Φροντιστηριακό μάθημα Αναερόβια μικρόβια και αναερόβιες λοιμώξεις

Transcript

1 Φροντιστηριακό μάθημα Αναερόβια μικρόβια και αναερόβιες λοιμώξεις Ιωσήφ Παπαπαρασκευάς Βιοπαθολόγος, Αν. Καθηγητής Πανεπιστημίου Αθηνών Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Αθηνών

2 1o περιστατικό Άνδρας 45 ετών παραπονείται για άλγος δεξιού υποχονδρίου από 10ημέρου, αίσθημα βάρους και πυρετό έως 38 ο C Κλινική εξέταση: επώδυνο ήπαρ στην βαθιά ψηλάφηση Απεικονιστικός έλεγχος (CT κοιλίας): αποστηματική μάζα (δε) λοβού ήπατος Παρακέντηση μάζας υπό CT, αποστολή δειγμάτων για έλεγχο Gram χρώση δείγματος (30 min): δύο διαφορετικά Gramαρνητικά βακτήρια Αερόβια κ/α (24 h): Escherichia coli Αναερόβια κ/α (5 d): E. coli και Bacteroides fragilis

3 Στάδια διαγνωστικής στην Κλινική Μικροβιολογία Πιθανή λοίμωξη Λήψη κλινικού υλικού Άμεση αναζήτηση του μικροοργανισμού με μικροσκόπηση νωπών ή κεχρωσμένων παρασκευασμάτων Αναζήτηση του μικροοργανισμού με καλλιέργεια του δείγματος Απομόνωση, ταυτοποίηση και έλεγχος ευαισθησίας Αναζήτηση αντιγόνου του μικροοργανισμού ή αντισώματος κατά του μικροοργανισμού Ανοσολογικός (ορολογικός) έλεγχος Αναζήτηση γενετικού υλικού του μικροοργανισμού Τεχνικές μοριακής μικροβιολογίας

4 2o περιστατικό Νέος άνδρας 35 ετών με Σακχαρώδη Διαβήτη παραπονείται για επώδυνο, πυοροούν έλκος έξω σφυρού (δε) κάτω άκρου Φυσική εξέταση: Έλκος διαμέτρου ~1 cm με επηρμένα χείλη. Μικρή ποσότητα δύσοσμου πύου Κλινικό δείγμα για εξέταση: ιστός και πύον από το πυθμένα του έλκους Gram χρώση (30 min): Gram(-) βακτήρια, Gram(+) κόκκος σε ομάδες Αερόβια κ/α (24 h): Pseudomonas aeruginosa και CoNS Αναερόβια κ/α (5 d): CoNS και Prevotella oralis

5 3o περιστατικό Άνδρας 65 ετών διακομίζεται στα επείγοντα περιστατικά του νοσοκομείου για δυσφαγία, δυσαρθρία και διπλωπία. Από το ιστορικό: κατανάλωση κονσέρβας σολομού προ 12ώρου Σε ελάχιστο χρονικό διάστημα (~8 h) εμφανίζεται ταχεία επιδείνωση με αναπνευστική ανεπάρκεια και χαλαρή μυϊκή παράλυση διασωλήνωση και εισαγωγή στην ΜΕΘ. Κλινικό δείγμα: αίμα (48 h) Gram(+) βακτηρίδιο αναερόβιο Ταυτοποίηση (24 h): Clostridium botulinum Χορήγηση αντιβίωσης και αντι-αλλαντικής αντιτοξίνης Ο ασθενής καταλήγει σε 48 h από την ώρα της εισαγωγής

6

7 S. Finegold (1977): αναερόβιο είναι το βακτήριο που: (α) απαιτεί ελαττωμένη τάση O 2 για ανάπτυξη και (β) δεν αναπτύσσεται στην επιφάνεια των στερεών καλλιεργητικών υλικών (τρυβλία) σε συνθήκες 5-10% CO 2 και 18-21% O 2

