκια αντιπροσωπεύουν τις τοποθεσίες ματίσματος του ιντρονίνου (αριστερά) Η La απαιτείται για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trnas Όπως αναφέρθηκε, τα πρόδρομα trna υποβάλλονται σε μια περίπλοκη διαδικασία επεξεργασίας και ωρίμανσης. Ωστόσο, για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trna απαιτείται η πρωτεΐνη La. H La είναι η πρώτη πρωτεΐνη που βρέθηκε να αλληλεπιδρά με τα πρόδρομα trna (pre-trna) σε ευκαρυώτες και παραμένει συνδεδεμένη με το pre-trna μέχρι να πραγματοποιηθεί η ενδονουκλεολυτική διάσπαση με τη μεσολάβηση της RNase Ζ, η οποία όπως αναφέρθηκε απομακρύνει το 3 trailer που περιέχει UUU 3'OH. H δέσμευση αυτή από την La μπορεί να προστατεύσει τα νεοσυντιθέμενα trnas από τη δράση 3 εξωνουκλεασών 13, 39, 98, 99 (Εικονα 1.8). Πειράματα σε κυτταρικά εκχυλίσματα Xenopus laevis 35, S.cerevisae αλλά και HeLa 22

23 Εισαγωγή κυττάρων 50 επαληθεύουν την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση της 3 ακολούθου αλληλουχίας απουσία της La. Τα κατάλοιπα ουριδινών παράγονται κατά τον τερματισμό της μεταγραφής των γονιδίων από την RNA pol III και επομένως παραμένουν στα 3 άκρα όλων των νεοσυντιθέμενων μεταγράφων της ΡοΙ ΙΙΙ και αναγνωρίζονται από τη La. Τα δυο δομικά στοιχεία που η La περιέχει, το La motif και RRM1, την καθιστούν ικανή να προσδένεται στα pre-trna, με υψηλή συγγένεια 100. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο η La διαχωρίζεται από τα 3 trailer μετά την επεξεργασία παραμένει άγνωστος. Εικόνα 8. Σχηματική απεικόνιση της ωρίμανσης των trna παρουσία της πρωτεΐνης La. H La απαιτείται για την ορθή πορεία ωρίμανσης των πρόδρομων trna. Η επεξεργασία γίνεται με την αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας (5 leader) από την ριβονουκλεάση P, το 3 άκρο (3 trailer) προστατεύεται από την La, από δράση εξωνουκλεασών ώστε να γίνει αφαίρεσή του από την RNase Z. Ακολουθεί το μάτισμα των ιντρονίων από το σύμπλοκο ΤSEN και η προσθήκη της 3 CCA αλληλουχίας με την μεσολάβηση του κατάλληλου ενζύμου (CCA-adding enzyme) Η La μια RNΑ-συνοδός πρωτεΐνη Ενώ η επεξεργασία των pre-trna λαμβάνει χώρα μέσα σε λίγα λεπτά, ο χρόνος ημίσειας ζωής της La είναι κάποιες ώρες 17, 76, 101, γεγονός που υποδηλώνει ό,τι η λειτουργία της επεκτείνεται πέραν της προστασίας του 3 άκρου των pre-trnas. Τα μικρότερα μόρια RNA, όπως trna, small nuclear RNA (snrna), ή small nucleolar RNA (snorna), συχνά υιοθετούν ειδικές δομές παρέχοντας την δυνατότητα αλληλεπίδρασης με πρωτεΐνες (RNA-binding proteins). Η αλληλεπίδραση αυτή είναι ζωτικής σημασίας για οποιοδήποτε μόριο RNA 102 για την υιοθέτηση της σωστής αναδίπλωσης. Οι πρωτεΐνες αυτές, γνωστές και ως RNA συνοδοί (RNA chaperones), είναι ικανές να βοηθήσουν αυτές τις δομικές αναδιατάξεις με έναν ΑΤΡ-ανεξάρτητο τρόπο, ώστε να υποστηρίζεται η αναδίπλωση και η σταθερότητα των RNA δομών 103. Μια τέτοια πρωτεΐνη είναι και η La. Επειδή, διευθύνει την ορθή τύχη πολλών 23

24 Εισαγωγή νεοσυντιθέμενων μορίων έχει προταθεί ότι λειτουργεί ως μοριακός συνοδός παρεμποδίζοντας την εσφαλμένη αναδίπλωση αυτών 85. Εικόνα 9. Μοντέλο της συμμετοχής της πρωτεΐνης La στο μονοπάτι της ωρίμανσης του trna 102. Η ιδιότητα αυτή της La διερευνήθηκε εκτενώς από τον Naeeni et al., 2012, και φάνηκε ότι βασίζεται στο RRM1 μοτίβο και συνδέθηκε με την ύπαρξη μίας «μη κανονικής» α3- έλικας μέσα σε αυτό. Η ανθρώπινη La, καθώς και η ομόλογη πρωτεΐνη του S. pombe, εξετάστηκαν με τη μεθοδολογία FRET (fluorescence resonance energy transfer) για την δυνατότητά τους να ενισχύουν την αποδιάταξη και την επαναδιάταξη ποικίλων μορίων RNA. Και οι δύο πρωτεΐνες εκδήλωσαν ιδιότητα RNA συνοδού ανεξάρτητα από την παρουσία αλληλουχίας UUU-OH στα υποστρώματα που εξετάστηκαν 45. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η La χρησιμοποιεί την ιδιότητα RNA συνοδού πρωτεΐνης, ώστε να προάγει τις αναδιπλώσεις εκείνες που ευνοούν την εκκίνηση της μετάφρασης. Τα περισσότερα mrna που ρυθμίζονται σε μεταφραστικό επίπεδο από τη La, περιέχουν στοιχεία IRES (Internal Ribosomal Entry Site) που είναι γνωστά για την τάση τους να αναδιπλώνονται σε πολύπλοκες δευτεροταγείς δομές. Πράγματι, σε πρόσφατη μελέτη, αποδείχθηκε ότι η ιδιότητα RNA συνοδού πρωτεΐνης είναι απαραίτητη για την προώθηση της IRES-διαμεσολαβούμενης μετάφρασης από τη La. Αυτή η παρατήρηση ενισχύει την υπόθεση ότι η La ήταν ο πρώτος γνωστός ITAF (IREStransacting factor) 73, 104, 105. Επιπλέον, η μελέτη αυτή χαρτογράφησε την ιδιότητα της συνοδού πρωτεΐνης στο C-τελικό άκρο της και αποκάλυψε πως η ιδιότητα αυτή ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης στη θρεονίνη 389 από την πρωτεϊνική κινάση AKT 73. H ιδιότητα της συνοδού-πρωτεΐνης έχει παρατηρηθεί και σε άλλα μέλη της υπεροικογένειας των LARP πρωτεΐνών, όμως η δομική βάση αυτής της δραστηριότητας παραμένει ασαφής. 24

25 Εισαγωγή H La και ο ρόλος της στα πρόδρομα μη κωδικά μόρια RNA Μέσα σε λιγότερο από μια δεκαετία από την αλληλούχηση του ανθρώπινου γονιδιώματος κατέστη σαφές ότι πάνω από το 90% των γονιδίων μας κωδικοποιούν μετάγραφα RNA που δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνες. Τα RNAs αυτά γνωστά και ως μη κωδικά μόρια RNA (non-coding RNAs, ncrnas) είναι εξαιρετικά πολύπλοκα, όσον αφορά την ποικιλομορφία και τη λειτουργία τους 106, 107. Διαφορετικές δομικές και λειτουργικές κατηγορίες των ncrna δρουν ως ρυθμιστές βασικών κυτταρικών διεργασιών, πολλές από τις οποίες συνδέονται με τον καρκίνο. Tα μη κωδικά αυτά RNA περιλαμβάνουν ριβοένζυμα, small nuclear RNAs (snrnas), small interfering RNAs (sirna), micrornas (mirna), και ένα πλήθος άλλων μικρών ρυθμιστικών μορίων ανάμεσα στα οποία συγκαταλέγονται τα long non-coding RNAs (lncrnas), PiWiinteracting RNAs (pirnas), Riboswitches (RNA διακόπτες) 108, καθώς και μια νέα ομάδα ρυθμιστικών μορίων, τα trfs (trna-derived fragments), τα οποία αναφέρονται ως λειτουργικά ncrnas, προερχόμενα από θραύση των trna 109. Εικόνα 10. Κατηγορίες non-coding RNA. Στην εικόνα παρουσιάζονται κατηγορίες μη κωδικών μορίων RNA. micrornas Τα micrornas (mirnas) είναι μικρά μη κωδικά RNAs, μήκους νουκλεοτιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών και διαφορετικών βιολογικών διαδικασιών 110. Μελέτες δείχνουν πως έχουν σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διαδικασίες όπως την ανάπτυξη, την διαφοροποίηση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση 111 H πλειοψηφία των mirnas, των θηλαστικών, κωδικοποιούνται από γονίδια που μεταγράφονται κυρίως από την RNA πολυμεράση II στον πυρήνα των κυττάρων, 25

26 Εισαγωγή ωστόσο μερικά απ αυτά μεταγράφονται και από την RNA πολυμεράση IIΙ 112. Από την μεταγραφή των γονιδίων αυτών προκύπτουν πρωταρχικά mirnas (primary-mirnas, pri-mirnas) με δομή φουρκέτας (hairpin), τα οποία περιέχουν στο 5 άκρο το κάλυμμα 7 MGpppG και στο 3 άκρο μία πολύ(a) ουρά. Τα pri-mirnas υπόκεινται σε μια αρχική μετα-μεταγραφική επεξεργασία από ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, που ονομάζεται microprocessor complex και αποτελείται από τις DROSHA-DGCR8, ώστε να ελευθερωθεί ένα πρόδρομο mirna (premature mirna, pre-mirna) μήκους ~70 νουκλεοτίδιων 113. H DGCR8 δεσμεύει τα πρωταρχικά μετάγραφα αναγνωρίζοντας τη δομή φουρκέτας και προσανατολίζει την ριβονουκλεάση ΙΙΙ (Drosha), η οποία τα διασπά δημιουργώντας ένα 5 -φωσφορικό άκρο και ένα 3 προεξέχον άκρο δυο νουκλεοτιδίων (nt). Τα μόρια αυτά εξάγονται από τον πυρήνα με την βοήθεια της ΕXPORTIN 5, μιας Ran GTPάσης εξειδικευμένης να μεταφέρει τα pre-mirnas από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα αναγνωρίζοντας τα προεξέχοντα άκρα. Στο κυτταρόπλασμα, ένα δεύτερο ένζυμο της οικογένειας RNAse III, η DICER, επεξεργάζεται το pre-mirna για να παραχθεί ένα παροδικό δίκλωνο μόριο mirna:mirna* (ds-rna) 113, 114. H Dicer έχει δραστικότητα ελικάσης (DExH-box RNA helicase-like domain), περιλαμβάνει 2 περιοχές με δραστικότητα ενδονουκλεάσης ΙΙΙ που λειτουργούν μαζί για να διασπάσουν τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς του dsrna, μία περιοχή πρόσδεσης σε δίκλωνο RNA, και μία PAZ περιοχή, μήκους περίπου 130 αμινοξέων, η οποία προσδένεται σε 3 μονόκλωνα άκρα δίκλωνων RNAs 115. Στον άνθρωπο, η Dicer δεν δρα μόνη της, αλλά σε συνεργασία με πρωτεϊνικούς συμπαράγοντες, όπως μέλη της οικογένειας AGO 116, 117, ή την πρωτεΐνη HIV-1 TAR RNA (TRBP) 118, 119. Ακολούθως, η δομή φουρκέτας-βρόγχου αποκόπτεται από το δίκλωνο mirna, αφήνοντας ένα μικρό δίκλωνο mirna. Το δίκλωνο αυτό μόριο ξετυλίγεται με τη βοήθεια δραστικότητας ελικάσης που διαθέτει η DICER και αποκόπτεται σε ένα ώριμο πλέον μονόκλωνο mirna (~20-25 νουκλεοτίδια). Το ώριμο mirna ενσωματώνεται στο σύμπλοκο RISC (RNA-induced silencing complex), όπου προσδένεται σε μια πρωτεΐνη της οικογένειας των αργοναυτών, AGO Σχηματίζονται έτσι τα miriscs, γνωστά και ως mirnps, τα οποία οδηγούνται στα mrna στόχους (Εικόνα 11). Το ανθρώπινο γονιδίωμα κωδικοποιεί τέσσερις Αgo πρωτεΐνες, ωστόσο μόνο η Αgo2 είναι καταλυτικά ενεργή και ικανή να διασπάσει τα συμπληρωματικά RNAs-στόχους. Tα mirnas που προέρχονται από τους 5' και 3' κλώνους των pre-mirnas αναφέρονται ως τα 5p και 3ρ mirna, αντίστοιχα. Η επιλογή του κλώνου mirna καθορίζεται από την θερμοδυναμική σταθερότητα των δύο άκρων του δίκλωνου mrna. Τα mirnps περιέχουν και άλλες πρωτεΐνες, όπως είναι η οικογένεια GW182, οι οποίες αλληλεπιδρούν με τις Ago και προωθούν την αποσιώπηση των γονιδίων-στόχων

27 Εισαγωγή Eικόνα 11. Μονοπάτι βιογένεσης των mirnas. Tο mirna μεταγράφονται ως pri-mirna από την RNA πολυμεράση ΙΙ και επεξεργάζεται μέσω του συμπλόκου Drosha/DGCR8. Μετατρέπεται σε pre-mirna και μεταφέρεται μέσω της Exportin-5 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εκεί, αναγνωρίζεται από τη Dicer και επεξεργάζεται περαιτέρω ως ώριμο mirnas. Ο οδηγός-κλώνος προσδένεται στο σύμπλοκο RISC, το οποίο περιέχει τις πρωτεΐνες DICER και Argonaute (AGO), ενώ ο άλλος κλώνος αποικοδομείται. Το mirisc κατευθύνεται για να στοχεύσει τα mrnas με συμπληρωματική αλληλουχία και να προκαλέσει καταστολή γονιδίων και καταστολή της μετάφρασης στα P-bodies 122. trna-derived fragments (trfs) Διάφορες μελέτες που βασίζονται στο προσδιορισμό της αλληλουχίας μικρών μορίων RNA από διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους ή διαφορετικούς ιστούς υποδηλώνουν ότι τα μονοπάτια βιογένεσης των trna και των μικρών μορίων RNA είναι αλληλένδετα. Αναφέρουν ότι τα pre-trna και τα ώριμα trna μπορεί να υποβληθούν σε επεξεργασία και να διακριθούν σε ξεχωριστά είδη μικρών RNA, τα οποία αναφέρονται ως θραύσματα trna (trna-derived fragments- trfs) 102. H λειτουργικότητα πολλών από αυτά τα θραύσματα παραμένει ακόμη ασαφής, αν και έχει αναφερθεί ότι παίζουν ρυθμιστικό ρόλο παρόμοιο με αυτό των mirnas. Συμμετέχουν, δηλαδή, σε ποικιλία κυτταρικών διεργασιών όπως στην απόπτωση, στη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Έχουν συσχετιστεί, επίσης, με νευροεκφυλιστικές διαταραχές, ιογενείς λοιμώξεις και φυσικά με τον καρκίνο, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να αποτελέσουν νέους μοριακούς στόχους για τη διαμόρφωση παθολογικών διεργασιών Επίσης, δύο πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν πως τα trfs που δημιουργούνται 27

28 Εισαγωγή κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης, δρουν ως μόρια σηματοδότησης ρυθμίζοντας τη γονιδιακή έκφραση στο έμβρυο 126, 127. Γίνεται, λοιπόν, σαφές πως τα μόρια αυτά δεν είναι προϊόντα τυχαίας διάσπασης των trnas, αλλά μόρια τα οποία παρουσιάζουν ρυθμιστικό ρόλο στα κύτταρα. Τα trfs ανακαλύφθηκαν πρώτη φορά σε καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων HeLa 128 και φαίνεται να διατηρούνται μεταξύ των ειδών, καθώς έχουν βρεθεί σε ιούς (Herpesvirus και HIV-1), βακτήρια, πρωτόζωα (Tetrahymena), φυτά (Hordeum vulgare), πτηνά, ποντίκια και ανθρώπους H βιογένεσή τους βρέθηκε να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο, τις συνθήκες και τα στάδια ανάπτυξης των κυττάρων 125, Τα trfs έχουν διαφορετικά μεγέθη και προέρχονται, είτε από τα πρόδρομα, είτε από τα ώριμα trna μόρια και στη διαδικασία παραγωγής τους διαμεσολαβούν σημαντικά ένζυμα της ωρίμασης του trna, όπως η RNase Z. Διακρίνονται στα 5 trf και 3 trf, γνωστά και ως trf σειράς 5 και 3 (trf-5 series και trf-3 series) και παράγονται από το 5 και 3 άκρο ώριμων trna, αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, τα trf-5 προέρχονται από το 5 άκρο του ώριμου trna, έπειτα από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο D-loop, πιθανότατα από το ένζυμο Dicer. Τα trf-3 προέρχονται από το 3 άκρο των trnas ύστερα από διάσπαση στον ΤψC-loop και περιέχουν τη 3 -CCA αλληλουχία του βραχίονα υποδοχής που φέρει το αμινοξύ. Το ένζυμο που εμπλέκεται πιθανότατα στην παραγωγή αυτών των trf είναι η Dicer, αν και δεν αποκλείονται και άλλοι ανεξάρτητοι της Dicer μηχανισμοί, όπως η διάσπαση μέσω της Angiogenin. Από τα πρόδρομα μετάγραφα των trnas διακρίνονται δύο κατηγορίες τα trfs της σειράς 1 (trf-1) και τα trf της σειράς 2 (trf- 2). Τα trf-1 χαρακτηρίζονται από τα poly-u κατάλοιπα και προέρχονται από το 3 άκρο των πρόδρομων trna μεταγράφων, έπειτα από διάσπαση από την trnase Z (elac2), ενώ, τα trf-2 περιέχουν το ιντρόνιο των pre-trnas. Τα trf-2 έχουν ταυτοποιηθεί πρόσφατα σε κύτταρα με μεταλλάξεις στο γονίδιο CLP1 (cleavage and polyadenylation factor I subunit 1), το οποίο απαιτείται για την λειτουργία του ΤSEN, του συμπλόκου που είναι υπεύθυνο για την απομάκρυνση του ιντρονίου από τα pre-trnas 136, 137. Επιπλέον, σε καταστάσεις στρες ανιχνεύθηκαν θραύσματα trna που αποκαλούνται trna halves (γνωστά και ως stess-dependent trfs ή ti-rnas), αργότερα παρατηρήθηκαν όμως και σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. Χωρίζονται σε 5 και 3 trna halves και προκύπτουν από διάσπαση στη θηλειά του αντικωδικονίου των ώριμων trnas. Στην κατηγορία αυτή αντιστοιχούν και τα SHOT-RNAs (Sex Hormone-dependent trnaderived RNA), τα οποία εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα καρκίνου του μαστού και του προστάτη 138, 139 (Εικόνα 12). 28

29 Εισαγωγή Eικόνα 12. Σχηματική απεικόνιση των θραυσμάτων trna (trfs). Διαφορετικοί τύποι trfs παράγονται από τα πρόδρομα trna (pre-trna) ή τα ώριμα trna (mature trna). Διάφορα ένζυμα φαίνεται να εμπλέκονται στη δημιουργία αυτών των θραυσμάτων, όπως η RNase Z, Dicer και η αγγειογενίνη. Tα trf-5 και trf-3, προέρχονται από την διάσπαση ώριμων trna και απεικονίζονται με γαλάζιο χρώμα και κόκκινο χρώμα, αντίστοιχα. Τα trf-1 απεικονίζονται με κίτρινο χρώμα και προέρχονται από πρόδρομα μετάγραφα των trna. Τέλος, παρουσιάζονται τα 5 trna halves και 3 trna halves με γκρί χρώμα, καθώς και τα SHOT-RNA (Sex Hormonedependent trna-derived RNA) με μωβ χρώμα 139. Τα τελευταία χρόνια ποικίλες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σχετικά με την λειτουργία των trfs, τον υποκυττάριο εντοπισμό τους καθώς και τον ρόλο τους στις ασθένειες. Δεδομένου ότι πολλά trfs μοιράζονται παρόμοια χαρακτηριστικά με τα sirnas και mirnas, πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν επικεντρωθεί στην ταυτοποίηση των Argonaute πρωτεϊνών που συνδέονται με τη λειτουργία των trfs. Στην εικόνα 13 παρουσιάζονται μερικές από τις πιθανές λειτουργίες τους, ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης τους παραμένει σε γενικές γραμμές άγνωστος. 29

30 Εισαγωγή Eικόνα 13. Σχηματική απεικόνιση των θραυσμάτων trna (trfs) και των λειτουργιών που έχουν συσχετιστεί με αυτά.. Η La και τα μετάγραφα mirnas - trfs Ενώ, οι πρωτεΐνες La δεσμεύουν με υψηλή συγγένεια RNA που περιέχουν αλληλουχία UUU-OH, όπου συμμετέχει το μοτίβο La και το RRM1, το εύκαμπτο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης επιτρέπει την αλληλεπίδραση και με άλλα στοιχεία RNA. Πρόσφατες μελέτες σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές αποκάλυψαν πως η καθολική έκφραση των mirnas προάγεται από την πρωτεΐνη La 65. Έχει προταθεί ότι η δραστικότητα της πρωτεΐνης Ago2, μια PIWI-ομόλογη πρωτεΐνη, η οποία αποτελεί το ενεργό μέλος του συμπλόκου του RISC (sirna-mediated silencing complex), που χρησιμοποιεί το sirna για να κατευθύνει το κοψιμο των mrna, μπορεί να ενισχυθεί από την La. Στοιχεία που παρουσιάστηκαν αργότερα αποδεικνύουν τον επιπρόσθετο ρόλο της La στο μονοπάτι αποσιώπησης των mirnas (mirna-mediated silencing pathway). Συγκεκριμένα, αναφέρεται ότι η La σταθεροποιεί και ρυθμίζει τα πυρηνικά πρόδρομα mirna (premirnas), καθώς προσδένεται με ένα UUU-ανεξάρτητο τρόπο στις stem Loop δομές, ο οποίος αποδίδεται στο RRM2a μοτίβο

