Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΜΗΡΤΣΟΥ-ΦΙ ΑΝΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ, ΠΕΠΤΙ ΙΩΝ ΚΑΙ ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΣΤΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΣΠΕΡΜΑ Σταµάτης Παπαχαρίτου Βιολόγος Αναπαραγωγής (M.Sc.) Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΧΑΤΖΗΧΡΗΣΤΟΥ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΟΛΥΜΠΙΑ ΓΚΙΜΠΑ-ΤΖΙΑΜΠΙΡΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΟΚΚΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΜΗΡΤΣΟΥ-ΦΙ ΑΝΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΧΑΤΖΗΧΡΗΣΤΟΥ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ

4 Στην οικογένειά µου Στους δασκάλους µου

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΠΡΟΟΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 1. Οι γαµέτες- Η γονιµοποίηση 2 Αρχέγονα γεννητικά κύτταρα 2 Ωοθήκες και ωάρια 3 Όρχεις και σπερµατοζωάρια 3 Σπερµατογένεση 5 Σπερµιογένεση 7 οµή του σπερµατοζωαρίου 7 Γονιµοποίηση 10 Ο ρόλος της κίνησης στην γονιµοποίηση Υπογονιµότητα 14 Γυναικεία υπογονιµότητα 17 Ανδρική υπογονιµότητα 19 Μέθοδοι υποβοηθούµενης αναπαραγωγής 22 Ιστορικό του υπογόνιµου ασθενή 23 Κριτική προσέγγιση της ανδρικής υπογονιµότητας 26 Ποιος µπορεί να χαρακτηριστεί ως "φυσιολογικός-γόνιµος"; Το σπέρµα και ο εργαστηριακός έλεγχός του 29 Φυσιολογία των σπερµατοζωαρίων 29 Σπερµοδιάγραµµα 30 Μακροσκοπική εξέταση 31 Μικροσκοπική ανάλυση 34 Σχέσεις µεταξύ των χαρακτηριστικών και της ποιότητας του σπέρµατος 37 Ανάλυση σπερµατοζωαρίων µε χρήση Η/Υ, C.A.S.A Η κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων 40 Η εκτίµηση της κινητικότητας 42 Κινητικότητα και γονιµότητα 43 Η κίνηση των σπερµατοζωαρίων µέσα στο σπερµατικό υγρό 44 Η κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων µέσα στην τραχηλική βλέννη- Έλεγχος αλληλεπίδρασής τους µε την τραχηλική βλέννη 46 Η ενεργοποίηση των σπερµατοζωαρίων 47 Κινητικότητα και «Human Egg Penetration Test» 47 Κινητικότητα και σχέση µε άλλους παράγοντες του σπερµοδιαγράµµατος48 Κίνηση και εξωσωµατική γονιµοποίηση (IVF) Τα αίτια της ασθενοσπερµίας- διέγερση της κινητικότητας 50 Μεταβολικές διαταραχές 50 Ανωµαλίες του αξονήµιου 51 Προσπάθειες διέγερσης της κινητικότητας Τα κανάλια εισόδου Ca +2 στα σπερµατοζωάρια 59

6 Τρόποι µελέτης των καναλιών ιόντων των σπερµατοζωαρίων 62 Κανάλια ανταλλαγής ιόντων - Ενεργοποίηση των σπερµατοζωαρίων 67 Κανάλια που λειτουργούν µε κυκλικά νουκλεοτίδια 70 Ρύθµιση των καναλιών ανταλλαγής ιόντων των σπερµατοζωαρίων από τη διάχυση των συστατικών του ωαρίου 71 Κανάλια ανταλλαγής ιόντων και ακροσωµική αντίδραση 72 Τα Κανάλια Ca Κ + και εκλεκτικά για τα κατιόντα κανάλια 78 Άλλα κανάλια εισόδου Ca Αγωνιστές ακροσωµικής αντίδρασης που δεν σχετίζονται µε τη διάφανη ζώνη Μεταλλοπρωτεάσες και ιστικοί αναστολείς τους 86 Έλεγχος δραστηριότητας ΜΜΡ 89 Ενεργοποίηση των ΜΜΡ 89 Αναστολή της δράσης των MMP από ενδογενείς παράγοντες 90 ΜΜΡ και ΤΙΜΡ σε αναπαραγωγικούς ιστούς Γλυκοζαµινογλυκάνες 93 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 103 i. Για τη µελέτη των καναλιών 103 Συµµετέχοντες άρρενες 103 Βιολογικό υλικό 104 Αποµόνωση των σπερµατοζωαρίων 105 Επώαση 105 Μέτρηση παραµέτρων της κινητικότητας 105 Στατιστική ανάλυση 106 ii. Για τη µελέτη των ΜΜΡ και ΤΙΜΡ 106 Συµµετέχοντες άρρενες 106 Βιολογικό υλικό 106 Προσδιορισµός πρωτεϊνών 107 Ανίχνευση και ταυτοποίηση των MMP και ΤIMP 107 Ζυµογράφηµα ζελατίνης 107 Πυκνοµετρία σάρωσης 108 Μέτρηση επιπέδων TIMP µε ELISA 108 Στατιστική ανάλυση 109 iii. Για τη µελέτη των GAGs 109 Συµµετέχοντες άρρενες 109 Βιολογικό υλικό 109