8 Υποχρεωτικά αερόβια Απαιτούν O 2, δεν αναπτύσσονται απουσία του Δυνητικά αερόβια έχουν ανάγκη O 2, αναπτύσσονται και απουσία του Μικροαερόφιλα Απαιτούν ειδική πυκνότητα αερίων (O 2, CO 2 ) Δυνητικά αναερόβια Αναπτύσσονται παρουσία ή απουσία Ο 2 Υποχρεωτικά αναερόβια Δεν αναπτύσσονται παρουσία Ο 2

9 Αναπτύσσονται σε χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό, δεν έχουν κυτοχρώματα και απαιτούν CO 2 για την ανάπτυξή τους ΦΧ του γαστρεντερικού σωλήνα, της στοματοφαρυγγικής κοιλότητας, του δέρματος, της ουρογεννητικής περιοχής και του κόλπου

10 Η ευαισθησία στο οξυγόνο οφείλεται σε ποικίλους παράγοντες: 1) Το O 2 στο κύτταρο μετατρέπεται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ). Οι αερόβιοι μικροοργανισμοί παράγουν τα ένζυμα δισμουτάση του υπεροξειδίου και καταλάση που καταλύει το υπεροξείδιο. Τα υποχρεωτικώς αναερόβια παράγουν τα ένζυμα αυτά σε μικρές ποσότητες ή και καθόλου με αποτέλεσμα την καταστροφή τους. 2) Η μεταβλητότητα στην ανοχή στο οξυγόνο (από <0.5 έως 8% O 2 ) οφείλεται στην ποσότητα των παραγόμενων ενζύμων.

11 Η ευαισθησία στο οξυγόνο οφείλεται σε ποικίλους παράγοντες: 3) Το O 2 σε ένα διάλυμα αυξάνει το οξειδοαναγωγικό δυναμικό το οποίο με την σειρά του αναστέλλει την ανάπτυξη ορισμένων μικροοργανισμών (π.χ. κάποια αναερόβια απαιτούν οξειδοαναγωγικό δυναμικό μικρότερο του -0,3 V). 4) Οι θειούχες ενώσεις είναι στοιχεία ενζύμων (π.χ. νιτροαναγωγάσες) απαραίτητων για την λειτουργία των κυττάρων. Το Ο 2 οξειδώνει τις θειούχες ενώσεις προς διθειούχες (δισουλφίδια) με αποτέλεσμα την αναστολή παραγωγής και λειτουργίας ενζύμων.

12 Παραγωγή ενέργειας στα αναερόβια βακτήρια: Τα υποχρεωτικά αναερόβια μεταβολίζουν την ενέργεια με αναερόβια αναπνοή Η αναερόβια αναπνοή διαφέρει από την αερόβια κατά το ότι χρησιμοποιεί έναν αποδέκτη ηλεκτρονίων διαφορετικό από το οξυγόνο στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων Παραδείγματα εναλλακτικών δεκτών ηλεκτρονίων περιλαμβάνουν θειικό, νιτρικό, σίδηρο, μαγγάνιο, υδράργυρο και μονοξείδιο του άνθρακα Η ενεργειακή απόδοση της αναερόβιας αναπνοής (δηλαδή ο αριθμός των παραγόμενων μορίων ΑΤΡ) είναι μικρότερη από την αερόβια αναπνοή Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο τα προαιρετικά αναερόβια, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιήσουν τόσο την αερόβια όσο και την αναερόβια οδό, προτιμούν κατ αρχήν την αερόβια και όταν δεν υπάρχει O 2 τότε επιστρατεύουν την αναερόβια Τα τελικά υποπροϊόντα του αναερόβιου κύκλου (πιο σύνθετα από τα αντίστοιχα του αερόβιου) είναι η αιτία της χαρακτηριστικής οσμής των αναεροβίων μικροβίων και των αναεροβίων λοιμώξεων

13

14 Συνήθεις αναερόβιες λοιμώξεις Μικτές πολυμικροβιακές ενδογενείς λοιμώξεις από αερόβια και αναερόβια βακτήρια της χλωρίδας Ενδοκοιλιακές και ενδοπυελικές Περιοδοντικές Δήγματα (δαγκώματα) Διαβητικό πόδι Μονομικροβιακές εξωγενείς λοιμώξεις από Clostridia Συμπεριλαμβάνεται η λοίμωξη από C. difficile (CDI)