31 Εισαγωγή Τα τελευταία αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η La παρεμποδίζει τα pre-trnas, τα οποία έχουν την τάση να μην αναδιπλώνονται σωστά, να παρεμβαίνουν στο μονοπάτι των pre-mirna. O D. Hasler και οι συνεργάτες του, ερεύνησαν τις πιθανές συνέπειες της απώλειας της La στην ωρίμανση του trna και το σχηματισμό των trfs. Έτσι, απομόνωσαν από κυτταρικά εκχυλίσματα σύμπλοκα RISC, τα οποία περιλαμβάνουν τις Argonaute πρωτεΐνες και μελέτησαν τα προσδεδεμένα μικρά μόρια RNA, απουσία ή παρουσία της La. Παρατήρησαν ότι μικρά μόρια RNA μήκους nt δεσμεύονται στο RISC μόνο απουσία της πρωτεΐνης La. Αυτά τα μικρά RNA ήταν κομμάτια από το 3 άκρο των trnas. Mερικά pre-trnas υποβάλλονται σε εναλλακτική αναδίπλωση σχηματίζονται βρόγχους (stem loop), δομές οι οποίες αναγνωρίζονται από την exportin-5, με αποτέλεσμα να εξέρχονται στο κυτταρόπλασμα, να επεξεργάζονται από την Dicer και να φορτώνονται στο σύμπλοκο RISC. Πιθανότατα, τα μόρια αυτά να λειτουργούν στο μονοπάτι των mirnas και να οδηγούν το RISC σε εσφαλμένους στόχους. Βασισμένοι σ αυτά τα αποτελέσματα, η ίδια ερευνητική ομάδα προτείνει ένα μοντέλο στο οποίο η La προσδένεται στα pre-trnas και τα αποτρέπει από την τάση τους για εσφαλμένη αναδίπλωση και την δρομολόγηση τους στο μονοπάτι των mirnas 102, 140. Έτσι η La χρησιμοποιεί την λειτουργία της ως συνοδoύ πρωτεΐνης για να διασφαλίσει την σωστή επιλογή των RNA στα μονοπάτια (Εικόνα 14). Εικόνα 14. A) Μοντέλο ρυθμιστικού ρόλου της La. Η La λειτουργεί ως φύλακας για την σωστή επεξεργασία και την διασφάλιση της ορθής επεξεργασίας των pre-trnas σε ώριμα trnas (αριστερά). Ορισμένα pre-trna fragments μπορεί να ξεφύγουν τον έλεγχο και να υποβληθούν σε επεξεργασία από Dicer σε mirnas (δεξιά). B) Μοντέλο λειτουργίας RNA συνοδών πρωτεϊνών για την επιλογή σωστού μονοπατιού. Ορισμένα μετάγραφα έχουν την δυνατότητα να αναδιπλώνονται σε εναλλακτικές δομές. Το λάθος αναδιπλούμενο RNA μπορεί τότε να υποστεί επεξεργασία και να διοχετευθεί σε μονοπάτια με πιθανότατα επιβλαβείς συνέπειες. Οι RNA συνοδοί βοηθούν τα RNAs να υιοθετήσουν τη σωστή δομή και διασφαλίζουν ότι εκπληρώνει την πραγματική τους λειτουργία, χωρίς να παρεμποδίζεται από μηχανισμό ανταγωνιστικών οδών

32 Εισαγωγή Στην ίδια μελέτη, αναφέρουν ότι ένα συγκεκριμένο πρόδρομο trna, το pre-trna-ile (pre-trna-ile-tat-2-3) μπορεί να ξεφύγει μερικώς από τη ρύθμιση της La. Το pre-trna- Ile μπορεί να δημιουργήσει ένα λειτουργικό trna-ile, εφόσον είναι αμινοακυλιωμένο και επιπλέον, μπορεί να παράγει το mir-1983, από το 3' άκρο του trna. Ωστόσο, το συγκεκριμένο pre-trna-ile έχει πλήρη συμπληρωματικότητα μεταξύ του 3 trailer και του 5 leader και μπορεί να σχηματίσει ένα δίκλωνο μόριο (dsrna) (Εικόνα 15) με αποτέλεσμα να διαφύγει από τον έλεγχο της La, καθώς το μοτίβο της πρωτεΐνης δεν αναγνωρίζει αυτή τη δομή. Έτσι, η σύνδεση της La ανταγωνίζεται τον σχηματισμό dsrna και η συγγένεια της αλληλεπίδρασης μειώνεται σημαντικά. Έτσι, επιτρέπεται η εναλλακτική αναδίπλωση του dsrna και αναγνώρισή του ως προδρόμου mirna από την Xpo5. Η επακόλουθη εξαγωγή επιτρέπει την επεξεργασία από την Dicer και την φόρτωση του στις Ago πρωτεΐνες 140. Εικόνα 15. Σχηματική αναπαράσταση δομής trna-ile-tat-2-3. Η La συνδέεται ασθενέστερα με το pre-trna-ile-tat-2-3 παρά με το trna-ile-tat-2-3 με μονόκλωνο 3 άκρο 140 Η La και σχετιζόμενα μη κωδικά RNA μόρια Η ανθρώπινη La εκτιμάται ότι υπάρχει σε 2x10 7 αντίγραφα ανά κύτταρο 141. Αυτό σημαίνει ότι είναι σχεδόν τόσο άφθονη όσο μία ριβοσωμική πρωτεΐνη. Πειράματα με ανοσοφθορισμό αποκάλυψαν ότι φαινομενικά σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και σε όλα τα είδη, η La περιορίζεται κατά κύριο λόγο στον πυρήνα. Μέσα στον πυρήνα, η La εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασμα όσο και στον πυρηνίσκο 17, 101, 142, 143. Ο εντοπισμός της αυτός έχει συσχετιστεί με το προφίλ φωσφορυλίωσή της. Σύμφωνα με αυτό, η La αποτελείται από πολλαπλές φωσφορυλιωμένες ισομορφές που βρίσκονται στο πυρηνόπλασμα, στους πυρηνίσκους και στο κυτταρόπλασμα, συνδεδεμένες με διαφορετικά μόρια RNA. Η φωσφορυλιωμένη La (pla) στη θέση Ser-366, σχετίζεται με τα pre-trnas 75. Ωστόσο, η μη φωσφορυλιωμένη La (np-la) αναφέρεται ότι είναι τόσο κυτταροπλασματική και προσδένεται σε ειδικά mrnas, όσο και ότι είναι συγκεντρωμένη 32

33 Εισαγωγή στον πυρηνίσκο (Εικόνα 17). Δεδομένα από πειράματα με FRET (fluorescence resonance energy transfer) δείχνουν ότι η npla αλληλεπιδρά με την νουκλεολίνη και ό,τι το μοτίβο SBM της La είναι αυτό που απαιτείται για αποτελεσματική αλληλεπίδραση 52, 75. Παρ όλα αυτά, η απόδειξη ότι η La επιδρά λειτουργικά στη βιογένεση του rrna παραμένει άγνωστη. Επιπλέον, αναφορές για δέσμευση της La με μη κωδικά μόρια RNA έχουν γίνει στον οργανισμό S. cerevisiae, όπου βρέθηκε να δεσμεύει μερικά RNAs που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II, όπως U1, U2, U3, U4 και U5 presnrnas 144, 145. Όταν απουσιάζει η La εντοπίζονται αλλαγές στα επίπεδα και τα μεγέθη αυτών. Έτσι, θεωρήθηκε ότι η ειδική δέσμευση από τη La σταθεροποιεί, τόσο τα πρόδρομα RNA U1, U2, U4, U5 που συμμετέχουν στη διαδικασία του ματίσματος (spliceosome), όσο και τα μικρά RNA μόρια που εντοπίζονται στον πυρηνίσκο (snorna). Τέλος, αναφορά έχει γίνει για δέσμευση της La στο U1 σε ανθρώπινα κύτταρα Κυτταροπλασματική La Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (Εικόνα 5), η πρωτεΐνη La περιέχει πολλαπλά στοιχεία υποκυτταρικής διακίνησης, όπως το NLS και NRE. Το NLS απαιτείται για την ικανότητα της La να εισάγεται στον πυρήνα, ενώ το NRE απαιτείται για πυρηνική παρακράτηση της La 48, 49, γεγονός που υποδηλώνει την εξαγωγή της πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα. Έχει βρεθεί, λοιπόν, ότι ενώ υπό φυσιολογικές για το κύτταρο συνθήκες, εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να ανακατανέμεται και να συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Ο ρόλος της στο κυτταρόπλασμα σχετίζεται με τον μεταβολισμό κυτταρικών και ιικών RNA σε θέσεις της 5 αμετάφραστης περιοχής, οι οποίες περιλαμβάνουν εσωτερικές θέσεις εισόδου του ριβοσώματος (IRES) 43, , 148, 5' τερματικές ολιγοπυριμιδίνες (5' TOPs) ή ανοδικά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (Upstream open reading frame- uorfs) 30. Για την εξαγωγή της στο κυτταρόπλασμα, έχουν ενοχοποιηθεί συνθήκες στρες, όπως είναι η έκθεση σε UV ακτινοβολία 149, η χορήγηση οξειδωτικών παραγόντων , 152, η μόλυνση από ιούς και η απόπτωση 49, 55, 57, 60, 61. Πειράματα αναφέρουν, ότι κατά την μόλυνση θηλαστικών κυττάρων από τον ιό της πολιομυελίτιδας ένα τμήμα της πρωτεΐνης αναδιανέμεται στο κυτταρόπλασμα 153. Αυτό συμβαίνει επειδή μία πρωτεάση του ιού (poliovirus specific protease 3C, 3Cpro), αποκόπτει κομμάτι της C-τελικής περιοχής της La, απομακρύνοντας έτσι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού 151. Επιπλέον, πειράματα ανοσοφθορισμού σε λευχαιμικά κύτταρα, στα οποία είχε χορηγηθεί χημειοθεραπευτικός παράγοντας, αλλά και σε HeLa κύτταρα, τα οποία είχαν ακτινοβοληθεί (UV irradiation), έδειξαν ότι η La διασπάται σε ένα θραύσμα των 43 kda, κατά της διάρκειας της απόπτωσης και ανακατανέμεται στο κυτταρόπλασμα. Προτείνουν δε ότι η La χάνει την 33

34 Εισαγωγή περιοχή NLS στο C-τελικό άκρο από πρωτεολυτική διάσπαση κατά την απόπτωση, από μια κασπάση 55. Αλληλεπίδραση της La με ιϊκά RNA Η πρώτη αναγνωρισμένη αλληλεπίδραση της La με RNA διαφορετικό από τα προϊόντα της RNA Pol III, ήταν το RNA του ιού της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (Vesicular Stomatitis Virus-VSV) 154 και ακολούθησε αυτό του ιού RSV (Respiratory Syncytial Virus). Συγκεκριμένα, η δέσμευση της La στο RNA του ιού RSV λειτουργεί ως ασπίδα προστασίας, αποτρέποντας την αναγνώριση του ιικού RNA από τον ενδογενή υποδοχέα RIG-I. Η αναγνώριση του ιικού RNA από τον RIGI πυροδοτεί ένα μονοπάτι που έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι. Έτσι, η αλληλεπίδραση της La με το ιικό RNA εμποδίζει την αντιική απόκριση του ξενιστή.to RΝΑ αυτό έχει τερματικά κατάλοιπα ουριδίνης και δεσμεύεται σε πρώιμα στάδια με την La κατά τη μόλυνση 155. Η μόλυνση RSV προκαλεί ανακατανομή της La στο κυτταρόπλασμα και η δέσμευσή της στο ιϊκό RNA διευκολύνει τον πολλαπλασιασμό του ιού. Άλλοι ιοί που έχουν καταγραφεί για συσχέτιση με την La είναι ο ιός parainfluenza, της πολιομυελίτιδας 69, 151, της πανώλης των βοοειδών 156, της λύσσας 157, του Δάγκειου πυρετού (DENV) 152, της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) 158, της ηπατίτιδας Β (HBV) 67 και της ηπατίτιδας C (HCV) 159, 160. Η La και το Internal Ribosomal Entry Site (IRES) Κάποιοι από τους προαναφερόμενους ιούς, συμπεριλαμβανομένου και του ιού της πολιομυελίτιδας, παρατηρήθηκε ότι δεν έχουν cap-εξαρτώμενη εκκίνηση μετάφρασης και αντ αυτού χρησιμοποιούν ένα δομικό στοιχείο IRES στη 5 UTR περιοχή που περικλείει την θέση έναρξης AUG. Τέτοιες αλληλουχίες ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 1988 στα RNA των ιών της πολιομυελίτιδας και της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας από τους Sonenberg N. και Wimmer E, αντίστοιχα 161, 162. Η La ήταν ο πρώτος τέτοιος παράγοντας που βρέθηκε ότι προήγαγε την IRES-διαμεσολαβούμενη έναρξη μετάφρασης στους ιούς, το οποίο αποδείχτηκε in vivo στον HCV 104, 153, 163. Μέχρι το 2009 είχαν ταυτοποιηθεί πάνω από 60 mrna θηλαστικών που περιείχαν IRES. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις, τα στοιχεία αυτά εντοπίζονται σε mrna που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σχετικές με την επιβίωση των κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες. Όταν η φυσιολογική εκκίνηση της μετάφρασης (Cap-dependent translation) παρεμποδίζεται σε συνθήκες, όπως η απόπτωση και το γονιδιοτοξικό στρες, 34

35 Εισαγωγή η μετάφραση μέσω των IRES στοιχείων λαμβάνει χώρα ως μηχανισμός «fail-safe mechanism» για την προώθηση της μετάφρασης 164, 165. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η μετάφραση ξεκινάει από το 5 άκρο ενός mrna, καθώς η αναγνώριση της 5 καλύπτρας είναι απαραίτητη για την συναρμολόγηση του συμπλόκου εκκίνησης της μετάφρασης (cap-dependent translation) στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. Ωστόσο, η ύπαρξη ενός σημείου δέσμευσης του ριβοσώματος καθοδικά του σημείου έναρξης της μετάφρασης (Internal Ribosome Entry Site, IRES) μπορεί να παρακάμψει τον κλασσικό τρόπο εκκίνησης της μετάφρασης. Οι αλληλουχίες IRES περιγράφονται ως ξεχωριστές περιοχές στο mrna, πλούσιες σε αναδιπλώσεις. Βρίσκονται στην 5 αμετάφραστη περιοχή (5 UTR) ενός mrna και έχουν την ικανότητα να προσελκύουν το ευκαρυωτικό ριβόσωμα και να διευκολύνουν την έναρξη της μετάφρασης (Εικόνα 16). Η διαδικασία αυτή έγινε γνωστή ως εσωτερική εκκίνηση της μετάφρασης (IRES mediated translation) 165. Εικόνα 16. Internal Ribosome Entry Site. Ξεχωριστές αλληλουχίες στο mrna πλούσιες σε αναδιπλώσεις, προσελκύουν το ευκαρυωτικό ριβόσωμα και διευκολύνουν την έναρξη μετάφρασης. Η ύπαρξη των ΙRES στα mrna των θηλαστικών, κίνησε το ενδιαφέρον των επιστημόνων για την συσχέτιση τους με τη La. Η La, λοιπόν, χρησιμοποιεί την 26, 28, 30, δραστικότητά της, ως RNA-συνοδός πρωτεΐνη και προσδένεται στα mrna αυτά 166, 167. Βιοχημικές μελέτες υποδηλώνουν ότι η La λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής της IRES-διαμεσολαβούμενης μετάφρασης, έπειτα από την παρεμπόδιση παραγόντων όπως eif4e-, PABP-cap-dependent που ενισχύουν την cap-dependent μετάφραση 168, 169. Στις περισσότερες των περιπτώσεων, η ανθρώπινη La δεσμεύεται στις αλληλουχίες IRES που υπάρχουν στο 5 UTR των mrnas και προάγει την μετάφρασή τους. Μερικά από τα mrna που έχουν μελετηθεί είναι της CcnD1 26, της LaminB1 28, του MDM2 30 και της πρωτεΐνης Binding immunoglobulin protein (BiP) 166. Η ενισχυτική αυτή δράση 35

36 Εισαγωγή βρέθηκε και στο mrna του παράγοντα Nrf2, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση αντιοξειδωτικών γονιδίων. Συγκεκριμένα, σε κύτταρα στα οποία χορηγήθηκε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2O 2), παρατηρήθηκε συσσώρευση της La στο κυτταρόπλασμα και πρόσδεσή της στην 5 -UTR περιοχή του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2, που υπάρχει θέση για εσωτερική εκκίνηση της μετάφρασης (IRES), η οποία ενεργοποιείται με τη συμβολή της La 150. Στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της La με πρωτεΐνες του ριβοσώματος παρουσία του H 2O 2. Ωστόσο, εξαίρεση αποτελεί ο φυλοσύνδετος αναστολέας της απόπτωσης (X-linked inhibitor of apoptosis XIAP), όπου πρόσδεση της La αναστέλει τη μετάφραση του 27. Αλληλεπίδραση της La με ΤΟP mrnas Ως oligo(u) δεσμευόμενη πρωτεΐνη, η La πιθανόν να παίζει ρόλο στην μετάφραση των mrnas που διαθέτουν 5 -ολιγοπυριμιδινική αλληλουχία (TOP mrnas) 170, 171. Αυτή η ενδιαφέρουσα κατηγορία των mrnas φέρει 4-14 κατάλοιπα πυριμιδινών που ακολουθούνται από περιοχές πλούσιες σε GC, γειτονικά του 5 m 7 Gppp cap και κωδικοποιούν πρωτεΐνες που απαιτούνται για την σύνθεση των ριβοσωμάτων και άλλων συστατικών της μεταφραστικής συσκευής, ώστε να διασφαλιστούν οι απαιτήσεις του κυττάρου για ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό 172. Όταν αναστέλλεται η κυτταρική ανάπτυξη, η μετάφραση των εν λόγω mrnas καταστέλλεται 170. Μελέτες υποδηλώνουν ότι η μη φωσφορυλιωμένη (non-phoshoser-366) κυτταροπλασματική ισομορφή της ανθρώπινης La έχει ειδική συσχέτιση με τα 5 ΤΟP mrnas, καθώς αναγνωρίζει το 5' GpppN cap 43, 71. Πειράματα σε μια κυτταρική σειρά του οργανισμού X. laevis δείχνει ότι η αγρίου τύπου La αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης των 5 TOP mrnas από 40 έως 50% σε κύτταρα μη μεταβολικά ενεργά. Ωστόσο, άλλη μελέτη σε ανθρώπινα κύτταρα δείχνει ότι, η δέσμευση των 5' TOP mrnas από την nonphospho-la έχει ανασταλτική ρύθμιση στη μετάφραση τους, ενώ μετέπειτα πειράματα δεν αποκαλύπτουν καμία απολύτως επίδραση 173. Από τα παραπάνω υπάρχουν ενδείξεις ότι η La επιλέγει τους προσδέτες της ανάλογα με την κατάσταση φωσφορυλίωσής της. Συγκεκριμένα, φωσφορυλίωση της La από την κινάση, CK2 (Casein kinase 2), στη σερίνη 366, ενεργοποιεί την δράση της στα μόρια trna, ενώ όταν αποφωσφορυλιώνεται, καταστέλλει τη μετάφραση των TOPs mrnas, όπως αυτό της ριβοσωματικής πρωτεΐνης L37 (rpl37) 77 (Εικόνα 17). 36

37 Εισαγωγή Εικόνα 17. Μοντέλο ρυθμιστικού ρόλου της πρωτεΐνης La. Η La φωσφορυλιωμένη στη Ser366 (pla, κίτρινο) είναι παρούσα στο νουκλεοπλάσμα (Ν) και σχετίζεται με πρόδρομα προϊόντα της RNA πολυμεράσης III (pol III). Οι συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του La motif και του RRM1 της La επιτρέπουν τη δέσμευση σε τερματικά ουριδιλικά κατάλοιπα των RNA μεταγράφων της pol ΙΙΙ. Στο κυτταρόπλασμα (C), η μη φωσφορυλιωμένη La (npla, κόκκινο) σχετίζεται με τα mrnas, πιθανώς με τα 5 'TOP mrnas που κωδικοποιούν ριβοσωμικές πρωτεΐνες, αλλά και άλλα δομικά στοιχεία, όπως τα IRES. Επίσης, η npla εντοπίζεται στον πυρήνα (κόκκινη περιοχή εντός του Ν) όπου μπορεί να συσχετιστεί με snornas ή / και άλλους παράγοντες που εμπλέκονται στη βιογένεση του ριβοσώματος 42, 75, Η La στον καρκίνο Μετά την αναγνώριση της La ως αυτοαντιγόνο σε διαταραχές του ανοσοποιητικού (SLE, σύνδρομο Sjögren) και παρά το γεγονός ότι παραμένει ακόμα ασαφής η αιτία της δημιουργίας των αντισωμάτων έναντι αυτής, αρκετές μελέτες επικεντρώθηκαν στην εύρεση του ρόλου της La στον καρκίνο. Ο ογκογόνος ρόλος τηs La έχει αποδοθεί στα IRES-διαμεσολαβούμενα γονίδια στόχους της, όπως BiP, MDM2, CyclinD1, των οποίων τα επίπεδα έκφρασης μεταβάλλονται σε κακοήθειες Τα τελευταία χρόνια, έχει αποκαλυφθεί ότι η La συμμετέχει σε διάφορους τύπους καρκίνου 177. Η αυξημένη έκφραση της La έχει μελετηθεί στον καρκίνο του πνεύμονα 178, του τραχήλου της μήτρας 179, της στοματικής κοιλότητας 180, καθώς και σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία 30. Ωστόσο, τα ευρήματα αυτά έθεσαν το ερώτημα πώς η La προάγει την παθογένεση του όγκου, έτσι τα τελευταία χρόνια κατέστη σαφές ότι η πρωτεΐνη La διεγείρει τον πολλαπλασιασμό, τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων in vitro 26, 180, καθώς και την ανάπτυξη του όγκου in vivo