7 Καθαρισµός, αποµόνωση, κλασµατοποίηση, ταυτοποίηση GAG 109 Απολιπίδωση των δειγµάτων 110 Ενζυµική διάσπαση πρωτεϊνών 110 Ενζυµική διάσπαση νουκλεϊνικών οξέων 110 β-απόσπαση 110 Αποµόνωση των ολικών GAGs 110 Μέτρηση ουρονικών οξέων των ολικών GAGs 110 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου 111 Ηλεκτροφόρηση σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης 111 Χαρακτηρισµός των GAGs µε ειδικά ένζυµα 111 Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 114 i. Αποτελέσµατα από τη διερεύνηση των καναλιών 114 Συµµετέχοντες άρρενες 114 Η επίδραση του Χλωριούχου Καλίου 114 Ποσοστό % των κινούµενων σπερµατοζωαρίων επί της συνολικής τους συγκέντρωσης 115 Γωνιακή ταχύτητα (curvilinear velocity VCL, microns/sec) 115 Ευθύγραµµη ταχύτητα (straight line velocity VSL, microns/sec) 115 Γραµµικότητα της κίνησης (linearity LIN= VSL/VCL X 100%) 116 Εύρος της κίνησης της κεφαλής (lateral head displacement ALH, microns) 116 Η επίδραση του ΝΜDA 116 Ποσοστό % των κινούµενων σπερµατοζωαρίων επί της συνολικής τους συγκέντρωσης 117 Γωνιακή ταχύτητα (curvilinear velocity VCL, microns/sec) 117 Ευθύγραµµη ταχύτητα (straight line velocity VSL, microns/sec) 117 Γραµµικότητα της κίνησης (linearity LIN= VSL/VCL X 100%) 118 Εύρος της κίνησης της κεφαλής (lateral head displacement ALH, microns) 118 Η επίδραση του AMPA 118 ii. Αποτελέσµατα από την ανάλυση των MMP και TIMP 118 Συµµετέχοντες άρρενες 118 Ζυµογραφία σε πήγµα ζελατίνης 118 Συσχέτιση των τιµών της ζυµογραφίας µε κινητικές και µορφολογικές παραµέτρους των σπερµατοζωαρίων 125 Συσχέτιση αριθµού σπερµατοζωαρίων µε ΜΜΡ 126 Συσχέτιση της % κινητικότητας των σπερµατοζωαρίων µε ΜΜΡ 128 Συσχέτιση βαθµού κινητικότητας σπερµατοζωαρίων µε ΜΜΡ 130 Συσχέτιση άλλων παραµέτρων µε ΜΜΡ 133 Ποσοτική ανάλυση MMP και αριθµού σπερµατοζωαρίων 133 Ποσοτική ανάλυση MMP και βαθµού κινητικότητας σπερµ/ρίων 133 Ποσοτική ανάλυση MMP και % κινητικότητας σπερµατοζωαρίων 135 Επίπεδα ΤΙΜΡ στο σπερµατικό υγρό 135