15 Ασυνήθεις αναερόβιες λοιμώξεις Σύνδρομο Lemierre ( the forgotten infection ) Ο ρόλος του Fusobacterium necrophorum στην φαρυγγίτιδα Λοιμώξεις μαλακών μορίων εκτός του διαβητικού ποδιού Βακτηριακή κολπίτιδα και χρόνια προστατίτιδα Λοιμώξεις προσθετικών συσκευών, ενδοφλέβιων γραμμών και εμφυτευμάτων (biofilm producing Propionibacterium acnes και Finegoldia magna) Βακτηριαιμία!!! Άλλες

16 Γαγγραινώδης σκωληκοειδίτιδα 48 h επώαση αναερόβιες συνθήκες

17 Ενδοκοιλιακά, ενδοπυελικά και περιεδρικά αποστήματα 72 h επώαση αναερόβιες συνθήκες

18 Διαβητικό πόδι 72 h επώαση αναερόβιες συνθήκες

19 Οδόντοστοματική λοίμωξη Κυτταρίτιδα προσώπου 72 h επώαση αναερόβιες συνθήκες

20 Τραυματισμός μετά από γροθιά Δήγμα (δάγκωμα) ανθρώπου 72 h επώαση αναερόβιες συνθήκες

21 Πολυμικροβιακή λοίμωξη Staphylococcus παρέχουν βιταμίνη Κ στα στελέχη Prevotella E. coli παρέχει το σύστημα απτοσφαιρίνης αιμοσφαιρίνης ως πηγή σιδήρου στα στελέχη Bacteroides Prevotella spp. Staphylococcus spp.

22 Αλλαντίαση (λοίμωξη από Clostridium botulinum)

23 Τέτανος (λοίμωξη από Clostridium tetani)

24 Αεριογόνος γάγγραινα (λοίμωξη από Clostridium perfrigens)

25 Ψευδομεμβρανώδης εντεροκολίτιδα (λοίμωξη από Clostridium difficile)

26 Ταξινόμηση αναεροβίων βακτηρίων Η κλινική σημαντικότητα είναι πάντα δεδομένη Gram (-) βακτηρίδια: Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp. Gram (+) βακτηρίδια σπορογόνα Clostridium spp. Gram (+) βακτηρίδια μη σπορογόνα Actinomyces spp., Propionobacterium spp. Η κλινική σημαντικότητα είναι συζητήσιμη Gram (-) κόκκοι: Veilonella spp. Gram (+) κόκκοι: Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Gemella spp. Η κλινική σημαντικότητα είναι σπάνια ή ανύπαρκτη

27 Εκτίμηση κλινικής σημαντικότητας Αναερόβια μέρος ΦΧ περιοχής Ύπαρξη σε μεγάλους αριθμούς (παχύ έντερο >10 12 cfu/ml) Κλινική εκτίμηση και συσχέτιση Η δυσοσμία της φλεγμονής δεν υπάρχει πάντα και δεν αποτελεί απαραίτητα παθογνωμονικό στοιχείο Αναερόβιες λοιμώξεις Ενδογενείς πολυμικροβιακές Εξωγενείς μονομικροβιακές

28 Ποιά αναερόβια σε ποιές λοιμώξεις Ενδοκοιλιακές λοιμώξεις Εμφυσιματώδης χολοκυστίτιδα Clostridium perfrigens Σκωληκοειδίτιδα Bilophila wadsworthia Ηπατικό απόστημα Bacteroides spp. Περιοδοντικό απόστημα Peptostreptococcus spp., Prevotella spp. Πνευμονικό απόστημα Fusobacterium necrophorum (νόσος Lemier) Διαβητικά έλκη Prevotella spp. Σαλπιγγοωοθηκικά αποστήματα Bacteroides spp.