38 Εισαγωγή Παρόλα αυτά, ο μηχανισμός δράσης της La με τον οποίο συμβάλει στην καρκινογένεση παραμένει ασαφής. Εικόνα 18. Σχηματική αναπαράσταση της εμπλοκής της La στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Η ενεργοποίηση του PDGFRa από τον PDGFA/B ενεργοποιεί τη μετατόπιση της La/SSB από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Η La δρα ως ΙΤΑF και δεσμεύεται στην 5 UTR του mrna της LAMB1 για ενίσχυση της μετάφρασης μέσω του IRES. Η LAMB1 στη συνέχεια συμμετέχει σε ένα μονοπάτι που καταλήγει στη φωσφορυλίωση του Rho associated coiled-coil containing protein kinase 2 (ROCK2) και την έκφραση της Κeratin 19 (K19) 181. Μια σειρά από ευρήματα που αποδεικνύουν τον ογκογόνο ρόλο της La αναφέρονται παρακάτω. Αρχικά, η La αποδείχθηκε ότι ενεργοποιεί την IRES-εξαρτώμενη μετάφραση του XIAP που υποστηρίζει την ογκογένεση με την αναστολή της απόπτωσης 27. Ακόμη, το 2009 ο Brenet F. και οι συνεργάτες του προτείνουν ότι η La θα μπορούσε να εμπλέκεται στην ογκογένεση, μέσω της ανώμαλης ενεργοποίησης της ΑΚΤ σε καρκινικά κύτταρα, καθώς η εξαρτώμενη από AKT μετακίνηση της La στο κυτταρόπλασμα οδηγεί σε μεταφραστική ενεργοποίηση ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου mrna των γλοιακών κύτταρων 74. Μελέτες που ακολούθησαν κάνουν αναφορά στη ρύθμιση, από την La, της IRES-μεσολαβούμενης έκφρασης της κυκλίνης D1 που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα HeLa 26. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο δείχνουν ότι η δέσμευσή της στην ΙRES αλληλουχία του mrna της λαμινίνης B1, ενισχύει την μετάφραση που οδηγεί στην 38

39 Εισαγωγή μετάπτωση του επιθήλιου σε μεσέγχυμα (Epithelial to Mesenchymal Transition-ΕΜΤ) 28, 167. Επίσης, σε λευχαιμικά κύτταρα και μυελοϋπερπλαστικά νεοπλάσματα, η La διεγείρει την μετάφραση του mrna του MDM2, αρνητικός ρυθμιστής του μεταγραφικού παράγοντα p53, καθώς αναγνωρίζει δομικά στοιχεία RNA τοποθετημένα εντός της 5' UTR περιοχής 30. Τέλος, δυο πρόσφατες μελέτες ενισχύουν τον ρόλο της La στον καρκίνο. Η πρώτη παρουσιάζει την La ως νέο παράγοντα που συμβάλλει στην ανθεκτικότητα στο χημειοθεραπευτικό παράγοντα σισπλατίνη, συνεισφέροντας στην ανθεκτικότητα των κυττάρων HNSCC (head and neck squamous cell carcinoma cells). Επιπλέον, συσχέτισαν την αποσιώπηση της La με τη μειωμένη έκφραση του BCL2 και την αυξημένη ευαισθησία στη σισπλατίνη. Οι in vitro και βασισμένες σε κύτταρα δοκιμασίες τους υποδεικνύουν, ότι η πρωτεΐνη La δεσμεύεται και αναδιαμορφώνει δευτερογενείς δομές σε μικρή απόσταση από τη θέση έναρξης της μετάφρασης του BCL2 και διεγείρει την μετάφραση του mrna 182. Τέλος, βάσει της δεύτερης μελέτης προτείνεται ένα σχηματικό μοντέλο (Εικόνα 18) για το πως ο λειτουργικός ρόλος της La ενισχύει τον «καταρράκτη» PDGFRα-Lamnin B1-keratin 19 και οδηγεί στην εξέλιξη του όγκου σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνο

40 Εισαγωγή 40

41 ΣΚΟΠΟΣ Από την ανακάλυψη της πρωτεΐνης La, ως αυτοαντιγόνο σε ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και systemic lupus erythematosus, SLE) μέχρι σήμερα, έχει γίνει αντιληπτό ότι αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα στη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, καθώς η συμβολή της είναι καθοριστική για την τύχη πολλών μορίων RNA. Τα τελευταία χρόνια κατέστη σαφές ότι η πρωτεΐνη La παρουσιάζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης σε καρκινικά κύτταρα. Σκοπός της εργασίας αυτής, ήταν να ερευνήσουμε τη βιοχημική και κυτταρική συμπεριφορά της SSB/La σε διάφορες συνθήκες στρες, τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε επίπεδο μετάφρασης, στον καρκίνο του πνεύμονα. Να μελετηθεί ο ενδοκυττάριος εντοπισμός της έπειτα από επαγωγή στρες αλλά και να διευκρινιστεί περαιτέρω η συμβολή της στην παθογένεση του όγκου, μελετώντας το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την ωρίμανση και διακίνηση του trna, τη βιογένεση mirnas και συγκεκριμένα mirnas και trfs τα οποία έχουν αυξημένη έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα, όπου η La φαίνεται να συμμετέχει ενεργά. 41

42

43 2. Υλικά & Μέθοδοι

44

45 Υλικά & Μέθοδοι Α. ΥΛΙΚΑ 2.1 Χημικά-Αντιδραστήρια Πίνακας 1. Αναλώσιμα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ΥΛΙΚΑ Acetic acid Acrylamide Agar Agarose Ammonium persulfate Bis-acrylamide b-mercaptoethanol Bromophenol blue Calcium Chloride Chloroform Coomassie G250 Coomassie R250 DEPC Dialysis Tubing Di-sodium hydrogen phosphate DMEM DMSO (Διμεθυλο-σουλφοξείδιο) dntps ECL kit EDTA Ethanol 99% denatured Ethanol Abs FBS Fetal Bovine Serum Gel Red Glycerol Hepes Hoechst HydroChloric acid Kanamycin Magnesium chloride hexahydrate Magnesium sulfate Methanol Methylene-bisacrylamide Mitotracker Na 2HPO4. 2H 2O N-N methylane bis-acrylamide PBS (Phosphate Buffer) PEPTONE Peptone Enzymatic Digest Phenol Phenol equilibrated, stabilized Penicillin/Streptomycin Propidium iodide Protein Ladder PVDF SDS Sodium acetate trihydrate ΕΤΑΙΡΕΙΑ MERK SIGMA - ALDRICH SERVA Biorad SERVA SERVA SERVA SIGMA - ALDRICH MERCK MERCK FLUKA PANREAC APPLICHEM RESEARCH ORGANICS SIGMA MERCK BIOSERA SIGMA - ALDRICH BIOLINE BIO-RAD SERVA APPLICHEM MERCK BIOSERA BIOTIUM DUCHEFA SIGMA - ALDRICH THERMO FISHER SCIENTIFIC MERCK SERVA MERCK MERCK CHEM-LAB SERVA THERMO FISHER SCIENTIFIC MERCK SERVA TAKARA MERCK SIGMA MERCK APPLICHEM BIOSERA SIGMA - ALDRICH NEB MACHEREY-NAGEL SERVA MERCK 45

46 Υλικά & Μέθοδοι Sodium Chloride TEMED Tris Tris ultrapure Triton-X-100 Trypsin EDTA 10X Tryptic Soy broth Turbofect Tween-20 Xylene cyanol Yeast extract SIGMA RESEARCH ORGANICS DUCHEFA APPLICHEM MERCK BIOSERA BIOLIFE THERMO FISHER SCIENTIFIC SIGMA - ALDRICH SERVA SIGMA 2.2 Ένζυμα Πίνακας 2: Ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν για την παρούσα εργασία Όνομα DNase I BamHI XhoI T4 DNA Ligase Recimbinant Rnase Inhibitor 2G FAST Taq DNA Polymerase BioScript Reverse Transcriptase E.coli Poly(A) polymerase KAPA HiFi DNA Polymerase Εταιρεία NEB NEB TAKARA NEB TAKARA KAPA BIOSYSTEMS BIOLINE AMBION KAPA BIOSYSTEMS 2.3 Θρεπτικά μέσα και Διαλύματα Παρακάτω αναφέρεται η σύσταση των βασικών διαλυμάτων και θρεπτικών που χρησιμοποιήθηκαν για την περάτωση των πειραμάτων. Υγρό θρεπτικό μέσο (LB Lysogeny Broth): Σε τελικό όγκο 1L: 10g πεπτόνη (Bacteriological peptone), 5 g εκχυλίσματος ζύμης (yeast extract powder), 10 g χλωριούχου νατρίου (Sodium Chloride). ph=7.4 (Ρύθμιση με διάλυμα NaOH). Στερεό θρεπτικό μέσο (LB- άγαρ) Σε τελικό όγκο 1L: 10 g πεπτόνη (Bacteriological peptone), 5 g εκχυλίσματος ζύμης (yeast extract powder), 10 g χλωριούχου νατρίου (Sodium Chloride), 15 gr άγαρ. 46

47 Υλικά & Μέθοδοι 100 mg/ml Καναμυκίνης: Σκόνη καναμυκίνης διαλύεται σε κατάλληλη ποσότητα αποστειρωμένου ddh 2O, φιλτράρεται (μικροφίλτρου 0.2 μm) και διατηρείται στους -20 C σε μικρές ποσότητες (aliquots). 10Χ Buffered Saline PBS: Σε τελικό όγκο 1 L: 137mM NaCl, 2.2 mm KCl, 10mM NaH 2PO 4, 2Mm KH 2PO 4. ph=7,4 (Ρύθμιση με HCl). Για PBS 1X: Σε τελικό όγκο 1L: Προσθήκη 100ml 10Χ PBS σε 800ml ddh 2O. Ρύθμιση ph στην τιμή 7.4 µε την προσθήκη HCl. PBS-Tween 0,1% Σε τελικό όγκο 50ml: Προσθήκη 50ml 1X PBS και 0.05ml Tween-20 Παραφορμαλδεϋδη (PFA) 4% 20gr PFA σε τελικό όγκο 500ml 1X PBS (ph 7.4). Το διάλυμα αφήνεται υπό ανάδευση στους 65 C, έως ότου διαλυτοποιηθεί πλήρως η ουσία. Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (50x) Για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης. Σε όγκο 1L 242 gr Tris base, 57,1 ml Οξικό οξύ και 100ml EDTA 0,5M ph 8. DNA Loading Buffer/Dye (6X) Σε τελικό όγκο 40ml: 100 mg Bromophenol Blue, 100 mg Xylene Cyanol FF, 6 g Ficoll Διάλυμα RIPA-Lysis Buffer 150 mm NaCl, 50 mm Tris-Cl, ph 7.5, 1% NP-40, 0,5% Triton X-100, 1 mm EDTA ph8.0 και 0.5% δεοξυχολικό άλας του νατρίου (Sodium Deoxycholate) το οποίο περιείχε 1mM Dithiothreitol (DTT) και αναστολείς πρωτεασών - 1 μg/ml απροτινίνη (aprotinin), 1 μg/ml πεψιστατίνη (pepstatin), 1 μg/ml λευπεψίνη (leupeptin), 1 mm PMSF και 1 mm ορθοβαναδικό άλας του νατρίου (Na 3VO 4). Bradford Reagent (5X) Σε τελικό όγκο 500ml: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250, 47 ml Methanol (100%), 100 ml Phosphoric Acid (Η 3PO 4) (85%) Διάλυμα TFB1: 30 mm KCL, 100 mmrbcl, 10 mm CaCl 2, 50 mm MnCl 2, 5% Glygerol, ph:5.8 (ρύθμιση με οξικό οξύ) Διάλυμα TFB2: 10 mm MOPS, 10 mm RbCI 2, και 75 mm CaCI 2, Glycerol: 15% ph:6.5 (ρύθμιση με KOH) 4Χ διάλυμα φόρτωσης πρωτεϊνών (Laemmli buffer): 250mM Tris-Cl ph 6.8, 40% γλυκερόλη, 8% SDS, 2.8 M β-μερκαπτοαιθανόλη, 0.2% κυανο βρωμοφαινόλη. 47

48 Υλικά & Μέθοδοι Διάλυμα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (1Χ Tris γλυκίνη/sds): 25 mm Tris, 250 mm γλυκίνη, 0.1% SDS. 1X Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς πρωτεϊνών (Transfer blotting buffer): M Tris, M γλυκίνη, 20% μεθανόλη 2.4 Βακτηριακά Στελέχη- Πλασμιδιακοί Φορείς DΗ5a: Χρωμοσωμικός γενότυπος fhua2 lac(del)u169 phoa glnv44 Φ80' lacz(del)m15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17. Αυτό το στέλεχος E. coli μετασχηματίζεται με μεγάλη απόδοση και ο γενότυπός του προσδίδει διάφορα χαρακτηριστικά που είναι πολύ χρήσιμα για μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA. puc57: Πλασμιδιακός φορέας μεγέθους 2710 bp (Genscript), ο οποίος διαθέτει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (Εικόνα 19). Εικόνα 19: Απεικόνιση πλασμιδιακού φορέα puc57. pegfp-c3: Πλασμιδιακός φορέας μεγέθους 4727 bp που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό καναμυκίνη. Διαθέτει υποκινητή του κυτταρομεγαλοιού (CMV) στον οποίο είναι κλωνοποιημένο το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη E-GFP ώστε οι παραγόμενες πρωτεΐνες να είναι συντηγμένες με GFP στο αμινο-τελικό τους άκρο. Υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού (Εικόνα 20). 48

49 Υλικά & Μέθοδοι Εικόνα 20: Απεικόνιση πλασμιδιακού φορέα pegfp-c3. Απεικονίζονται τα κυριότερα στοιχεία και ο χάρτης του πλασμιδιακού φορέα pegfp-c3 2.5 Εκκινητές (primers) Πίνακας 3. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την παρούσα εργασία Εκκινητής Αλληλουχία (Forward primer) Αλληλουχία (Reverse primer) hlaxhoif (cloning) ACTAGGCTCGAGATGGCGGAAAACGGC GATAA HLaBamHI (cloning) TAGTGGGGATCCCTGATCGCCCGCACC ATT hactb AGCGAGCATCCCCCAAAGTT GGGCACGAAGGCTCATCATT AGO2 AGTTGATTTCCAGGCGATGC TCTGCCAACCTCTCTGGACC AGO3 AGGACACCTCCAGCCATACA ACCGCACAAAAAGCAGTTGG AGO4 TTGCTGCTTCCAAAGGTGATG TTCCCACTTGAAGGGTAGGC ANG AACCCATCTCCCGTTGAAGG GTTATCCTGAGCCAGGGTCG CCND1 CAATGACCCCGCACGATTTC CATGGAGGGCGGATTGGAA DICER GTACGACTACCACAAGTACTTC ATAGTACACCTGCCAGACTGT DROSHA ATCGGTTGTTCCTGAACCTGC GGTTGTCACTCCAACGGTCT ELAC1 (trnase Z) TGTGGTCCTTCGGTGTGAAG AGAGTTCCATGGTTCGCCAG ELAC2 (trnase Z) GCTCACCAGTTTCCGCTGTA GACACAAACACAGCAGCCAG TP53 CTGCATTTTCACCCCACCCTT CACACAGGTGGCAGCAAAGTT MDM2 CAGCAGGAATCATCGGACTCA AAGATCCGGATTCGATGGCG 49

50 Υλικά & Μέθοδοι SSB AGA AATTTGTAGAGACCCCTGGC TTTGCTTCTTGCTCCTGTTTAGC P21 TCTGACCCCAAACACCTTCCAG GACACATGGGGAGCCGAG A XPOT TGTTCATGCCCCTGCTTCAT TCAGCAAATCCCACTGGTCC has- mir518e3p AAAGCGCTTCCCTTCAG GTG hsa-mir-34b-5p TAGGCAGTGTCATTAGCTGATTGAA hsa-mir-21-5p TAGCTTATCAGACTGATGTTGA hsa-let-7b-5p TGAGGTAGTAG TTGTGTGGTT hsa-mir-34a-5p TGG CAG TGT CTT AGC TGG TTG T OligodT adapter GCGAGCACAGAATTAATACGACTCA CTATAGGTTTTTTTTTTTTVN Outer Primer: GCGAGCACAGAATTAATACGACT trf-5003b GGTGGTTCAGTGGTAGAAAAAA trf-3028b TCGATTCCCGGCCCATGCACCA trf-1001 GAAGCGGGTGCTCTTATTTTAAAAA trna Ser TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT CAGCGATGGCCGAGTGGTTAAG trna GlyGCC GTGGTAGAATTCTCGCCTGCC TGCATGGGCCGGGAATCGAA U6 GCTCGCTTCGGCAGCACATA AACGCTTCACGAATTTGCGTGT 2.6 Αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για το western ήταν της εταιρείας Santa Cruz Biotechnology Πρωτογενή αντισώματα Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού: La/SSB (sc ) Δευτερογενή αντισώματα Goat anti-mouse IgG (HRP) (sc ) Goat anti-rabbit IgG (HRP) (sc-2357) Ενώ για τον ανοσοφθορισμό χρησιμοποιήθηκε ως δευτερογενές αντίσωμα το Goat Anti- Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) (ab150115) της εταιρείας Abcam. 50

51 Υλικά & Μέθοδοι Β. ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Μοριακή κλωνοποίηση του γονιδίου της ανθρώπινης πρωτεΐνης La Το τμήμα του γονιδίου της La ενισχύθηκε μέσω PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα το πλασμίδιο puc57 το οποίο περιείχε την αλληλουχία του γονιδίου (1224 nt) με κωδικόνια που διευκολύνουν την ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης (Optimized Sequence, GenScript) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης βασιστήκαμε στο πρωτόκολλο από το Kapa HiFi PCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS). Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο μετουσίωσης σε θερμοκρασία 95 C για 3 λεπτά. Ακολουθούν 25 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 96 C για 15 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για τη σύνδεση των εκκινητών στους 60 C για 15 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 C για 45 δευτερόλεπτα. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία επιμήκυνσης 72 C για 5 λεπτά. Μετά το πέρας της αντίδρασης ενίσχυσης των επιθυμητών τμημάτων, προκύπτουν προϊόντα που στα άκρα τους φέρουν θέσεις κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα BamHI και XhoI. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή μείγματος τελικού όγκου 20 μl φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 4). Πίνακας 4: Αντιδραστήρια για ενίσχυση μέσω PCR. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΤΕΛΙΚΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ 5X KAPA HIFI FIDELITY BUFFER 1Χ 10 mμ dntps MIX 0,3 mm 10µΜ FW PRIMER (hla_xho F) 0,3 μμ 10µΜ RV PRIMER (hla_bamhi R) 0,3 μμ TEMPLATE DΝΑ (puc57) 5ng KAPA ΗIFI DNA POLYMERASE 0,5 U ddh μl Καθαρισμός και απομόνωση τμήματος DNA Για το διαχωρισμό του τμήματος DNA και τον προσδιορισμό του μεγέθους του το δείγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1,5%. Για την παρασκευή πηκτής χρησιμοποιήθηκε 0.45g αγαρόζης σε 30ml ΤΑΕ buffer 1x. Το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης και να γίνει διαυγές. Αφού κρύωσε ακολουθήσε προσθήκη 0,8μl Gel Red, ήπια ανάδευση και στη συνέχεια τοποθέτηση στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και αφέθηκε να πήξει. Τα δείγματα που πρόκειται να 51

52 Υλικά & Μέθοδοι ηλεκτροφορηθούν, προετοιμάστηκαν με την προσθήκη 5x loading buffer. Ως μάρτυρας μοριακού βάρους χρησιμοποιήθηκε ο Hyperladder II. Η απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (DNA extraction from agarose gels) έγινε με βάση το πρωτόκολλο του kit NucleoSpin PCR clean-up, Gel extraction της MACHEREY- NAGEL. Περιληπτικά, 1. Εξαγωγή του τμήματος DNA- Διάλυση της πηκτής: Αρχικά, έγινε παρατήρηση της πηκτής σε λάμπα UV και εξάχθηκε η ζώνη με το επιθυμητό προς απομόνωση τμήμα του DNA με τη χρήση ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Η εξαγωγή πραγματοποιήθηκε με προσοχή ώστε να ελαχιστοποιηθεί όσο το δυνατόν ο περιττός όγκος της πηκτής. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε eppendorf, αφού προηγουμένως ζυγίσαμε το καθαρό του βάρος. Το κομμάτι αυτό διαλύθηκε σε buffer NTΙ σε αναλογία 200μl buffer για κάθε 100mg πηκτής αγαρόζης. Το ΝΤΙ περιέχει χαοτροπικά άλατα, τα οποία είναι πολύ ισχυρά και θα διαλύσουν την δομή της αγαρόζης, όχι όμως το DNA. Η διάλυση επιτυγχάνεται με θέρμανση στους 50 C για 5-10 λεπτά με ανάδευση κάθε 2-3 λεπτά. 2. Δέσμευση του DNA- Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Το δείγμα φορτώθηκε σε στήλη, η οποία τοποθετήθηκε σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2mL. Ακολουθήσε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g. Το έκλουσμα απομακρύνθηκε και η στήλη επανατοποθετήθηκε στο συλλεκτικό σωλήνα. Προστέθηκαν 700μl NT3 buffer, το οποίο περιέχει 70% αιθανόλη η οποία θα ξεπλύνει το DNA. Ακολουθήσε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g και απομάκρυνση του εκλούσματος. 3. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης- Έκλουση του DNA Η στήλη φυγοκεντρήθηκε για 2 λεπτά στις x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer NT3. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Ακολούθως, η στήλη μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα (Recovery Tube) και προστέθηκαν 15-30μl αποστειρωμένου ddh 2O. Ακολουθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό με σκοπό την αύξηση της απόδοσης της έκλουσης του DNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g. Το εκλουόμενο DNA φυλάχθηκε στους -20 C. 52