8 iii. Αποτελέσµατα από την ανάλυση των GAGs 136 Συµµετέχοντες άρρενες 136 Α. Γλυκοζαµινογλυκάνες στα σπερµατοζωάρια 136 Β. Γλυκοζαµινογλυκάνες στο σπερµατικό υγρό 136 Ηλεκτροφόρηση GAGs σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου βαθµίδωσης 8-20% 136 Συσχέτιση των GAGs µε κινητικές και µορφολογικές παραµέτρους των σπερµατοζωαρίων µετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου βαθµίδωσης 8-20% 138 Ηλεκτροφόρηση GAgs σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος πυριδίνης/φορµικού οξέος 139 Συσχέτιση των GAGs µε κινητικές και µορφολογικές παραµέτρους των σπερµατοζωαρίων µετά από ηλεκτροφόρηση σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος πυριδίνης/φορµικού οξέος 139 Ηλεκτροφόρηση GAGs σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος οξικού βαρίου 140 Συσχέτιση των GAGs µε κινητικές και µορφολογικές παραµέτρους των σπερµατοζωαρίων µετά από ηλεκτροφόρηση σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος οξικού βαρίου 141 Ταυτοποίηση των GAGs 1 και 2 του σπερµατικού υγρού που διαχωρίστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε µεµβράνες οξικής κυτταρίνης χρησιµοποιώντας ένζυµα που διασπούν τις GAGs 142 Συσχέτιση άλλων παραµέτρων µε επίπεδα GAGs ΣΥΖΗΤΗΣΗ 143 i. Η διερεύνηση των καναλιών ιόντων ασβεστίου 143 Εξαρτώµενα από υποδοχείς κανάλια ασβεστίου 146 Τασεοεξαρτώµενα κανάλια ασβεστίου 148 ii. Η διερεύνηση των µετταλοπρωτεασών 150 iii. Η διερεύνηση των γλυκοζαµινογλυκανών 156 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 160 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 162 ABSTRACT 167 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 171

9 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ALH (lateral head displacement): εύρος της πλάγιας µετατόπισης της κεφαλής σπερµατοζωαρίου ARTs (assisted reproduction techniques): τεχνικές υποβοηθούµενης αναπαραγωγής BLM (Black lipid membranes): µέλαινες λιπιδικές µεµβράνες C.A.S.A. (Computerized Analysis of Semen Assesment): Ανάλυση των παραµέτρων των σπερµατοζωαρίων µε χρήση Η/Υ CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator): διαµεµβρανικός ρυθµιστής της κυστικής ίνωσης cgmp (cyclic monophosphoric gouanosine): 3,5 - κυκλική µονοφωσφορική γουανοσίνη CNG (cyclic nucleotide-gated channel): Κανάλι που λειτουργεί µε κυκλικά νουκλεοτίδια ECM (extracellular matrix): εξωκυττάριος χώρος EGF (epidermal growth factor): επιδερµικός παράγοντας ανάπτυξης ET (embryo transfer): µεταφορά εµβρύου FSH (Follicular stimulating hormone): ωοθυλακιοτρόπος ορµόνη GAGs (glycosaminoglycans): γλυκοζαµινογλυκάνες HEPT (Human Egg Penetration Test): τέστ διαπερατότητας του ανθρώπινου ωαρίου ICSI (intracytoplasmic sperm injection): ενδοκυτταροπλασµατική έγχυση του σπερµατοζωαρίου στο ωάριο IP 3 R (IP 3 receptor): υποδοχέας της τριφωσφορικής ινοσιτόλης IUI (intrauterine insemination): ενδοµήτρια έγχυση σπέρµατος IVF(in vitro fertilization): εξωσωµατική/in vitro γονιµοποίηση IVF-D (in vitro fertilization from donor): in vitro γονιµοποίηση µε την χρήση σπέρµατος δότη LIN (linearity): γραµµικότητα της κίνησης (γραµµική κίνηση) σπερµατοζωαρίου Μ/ml (million/milliliter): εκατοµµύρια/ χιλιοστό του λίτρου MMP (matrix metalloproteinases): µεταλλοπρωτεάσες ή µεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού OAT (oligo-astheno-teratozoospermia): ολιγοασθενοτερατοζωοσπερµία PAF (platelet-activating factor): παράγοντας ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων PCR (polymerase chain reaction): αλυσιδωτή αντίδραση πολυµερασών PKA (phosphate kinase A): φωσφορική κινάση Α PP (proteinic phospatases): πρωτεϊνικές φωσφατάσες PSA (prostate specific antigen): ειδικό προστατικό αντιγόνο