29 B. fragilis aιματούχο άγαρ B. fragilis Gram χρώση B. fragilis προκαταρκτική

30 Διαφορές στην ανάπτυξη στο ίδιο υλικό Bacteroides fragilis Ανάπτυξη (+) Μαύρες αποικίες Μαύρισμα του υλικού Bacteroides vulgatus Ανάπτυξη (+) Άχρωμες αποικίες Υλικό χωρίς αλλαγή Bilophila wadsworthia Ανάπτυξη (+) αργή Αποικίες με μαύρο κέντρο Μαύρισμα του υλικού

31 B. ureolyticus aιματούχο άγαρ

32 Αιματούχο Prevotella spp. Διαφορά στην παραγωγή χρωστικής ανάλογα το υλικό KVLB Αίμα κονίκλου γρηγορότερη ανάπτυξη χρωστικής Prevotella spp. παραγωγή χρωστικής

33 Prevotella dentalis Παραγωγή χρωστικής (-) Αποικίες βλεννώδεις σαν σταγόνα Prevotella pallens Παραγωγή χρωστικής (±) Prevotella catoniae Παραγωγή χρωστικής (-)

34 Αντιδράσεις λιπάσης λεκιθινάσης Αντίδραση λιπάσης Η αντίδραση φαίνεται στην επιφάνεια του άγαρ σαν μαργαριταροειδής επίστρωση Αντίδραση λεκιθινάσης Η αντίδραση φαίνεται στο εσωτερικό του άγαρ σαν θόλωση του υλικού

35 F. nucleatum subsp. nucleatum F. nucleatum subsp. polymorphum F. nucleatum subsp. fusiforme F. nucleatum

36 F. necrophorum F. necrophorum

37 Αναερόβια καλλιέργεια Βασικός κανόνας Σωστή λήψη και ταχεία μεταφορά του υλικού για καλλιέργεια Η επαφή με το Ο 2 μειώνει τις πιθανότητες απομόνωσης του αναεροβίου παθογόνου Συνθήκες καλλιέργειας Ατμόσφαιρα 10-15% CO 2 και 85% N, θερμοκρασία ο C Παρατεταμένη επώαση έως και 15 ημέρες Έλεγχος κάθε 2-3 ημέρες

38 Αναερόβια καλλιέργεια Καλλιεργητικά υλικά Εμπλουτισμένα υλικά με βάση το αιματούχο άγαρ Προσθήκη βιταμίνης Κ, αιμίνης και αντιβιοτικών Ταυτοποίηση Χρήση βιοχημικών αντιδράσεων Δύσκολη η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους

39 Αναερόβιες συνθήκες

40 Αναερόβιοι κλίβανοι Συνεχές αναερόβιο περιβάλλον Όλη η εργασία πραγματοποιείται στο εσωτερικό (μη έκθεση σε O 2 ) Απαιτείται συστηματική συντήρηση Μεγάλο κόστος

41 Anoxomat system Άμεση πλήρωση συνθηκών (αναερόβιες, μικροααερόφιλες, CO 2, κλπ.) Ταυτόχρονη πλήρωση πολλαπλών δοχείων με διαφορετικές συνθήκες Επώαση στον κοινό κλίβανο Διαχείριση των καλλιεργειών στον πάγκο (έκθεση σε O 2 ) Ενδιάμεσο κόστος

42 Συστήματα καταλυτών Αργή πλήρωση συνθηκών (αναερόβιες, μικροααερόφιλες, CO 2, κλπ.) Επώαση στον κοινό κλίβανο Διαχείριση των καλλιεργειών στον πάγκο (έκθεση σε O 2 ) Χαμηλό κόστος

43 Ταυτοποίηση αναερόβιων μικροοργανισμών Επίπεδο Ι και ΙΙ (γένος) Κλινικό υλικό, χρώση Gram Μορφολογία αποικίας, ανάπτυξη σε εκλεκτικά υλικά, παραγωγή χρωστικής Δοκιμασία δισκίων Επίπεδο ΙΙΙ (είδος) Βιοχημικές δοκιμασίες Ορολογικές δοκιμασίες Αέριος χρωματογραφία MALDI TOFF MS

44 Ευχαριστώ για την προσοχή σας