53 Υλικά & Μέθοδοι Πέψεις και Σύνδεση τμημάτων (επιθυμητού φορέα με το ένθεμα) Ακολούθως προετοιμάστηκαν πέψεις του PCR προϊόντος και του επιθυμητού φορέα ώστε να δημιουργηθούν τα κατάλληλα άκρα για την σύνδεση των τμημάτων (Εικόνα 21). Οι πέψεις ετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις παρακάτω ποσότητες του Πίνακα 5. Πίνακας 5. Ποσότητες αντιδραστηρίων για τις πέψεις ΠΡΟΪΟΝ PCR PEGFP-C3 ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ 500ng 500ng XhoΙ 5U 5U BamHI 5U 5U ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ 10X 1X 1X ddh 2O Up to 20μl Up to 20μl Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 37 C για 1 ώρα και 30 λεπτά, ηλεκτροφορήθηκαν ο φορέας και τα ενθέματα για να ελεγχθεί η ποιότητα της πέψης και έγινε η απομόνωση των τμημάτων DNA από το πήκτωμα όπως περιγράφηκε παραπάνω. Στη συνέχεια, ποσοτικοποιήσαμε τα τμήματα DNA μέσω φωτομέτρησης και προχωρήσαμε στην ένωση των τμημάτων με αντίδραση λιγάσης. Το μίγμα της αντίδρασης περείχε συνολικά 50 ng πλασμιδιακού φορέα, κατάλληλη ποσότητα από το ένθεμα ώστε ο λόγος αριθμού μορίων κάθε ενθέματος προς φορέα να είναι 3:1. Χρησιμοποιήθηκαν 0,4U Τ4 DNA λιγάσης σε τελικό όγκο αντίδρασης 20μl. Ακολούθησε επώαση στους 16 C για 16 ώρες. Τα προϊόντα της αντίδρασης συνένωσης χρησιμοποιήθηκαν για μετασχηματισμό δεκτικών βακτηρίων DH5a και τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια απομονώθηκαν όπως περιγράφεται στη συνέχεια. Εικόνα 21: Ενδεικτική παρουσίαση ενίσχυσης ενθέματος, πέψης και σύνδεση τμημάτων. 53

54 Υλικά & Μέθοδοι Παρασκευή βακτηρίων επιδεκτικών (DH5a) προς μετασχηματισμό- (competent cells) Η δημιουργία επιδεκτικών προς μετασχηματισμό βακτηρίων, απαιτεί την κατεργασία τους με παράγοντες που σχηματίζουν πόρους στο κυτταρικό τους τοίχωμα, επιτρέποντας την εισαγωγή με παθητική διάχυση, εξωγενώς προστιθέμενου DΝΑ. Τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή επιδεκτικών βακτηρίων ικανών προς μετασχηματισμό με πλασμίδια (competent cells) ήταν το στέλεχος E. Coli DH5a. 1 η ημέρα: Αρχικά, μη επιδεκτικά βακτήρια από αποθέματα γλυκερόλης βακτηρίων επιστρώθηκαν (stricking) σε τρυβλία χωρίς αντιβιοτικό, με την βοήθεια ρύγχους (tips) των 20μl και αφέθηκαν να αναπτυχθούν. 2 η ημέρα: Μοναδιαίες αποικίες από τα τρυβλία ενοφθαλμίστηκαν σε 5 ml LB, (σε αποστειρωμένους σωλήνες τύπου falcon) και επωάστηκαν σε θερμαινόμενο τροχιακό αναδευτήρα (orbital shaker) στους στους 37 C για 16 ώρες ώστε να αναπτυχθούν. 3 η ημέρα: 200μl ολονύχτιας υγρής βακτηριακής καλλιέργειας εμβολιάστηκαν σε 12 ml LB σε αποστειρωμένη κωνική φιάλη, όπου επωάστηκαν για 2-3 ώρες στους 30 ο C, μέχρι η OD 600 να φτάσει Έπειτα, η καλλιέργεια τοποθετήθηκε σε πάγο για 5 λεπτά και μοιράστηκε σε σωλήνες των 50 ml και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά, στις 5000 x g, στους 4 ο C. Το βακτηριακό ίζημα επανεωρήθηκε σε 4 ml διαλύματος TFB1 ( 2.3.), τοποθετήθηκε στον πάγο για 5min και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά, στις 5000 x g, στους 4 ο C. Ακολούθησε απομάκρυνση υπερκειμένου και επαναιώρηση βακτηριακού ιζήματος σε 1 ml διαλύματος TFB2 ( 2.3.) και τοποθέτηση στον πάγο για 15 λεπτά. Στη συνέχεια δείγματα των 50 μl βακτηρίων τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες eppendorff και αποθηκεύτηκαν στους -80oC για μελλοντική χρήση Μετασχηματισμός βακτηρίων με πλασμιδιακό DNA Τα βακτήρια Ε.coli που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στο στέλεχος DH5a (competent cells) της εταιρείας Invitrogen. 1. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο μέχρι να ξεπαγώσουν μl ικανών βακτηριακών στελεχών DH5a αναμίχθηκαν σε σωληνάρια τύπου eppendorf, με 5 μl από την αντίδραση με τη λιγάσης σε στείρες συνθήκες. 3. Επώαση στον πάγο για 20/30min. 4. Τοποθέτηση των βακτηρίων στους 42 C για 45 sec ώστε να υποστούν θερμικό στρες και να γίνει εισαγωγή του πλασμιδίου. 54

55 Υλικά & Μέθοδοι 5. Mεταφορά στον πάγο για 2min. 6. Προσθήκη 0,5 ml LB (προθερμασμένο στους 37 C) και επωάση στους 37 C, 1 ώρα υπό ανάδευση. 7. Με το πέρας της 1 ώρας, επιστρώθηκαν 50μl-100μl από την καλλιέργεια σε τρυβλίο με θρεπτικό LB-άγαρ με το κατάλληλο αντιβιοτικό. 8. Τα τρυβλία, εφόσον στεγνώσαν για 20 λεπτά, τοποθετήθηκαν ανάποδα και επωάστηκαν στους 37 C για 16 ώρες Ανάπτυξη υγρών καλλιεργειών βακτηρίων - Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (mini prep) Για απομόνωση πλασμιδιακού DΝΑ σε μικρούς όγκους (mini prep) ήταν απαραίτητη η ανάπτυξη υγρών καλλιεργειών βακτηρίων. 7,5 ml L-broth που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό εμβολιάσθηκαν με αποικίες ή αποθέματα γλυκερόλης βακτηρίων, με τη χρήση κρικοφόρου στυλεού και επωάστηκαν σε θερμαινόμενο τροχιακό αναδευτήρα (orbital shaker) στους 37 C για όλη τη νύχτα (>16 ώρες). Ακολουθήσε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με βάση το πρωτόκολλο απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E. coli του kit NucleoSpin Plasmid της MACHEREY-NAGEL. Περιληπτικά, 1. Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων Μεταφορά 5ml από την βακτηριακή καλλιέργεια σε Eppendorf, φυγοκέντρηση για 1min, g και απόχυση υπερκειμένου. 2. Λύση κυττάρων Προσθήκη 250μl Βuffer A1 και επαναιώρηση του κυτταρικού ιζήματος με δίνη (vortex). Ακολουθησε προσθήκη 250 μl Buffer Α2. Ήπια ανάμιξη αναποδογυρίζοντας 6-8 φορές και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5min. Ακολούθως προστέθηκαν 300μl Buffer A3 και ήπια ανάμιξη 6-8 φορές. Φυγοκέντρηση 5-10min, xg σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Δέσμευση DNA Τοποθέτηση στήλης NucleoSpin σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2ml και μεταφορά υπερκειμένου πάνω στη στήλη. Φυγοκέντρηση για 1min στα xg και απόχυση φιλτραρισμένου δ/τος. 4. Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Προσθήκη στη στήλη 600μl Buffer Α4 το οποίο περιέχει αιθανόλη. Φυγοκέντρηση 1min, στις x g και απόχυση εκλούσματος. Ακολούθησε μια επιπλέον φυγοκέντρηση για 2min στις xg, για ξήρανση της στήλης και απόχυση καταλοίπων αιθανόλης. 55

56 Υλικά & Μέθοδοι 5. Έκλουση υψηλής καθαρότητας DNA Τοποθέτηση της στήλης σε συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 1,5ml των και προσθήκη 50μl αποστειρωμένου ddh 2Ο. Επώαση για 1min σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκέντρηση για 1min στις 11000xg. Το εκλουόμενο πλασμιδιακό DNA φυλάχθηκε στους -20 C Παρασκευή βακτηριακών αποθεμάτων γλυκερόλης Τα αποθέματα βακτηρίων παρασκευάστηκαν αναμιγνύοντας 700 μl αναπτυγμένης υγρής καλλιέργειας βακτηρίων και 700μl 50% διάλυμα γλυκερόλης (10% τελική συγκέντρωση γλυκερόλης), και διατηρήθηκαν στους -80 C για περαιτέρω χρήση Ανάλυση πλασμιδίων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης- Πέψεις Για να βρεθούν οι θετικές αποικίες τις οποίες επιλέξαμε και απομονώσαμε πλασμιδιακό φορέα ακολουθήσε αντίδραση PCR σύμφωνα με το Kapa 2G Fast PCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε με κατάλληλα αντιδραστήρια που αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα 6 και σύμφωνα με το πρόγραμμα του πίνακα 7. Πίνακας 6: Ποσότητες αντιδραστηρίων για αντίδραση PCR ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΤΕΛΙΚΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ 5X KAPA 2G FAST BUFFER 1Χ 10 mm dntps MIX 0,8 mm 10 µm FW PRIMER (LA_Xho F) 0,4 μμ 10 µm RV PRIMER (LA_BamHI R) 0,4 μμ TEMPLATE DNA (PLASMID) 5ng 1 U/µL KAPA 2G FAST 0,004U POLYMERASE ddh 2O έως 20 μl Πίνακας 7: Πρόγραμμα αντίδρασης PCR C 5min C 20sec C 30sec C 30sec repeat steps 2-4 x C 3min C hold 56

57 Υλικά & Μέθοδοι Τα προϊόντα της αντίδρασης ηλεκτροφορήθηκαν και ελέγχθηκαν έτσι οι θετικές αποικίες. Στα πλασμίδια που έχουν λάβει το ένθεμα έγινε περαιτέρω έλεγχος και με πέψη. Η πέψη με τη χρήση ενζύμων περιορισμού έχει σκοπό την υδρόλυση των φωσφοδιεστερικών δεσμών του DNA, έτσι το πλασμιδιακό DNA επωάζεται με το ένζυμο σε αναλογία 2 Units (ενζυμικές μονάδες)/μg DNA, παρουσία του κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο προτείνεται από την κατασκευαστική εταιρεία. Η ενζυμική μονάδα (Unit) ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 1 μg DNA από βακτηριοφάγο σε μια ώρα, στους 37 C. Η αντίδραση διαρκεί περίπου 2 ώρες στους 37 C. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία είναι τα BamHI (10U/μl) και XhoI (10U/μl). Μετά την πέψη ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Η επιβεβαίωση για το ότι το πλασμίδιο φέρει το ένθεμα που πρέπει έρχεται από το γεγονός ότι παίρνουμε προϊόν από την πέψη με συγκεκριμένο ζεύγος ενζύμων περιορισμού, αλλά και από το μέγεθος του ενθέματος. Το τελευταίο βήμα για επιβεβαίωση επιτυχίας της κλωνοποίησης ήταν να πραγματοποιηθεί ανάλυση Sequencing (Αλληλούχηση) στα ανασυνδυασμένα πλασμίδια έτσι ώστε να ελεγχθεί τυχόν ύπαρξη μετάλλαξης που θα αλλοίωνε το πλαίσιο ανάγνωσης του κάθε γονιδίου Κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια H κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη αναφέρεται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 8): Πίνακας 8. Περιγραφή κυτταρικών σειρών Κυτταρική σειρά Α549 Περιγραφή Ανθρώπινα κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα Πηγή προέλευσης ATCC Στον παραπάνω πίνακα αναφέρεται η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία. Συγκεκριμένα: Η κυτταρική σειρά Α549 είναι ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Προέρχονται από κυψελιδικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα. Απομονώθηκαν από Καυκάσιο άντρα 58 ετών, που έπασχε από μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα. Φέρουν αγρίου τύπου γονίδιο της p53 και μεταλλάξεις στα γονίδια K-Ras, p16 INK4A καιp14 ARF. H κυτταρική σειρά Α549 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium). Το θρεπτικό υλικό εμπλουτίστηκε με 10% εμβρυϊκό ορό 57

58 Υλικά & Μέθοδοι μόσχου (Fetal Bovine Serum), 100 μg/ml πενικιλίνη, 100 μg/ml στρεπτομυκίνη. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο στους 37 C, 5%CO Στην παρούσα μελέτη πραγαμτοποιήθηκε και καλλιέργεια των συγκεκριμένων κυττάρων έπειτα από επαγωγή στρες. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium). Στον πίνακα 9 αναγράφονται οι συνθήκες στρες που επιλέχθηκαν καθώς και κάθε υλικο το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή του στρες. Πίνακας 9. Υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες. 1. Full Medium- Πλήρες θρεπτικό υλικό (Μάρτυρας) 2. Serum Starvation- Στέρηση ορού εμβρύου βοός. Συνθήκες καλλιέργειας 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 4,5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 4,5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 3. Glucose starvation- Στέρηση πηγών γλυκόζης. 4. Glucose & FBS starvation- Στέρηση ορού εμβρύου βοός και πηγών γλυκόζης. 5. Χορήγηση 500μM υπεροξειδίου (Η ) 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 4,5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 500μΜ Η Ανακαλλιέργεια κυττάρων Η ανακαλλιέργεια κυττάρων έγινε: 1) Για να διατηρηθούν τα καλλιεργούμενα κύτταρα ζωντανά, και 2) Για να προετοιμαστούν τα καλλιεργούμενα κύτταρα για έκθεση σε παράγοντες, κατά τη διάρκεια των διαφόρων πειραμάτων. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων διεξάγονταν στην εστία κυτταροκαλλιέργειας κάθετης νοηματικής ροής (Tissue culture hood) 183. Tρυβλία διαμέτρου 100 mm, με κύτταρα σε πλήρες ταπήτιο (confluent) εκπλύθηκαν δύο φορές με 10 ml PBS και ύστερα προστέθηκε 1 ml διάλυμα θρυψίνης-edta (biosera). Τα κύτταρα αφέθηκαν στον επωαστικό κλίβανο στους 37 C, 5%CO 2 για περίπου 2-5 λεπτά, ώστε να αποκολληθούν από το τρυβλίο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωληνάρια των 15ml τύπου falcon, φυγοκεντρήθηκαν για 3-5 λεπτά στις 1500 στροφές και 58

59 Υλικά & Μέθοδοι επαναιωρήθηκαν σε κατάλληλο όγκο θρεπτικού υλικού, ώστε να γίνουν οι επιθυμητές αραιώσεις. Το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρθηκε στο τρυβλίο και συμπληρώθηκε θρεπτικό υλικό μέχρι τα 10 ml. Τέλος, τα τρυβλία τοποθετήθηκαν στον επωαστικό κλίβανο στους 37 C, 5%CO 2, ώστε να αναπτυχθούν τα κύτταρα εκ νέου Διατήρηση των κυττάρων σε υγρό άζωτο Η μακροχρόνια συντήρηση των κυτταρικών σειρών είναι δυνατή με την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο (-192 C) σε υλικό που αποτελείται από 90% FΒS και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) 183. Για τη διατήρηση και τη βαθιά κατάψυξη των κυττάρων, επιλέχθηκαν τρυβλία με κύτταρα σε ημι-πλήρες ταπήτιο (semi-confluent) και αποκολλήθηκαν με θρυψίνη EDTA. Στη συνέχεια προστέθηκαν 9 ml PBS και τα εναιωρήματα των κυττάρων μεταβιβάστηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες Falcon των 15 ml. Έγινε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 1500 στροφές και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 2 ml ορού (FΒS) που περιείχε 10% διμέθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO), μεταφέρθηκε σε 2 ειδικές αμπούλες (cryovials) των 2 ml (1 ml εναιωρήματος ανά Falcon). Οι αμπούλες τοποθετήθηκαν σε ισοθερμικό δοχείο που περιείχε ισοπροπανόλη και μεταφέρθηκαν στους -80 C για όλη τη νύχτα ώστε να παγώσουν σταδιακά (1 ο C/λεπτό). Την επόμενη ημέρα μεταφέρθηκαν στο υγρό άζωτο για μακροπρόθεσμη διατήρηση. Για την ανασύστασή τους, οι αμπούλες από το υγρό άζωτο τοποθετήθηκαν για περίπου 1-2 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 37 ο C ώστε να ξεπαγώσουν τα κύτταρα και το περιεχόμενο μεταβιβάστηκε σε τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας διαμέτρου 100 mm όπου προστέθηκαν 9 ml πλήρους θρεπτικού υλικού. Τα κύτταρα ανακινήθηκαν ελαφρά και τοποθετήθηκαν στον επωαστικό κλίβανο στους 37 C, 5% CO Διαµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε πλασµιδιακό DNA Για τα πειράματα μελέτης της ενδοκυτταρικής κατανομής της εξωγενώς La πρωτεΐνης, κύτταρα διαµολύνθηκαν µε το επιθυμητό πλασµιδίο με την χρήση αντιδραστηρίου TurboFect (Fermentas). Το αντιδραστήριο σχηματίζει ένα θετικώς φορτισμένο σύµπλοκο µε το πλασµιδιακό DNA και κατά αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η εισαγωγή του στο κύτταρο. Η διαδικασία ακολουθήθηκε σύμφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προς διαμόλυνση κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν ( ) από ένα πλήρες ταπήτιο των 100mm και προστέθηκε κατάλληλη ποσότητα κυττάρων σε τρυβλίο 6 βοθρίων (6- well plate) έτσι ώστε να έχουμε πληρότητα περίπου 70-80% την επόμενη μέρα σε κάθε πηγάδι. Η πληρότητα αυτή ενδείκνυται για τη διαμόλυνση. Στον πυθμένα των 6 βοθρίων, 59

60 Υλικά & Μέθοδοι πριν την ανακαλλιέγεια, τοποθετήθηκαν στρογγυλές καλυπτρίδες για καλύτερη προσκόλληση των κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν ολονύκυτια σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM, απουσία pen/strep. Για την διαδικασία της διαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκαν: θρεπτικό μέσο OptiMEM I Reduced Serum Media χωρίς αντιβιοτικά, το αντιδραστήριο turbofect και τα επιθυμητά πλασμίδια: α) pεgfp-c3-empty: πλασμιδιακός φορέας που φέρει πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP (Green Fluorescent Protein) χωρίς ένθεμα ο οποίος χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας-μάρτυρας, β) pεgfp-c3-la: πλασμιδιακός φορέας που φέρει πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP καθώς και το κλωνοποιημένο γονίδιο της πρωτεΐνης La. Αρχικά προετοιμάστηκαν τα transfection mix: Mix 1: 1μg DNA και θρεπτικό optimem up to 100μl Mix 2: 3μl turbofect και θρεπτικό optimem up to 100μl 1. Προετοιμάστηκε το mix 1, έπειτα το mix 2. Ακολούθησε ελαφρά ανακίνηση και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Προστέθηκε το mix 1 στο mix 2 και ακολούθησε ελαφρά ανακίνηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά για να σχηματιστούν τα συσσωματώματα. 4. Μετά το πέρας της επώασης το μίγμα προστέθηκε κατευθείαν στάγδην σε κάθε πηγάδι. Απαλή κίνηση του τρυβλίου προς-πίσω και τα κύτταρα επωάζονται στους 37ºC για 24 ώρες. Συνοπτικά, οι πορείες της διαμόλυνσης αναγράφονται στην εικόνα 22 Εικόνα 22: Πορεία διαμόλυνση κυττάρων 5. Ύστερα από τη διαδικασία της διαμόλυνσης, πριν την μονιμοποίηση των κυττάρων, έγινε επώαση για 30 λεπτά σε πλήρες θρεπτικό υλικό παρουσία 150nM Mitotracker 60

61 Υλικά & Μέθοδοι Red στους 37ºC για χρώση μιτοχονδρίων. Στη συνέχεια προετοιμάστηκαν καλυπτρίδες ως εξής: 6. Προετοιμασία καλυπτρίδων για παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο 6.1. Ξεπλυμα κύτταρα δύο φορές με PBS Προσθήκη 4% PFA για μονιμοποίηση. Αναμονή 10 λεπτά Ξέπλυμα δύο φορές με PBS Χρώση πυρήνα με χρωστική Hoechst (10μg/ml) σε αραίωση 1/ Επώαση 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (υπό συνθήκες σκότους) Ξεπλυμα 2 φορές με PBS για 5 λεπτά Τοποθέτηση κυττάρων σε αντικειμενοφόρο πλάκες 6.8. Στην αντικειμενοφόρο βάζουμε μία σταγόνα στερεοποιητικού Mowiol και πάνω της τοποθετούμε την καλυπτρίδα από το κάθε πηγάδι 6.9. Αφήνουμε σε σκοτεινό μέρος για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου Τα διατηρούμε στο ψυγείο καλυμμένα (υπό συνθήκες σκότους) μέχρι να παρατηρηθούν στο συνεστιακό μικροσκόπιο ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Ο ανοσοφθορισµός είναι σχετικά μια απλή τεχνική που μας επιτρέπει την ειδική ανίχνευση μιας πρωτεΐνης σε κύτταρα. Περιλαμβάνει την επώαση των κυττάρων µε ένα ειδικό αντίσωμα έναντι της υπό μελέτης πρωτεΐνης και την ανίχνευσή της έπειτα από επώαση µε ένα ειδικό δευτερογενές αντίσωµα, σημασμένο με φθοριόχρωμα, το οποίο αναγνωρίζει το πρωτογενές αντίσωµα. Το φθορίζων σήµα που παρατηρείται στο µικροσκόπιο φθορισµού, αντιπροσωπεύει το σηµείο που έχει επικαθήσει το πρωτογενές αντίσωµα και εποµένως την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντός µας. Τα στάδια που ακολουθήθηκαν είναι τα εξής: 1. Τα υπό μελέτη κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν ( ) και κατάλληλος αριθμός επιστρώθηκε στον πυθμένα 12 βοθρίων (12-well plate) στα οποία είχαν τοποθετηθεί αποστειρωμένες καλυπτρίδες, και αφέθηκαν ολονύκτια να προσκολληθούν. 2. Την επόμενη ημέρα, αφαιρέθηκε το θρεπτικό μέσο και αντικαταστάθηκε µε φρέσκο, το οποίο περιείχε τις αντίστοιχες συνθήκες στρες που ήταν απαραίτητες για την μελέτη (Πίνακας 9). 3. Μετά το πέρας 24 ωρών από την επώαση, τα τρυβλία, τοποθετήθηκαν σε πάγο, αφαιρέθηκε το θρεπτικό και ακολούθησε γρήγορη πλύση με PBS (1x) 2-3 φορές 61