10 PZD (partial zona dissection): µερική θραύση της διαφανούς ζώνης του ωαρίου ROSI (round spermatid injection): έγχυση στρογγυλής σπερµατίδας στο ωάριο ROSNI (round spermarid nuclei injection): έγχυση πυρήνα στρογγυλής σπερµατίδας στο ωάριο. RyR (ryanodine receptor): υποδοχέας της ρυανοδίνης SMIT (sperm-mucus interaction test): τεστ αλληλεπίδρασης της τραχηλικής βλέννης µε τα σπερµατοζωάρια in vitro SOC channel (Store-operated calcium channel): κανάλι ιόντων Ca που παραµένει διαρκώς ανοικτό µε την επίδραση ουσιών SUZI (subzonal sperm injection): εισαγωγή του σπερµατοζωαρίου κάτω από την διαφανή ζώνη του ωαρίου TEA (tetraethylammonium chloride): χλωριούχο τετρα-αιθυλαµµώνιο TIMP (tissue inhibitor metalloproteinase): ειδικός αναστολέας των MMP VCL (curvilinear velocity): γωνιακή ταχύτητα σπερµατοζωαρίου VDCC (Voltage dependent Calcium channel): δυναµικο-εξαρτώµενο κανάλι Ca +2 VSL (straight line velocity): ευθύγραµµη ταχύτητα σπερµατοζωαρίου WHO (World Health Organisation); Παγκόσµιος Οργανισµός Υγείας ZP (zona pellucida): διαφανής ζώνη

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η γονιµότητα αποτελεί ένα αναφαίρετο και προστατευόµενο αγαθό. Σύµφωνα µε τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας η ελευθερία του ατόµου να αποφασίζει αν και πότε και πώς θα αναπαραχθεί, ονοµάζεται αναπαραγωγική υγεία. Ωστόσο σήµερα φαίνεται πως η υπογονιµότητα αφορά σε όλο και περισσότερα ζευγάρια. Μόνο στην Ελλάδα, υπολογίζεται πως υπάρχουν υπογόνιµα ζευγάρια και γίνονται περίπου προσπάθειες τον χρόνο για σύλληψη, µε την εφαρµογή τεχνικών υποβοηθούµενης αναπαραγωγής. Τα επιδηµιολογικά δεδοµένα δείχνουν πως το 33% των περιπτώσεων υπογονιµότητας οφείλεται σε παθολογικούς παράγοντες που αφορούν στον άνδρα. Βέβαια, από την εφαρµογή το 1978 για πρώτη φορά της µεθόδου της εξωσωµατικής γονιµοποίησης από τους Edwards και Steptoe, έγιναν και συνεχίζονται να γίνονται πολλά βήµατα για την αντιµετώπιση του προβλήµατος της υπογονιµότητας. Όµως τα τελευταία χρόνια υπάρχει η τάση να προβάλλονται οι µέθοδοι υποβοηθούµενης αναπαραγωγής και ειδικότερα η µέθοδος της µικρογονιµοποίησης ως πανάκεια για κάθε άνδρα µε πρωτοπαθή ή µε δευτεροπαθή υπογονιµότητα. εδοµένου του γεγονότος ότι η εφαρµογή των µεθόδων αυτών δε λύνει την αιτία του προβλήµατος και έχει µεγάλο κόστος, αποτελεί πρόκληση πλέον η συγκέντρωση δεδοµένων τόσο σχετικά µε τη λειτουργία όσο και σχετικά µε τον έλεγχο κυρίως της κινητικότητας των ανθρωπίνων σπερµατοζωαρίων. Απώτερος στόχος είναι η διευκρίνηση των µηχανισµών ώστε να εκτιµηθεί η συµβολή διαφόρων ενδογενών και εξωγενών παραγόντων καθώς και η πιθανή ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη διευκρίνηση των αιτιών της ασθενοζωοσπερµίας, την αύξηση της κινητικότητας και την κινητοποίηση ακίνητων σπερµατοζωαρίων in vivo και in vitro. Η µελέτη της σχετικής βιβλιογραφίας έδειξε πως υπάρχει ένα σηµαντικό κενό ακόµα στη γνώση της ασθενοζωοσπερµίας αλλά και στην αποσαφήνιση εκείνων των µηχανισµών κίνησης του σπερµατοζωαρίου. Έτσι, παρόλο που στο παρελθόν χρησιµοποιήθηκαν ουσίες που φαινόταν πως θα µπορούσαν να αυξήσουν την κινητικότητα, τα πειραµατικά δεδοµένα είχαν αντιφατικά αποτελέσµατα και τελικά η χρήση των ουσιών αυτών πλέον έχει ουσιαστικώς καταργηθεί.

12 Η αποτελεσµατική διάγνωση και θεραπεία των υπογόνιµων ανδρών απαιτεί ολιστική προσέγγιση για τη µελέτη της φυσιολογίας και των µηχανισµών ελέγχου της κίνησης των σπερµατοζωαρίων. Για το λόγο αυτό, η παρούσα διατριβή κατά το ένα µέρος της είναι βασισµένη σε µια ιδέα του αναπληρωτή καθηγητή κ.. Κούβελα και έχει ως σκοπό τη διερεύνηση των µηχανισµών που εµπλέκονται στην κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων και κατά το άλλο µέρος της είναι στηριγµένη στην τεχνογνωσία που έχει αποκτηθεί από το ερευνητικό έργο της επίκουρης καθηγήτριας κ. Ε. Παπακωνσταντίνου και του αναπληρωτή καθηγητή κ. Γ. Καρακιουλάκη και επικεντρώνεται στη διερεύνηση του ρόλου µορίων του εξωκυττάριου χώρου (GAGs, ΜΜΡ και ΤΙΜΡ) και την πιθανή συσχέτισή τους µε παραµέτρους κινητικότητας του σπέρµατος. Με αφορµή την ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής µου, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη της τριµελούς επιτροπής µου, γιατί µου έδωσαν τη δυνατότητα να κερδίσω περισσότερη ερευνητική εµπειρία τόσο µε την επίβλεψή τους στο έργο µου όσο και µε τη συναναστροφή µαζί τους. Ειδικότερα, ευχαριστώ τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Γ. Καρακιουλάκη γιατί µου εµπιστεύθηκε την αρχική ιδέα του και την παρούσα ερευνητική δουλειά και στάθηκε δίπλα µου στη διάρκεια αυτών των χρόνων και την τελευταία στιγµή, µε µοναδικά υποστηρικτικό τρόπο. Επίσης, θα ήθελα από καρδιάς να ευχαριστήσω τους δύο άλλους επιβλέποντες αναπληρωτές καθηγητές κ.. Κούβελα και κ.. Χατζηχρήστου. Τον µεν πρώτο γιατί, µε τις υποδείξεις του και το ενδιαφέρον του, µε βοήθησε να προσεγγίσω την εργαστηριακή ανάλυση του σπέρµατος µε περισσότερη ερευνητική µατιά, τον δε δεύτερο, για τα ενδιαφέροντα σχόλιά του και πάνω από όλα, για την πραγµατικά αµέριστη συµπαράστασή του κατά την εκπόνηση και τη συγγραφή της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω: Την καθηγήτρια κ Β. Μήρτσου-Φιδάνη για την υποστήριξή της στην πραγµατοποίηση της ερευνητικής αυτής εργασίας στο Εργαστήριο της Πειραµατικής Φαρµακολογίας της Ιατρικής του Α.Π.Θ. και για την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου. Την επίκουρη καθηγήτρια κ. Ε. Παπακωνσταντίνου για την ουσιαστική υποστήριξή της τόσο κατά την εκπόνηση της ερευνητικής µου εργασίας, όσο και κατά την παρουσίαση των αποτελεσµάτων. Την τεχνολόγο Ιατρικών Εργαστηρίων κ. Χ Πεσιντζάκη για την υποµονή που επέδειξε και τη βοήθεια που πρόσφερε κατά την εργασία µου στο εργαστήριο Πειραµατικής Φαρµακολογίας και κατά την πραγµατοποίηση σηµαντικού µέρους των πειραµάτων. εν θα παραλείψω να ευχαριστήσω και την ιατρό κ. Χ. Πουρζιτάκη.