62 Υλικά & Μέθοδοι 4. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν µε επώαση σε διάλυμα 4% παραφορµαλδεϋδης (PFA), για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Ακολούθησε ξέπλυμα 3 φορές των 5 λεπτών με PBS (1x) υπό ήπια ανάδευση. 6. Η διάρρηξη της κυτταρικής μεμβράνης πραγματοποιήθηκε με προσθήκη 1ml φρέσκου διαλύματος Triton 0,3% (σε PBS 1x). Επώαση 5 λεπτών υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκπλύθηκαν τρεις φορές µε 1X PBS. 8. Για να καλυφθούν οι µη ειδικές θέσεις πρόσδεσης του αντισώματος, τα κύτταρα επωάστηκαν για 1ώρα µε διάλυμα που περιέχει 3% BSA (Bovine Serum Albumin), 10% FBS, σε 1X PBS (διάλυμα blocking), σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Μετά το πέρας της επώασης, αφαιρέθηκε το διάλυμα blocking και τοποθετήθηκε σε κάθε καλυπτρίδα 40µl 1 ου αντισώματος (1/200 Lupus antigen/ssb- Santa Cruz biotechnology) για τουλάχιστον 16ώρες, σε υγρό περιβάλλον, στους 4 C. 10. Την επόμενη ημέρα, ακολούθησε ξέπλυμα του 1 ου αντισώματός τρεις φορές µε διάλυμα PBS-Tween 0,1% διάρκειας 5 λεπτών. 11. Ακολούθησε επώαση των κυττάρων µε το 2 ο αντίσωμα, για 1ώρα σε συνθήκες σκότους και υγρασίας. 12. Η περίσσεια του 2 ου αντισώματος απομακρύνεται µε τρεις πλύσεις µε διάλυμα PBS- Tween 0,1%. 13. Για την χρώση των πυρήνων προστέθηκε 40μl σε κάθε καλυτρίδα χρωστικής Hoechst σε αραίωση 1:2000, για 2 λεπτά. 14. Ακολούθησαν δύο πλύσεις µε 1Χ PBS. 15. Στη συνέχεια, προσεκτικά, οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν µε την πλευρά των κυττάρων προς τα κάτω, σε αντικειµενοφόρους πλάκες, πάνω στο στερεοποιητικό διάλυµα MOWIOL και αφέθηκαν να στεγνώσουν για τουλάχιστον 30 λεπτά σε σκοτεινό χώρο πριν την παρατήρηση στο μικροσκόπιο φθορισμού Απομόνωση ολικού RNA και μικρών μορίων RNA από κύτταρα Η απομόνωση του RNA από τα κύτταρα έγινε με την προσθήκη διαλύματος Trizol, ένα όξινο φαινολικό διάλυμα θειοκυανικής γουανιδίνης. H διαδικασία αυτή είναι βασισμένη στην μέθοδο των Chomczynski και Sacchi 184 στην οποία χρησιμοποιείται για ομογενοποίηση κυττάρων ή ιστού και εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων. Είναι μία γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδος απομόνωσης RNA καθώς το δείγμα διαλυτοποιείται άμεσα σε συνθήκες που αποτρέπουν οποιαδήποτε υδρόλυση του RNA ενώ παράλληλα διαχωρίζεται από όλα τα υπόλοιπα συστατικά των κυττάρων (DNA, πρωτεΐνες και λιπίδια). Ο διαχωρισμός του RNA από τα άλλα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υλικά 62

63 Υλικά & Μέθοδοι (DNA, πρωτεΐνες κ.ά.) γίνεται με τη χρήση διαλύματος χλωροφορμίου- ισοαμηλικής αλκοόλης (49:1). Για τα βήματα της απομόνωσης ακολουθείται το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα στάδια απομόνωσης αναφέρονται παρακάτω: Απομόνωση ολικού RNA 1. Ανακαλλιεργήθηκε ( ) κατάλληλος αριθμός κυττάρων και επιστρώθηκαν στον πυθμένα αντίστοιχου επιλεγμένου τρυβλίου. 2. Μεταφορά κυττάρων στον πάγκο. 3. Αφαίρεση θρεπτικού υλικού και ξέπλυμα των κυττάρων, 2 φορές από 1-3ml 1x PBS. 4. Προσθήκη ποσότητας δ/τος Trizol σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα Πίνακας 2.9. Ποσότητες διαλύματος Trizol σύμφωνα με την επιλογή τρυβλίου Τρυβλίο Ποσοστό κυττάρων TRIzol Reagen (ml) 6 well (35 mm) 100% 1 ml TRIzol Reagen 60 mm dish 100% 3 ml 5. Λύση των κυττάρων και συλλογή ολόκληρης της ποσότητας σε συλλεκτικό σωλήνα τύπου eppendorf. Φάση διαχωρισμού Σε αυτή τη φάση γίνεται διαχωρισμός του δείγματος σε υδατική, ενδιάμεση και οργανική φάση. Το RNA συγκεντρώνεται στην υδατική, το DNA στη μεσαία και οι πρωτεΐνες στην οργανική φάση (Εικόνα 23). 6. Προστέθηκαν 200μl χλωροφορμίου για κάθε 1 ml TRIzol Reagent που χρησιμοποιήθηκε. 7. Φυγοκέντρηση στις g για 15 λεπτά στους 4ºC. Εικόνα 23. Φάση διαχωρισμού RNA από τα άλλα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υλικά (DNA, πρωτεΐνες κ.ά.). Το RNA συγκεντρώνεται στην υδατική, το DNA στη μεσαία και οι πρωτεΐνες στην οργανική φάση ( 63

64 Υλικά & Μέθοδοι Απομόνωση-κατακρήμνιση RNA 8. Συλλέχθηκε η υπερκείμενη υδατικής φάσης, προσεκτικά ώστε να μην διαταραχθεί το ίζημα. 9. Προστέθηκε ίσος όγκος με την υδατική φάση ισοπροπανόλης 100%. Τα δείγματα ανακινήθηκαν και αναδεύτηκαν με δίνη (vortex). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις x g για 15 λεπτά στους 4ºC και το υπερκειμένο αφαιρέθηκε. 10. Στο ίζημα προστέθηκε 1ml ψυχρής 75% αιθανόλης και φυγοκεντρήθηκε στις xg για 15 λεπτά στους 4ºC. 11. Aφαίρεση υπερκειμένου και ξήρανση δειγμάτων για 3 λεπτά ώστε να απομακρυνθούν τα κατάλοιπα αιθανόλης. 12. Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωμένο DEPC ddh 2O, το οποίο δεν περιέχει ριβονουκλεάσες ώστε να καταστραφεί το δείγμα. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε 1,5% πηκτή αγαρόζης για την διαπίστωση της ακεραιότητας του RNA. Επίδραση με ένζυμο DNase I Για απομάκρυνση γενομικού DNA από τα δείγματα πραγματοποιήθηκε αντίδραση με το ένζυμο DNase Ι της εταιρείας Ambion. Το ένζυμο θα πέψει τυχόν μόρια DNA που υπάρχουν στα δείγματα, χωρίς καμία επίδραση στο RNA. 13. Προσθήκη 5μl DNase Buffer I στο δείγμα μας 14. Προσθήκη 1μl DNase I (2U/μl) 15. Προσθήκη 0,3 μl RRI (Ribosafe RNase Inhibitor) (προαιρετικά) 16. Ήπια ανάδευση με δίνη (Vortex). 17. Τοποθέτηση δειγμάτων στους 37ºC, για λεπτά Καθαρισμός δειγμάτων με Phenol-ethanol precipitation Μετά το πέρας των 40 λεπτών ακολούθησε απενεργοποίηση του ενζύμου και καθαρισμός των δειγμάτων ως εξής: 18. Προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος φαινόλης και ανάδευση με vortex 19. Φυγοκέντρηση στις x g για 3 λεπτά. 20. Συλλογή υπερκείμενης φάσης σε νέο Eppendorf. 21. Για την απομάκρυνση τυχόν καταλοίπων φαινόλης προστέθηκε ίσος όγκος χλωροφορμίου και ακολούθησε ανάδευση με vortex. 22. Φυγοκέντρηση στις x g για 3 λεπτά στους 4ºC. Η υπερκείμενη φάση συλλέχθηκε σε νέο Eppendorf. 23. Ακολούθησε κατακρήμνιση των δειγμάτων με προσθήκη 1/10 του όγκου οξικού 64

65 Υλικά & Μέθοδοι Νάτριου (NaOAc) 3M ph 5,2 και προσθήκη 2,5 φορές του όγκου ψυχρής 100% αιθανόλης. 24. Ανάδευση των δειγμάτων και αποθήκευση στους -80ºC για 30 λεπτά. Για την ανάκτηση καθαρού διαλύματος RNA, το οποίο είχε καθιζάνει κατά την κατακρήμνιση με αιθανόλη, ακολούθησε: 25. Φυγοκέντρηση x g για 30 λεπτά στους 4ºC. Αφαίρεση υπερκειμένου και για επιπλέον πλύση των δειγμάτων με 75% ψυχρή αιθανόλη και ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4ºC. 26. Αφαίρεση υπερκειμένου και ξήρανση των δειγμάτων για 3 min ώστε να φύγουν κατάλοιπα αιθανόλης. 27. Επαναδιάλυση σε αποστειρωμένο DEPC H 2O. 28. Στη συνέχεια τα δείγματα φωτομετρήθηκαν. Λήφθηκε ποσότητα (2-3μl) από κάθε δείγμα ώστε να αραιωθεί με νερό (1:200-1:300) σε τελικό όγκο 600μl. Με την χρήση κυβέτας χαλαζία έγινε φωτομέτρηση στα 260. Η συγκέντρωση του RNA προκύπτει από την ακόλουθη σχέση: O.D.260 x συντελεστής αραίωσης x 40 =ng/ μl RNA Απομόνωση μικρών μορίων RNA Για την απομόνωση μικρών μορίων RNA από διάλυμα ολικού RNA ακολουθήθηκε κλασματική κατακρήμνιση. Συγκεκριμένα, 1. Σε ποσότητα ολικού RNA προστέθηκε 1/10 του όγκου οξικό Νάτριο (ΝaOAc) 3M ph 5,2 και 33% ψυχρή αιθανόλη (με DEPC ddh 2O). Τα δείγματα επωάστηκαν για 3-16 ώρες στους -20 ο C ώστε να κατακρημνιστούν. Το ίζημα που σχηματίστηκε περιέχει τα μεγάλα μόρια RNA ενώ στο υπερκείμενο βρίσκονται τα μικρά μόρια RNA (<200nt). 2. Προσεκτικά, λήφθηκε το υπερκείμενο (μικρά μόρια RNA) και μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα τύπου eppendorf. Το ίζημα (μεγάλα μόρια RNA) αποθηκεύτηκε στους -80ºC. 3. Στο υπερκείμενο προστέθηκε 100%ψυχρή αιθανόλη (με DEPC ddh 2O) -2,5 φορές του όγκο του υπερκειμένου- ώστε να καταβυθιστούν τα μικρά RNA. Τα δείγματα επωάστηκαν για 16 ώρες -20ºC. 4. Την επόμενη μέρα, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά στα x g, στους 4ºC. 5. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και πραγματοποιήθηκε βήμα πλύσης με 1ml 75% ψυχρής αιθανόλης και τα δείγματα αφέθηκαν για ξήρανση. 65

66 Υλικά & Μέθοδοι 6. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε DEPC ddh 2Ο (nuclease-free) μέσω ανακίνησης με vortex και φωτομετρήθηκαν (260 nm) για τον ακριβή προσδιορισμό της συγκέντρωσης τους ώστε να ακολουθηθεί η πολυαδενυλίωσή τους. 3 -πολυαδενυλίωση των μικρών μορίων RNA Η πολυαδενυλίωση των μικρών μορίων RNA στα δείγματά μας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός ενζύμου πολυαδενυλίωσης (Poly(A) Tailing Kit της εταιρείας Ambion). Αρχικά, έγινε η κατάλληλη αραίωση των δειγμάτων μας με βάση τη συγκέντρωσή που υπολογίστηκε, προκειμένου όλα τα δείγματα να έχουν περίπου την ίδια συγκέντρωση και τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Σε κάθε δείγμα προστέθηκαν τα παρακάτω σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή: Πίνακας 10. Μίγμα αντιδραστηρίων για αντίδραση πολυαδενυλίωσης ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΤΕΛΙΚΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ 5X E-PAP BUFFER 1Χ 25 mm MnCl mm 10 mm ATP 1 mm E-PAP (ένζυμο) 1 U RNA- δειγμα 200ng DEPC ddh 2O (nuclease-free) έως 20 μl Πραγματοποιήθηκε επώαση των δειγμάτων για 1h στους 37ºC. Μετά την επώαση ακολούθησε απενεργοποίηση του ενζύμου και καθαρισμός των δειγμάτων phenolethanol precipitation Αντίστροφη μεταγραφή για τη δημιουργία cdna Η κατασκευή του cdna από το ολικό RNA των δειγμάτων, έγινε με χρήση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase) σύμφωνα με το πρωτόκολλο BioScript TM Reverse Transcriptase της Bioline. Τα βήματα αναγράφονται παρακάτω: Παρασκευή mix 1 και mix 2 Πίνακας 11. Μίγματα αντίδρασης και οι αντίστοιχες ποσότητες. Mix 1 - priming mix Mix 2 - reaction premix Ολικό RNA 2,5 μg 5x RT Buffer 1x 10 μm oligo-dt primer 1μM RiboSafe RNase Inhibitor 1 U 10 mm dntps mix 1mM Reverse Transcriptase (200 U/μl) 10U DEPC-Treated Water έως 10 μl DEPC-Treated Water έως 10 μl 66

67 Υλικά & Μέθοδοι 1) Επώαση του mix 1 στους 70ºC για 5 λεπτά και μεταφορά στον πάγο 2) Ανάμιξη του mix 2 στο mix 1 και ήπια ανάδευση. 3) Επώαση στους 42ºC για 30 λεπτά προκειμένου να δράσει η αντίστροφη μεταγραφάση. 4) Τοποθέτηση στους 85ºC για 5 λεπτά ώστε να γίνει ο τερματισμός της αντίδρασης. 5) Μεταφορά σε πάγο και αποθήκευση στους -20ºC για περαιτέρω χρήση. Σύνθεση cdna από πολυαδενυλιωμένα μικρά RNA μόρια Για τη σύνθεση cdna των πολυαδενυλιωμένων μικρών RNA ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο (BioScriptTM Reverse Transcriptase). Τα μίγματα που προετοιμάστηκαν αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα 12. Πίνακας 12. Μίγματα αντίδρασης και οι αντίστοιχες ποσότητες για μικρά μόρια RNA. Mix1 - priming mix Mix2 - reaction premix Small poly-a RNAs εώς 500 ng 5x RT Buffer 1x 10μΜ Primer με oligo-dt adapter 10 mm dntp mix 1mM 1μM RiboSafe RNase Inhibitor 1 U BioScript Reverse Transcriptase (200 u/μl) DEPC-Treated Water έως 10 μl DEPC-Treated Water έως 10 μl 4U Εικόνα 24. Σχηματική απεικόνιση Α) Πολυαδενυλίωσης μικρών μορίων RNA B) Σύνθεσης cdna από πολυαδενυλιωμένα μικρά RNA μόρια και Γ) qrt-pcr μικρών RNA. 67

68 Υλικά & Μέθοδοι 2.6. Ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο της RTqPCR Η Real time PCR (qpcr) είναι μία ποσοτική μέθοδος όπου ανιχνεύεται σε κάθε κύκλο αντίδρασης της PCR (σε πραγματικό χρόνο) το παραγόμενο προϊόν (δίκλωνο DNA) λόγο της παρουσίας στην αντίδραση μία φθορίζουσας χρωστικής που φθορίζει όταν προσδένεται σε δίκλωνο DNA. Η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας του δίκλωνου DNA (αυξάνεται εκθετικά σε μία PCR) και αποτυπώνεται σε ένα διάγραμμα έντασης φθορισμού κύκλων. (Εικόνα 25) Ct value Εικόνα 25. Απεικόνιση διάγραμματος έντασης φθορισμού-κύκλων. Παρατηρείται μία αρχική επίπεδη γραμμή που αντιστοιχεί σε επίπεδα φθορισμού κάτω από το όριο ανίχνευσης ενώ ο κύκλος όπου ξεπερνάει το κατώφλι είναι αντιπροσωπευτικός της αρχικής ποσότητας του γονιδίου που μελετάται. Ο αριθμός αυτός (Ct Value) είναι η τιμή που λαμβάνεται υπόψη για την ποσοτικοποίηση. H καμπύλη φτάνει σε πλατό καθώς καταναλώνονται υλικά της αντίδρασης όπως εκκινητές και νουκλεοτίδια. Για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της τυπικής αντίδρασης two step Real Time- PCR με χρήση του KAPA SYBR FAST Universal qpcr Kit της KAPA Biosystems. Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε στον υπολογιστή είναι το MxPro QPCR software. Αρχικά, για κάθε γονίδιο προετοιμάστηκε και ένα ξεχωριστό μίγμα αντιδραστηρίων όπως αναγράφεται στον πίνακα 13. Στη συνέχεια τοποθετήσαμε σε κάθε πηγάδι του 96 well plate 1 μl από το κάθε δείγμα cdna και έπειτα προσθέσαμε σε κάθε πηγάδι 19 μl από το αντίστοιχο mix. Το plate μεταφέρθηκε στο θερμικό κυκλοποιητή (Agilent, Stratagene Mx3000P) για να ξεκινήσει η αντίδραση. Τα βήματα των αντιδράσεων που πραγματοποιήθηκαν, και το θερμικό προφίλ που επιλέχθηκε παρουσιάζονται στον πίνακα 14. Ταυτόχρονα με τις αντιδράσεις των υπό μελέτη γονιδίων, για κάθε δείγμα μετρήθηκε και ένα γονίδιο αναφοράς ή γονίδιο κανονικοποιητής (μάρτυρας) για την απεικόνιση διαφορικής έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται η ακτίνη β που εκφράζεται διαρκώς (housekeeping gene), ενώ για την μελέτη των μικρών μορίων 68

69 Υλικά & Μέθοδοι RNA ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το RNU6, το οποίο χρησιμοποιείται ως τα πιο σταθερά εκφρασμένα μικρά RNAs στις περισσότερες κυτταρικές σειρές. Πίνακας 13. Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που προστίθενται σε κάθε μίγμα για την RT-qPCR. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ RNase free water Forward Primer Reverse Primer (ή Outer) KAPA SYBR FAST ROX Low (50x) KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2X) Total ΓΙΑ 1 ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ 7,8 μl 0,4 μl 0,4 μl 0,4 μl 10,0 μl 19 μl Οι εκκινητές (primer) που χρησιμοποιήθηκαν είναι ειδικοί για κάθε γονίδιο και αναφέρονται στην παράγραφο A.2.5. Στην περίπτωση μελέτης μικρών μορίων RNA χρησιμοποιήθηκε ως αντίστροφος εκκινητής- Reverse primer (ή Outer primer) ένας εκκινητής κοινός για όλα τα μικρά μόρια RNA, καθώς προσδένεται στον ολιγο-dt adapter που προστέθηκε στο 5 -άκρο των μορίων κατά τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής (cdna). Η ROX Low που προστέθηκε είναι μία χρωστική που χρησιμοποιείται προαιρετικά για την εξομάλυνση των σφαλμάτων πιπεταρίσματος αλλά και μετρήσεων του μηχανήματος. Το KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2x) περιέχει: α) τη SYBR Green I, φθορίζουσα χρωστική η οποία προσδένεται στα δίκλωνα μόρια DNA και δίνει σήμα φθορισμού μόνο όταν είναι προσδεδεμένη σ αυτά, ενώ τα ελεύθερα μόρια φθορίζουν ελάχιστα 185, Β) χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl 2), το οποίο βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης και την εξειδίκευση και γ) τριφωσφορικά νουκλεοτίδια (dntps), τα οποία χρησιμοποιούνται από τη DNA πολυμεράση για σύνθεση των νέων κλώνων DNA. Πίνακας 14. Τα βήματα των αντιδράσεων που πραγματοποιούνται, η θερμοκρασία που απαιτεί το καθένα, η διάρκεια του κάθε βήματος και οι κύκλοι κάθε βήματος. Βήμα Θερμοκρασία Διάρκεια Κύκλοι Αρχική αποδιάταξη - ενεργοποίηση της 95 ο C 3 min 1 πολυμεράσης Μετουσίωση 90 ο C 3 sec 40 Επέκταση 60 ο C 30 sec Πλήρης Αποδιάταξη 95 ο C 1 min 1 Πλήρης Επαναδιάταξη 55 ο C 30 sec Σταδιακή Αποδιάταξη 95 ο C 30 sec 69

70 Υλικά & Μέθοδοι Κατόπιν της αντίδρασης τα δεδομένα, οι κύκλοι δηλαδή (τιμές Ct), εξάγονται και σε φύλο excel προς ανάλυση σύμφωνα με τον τύπο 2 -ΔΔCt (leevac) Απομόνωση και ανάλυση πρωτεΐνών Απομόνωση ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων για την ανάλυση πρωτεϊνών Περιληπτικά, τρυβλία διαμέτρου 100mm εκπλύθηκαν αρχικά δύο φορές με 5ml ψυχρής PBS-1mM EDTA ph8.0 και στη συνέχεια προστέθηκε 1.0ml ψυχρής PBS-1mM EDTA ph 8.0 και τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ειδικό σιλικονούχο υλικό (rubber policeman) σε σωλήνα eppendorf. Το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στις 6500 στροφές για 1.5 λεπτό στο ψυχρό θάλαμο (cold room) και το υπερκείμενο αφαιρέθηκε. Κατόπιν προστέθηκαν μl διαλύματος RIPA, το ίζημα επαναιωρήθηκε με δίνη (vortex) και το μίγμα παρέμενε στον πάγο για 20 λεπτά. Ακολούθησε ανάδευση με δίνη (vortex) για περίπου 1 λεπτό και φυγοκέντρηση στις στροφές για 20 λεπτά στους 4 ο C. Tο υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε καθαρό, αποστειρωμένο σωλήνα eppendorf και μικρή ποσότητα των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Με την ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε σύστημα κάθετων γυάλινων πλακών 183, 186. Η πηκτή αποτελείται από δύο μέρη: Από την πηκτή επιστοίβαξης με μεγάλο μέγεθος πόρων και την πηκτή διαχωρισμού με μικρότερο μέγεθος πόρων. Τα πρωτεϊνικά μόρια διαπερνούν γρήγορα την πρώτη συσσωρεύονται σε μια λεπτή στιβάδα και εισέρχονται ταυτόχρονα στη δεύτερη πηκτή όπου και γίνεται ο διαχωρισμός. Η αναλογία όγκων πηκτής διαχωρισμού:πηκτή επιστοίβαξης είναι ~5:1. Για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), που πραγματοποιήθηκε σε μικρή διπλή συσκευή (Mini-Protean gel electrophoresis tank; Bio-Rad Labs, USA), παρασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν 10% πηκτές SDS-PAGE (Πίνακας 3.2), σύμφωνα με προηγούμενες μεθόδους 183, 186. Το μίγμα αφέθηκε να πολυμεριστεί σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Στα πρωτεϊνικά δείγματα (200μg πρωτεΐνης) προστέθηκαν 4X διαλύματος φόρτωσης πρωτεϊνών και αφού θερμάνθηκαν για 5 λεπτά στους 100 C, φορτώθηκαν στην πηκτή. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στα 100 V σε διάλυμα ηλεκτροφόρησης για ~2 ώρες. Ως δείκτης του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε ένα πρότυπο 70

71 Υλικά & Μέθοδοι έγχρωμο μίγμα πρωτεϊνών Color Prestained Protein Standard, Broad Range ( kda). Πίνακας 15. Πηκτές SDS-Πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Όγκοι πηκτής επιστοίβαξης (για δύο πηκτές: 6 ml) Διάλυμα Όγκος (ml) Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο ddη 2O % μίγμα ακρυλαμιδίου (29.2% ακρυλαμίδιο, 0.8% Δις-ακρυλαμίδιο) (29.2% ακρυλαμίδιο, 0.8% Διςακρλυλαμίδιο) 1.0 5% w/v 1.0 Μ Tris pη Μ 10% SDS % 10% υπερθειϊκό αμμώνιο % ΤΕΜΕD Τελικός όγκος (ml) 6 (Για 2 πηκτές) Όγκοι πηκτής διαχωρισμού 10% (για δύο πηκτές: 15 ml) Διάλυμα Όγκος (ml) Τελική συγκέντρωση Αποστειρωμένο ddη 2O % μίγμα ακρυλαμιδίου % w/v 1.5 Μ Tris pη Μ 10% SDS % 10% υπερθειϊκό αμμώνιο % ΤΕΜΕD Τελικός όγκος (ml) Ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωμα κατά Western (Western blot) Μετά την ηλεκτροφόρηση σε 1X ρυθμιστικό διάλυμα Tris-γλυκίνης που περιείχε SDS, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF σε 1X ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς πρωτεϊνών για 4 ώρες στους 4ºC και τάση 42V σύμφωνα με προηγούμενες μεθόδους που έχουν περιγραφεί 183. Μετά την μεταφορά των πρωτεϊνών, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα και 30 λεπτά σε 5% άπαχο γάλα σκόνη ελεύθερο λιπιδίων διαλυμένο σε PBS (5% blocking solution). Στην συνέχεια οι μεμβράνες επωάστηκαν με το πρώτο αντίσωμα mouse anti- 71

72 Υλικά & Μέθοδοι La (A.2.6) σε 3.5% blocking solution ολονύκτια στους 4ºC υπό ανάδευση. Οι μεμβράνες εκπλύθηκαν 3 φορές από 10 λεπτά με 0,1% PBS-Τween και εκτέθηκαν στο δεύτερο αντίσωμα goat anti-mouse IgG (HRP) (A.2.6) σε 3.5% blocking solution για ώρες, στους 4ºC, υπό ανάδευση. Οι μεμβράνες εκπλύθηκαν 3 φορές από 10 λεπτά με 1x PBS και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε σκοτεινό θάλαμο χρησιμοποιώντας το ECL kit (Bio- Rad). Η έκθεση των μεμβρανών πραγματοποιήθηκε με φιλμ αυτό-ραδιογραφίας (UltraCruz Autoradiography Film). Tα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα ΑΙDA version Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής Με την κυτταρομετρία ροής γίνεται μέτρηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου (ανάλυση του κυτταρικού κύκλου) καθώς και του ολικού περιεχόμενου του DNA ενός κυτταρικού πληθυσμού. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων στη φάση ηρεμίας (G0/G1), στη φάση σύνθεσης DNA (S) και στη φάση μίτωσης (G2/M). Η διαδικασία έχει ως εξής: 1. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν ( 2.2.1), επιστρώθηκαν σε τρυβλία διαµέτρου 60mm και αφέθηκαν να προσκολληθούν ολονύκυτια σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM, απουσία pen/strep. 2. Την επόμενη μέρα τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμιδιακούς φορείς: α) pεgfp-c3-empty και β) pεgfp-c3-la ( B.2.3.) 3. Έπειτα από επώαση 6 ωρών, αφαιρέθηκε το θρεπτικό υλικό και αντικαταστάθηκε με φρέσκο είτε πλήρες θρεπτικό είτε θρεπτικό για χορήγηση στρες (Πίνακας 9). 4. Πραγματοποιήθηκε επώαση για 24 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα μονιμοποιούνται σε 70% παγωμένη αιθανόλη και φυλάχθηκαν για τουλάχιστον 16 ώρες σε καταψύκτη -20 C. 5. Ακολούθως της μονιμοποίησης των κυττάρων, πραγµατοποιήθηκαν 2 πλύσεις µε 1Χ PBS και προσθήκη 2µg/ml ιωδιούχου προπιδίου (Propidium Iodide και 100μg/ml RNAse A. Το ιωδιούχο προπίδιο είναι μία φθορίζουσα ουσία η οποία έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA (αλλά και του RNA) και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται για τη σήμανση νουκλεϊκών οξέων. Το ένζυμο RNAse A χρησιμοποιείται για να απομακρύνει το RNA από τα δείγματά μας. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή Becton Dickinson BD Calibur. Τα δεδομένα αναλύθηκαν μέσω του λογισμικού FlowJo V

73 Υλικά & Μέθοδοι Εικόνα 26. A) Φάσεις του κυτταρικού κύκλου Β) Ιστόγραμμα που απεικονίζεται το ποσοστό των κυττάρων κάθε φάσης του κυτταρικού κύκλου έπειτα από χρώση ιωδιούχου προπιδίου Wound Healing Assay Η δοκιμή επούλωσης τραύματος είναι μία μέθοδος για τη μελέτη της κυτταρικής μετανάστευσης in vitro. Δημιουργείται μια τεχνητή πληγή (χαραγή) στην επιφάνεια του μονόστιβου της κυτταροκαλλιέργειας και αφήνοντας τα κύτταρα με τον υπό μελέτη παράγοντα για ένα χρονικό διάστημα μπορεί να διαπιστωθεί ο ρυθμός της μεταναστευτικής ικανότητας των κυττάρων. Η συγκεκριμένη διαδικασία πραγματοποιήθηκε προκειμένου να μελετηθεί η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων, με σκοπό να επανορθώσουν τον προκαλούμενο τραυματισμό (wound healing) σε διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε αναφέρεται παρακάτω: 1. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν ( ), επιστρώθηκαν σε τρυβλία 12 βοθρίων (12- well plate) και αφέθηκαν να προσκολληθούν ολονύκτια σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM, απουσία pen/strep. 2. Την επόμενη μέρα τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμιδιακούς φορείς: α) pεgfp-c3-empty και β) pεgfp-c3-la. 3. Έπειτα από επώαση 6 ωρών, η πληρότητα των κυττάρων βρισκόταν στο 100% και ο πυθμένας του κάθε πηγαδιού έχει καλυφθεί πλήρως από κύτταρα. Με τη χρήση του ρύγχους (tip) των 10μl μιας πιπέτας δημιουργήσαμε μία ασυνέχεια ή αλλιώς μία τεχνητή πληγή (wound) στη μονοστιβάδα των κυττάρων κατά μήκος της επιφάνειας της καλλιέργειας, έτσι ώστε στην επιφάνεια επαφής με το ρύγχος να αποκολληθούν τα κύτταρα. 73

74 Υλικά & Μέθοδοι 4. Το θρεπτικό υλικό αφαιρέθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS (1x) ώστε να απομακρυνθούν τα κύτταρα που είχαν αποκολληθεί 5. Προστέθηκε νέο θρεπτικό υλικό με τις εκάστοτε συνθήκες που αναφέρθηκαν παραπάνω στον Πίνακα Ακολούθησε φωτογράφηση όλων των καλλιεργειών στα επιθυμητά χρονικά διαστήματα των 0, 6, 12, 24 και 48 ωρών, με τη χρήση φωτογραφικής μηχανής ενσωματωμένης σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο για να διαπιστωθεί αν τα κύτταρα μετακινήθηκαν ώστε να καλύψουν τον κενό χώρο στην επιφάνεια. Η λήψη της εικόνας έγινε ακριβώς πάνω από τη γραμμή/πληγή (wound) και κάθε φορά σε συγκεκριμένα πεδία που είχαν σχεδιαστεί κατά μήκος της γραμμής, για εξομάλυνση αποκλίσεων. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με την βοήθεια του προγράμματος MRI Wound healing Tool of Image J-macros. 74

75

76 3. Αποτελέσματα

77 Αποτελέσματα 3.1. H La εντοπίζεται στον πυρήνα στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου της ανθρώπινης πρωτεΐνης La χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα, πλασμίδιο το οποίο περιείχε την αλληλουχία του γονιδίου με κωδικόνια που διευκολύνουν την ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης (Optimized Sequence, GenScript). Το πλασμίδιο ήταν ευγενική χορηγία του Εργαστηρίου του Καθ. Γ. Σπυρούλια, Τμήματος Φαρμακευτικής, στα πλαίσια ερευνητικής συνεργασίας. Μέσω PCR ενισχύθηκε το επιθυμητό τμήμα και κλωνοποιήθηκε επιτυχώς σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα, καθοδικά του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας χρωστικής GFP (Green Fluorescent Protein) ( A.2.4). Ακολούθησε εισαγωγή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 για την ανίχνευση της La, με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Για εσωτερικό μάρτυρα του κυτταρικού συστήματος μελέτης έγινε διαμόλυνση με τον πλασμιδιακό φορέα χωρίς το ένθεμα, προκειμένου να διαπιστωθεί η ανίχνευση της μεταβολής της ενδοκυττάριας κατανομής. Τα κύτταρα επωάστηκαν με κατάλληλες χρωστικές για παρατήρηση των πυρήνων και των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, η οπτικοποίηση των πυρήνων έγινε με την μπλε φθορίζουσα χρωστική, Hoechst, η οποία προσδένεται στο DNA, ενώ για την σήμανση των μιτοχονδρίων χρησιμοποιήθηκε η κόκκινη χρωστική MitoTracker, η οποία διαχέεται παθητικά κατά μήκος της μεμβράνης του πλάσματος και συσσωρεύεται σε ενεργά μιτοχόνδρια. Η μελέτη της ενδοκυττάριας κατανομής της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε µέσω της παρατήρησης του φθορισµού του GFP µορίου που εκπέμπει στο πράσινο χρώμα. Τέλος, παρατηρήθηκε η συγχώνευση και των τριών πεδίων (Εικόνα 28). Από τις εικόνες του υποκυττάριου εντοπισμού γίνεται φανερό ότι η πρωτεΐνη La, εντοπίζεται στον πυρήνα των καρκινικών κύτταρα Α549. Το πρότυπο αυτό συμβαδίζει με παρατηρήσεις που έχουν γίνει από προηγούμενες έρευνες σε άλλες κυτταρικές σειρές 51, 75. Ωστόσο, παρατηρείται στην εικόνα 28 μια έντονη χρώση σε συγκεκριμένα σημεία στον πυρήνα και υποθέτουμε ότι τα σημεία αυτά αντιστοιχούν στους πυρηνίσκους όπου η La έχει βρεθεί να σταθεροποιεί μεταγράφα που βρίσκονται στον πυρηνίσκο αλλά και ότι αλληλεπιδρά με την νουκλεολίνη 52, 144, 146. Μελέτες σχετικά με τον εντοπισμό της La αναφέρουν την εξαγωγή της στο κυτταρόπλασμα και την συμμετοχή της στο μεταβολισμό mrnas. Για να διαπιστώσουμε αν υπάρχει κυτταροπλασµατική μεταφορά της La, στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, προχωρήσαμε σε μελέτη του εντοπισμού της με ανοσοφθορισμό, κάτω από διαφορετικές συνθήκες στρες. 77

78 Αποτελέσματα Hoechst La Mitotracker Merge Hoechst Μάρτυρας Mitotracker Merge Εικόνα 28. Κυτταρικός εντοπισμός πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Α549 διαμολυσμένα με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το ανασυνδυασμένο γονίδιο της GFP - La και η ανίχνευση της παραγόμενης πρωτεΐνης με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Στο πείραμα χρησιμοποιήθηκε και ως αρνητικός μάρτυρας, ο φορέας χωρίς το ένθεμα Πυρηνικός εντοπισμός της La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 έπειτα από επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες. Μελέτες σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές έχουν δείξει ότι ο υποκυττάριος εντοπισμός της πρωτεΐνης La μπορεί να διαφέρει σε συνθήκες στρες, όπως η χορήγηση υπεροξειδίου 150, η έκθεση σε UV ακτινοβολία 149, 150, η μόλυνση από ιούς 151, 152 και η απόπτωση 55. Πραγματοποιήθηκαν, λοιπόν, πειράματα ανοσοφθορισμού προκειμένου να διερευνηθεί ο εντοπισμός της ενδογενούς πρωτεΐνης, στα κύτταρα Α549, σε συνθήκες στρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν έπειτα από επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες (πίνακας 9) σε διαφορετικές χρονικές στιγμές (Εικόνες 29-31). 78

79 Αποτελέσματα Εικόνα 29. Κυτταρικός εντοπισμός πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 έπειτα από επαγωγή στρες. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό διαφορετικές καταστάσεις στρες στο θρεπτικό τους υλικό για 6 ώρες και ακολούθησε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης La. (Scale bar 60μm). 79

80 Αποτελέσματα Εικόνα 30. Κυτταρικός εντοπισμός πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 έπειτα από επαγωγή στρες. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό διαφορετικές καταστάσεις στρες στο θρεπτικό τους υλικό για 12 ώρες και ακολούθησε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης La. (Scale bar 60μm). 80

81 Αποτελέσματα Εικόνα 31. Κυτταρικός εντοπισμός της ενδογενούς πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 έπειτα από χορήγηση υπεροξειδίου. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν ύστερα από. χορήγηση 500μM υπεροξειδίου (Η202) στο θρεπτικό τους υλικό σε διαφορετικές χρονικές στιγμές 1, 2, 6 και 12 ώρες και ακολούθησε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης La. (Scale bar 60μm). 81

82 Αποτελέσματα Από τα αποτελέσματα εξάγουμε το συμπέρασμα ότι η πρωτεΐνη La παρουσιάζει τον ίδιο εντοπισμό, τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης των κυττάρων, όσο και έπειτα από τις διαφορετικές συνθήκες στρες που μελετήσαμε, οι οποίες περιλαμβάνουν τη στέρηση του ορού, της γλυκόζης, την ταυτόχρονη απουσία ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας, αλλά και την χορήγηση 500μΜ υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2Ο 2). Τα κύτταρα έχουν αναπτύξει μια ποικιλόμορφη απόκριση για να αντιμετωπίσουν τις εν δυνάμει καταστροφικές συνέπειες που προκαλούνται από το στρες. Μόλις το κύτταρο ανιχνεύσει βλάβες, ενεργοποιεί πορείες ελέγχου για αποκατάσταση της κυτταρικής βλάβης, όπως είναι η διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ώστε να δοθεί χρόνος για επιδιόρθωση, η ρύθμιση του μεταβολισμού του RNA, η οποία συχνά συνεπάγεται γενική μείωση της μετάφρασης και επαγωγή της έκφρασης γονιδίων που αποκρίνονται στο στρες ή ακόμα και επαγωγή της απόπτωσης. H στέρηση του ορού και κατά συνέπεια των αυξητικών παραγόντων από το μέσο καλλιέργειας των κυττάρων, επιδρά στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, καθώς το κύτταρο δεν δέχεται μιτογόνα ερεθίσματα από το περιβάλλον του και σταματά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η έλλειψη θρεπτικών, όπως είναι η στέρηση της γλυκόζης, μπορεί να επάγει το στρες του Ενδοπλασματικού Δικτύου 187, πιθανώς μέσω αναστολής της πρωτεϊνικής γλυκοζυλίωσης, αλλά και διακοπή της προόδου του κυτταρικού κύκλου, επηρεάζοντας σημαντικά γονίδια που συμμετέχουν στην εξέλιξη του, όπως οι παράγοντες p21 και p Επιπλέον, η έλλειψη θρεπτικών μπορεί να οδηγήσει και στην αυτοφαγία, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στα καρκινικά κύτταρα που τη χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας. Η αυτοφαγία φαίνεται να λειτουργεί ως μονοπάτι που ενισχύει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων 189, 190. Τέλος, το Η 2Ο 2 χρησιμοποιείται ευρέως ως μοντέλο επαγωγής εξωγενούς οξειδωτικού στρες, το οποίο διαχέεται μέσω των κυτταρικών μεμβρανών προς τους ενδοκυττάριους μοριακούς στόχους. Εμπλέκεται στην κυτταρική σηματοδότηση, εξ αιτίας της ικανότητάς του να αναστέλλει τις φωσφατάσες τυροσίνης, μέσω οξείδωσης των καταλοίπων κυστεΐνης, στις καταλυτικές περιοχές τους, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης, όπως του αυξητικού παράγοντα PDGF (platelet derived growth factor) και της καθοδικής σηματοδότησης 191, 192. Το οξειδωτικό στρες μπορεί να ενεργοποιήσει διαφορετικούς μεταγραφικούς παράγοντες που συντονίζουν διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως για παράδειγμα τον Nrf2, μεταγραφικό παράγοντα, που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν αντιοξειδωτικά ένζυμα ή τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ (NF-kappa-B inhibitor beta), που ενεργοποιείται σε απόκριση σε στρεσογόνα ερεθίσματα και ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση. Ωστόσο, το Η 2Ο 2, μπορεί να προκαλέσει διαταραχή στη μεταφορά ηλεκτρονίων και βλάβες της μιτοχονδριακής μεμβράνης του κυττάρου οδηγώντας στην απόπτωση 193, 194. Τα δεδομένα μας για τον εντοπισμό της ενδογενούς La πρωτεΐνης, έπειτα από επαγωγή στρες σε όλες τις συνθήκες που 82

83 Αποτελέσματα μελετήθηκαν, παρουσιάζουν κατανομή της πρωτεΐνης τόσο στον πυρήνα, όσο και στον πυρηνίσκο και έρχεται σε αντίθεση με παλιότερες έρευνες που δείχνουν την La να μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα έπειτα από χορήγηση Η 2Ο 2. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτά βασίστηκαν σε πειράματα που διεξήχθησαν σε διαφορετικές συνθήκες και άλλη κυτταρική σειρά από τη δική μας, όπως HeLa Οι συνθήκες στρες επηρεάζουν την έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης La τόσο σε επίπεδο mrna, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης Έπειτα από αναζήτηση κατάλληλων συνθηκών καλλιέργειας καταλήξαμε σε επώαση των κυττάρων και επαγωγή του στρες (Πίνακας 9) για 48 ώρες, καθώς στο συγκεκριμένο χρονικό διάστημα παρατηρήσαμε την μεγαλύτερη αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης του mrna της πρωτεΐνης La. Ως γονίδιο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της ακτίνης. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της La σε καρκινικά κύτταρα Α549, έπειτα από επαγωγή στρες, κατέδειξε αλλαγή προτύπου αναφορικά με την στέρηση θρεπτικών και την επαγωγή οξειδωτικού στρες. Παρατηρήθηκε, 2.2 φορές αύξηση της έκφρασης του γονιδίου SSB, έπειτα από αφαίρεσης γλυκόζης και 1.7 φορές αύξηση, έπειτα από ταυτόχρονη απουσία ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων. Καμία μεταβολή στα επίπεδα του mrna της La δεν φάνηκε σε αφαίρεση ορού (FBS), ενώ παρατηρήθηκε μείωση 2.5 φορές έπειτα από χορήγηση υπεροξειδίου (Εικόνα 32). Εικόνα 32. Μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου SSB στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικές συνθήκες στρες για 48 ώρες και μελετήθηκαν με qrt-rcr τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SSB. Ως μάρτυρας-untreated χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα, χωρίς επαγωγή στρες. Για κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων και τη διαφορική έκφραση των γονιδίων υπολογίστηκε η μεταβολή στην έκφραση έναντι του γονιδίου της ακτίνης. 83

84 Αποτελέσματα Στη συνέχεια, αναλύθηκε με ανοσοαποτύπωμα κατά western, η έκφραση της πρωτεΐνης La σε συνθήκες στρες (Εικόνα 33). Έγινε κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων, κάθε δείγματος, με βάση την ακτίνη στο πρόγραμμα ΑΙDA. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης La, περίπου 10% πάνω σε σχέση με τον μάρτυρα (Α549 χωρίς επαγωγή στρες), τόσο σε συνθήκες στέρησης γλυκόζης, όσο και σε ταυτόχρονη απουσία ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο. Η χορήγηση υπεροξειδίου έδειξε μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης κατά 80%, ενώ έπειτα από αφαίρεση ορού, τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν κατά 50%. kda La/SSB β-actin Εικόνα 33. Eπίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 έπειτα από επαγωγή στρες. Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικές συνθήκες στρες για 48h. Απομονώθηκαν ολικά εκχυλίσματα πρωτεϊνών και αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά western για την έκφραση της La και της β-ακτίνης. 3.4 Υπερέκφραση της La σε στρες επηρεάζει γονίδια που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση με RT-qPCR, της έκφρασης μερικών γονιδίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο και εμπλέκονται με την πρωτεΐνη La. Στα κύτταρα, αρχικά, έγινε διαμόλυνση με κατάλληλο φορέα, για να υπερεκφράσουμε την La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης των κυττάρων (Εικόνα 35), αλλά και έπειτα από επαγωγή στρες (Εικόνα 36). Επιπλέον μελετήθηκαν, τα επίπεδα έκφρασης των ίδιων γονιδίων, με επαγωγή στρες χωρίς υπερέκφραση της πρωτεΐνης (Εικόνα 36). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι για την απεικόνιση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων υπολογίστηκε η μεταβολή στην έκφραση έναντι του γονιδίου της ακτίνης. Η επιτυχία της 84

85 Αποτελέσματα διαμόλυνσης επιβεβαιώθηκε με RT-qPCR, με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SSB να αυξάνονται 5 φορές (Εικόνα 34). Εικόνα 34. Μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου SSB στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La/SSB. Απομονώθηκε ολικό RNA, δημιουργήθηκε cdna και ακολούθησε ανάλυση με RT-qPCR. Εικόνα 35. Μεταβολή της έκφρασης των γονιδίων MDM2, P53 και P21 που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της SSB. Απομονώθηκε ολικό RNA, δημιουργήθηκε cdna και ακολούθησε ανάλυση με RT-qPCR. Παρατηρήθηκε, έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης La, σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης, αυξημένη κατά 7 φορές, η έκφραση του γονίδιου MDM2, που κωδικοποιεί μια λιγάση ουβικιτίνης με κύρια λειτουργία την αρνητική ρύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα p53 (Εικόνα 35). Η αύξηση αυτή, συνάδει με προηγούμενη μελέτη, σε λευχαιμικά κύτταρα 30, αναφορικά με την πρόσδεση της La, σε ένα τμήμα 27 νουκλεοτιδίων, στη 5 αμετάφραστη περιοχή του mrna του MDM2 προωθώντας την μετάφρασή του. Τα επίπεδα έκφρασης του p53 και του αναστολέα κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών, p21 Cip1/Waf1, δεν μεταβλήθηκαν. Διαπιστώθηκε, λοιπόν, υπό φυσιολογικές συνθήκες καλλιέργειας και σε συνθήκες υπερέκφρασης της La, τα επίπεδα έκφρασης 85

86 Αποτελέσματα του p53 μειώνονται από αύξηση της έκφρασης του MDM2, ο οποίος δεσμεύει το p53 και προωθεί την πρωτεοσωμική αποικοδόμηση του 195 (Εικόνα 35). A) Β) Γ) Εικόνα 36. Μεταβολή της έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων MDM2, P53 και P21 που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Κύτταρα καλλιεργήθηκαν και επωάστηκαν για 48h σε διαφορετικές συνθήκες στρες με ή χωρίς υπερέκφραση της La. Απομονώθηκε ολικό RNA, ακολούθησε δημιουργία cdna και ανάλυση με RT-qPCR. Έπειτα από επαγωγή στρες το πρότυπο των γονιδίων αλλάζει. Σε αποπτωτικές για το κύτταρο συνθήκες, όπως είναι η στέρηση ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο, παρατηρήθηκε ότι το mrna του p53 αυξάνεται 6 φορές. O p53 ενεργοποιείται από την καταστροφή του DNA, που μπορεί να προκληθεί σε απόκριση στο στρες ή από την έκφραση ογκογονιδίων, ρυθμίζοντας τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, την κυτταρική γήρανση και την απόπτωση Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση του p53 οδηγεί επίσης σε αυξημένη, κατά 16 φορές, έκφραση του mrna του MDM2 (negative feedback) (Εικόνα 36.B). Η υπερέκφραση της La, επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης του MDM2, σε όλες τις συνθήκες στρες που εξετάστηκαν (Εικόνα 36.A). Επίσης, παρατηρήθηκε επαγωγή της έκφρασης του mrna του p21 Cip1/Waf1 (Εικόνα 36.Γ), που προάγει την καταστολή του κυτταρικού κύκλου και αποτελεί μεταγραφικό στόχο του p53. Όμως, έπειτα από χορήγηση Η 2O 2 και σε συνθήκες υπερέκφρασης της La, τα επίπεδα έκφρασης του p53 μειώνονται, πιθανότατα λόγω αποσταθεροποίησης του p53 σε απόκριση στο υπεροξείδιο 199. H αύξηση του p21 Cip1/Waf1 86

87 Αποτελέσματα είναι ανεξάρτητη της κατάστασης του p53, καταδεικνύοντας ότι η έκφραση του p21 μπορεί να επαχθεί με μηχανισμούς εξαρτώμενους ή ανεξάρτητους από τον παράγοντα p Υπερέκφραση της La και ο ρόλος της στη έκφραση ρυθμιστικών μορίων RNA Ο κεντρικός ρόλος της πρωτεΐνης La στην ροή της γενετικής πληροφορίας ως απολύτως απαραίτητος διαμεσολαβητής της βιογένεσης των trna είναι πλέον γνωστός. Ωστόσο, πρόσφατες ανακαλύψεις θραυσμάτων trnas, τα οποία έχουν σημαντικότατο ρυθμιστικό ρόλο, έχουν συσχετιστεί με την La 140. Μελετήσαμε, λοιπόν, μικρά ρυθμιστικά μόρια RNA, αλλά και ένζυμα που παίζουν ρόλο στη βιογένεση αυτών, ώστε να διερευνηθούν πιθανές συσχετίσεις της La-εξαρτώμενης παραγωγής ρυθμιστικών μορίων κάτω από συνθήκες στρες. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι για την απεικόνιση της διαφορικής έκφρασης των μικρών μορίων, υπολογίστηκε η μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου του RNU6, το οποίο χρησιμοποιείται ως σταθερά εκφρασμένο γονίδιο στις περισσότερες κυτταρικές σειρές. Στην εικόνα 37 απεικονίζονται τα επίπεδα έκφρασης διαφόρων γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα A549, έπειτα από διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα στα οποία έγινε διαμόλυνση με τον πλασμιδιακό φορέα, χωρίς το ένθεμα για προσομοίωση την συνθηκών. Παρατηρήθηκε, 3 φορές αύξηση των επιπέδων έκφρασης του γονίδιου της trnase Z (ELAC2), η ισομορφή της οποίας βρίσκεται στον πυρήνα και συμμετέχει στην ενδονουκλεολυτική αφαίρεση του 3 άκρου των pre-trnas, ενώ 1.6 φορές αυξημένη είναι η έκφραση της trnase ZS (ELAC1), η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ωστόσο καμία σχετική αναφορά με τον ρόλο της δεν έχει γίνει και πιστεύεται ότι μπορεί να έχει δραστικότητα διάσπασης μη διαμορφωμένων RNA μορίων ή να παίζει κάποιο ρόλο στη μεταγωγή σήματος203, 204. Επιπλέον, 1.6 φορές αύξηση της έκφρασης, παρατηρήθηκε στο γονίδιο της αγγειογενίνης, μιας ριβονουκλεάσης που συμμετέχει στη βιογένεση των ριβοσωμάτων, ενώ ταυτόχρονα μεταφορικά μόρια RNA μπορεί να αποτελούν υπόστρωματά της. Επίσης, 1.4 φορές αύξηση της έκφρασης της Exportin-T, μιας GTPάσης υπεύθυνη για την μεταφορά των trnas στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 37.Α). 87

88 Αποτελέσματα Α) Β) trf-5003b trf-3028b Γ) Δ) Εικόνα 37. Μεταβολή της έκφρασης γονιδίων και ρυθμιστικών μορίων RNA έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Κύτταρα A549 καλλιεργήθηκαν και διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB. Στη συνέχεια απομονώθηκε RNA, δημιουργήθηκε cdna και ακολούθησε ανάλυση με RT-qPCR. Στην Εικόνα 37.Β, η La δεν φαίνεται να επάγει την έκφραση του trna Gly GCC (1.2 φορές), ούτε και του θραύσματος αυτού, trf3028b. Αντίθετα, παρατηρήθηκε 1.8 φορές 88

89 Αποτελέσματα αύξηση του trna Ser UGA, γεγονός που υποδηλώνει ότι συγκεκριμένα trna μόρια χρησιμοποιούνται ανάλογα με τις ανάγκες του κυττάρου. Ωστόσο, 2.3 φορές είναι αυξημένη η έκφραση του trf5003b (5 trf της γλυκίνης), το οποίο προέρχεται από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση του 5 άκρο του ώριμου trna, κοντά στο D-loop, πιθανότατα από το ένζυμο Dicer, του οποίου παρατηρείται αυξημένη έκφραση σε συνθήκες υπερέκφρασης της La. (Εικόνα 37.Γ). Το trf-1001, το οποίο προέρχεται από την θραύση του 3 trailer του pre-trna Ser UGA, από το ένζυμο trnase Z βρέθηκε να αυξάνεται 1.5 φορές όταν η La υπερεκφράζεται (Εικόνα 37.Β). Σε πολλές κυτταρικές σειρές, παρατηρείται αυξημένη η έκφρασή του, η οποία έχει συσχετιστεί με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο επιδρά στην φυσιολογία του κυττάρου παραμένει άγνωστος, ωστόσο knockdown αυτού προκαλεί μείωση της κυτταρικής επιβίωσης και αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου. Ενώ, η ωρίμανση του 3 άκρου λαμβάνει χώρα στον πυρήνα, και ως εκ τούτου τα trf-1 αναμένεται να είναι παρόντα εκεί, παρατηρούνται άφθονα στο κυτταρόπλασμα, κάτι που υποδηλώνει ότι εξάγονται από τον πυρήνα με έναν άγνωστο μέχρι στιγμής μηχανισμό. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, τα trfs έχουν βρεθεί να συνδέονται με τις Argonaute πρωτεΐνες και συγκεκριμένα τις ΑGO 3 και 4, των οποίων τα επίπεδα έκφρασης είναι 1.3 και 1.4 φορές αυξημένα, αντίστοιχα, σε σχέση με τον μάρτυρα (Εικόνα 37.Γ). Ωστόσο, σταθερή φαίνεται και η έκφραση της AGO 2. Παρόμοια σταθερή μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης τους παρουσιάζουν και τα mirnas που μελετήσαμε (Εικόνα 37.Δ). Τα mirnas αυτά αφορούν το mir-21-5p, ένα ογκογόνο micrornas, το οποίο έχει μελετηθεί εκτενώς στον καρκίνο του πνεύμονα, μειορυθμίζοντας την έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN (Phosphatase and tensin homolog) και ακολούθως διεγείροντας την ανάπτυξη και την μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer) 201. To let7b-5p, μέλος της οικογένειας let-7, τα οποία έχουν βρεθεί ότι ρυθμίζουν αρνητικά τα Ras ογκογονίδια, κατευθύνουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, αλλά σχετίζονται και με τις κυκλίνες 202. Το mir-34a-5p, παίζει σημαντικό ρόλο στην απόκριση σε βλάβες του DNA και στόχος του είναι ο MDM2, με αποτέλεσμα να αυξάνεται ο p53 επάγοντας την απόπτωση και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου 203, 204. Τέλος, το mir- 518e-3p, το οποίο έπειτα από NGS ανάλυση του εργαστηρίου μας, έχει βρεθεί αυξημένη η έκφρασή του, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα και το οποίο έπειτα από ανάλυση με RT-qPCR, στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε αυξημένο 7 φορές, έπειτα από υπερέκφραση της La. Ωστόσο, καμία αναφορά στη βιβλιογραφία δεν υπάρχει για την δράση του, έτσι έπειτα από αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων (TarBase) για πρόβλεψη των στόχων του, βρέθηκαν 2 επιβεβαιωμένοι στόχοι. Πρώτα, το γονίδιο CHD6 89

90 Αποτελέσματα (chromo-atpase/helicase DNA binding protein), το οποίο κωδικοποιεί οικογένεια πρωτεϊνών SNF2/RAD54, οι οποίες εκτός από την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, μπορούν να λειτουργήσουν και ως μεταγραφικοί ρυθμιστές συγκεκριμένων γονιδίων, όπως του nrf Δεύτερον, το γονίδιο KLF6, ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Kruppel-like factor 6, ένα μέλος των μεταγραφικών παραγόντων Kruppel-like factors. Είναι DNA-binding πρωτεΐνη που ρυθμίζει την έκφραση διαφόρων γονιδίων, ένα απ αυτά είναι και η κυκλίνης D Στη συνέχεια, έγινε ανάλυση με RT-qPCR, των ίδιων γονιδίων, έπειτα από επαγωγή στρες. Αρχικά, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση,16 φορές, της έκφρασης του γονιδίου XPOT, έπειτα από αφαίρεση γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο, αλλά και 11 φορές αύξηση, από ταυτόχρονη αφαίρεση γλυκόζης και ορού. Στα ευκαρυωτικά, η μεταφορά των trna μορίων μεταξύ του πυρήνα και του κυτταρόπλασματος, γίνεται μέσω μιας GTPάσης, της Exportin-T. Η διακίνηση των trna μορίων συχνά ανταποκρίνεται στο περιβαλλοντικό στρες, συνδέοντας έτσι τη μεταγραφή στον πυρήνα με τη μετάφραση στο κυτταρόπλασμα Η αύξηση αυτή ενδεχομένως σχετίζεται με την αυξημένη παραγωγή trnas, όπως απεικονίζεται και στο γράφημα του trna της γλυκίνης (Εικόνα 38.Θ). Ωστόσο, με υπερέκφραση της La, η έκφραση του XPOT, διατηρείται αυξημένη, αλλά σε μικρότερο ποσοστό, 4 φορές πάνω και στις δυο συνθήκες στέρησης θρεπιτκών συστατικών. Επιπλέον, μελετήσαμε τα trfs, των οποίων τα επίπεδα έκφρασης ήταν αυξημένα στην ανάλυση NGS, καθώς και των αντίστοιχων trnas από τα οποία προκύπτουν. Το trf-1001, το οποίο παράγεται από την trnase Z, επάγεται τόσο έπειτα από αφαίρεση αυξητικών παραγόντων (FBS deprivation) και οξειδωτικού στρες (H 2O 2), όσο και έπειτα από υπερέκφραση της La, 8 φορές και 4 φορές αύξηση, αντίστοιχα. Ενώ, το trf-5003, αυξάνει 12 φορές, σε στέρηση γλυκόζης, κάτι που δεν παρατηρείται έπειτα από υπερέκφραση της La. Σημαντική είναι η αύξηση της αγγειογενίνης σε καταστάσεις στρες. Η αγγειογενίνη, έχει βρεθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο, αλλά και στο μεταβολισμό του RNA. Διεγείρει τόσο την αγγειογένεση, όσο και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων 210. Σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης για τα κύτταρα, η αγγειογενίνη είναι κυρίως στον πυρήνα και στους πυρηνίσκους, για να διεγείρει τη μεταγραφή rrna, ενώ η κυτταροπλασματική αγγειογενίνη είναι συνδεμένη με τον αναστολέα της (RNH1). Σε συνθήκες στρες, ο RNH1 συσσωρεύεται στον πυρήνα, έτσι ώστε να αναστέλλει την διαμεσολαβούμενη από την αγγειογενίνη μεταγραφή του rrna

91 Αποτελέσματα Α) Β) Γ) Δ) Ε) ΣΤ) Z) H) Θ) Εικόνα 38. Μεταβολή της έκφρασης γονιδίων και ρυθμιστικών μορίων RNA έπειτα από επαγωγή στρες με ή χωρίς υπερέκφραση της πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Τα A549 καλλιεργήθηκαν, επωάστηκαν με στρες για 48h, διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της SSB. Aκολούθησε απομόνωση RNA, δημιουργία cdna και ανάλυση με RT-qPCR. 91

92 Αποτελέσματα Πρόσφατα, η κυτταροπλασματική αγγειογενίνη ταυτοποιήθηκε με τα θραύσματα των ώριμων trna μορίων στην περιοχή του αντικωδικονίου, έπειτα από επαγωγή στρες όπως υποξία και στέρηση θρεπτικών, παράγοντας τα trfs (trna halves). Πράγματι, όπως παρατηρούμε και στο γράφημα (Εικόνα 38.Δ), τα επίπεδα έκφρασης της αγγειογενίνης είναι σε σημαντικό βαθμό αυξημένα, ειδικά στις συνθήκες στέρησης θρεπτικών, ενισχύοντας την υπόθεση της μεσολαβούμενης από αγγειογενίνη παραγωγής των trfs σε απόκριση στο στρες, που πιθανόν να οδηγεί σε επαναπρογραμματισμό της πρωτεϊνικής μετάφρασης. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασής της, φανερώνουν σημαντική πτώση σε σύγκριση με τις συνθήκες υπερέκφρασης της La, σε όλες τις συνθήκες στρες με εμφανή πτώση στο οξειδωτικό στρες. Και ενώ, η αγγειογενίνη έχει συσχετιστεί με τα trna halves, άλλες σημαντικές ριβονουκλεάσες έχουν προταθεί ότι συντελούν στην παραγωγή των trfs, όπως η DICER και η trnase Z που έχουν προταθεί ότι επάγουν το κόψιμο των trf3, 5 και 1, αντίστοιχα. Όπως βλέπουμε και στο γράφημα, σε αφαίρεση γλυκόζης το trf-5003b είναι αρκετά αυξημένο σε σύγκριση και με τα επίπεδα της DICER. Τα αυξημένα επίπεδα του γονιδίου τόσο της trnase Z, όσο και της DICER στις συνθήκες στρες πιθανότατα να οφείλεται στα trfs, αλλά και στον ανταγωνισμό στην πρόσδεση των φυσιολογικών τους υποστρωμάτων. Η αύξηση αυτή δεν παρατηρήθηκε, ωστόσο παρουσία υπερεκφρασμένης της La. Αντίθετα, σε όλες τις συνθήκες στρες παρατηρείται σημαντική αύξηση του γονιδίου DROSHA, μιας ριβονουκλεάσης που διασπά τα πρώιμα mirna μόρια. Όσον αφορά τις πρωτεΐνες Argonaute, παρατηρούμε αύξηση των επιπέδων των γονιδίων τους σε όλες τις συνθήκες στρες, που πιθανότατα να σχετίζεται με τα αυξανόμενα επίπεδα των trfs, τα οποία σε μελέτες έχει δειχθεί ότι παρουσιάζουν προτίμηση σ αυτές. Μια σημαντική παρατήρηση στα αποτελέσματα αποτελεί η ΑGΟ2, το ενεργό συστατικό του συμπλόκου RISC στο μονοπάτι βιογένεσης των mirnas, η οποία στη συνθήκη αφαίρεσης ορού από το θρεπτικό μέσο των κυττάρων, φαίνεται αρκετά αυξημένη και πιθανότατα εξηγεί και την αύξηση του let7 στην ίδια συνθήκη. Η AGO2 σε σύμπλοκο με το let-7 επιδρούν στο mrna της κυκλίνης D Τέλος, αξίζει παρατήρησης ότι παρουσία αυξανόμενων επιπέδων της La, τα επίπεδα έκφρασης όλων των AGO πρωτεϊνών μειώνονται σε όλες τις συνθήκες, με εξαίρεση την Argonaute 3, που σε συνθήκες στέρησης θρεπτικών, επάγονται. Τέλος, παρατηρούμε ότι κάτω από συνθήκες στρες και υπερέκφρασης της La επάγεται η έκφραση όλων των μελετημένων mirnas. 92

93 Αποτελέσματα Α) Β) Γ) Δ) ΣΤ) Ε) Ζ) Η) Θ) Εικόνα 39. Μεταβολή της έκφρασης γονιδίων και ρυθμιστικών μορίων RNA έπειτα από επαγωγή στρες με ή χωρίς υπερέκφραση της πρωτεΐνης La στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Τα A549 καλλιεργήθηκαν, επωάστηκαν με στρες για 48h και διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La. Ακολούθως, απομονώθηκε RNA, δημιουργήθηκε cdna και ακολούθησε ανάλυση με RT-qPCR. 93

94 P e rc e n ta g e o f c e lls Αποτελέσματα 3.6. Μεταβολές του κυτταρικού κύκλου έπειτα από υπερέκφραση της La σε φυσιολογικές και συνθήκες στρες Σε προηγούμενη μελέτη που έχει διεξαχθεί στο εργαστήριο μας, έχει παρατηρηθεί σημαντική αύξηση της πρωτεΐνης La, τόσο σε ιστούς όσο και σε κυτταρικές σειρές από καρκίνο πνεύμονα. Ωστόσο, μελέτες αναφορικά με τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της La, έχουν πραγματοποιηθεί και σε τύπους καρκίνου 177, υποδηλώνοντας ότι η La μπορεί να παίζει ρόλο στην ογκογένεση. Θέλοντας να ελέγξουμε κατά πόσον η πρωτεΐνη μας επηρεάζει την έκφραση του κυτταρικού κύκλου, στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα A549, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, έπειτα από υπερέκφραση της La, σε φυσιολογικές και συνθήκες στρες (Πίνακας 9). 5 0 O v e r e x p r e s s io n L a N o rm a l O v e re x p re s s io n L a G 0 /G 1 S G 2 /M P h a s e s o f th e C e ll C y c le Εικόνα 40. Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα A549 με υπερκεφρασμένη την La. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων Α549 μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η εικόνα απεικονίζει την κατανομή των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, έπειτα από διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της SSB. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα χωρίς το ένθεμα. 94

95 Αποτελέσματα Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα στα οποία έγινε διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La και επώασή τους σε πλήρες θρεπτικό υλικό για 24 ώρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα χωρίς το ένθεμα. Παρακάτω φαίνονται τα αποτελέσματα από πειράματα κυτταρομετρίας ροής έπειτα από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Κάθε ανάλυση έχει προέλθει από μέτρηση κυττάρων. Τα αποτελέσματα φανερώνουν ότι το συνολικό προφίλ του κυτταρικού κύκλου, στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549, δεν μεταβλήθηκε έπειτα από υπερκέφραση της πρωτεΐνης La (Εικόνα 40). Ωστόσο, παρατηρείται ότι η διάρκεια της G1 φάσης είναι ελάχιστα μικρότερη έπειτα από υπερέκφραση της La σε ένα ποσοστό 37% συγκριτικά με τα κύτταρα χωρίς την υπερέκφραση, όπου το ποσοστό είναι στο 43,7%. Πειράματα RT-qPCR, φανέρωσαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου CCND1 χωρίς επαγωγή στρες (Εικόνα 41), κάτι που συνηγορεί στο ότι τα κύτταρα εισέρχονται στην S φάση του κύκλου πιο γρήγορα. Από τα παραπάνω αποτελέσματα αλλά και από όσα ήδη είναι γνωστά από τη βιβλιογραφία 180, είναι πιθανό η υπερέκφραση της La να επάγει το κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες πρέπει να πραγματοποιηθούν στα καρκινικά κύτταρα αυτά για να ελεγχθεί το παραπάνω συμπέρασμα. Εικόνα 41. Μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου της κυκλίνης D1, έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης, αλλά και μετά από επαγωγή στρες στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549. Τα A549 καλλιεργήθηκαν και διαμολύνθηκαν με κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς, επωάστηκαν με και χωρίς στρες για 48h και ακολούθως απομονώθηκε RNA, δημιουργήθηκε cdna και ακολούθησε ανάλυση με RT-qPCR. 95

96 Αποτελέσματα Στη συνέχεια, στις εικόνες που ακολουθούν φαίνεται η ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής, όπου όλα τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και επωάστηκαν για 24 ώρες σε διαφορετικές συνθήκες στρες. Ως Μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα με το ένθεμα σε φυσιολογικές συνθήκες επώασης-πλήρες θρεπτικό υλικό. (Εικόνα 42-45). Εικόνα 42. Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα A549 με υπερκεφρασμένη την La έπειτα από στέρηση ορού στο θρεπτικό μέσο. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων Α549 μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η εικόνα απεικονίζει την κατανομή των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έπειτα από παροδική διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και μετά από επαγωγή στρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. 96

97 Αποτελέσματα Εικόνα 43. Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα A549 με υπερκεφρασμένη την La έπειτα από στέρηση γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων Α549 μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η εικόνα απεικονίζει την κατανομή των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έπειτα από διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και μετά από επαγωγή στρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. 97

98 Αποτελέσματα Εικόνα 44. Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα A549 με υπερκεφρασμένη την La έπειτα από ταυτόχρονη στέρηση ορού και γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων Α549 μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η εικόνα απεικονίζει την κατανομή των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έπειτα από διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και μετά από επαγωγή στρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. 98

99 Αποτελέσματα Εικόνα 45. Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα A549 με υπερκεφρασμένη την La έπειτα από χορήγηση 500 μμ Η 2Ο 2 στο θρεπτικό μέσο. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων Α549 μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η εικόνα απεικονίζει την κατανομή των ανθρωπίνων καρκινικών κυττάρων πνεύμονα στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έπειτα από διαμόλυνση τους με πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και μετά επαγωγή στρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο της La σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, έπειτα από επαγωγή διαφόρων συνθηκών στρες (Πίνακας 9) για 24 ώρες, αλλά και έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης La σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, δείχνει μόνο τα αναμενόμενα αποτελέσματα και όχι κάποια εμπλοκή της La στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου κάτω από καταστάσεις στρες. Συγκεκριμένα, η αποστέρηση ορού εμβρύου βοός (FBS) από το καλλιεργητικό μέσο είναι γνωστό πως περιορίζει την κυτταρική επιβίωση, επάγει την καταστροφή του 99

100 Αποτελέσματα γονιδιώματος, ενώ ταυτόχρονα σταματά τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/G1 188, κάτι που συνάδει και από το αποτέλεσμα της RT-qPCR, όπου παρατηρούμε τα επίπεδα του γονιδίου της CcnD1 να μειώνονται αισθητά σε επαγωγή στρες (Εικόνα 41). Το ίδιο αποτέλεσμα φαίνεται και στο συνδυασμό αφαίρεσης ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο (Εικόνα 34). Επιπλέον, η αφαίρεση της γλυκόζης από τα κύτταρα προκαλεί αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 188, 213. Τέλος, η προσθήκη Η 2Ο 2 στη φάση G2/M 214. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου, λοιπόν, ρυθμίζεται ως απάντηση στις μεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών ανεξάρτητα από την La. 3.7 Υπερέκφραση της La επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση in vitro Με σκοπό να αξιολογηθεί ο τρόπος με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα επηρεάζονται από την πρωτεΐνη La, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Wound Healing Assay. Μια τεχνική που μας επιτρέπει να καταγράψουμε οπτικά την κινητικότητα των κυττάρων σε διάφορες χρονικές περιόδους. Τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν και χρησιμοποιούν το στρώμα προς όφελος τους με τελικό σκοπό να επιτύχουν την μετάσταση. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων Α549 µε πλασμιδιακό φορέα που φέρει ως ένθεμα το γονίδιο της πρωτεΐνης La (overexpression La), αλλά και με τον πλασμιδιακό φορέα, χωρίς το ένθεμα ως μάρτυρας (Εικόνα 46). Η κυτταρική κινητικότητα μετρήθηκε αναλύοντας την εικόνα σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, από 6 ώρες έως και 48 ώρες. Τα κύτταρα παρουσίασαν σημαντική αύξηση της κινητικότητάς τους. Η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων αυξο-ρυθμίστηκε κατά 30-40%. Τα αποτελέσματα ήταν εμφανή μετά την πάροδο των 24 ωρών και έγιναν ακόμα πιο έντονα στις 48 ώρες. Φαίνεται λοιπόν πως η La πριμοδοτεί την αυξημένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων (Εικόνα 46). 100

101 A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) Αποτελέσματα 0h 6h 12h 24h 48h Μάρτυρας Overexpression La C o n tr o l O v e r e x p r e s s io n L a h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 0 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h Εικόνα 46. Επίδραση της La στην κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων A549. Τα Α549 διαμολύνθηκαν με πλασμιδιακό φορέα που φέρει ως ένθεμα το γονίδιο SSB (Overexpression La), αλλά και με πλασμιδιακό φορέα χωρίς τον ένθεμα (Μάρτυρας) και μελετήθηκαν με την μέθοδο Wound Healing Assay για τη κινητικότητά τους για 48 ώρες. 101

102 A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) A re a o f w o u n d c lo s u r e (% ) Αποτελέσματα 0h 6h 12h 24h 48h Over La (Μάρτυρας) Over La & FBS deprivation Over La & Glucose deprivation Over La & Glucose-FBS deprivation Over La & Η 2 Ο O v e r e x p r e s s io n L a (N o rm a l) G lu c o s e d e p r iv a tio n F B S d e p r iv a tio n h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 0 0 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 0 0 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h G lu c o s e & F B S d e p r iv a tio n H 2 O 2 (5 0 0 μ M ) h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 0 0 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h Εικόνα 47. Επίδραση της La στην κυτταρική μετανάστευση A549, έπειτα από επαγωγή στρες. Τα Α549 μελετήθηκαν για τη κινητικότητά τους, με την μέθοδο Wound Healing Assay, έπειτα από υπερέκφραση της πρωτεΐνης La και επαγωγή διαφορετικών συνθηκών στρες. 102

103 Αποτελέσματα Στη συνέχεια, για περαιτέρω μελέτη της κυτταρικής κινητικότητας των κυττάρων παρουσία αυξημένων επιπέδων της La, πραγματοποιήθηκε η ίδια μέθοδος (wound healing assay), έπειτα από επαγωγή στρες. Στην προκειμένη περίπτωση όλα τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με τον πλασμιαδιακό φορέα που φέρει το γονίδιο SSB και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν παρουσία της La στις διαφορετικές συνθήκες στρες (Πίνακας 9). Όπως παρατηρείται στην Εικόνα 47 υπερέκφραση της La και έπειτα από αφαίρεση ορού (FBS deprivation), αλλά και αφαίρεση γλυκόζης (Glucose deprivation) τα κύτταρα δεν καλύπτουν το κενό. Στη συνθήκη αφαίρεσης γλυκόζης και ορού από το θρεπτικό μέσο παρατηρείται έντονα και η απόπτωση των κυττάρων. Έπειτα από χορήγηση Η 2Ο 2 στα κύτταρα, φαίνεται να επηρεάζεται η κινητικότητά τους, μετά την πάροδο των 24 ωρών και σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με το μάρτυρα. H επίδραση της La δεν φαίνεται να επηρεάζει την κινητικότητα των κυττάρων σε καμία από τις συνθήκες στρες, κάτι που παρατηρείται και από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου που έγινε παραπάνω (Εικόνα 47). 103

104 4. Συζήτηση

105 Συζήτηση Η πρωτεΐνη La ανήκει σε μια εξελικτικά διατηρημένη υπερ-οικογένεια, τις LARPs πρωτεΐνες. Η συντήρησή της από τους μύκητες μέχρι τον άνθρωπο υποδηλώνει πως η πρωτεΐνη αυτή διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των οργανισμών (Εικόνα 48). Από την ανακάλυψή της, ως αυτοαντιγόνο σε ασθενείς με σύνδρομο Sjögren 12 και συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus, SLE) 11, μέχρι σήμερα, έχει γίνει αντιληπτό ότι η πρωτεΐνη La αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα στη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, καθώς η συμβολή της είναι καθοριστική για την τύχη πολλών μορίων RNA. Ωστόσο, εκτός από τον ουσιαστικό ρόλο της, ως μια RNA συνοδός πρωτεΐνη στα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ, κατέστη σαφές, τα τελευταία χρόνια, ότι τα επίπεδα έκφρασής της είναι αυξημένα σε μια ποικιλία καρκίνων 177. Αυτό το εύρημα πυροδότησε το ενδιαφέρον ερώτημα εάν η πρωτεΐνη La προάγει την καρκινογένεση. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο μας, έδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης της La σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς πνεύμονα σε σύγκριση με υγιή κύτταρα μέσω ανάλυσης Next Generation Sequencing (NGS). Δεδομένου, λοιπόν, ότι ο καρκίνος του πνεύμονα κατέχει υψηλά ποσοστά θνησιμότητας στη σύγχρονη κοινωνία, ερευνήσαμε τη βιοχημική και κυτταρική συμπεριφορά της La, τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μεταφραστικό επίπεδο σε διάφορες συνθήκες στρες, χρησιμοποιώντας κύτταρα Α549. Στη παρούσα μελέτη παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του SSB αυξάνονται σε συνθήκες στέρησης της γλυκόζης, ενώ μειώνονται έπειτα από επίδραση οξειδωτικού στρες. Είναι γνωστό, πως η πρόσληψη θρεπτικών συστατικών, όπως αμινοξέων και γλυκόζης, τόσο από υγιή, όσο και από καρκινικά κύτταρα, είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό τους, επομένως είναι εύκολο να θεωρηθεί ότι η έλλειψη αυτών ρυθμίζει με διαφορετικό ρυθμό την κυτταρική διαίρεση. Πράγματι, σχετικές αναφορές αποδεικνύουν την επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων απουσία αμινοξέων και γλυκόζης, γεγονός το οποίο σε συνδυασμό με τα αυξημένα επίπεδα μεταγραφής της La, που παρατηρήσαμε, δείχνει ένα πιθανό σημαντικό ρόλο της La σε τέτοιες συνθήκες. Σε φυσιολογικές αλλά και σε όλες τις συνθήκες στρες που εξετάστηκαν, η La φαίνεται να είναι άφθονη κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων. Η παρατήρηση αυτή συνάδει και με την λειτουργία που της έχει αποδοθεί για την συμμετοχή της στην προστασία και αναδίπλωση των μεταγράφων της RNA Pol III. Ωστόσο, παρατηρήθηκε και πιθανός εντοπισμός της στους πυρηνίσκους (Εικόνα 28), όπου εκεί έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με την νουκλεολίνη 52, και ενδέχεται να συμβάλλει στη συναρμολόγηση snrnps 86, 145. Ο εντοπισμός της στον πυρηνίσκο, σε καρκινικά κύτταρα, θα μπορούσε να συσχετιστεί με την αυξημένη βιογένεση των ριβοσωμάτων και τελικά την πρωτεϊνική σύνθεση, οι οποίες 107

106 Συζήτηση είναι χαρακτηριστικές διεργασίες της καρκινογένεσης. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να διεξαχθούν για τον ακριβή ρόλο της εκεί. Εικόνα 48. Φυλογενετικό δέντρο της La πρωτεΐνης ανώτερων και κατώτερων ευκαρυωτών. 108

107 Συζήτηση Πρόσφατες μελέτες, υποστηρίζουν ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη La ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, το οποίο είναι εμφανές και στη δική μας μελέτη, θέτοντας το ερώτημα με ποιο μηχανισμό η La διευκολύνει τις διεργασίες μετάστασης των όγκων. Αν και η ανάλυση FACS έδειξε ότι η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου παραμένει ουσιαστικά ανεπηρέαστη μετά από υπερέκφραση της La, επακόλουθοι προσδιορισμοί «wound healing» έδειξαν ότι η La οδηγεί στην ταχύτερη μετανάστευση των κυττάρων. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό θα πρέπει να επιβεβαιωθεί και με τη χρήση της χρωστικής CFSE (Carboxyl Fluorescein Succinimidyl Ester). Επίσης, ένας μεγάλος αριθμός μελετών δείχνει ότι η πρωτεΐνη La διεγείρει τη μετάφραση των mrnas που κωδικοποιούν κυτταρικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, όπως ο MDM2, η κυκλίνη D1, XIAP και η Lamimin B. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η La, όταν υπερεκφράζεται συμβάλλει στην καρκινογένεση και την μετάσταση του όγκου μέσω εσφαλμένης ρύθμισης της πρωτεϊνικής σύνθεσης των παραγόντων αυτών 26, 28, 30, 167, 180. Η αλληλεπίδραση της La με τον MDM2 (murine double minute 2) έχει αναφερθεί σε λευχαιμικά κύτταρα 30, ενώ και σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα παρατηρήσαμε πως υπερέκφραση της La ενισχύει την έκφραση του γονιδίου MDM2 σε όλες τις συνθήκες που εξετάστηκαν. O MDM2 είναι ένα ογκογονίδιο που αναστέλλει την λειτουργία της πρωτεΐνης p53 μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Ως E3 λιγάση ουβικιτίνης, υπό φυσιολογικές συνθήκες, δεσμεύει τον p53 διασφαλίζοντας τη γρήγορη αποικοδόμησή του 215 (Εικόνα 49). To P53 ογκοκατασταλτικό γονίδιο εμπλέκεται σε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου, η απόπτωση και η διαφοροποίηση. Σε φυσιολογικές συνθήκες τα κύτταρα παρουσιάζουν πολύ χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης p53, ώστε ο κυτταρικός κύκλος να προχωρά ανεμπόδιστα 196, 198 κάτι που παρατηρούμε και σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα όταν η La υπερεκφράζεται σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης (Εικόνα 35). Επίσης, o p53 ως μεταγραφικός παράγοντας παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της γενωμικής σταθερότητας και την διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε συνεργασία με τον αναστολέα p21, όπως παρατηρήθηκε και στα πειράματα της RT-qPCR, έπειτα από αφαίρεση γλυκόζης ή ταυτόχρονη απουσία ορού και γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο. Επίσης, διαπιστώσαμε αυξημένα επίπεδα έκφραση του p53 σε συνθήκες στέρησης όρου και γλυκόζης, αποτέλεσμα το οποίο εξηγείται από το γεγονός ότι σε συνθήκες στρες, η p53 επάγει αποπτωτικούς παράγοντες, όπως η Bax και η Puma 197, 200, 216. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων P53 και P21 φαίνονται να μειώνονται όταν η La υπερεκφράζεται σε όλες τις καταστάσεις στρες που εξετάστηκαν, ενισχύοντας έτσι την υπόθεση ότι η La προάγει την καρκινογένεση. 109

108 Συζήτηση Εικόνα 49. Σχηματική απεικόνιση της ρύθμισης του παράγοντα p53 έπειτα από επαγωγή στρες (b) ή μη (α) 217. Αν και η αλληλεπίδραση μεταξύ της La και των μικρών μορίων RNA, όπως τα pretrnas, έχει εκτενώς μελετηθεί, απομένει να αποδειχθεί πώς η πιθανή ρύθμιση των μικρών RNAs από τα αυξημένα επίπεδα της La σε καρκινικά κύτταρα συνεισφέρει στην δημιουργία κακοήθειας. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος της, υπερεκφράσαμε τη La και συγκρίναμε το προφίλ έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην ωρίμανση και διακίνηση των μορίων trna, τη βιογένεση mirnas, αλλά και ενδεικτικά συγκεκριμένα mirnas και trfs, τα οποία βρέθηκαν αυξημένα στον καρκίνο του πνεύμονα έπειτα από την NGS ανάλυση. Από τα πειράματα RT-qPCR αυτά φαίνεται ότι η La πιθανόν να επηρεάζει τη βιογένεση των μορίων αυτών. Προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε πως η καθολική έκφραση των mirnas προάγεται από την πρωτεΐνη La, σε μια διαδικασία όπου La και Dicer συνεργάζονται για τη ρύθμιση της παραγωγής mirnas. Ενώ, η φυσιολογική λειτουργία της DICER στην ωρίμανση των παραγόμενων, από την DROSHA, mirnas είναι γνωστή, έχει προταθεί ότι η ανθρώπινη πρωτεΐνη La δεσμεύεται στη δομή στελέχους-βρόχου των πρόδρομων μορίων mirna (pre-mirna) και τα προστατεύει από τη νουκλεολυτική αποικοδόμηση. Παρατηρήθηκε μάλιστα πως η La συνεργάζεται με την Dicer για τη δέσμευση των συγκεκριμένων μορίων 110

109 Συζήτηση και πως οι δύο πρωτεΐνες παρουσιάζουν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης στα premirnas. Με αυτό τον τρόπο, η La εξασφαλίζει την ορθή ωρίμανση των pre-mirnas από την Dicer 65. Στη παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε πως σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης και παρουσία αυξημένων επιπέδων της La τα επίπεδα έκφρασης της DICER αυξάνονται, ενώ σε καταστάσεις στρες, μειώνονται σημαντικά. Η μειο-ρύθμιση ή αυξορύθμιση των ενζύμων επεξεργασίας των mirnas, όπως της Dicer και Drosha έχουν συσχετιστεί με διάφορους τύπους καρκίνου 218. Παράλληλα, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα των mirnas που μελετήθηκαν, σε συνθήκες στρες και υπερέκφρασης της La. Εικόνα 50. Σύνδεση μονοπατιών βιογένεσης και λειτουργίας μη κωδικών μορίων RNA 111. Τα pre- και τα ώριμα trna μόρια έχουν πρόσφατα βρεθεί ότι επεξεργάζονται και δημιουργούν μικρά θραύσματα, τα trfs (trna fragments), τα οποία έχουν βρεθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση, ακόμα και στην καρκινογένεση. 111

110 Συζήτηση Ορισμένα trfs μπορούν να επηρεάσουν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες μέσω δέσμευσης με Argonaute (Ago) πρωτεΐνες 139, 219 (Εικόνα 50). H La έχει δειχθεί ότι μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στο μονοπάτι αυτό, ως φύλακας για την σωστή διασφάλιση της αναδίπλωσης των pre-trnas, τα οποία αποτρέπει από την τάση για την εσφαλμένη αναδίπλωση και την δρομολόγηση τους στο μονοπάτι των mirnas μέσω αλληλεπίδρασης με τις Ago πρωτεΐνες, οδηγώντας το RISC σε εσφαλμένους στόχους 140. Σε αυτή την εργασία, επικεντρωθήκαμε στην μελέτη των trfs, τα οποία ανιχνεύθηκαν, σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας, σε υψηλά επίπεδα σε υγιή και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Σε καταστάσεις στέρησης του ορού και χορήγησης υπεροξειδίου στο θρεπτικό μέσο ανάπτυξης, παρατηρήσαμε πως η υπερέκφραση της La οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα έκφρασης των trfs, ενώ απουσία γλυκόζης παρατηρείται σχετική μείωση, γεγονός που συμπίπτει με τα επίπεδα έκφρασης των αντίστοιχων trna μορίων από τα οποία προέρχονται. Η αύξηση αυτή πιθανότατα να σχετίζεται με την απορρύθμιση των trnas στις καταστάσεις αυτές, που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή trna θραυσμάτων και τελικά την μείωση των επιπέδων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Είναι γνωστό ότι, η αυξημένη πρόσληψη θρεπτικών συστατικών αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα πολλών κακοηθειών. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, τα καρκινικά κύτταρα οδηγούνται σε περιόδους θρεπτικής στέρησης ωστόσο, συχνά αναπτύσσουν στρατηγικές προσαρμογής και επιβίωσης σε αυτές τις συνθήκες στρες 220. Δεδομένου λοιπόν, της συσχέτισης της La με τον καρκίνο, μελέτησαμε για πρώτη φορά την αυξημένη έκφραση της La στον καρκίνο του πνεύμονα σ αυτές τις συνθήκες. Από τα αποτελέσματά μας, συμπεραίνουμε ότι η πρωτεΐνη La διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διεργασίες που προάγουν τον όγκο, μέσω της απορρύθμισης των βασικών συστατικών μεταγραφής της RNA pol ΙΙΙ. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να πραγματοποιηθούν για την διερεύνηση του ρόλου της La στις συνθήκες αυτές. 112

111

112 5. Βιβλιογραφία