13 Θα ήθελα ακόµη να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στους συναδέλφους µου στο Andrology laboratory του Νοσοκοµείου Hammersmith, στο Λονδίνο και κυρίως στον υπεύθυνο του εργαστηρίου Dr K. Lindsay, για την πολύτιµη βοήθεια και στήριξή τους, σε πρακτικό επίπεδο και ειδικότερα στη συλλογή της εκτεταµένης βιβλιογραφίας. Τέλος, θεωρώ επίσης χρέος µου να ευχαριστήσω: To Kέντρο Σεξουαλικής και Αναπαραγωγικής Υγείας (ΚΕ.Σ.Α.Υ.), µε το επιστηµονικό προσωπικό του αλλά και τον επιστηµονικώς υπεύθυνό του αν. καθηγητή Ιατρικής ΑΠΘ κ.. Χατζτηχρήστου, γιατί το ΚΕ.Σ.Α.Υ. εκτός από άψογο επαγγελµατικό περιβάλλον από το 1998, αποτέλεσε για µένα ένα µοναδικό ερευνητικό πλαίσιο µέσα από το οποίο κατάφερα να έρθω σε επαφή µε σηµαντικούς επιστήµονες τόσο εντός όσο και εκτός Ελλάδας, µε βοήθησε να διευρύνω τους επιστηµονικούς µου ορίζοντες και επανειλληµένα στήριξε δηµιουργικά κάθε ερευνητική µου ανησυχία Τα µέλη της οικογένειάς µου και τους φίλους µου, για την όποια ψυχολογική στήριξή τους στις διάφορες φάσεις ολοκλήρωσης της δουλειάς µου.

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

15 Κεφάλαιο 1. Οι γαµέτες- Η γονιµοποίηση Η αναπαραγωγή του ανθρώπου γίνεται, όπως και στους υπόλοιπους πολυκύτταρους οργανισµούς, µε αµφιγονία, δηλαδή µε τη συνένωση δύο ετερόφυλων κυττάρων, των γεννητικών κυττάρων ή γαµετών. Τα γεννητικά κύτταρα παράγονται µέσα στους γεννητικούς αδένες του άνδρα (σπερµατοζωάρια) και της γυναίκας (ωάρια). Η αλληλεπίδραση των γαµετών και η γονιµοποίηση είναι ιδιαίτερα πολύπλοκες αλλά και ακριβείς διαδικασίες που σηµατοδοτούν βέβαια την αφετηρία της ζωής ενός ατόµου, αλλά ταυτόχρονα και το τέλος της σηµαντικής λειτουργίας των γαµετών. Ωστόσο, κάθε άωρο γεννητικό κύτταρο, για να φθάσει ως την ωρίµανσή του, περνά από διάφορα εξελικτικά στάδια το σύνολο των οποίων αποτελεί τη γαµετογένεση, η οποία διακρίνεται αντίστοιχα στη σπερµατογένεση και στην ωογένεση, ενώ πριν ενωθούν αποτελεσµατικά έχει προηγηθεί µια εκτενής σειρά συντονισµένων γεγονότων για την ωρίµανση των γαµετών, που θα τους δώσει τη δυνατότητα να συνενωθούν µε επιτυχία. Στα θηλαστικά, αν και ουσιαστικά αρσενικοί και θηλυκοί γαµέτες ακολουθούν την ίδια διαδικασία, ωστόσο ο τρόπος που ωριµάζουν και τελικά προετοιµάζονται οι γαµέτες, για να είναι σε θέση να γονιµοποιήσουν και να γονιµοποιηθούν, είναι εντελώς διαφορετικός. Και τελικά, από το γεννητικό σύστηµα της γυναίκας απελευθερώνεται περιορισµένος αριθµός ωαρίων έτοιµα να γονιµοποιηθούν, ενώ στα σπερµατικά σωληνάρια ελευθερώνονται εκατοµµύρια σπερµατοζωάρια, τα οποία δεν µπορούν ούτε να κινηθούν ούτε να γονιµοποιήσουν. Αρχέγονα γεννητικά κύτταρα. Τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα εµφανίζονται µέσα στους διαπλασσόµενους γεννητικούς αδένες κατά την πέµπτη εµβρυϊκή εβδοµάδα. Η προέλευσή τους δεν είναι γνωστή. Σύµφωνα µε ορισµένους ερευνητές προέρχονται από µετανάστευση από άλλες περιοχές. Σύµφωνα µε άλλους, παράγονται από το βλαστικό επιθήλιο των γεννητικών οργάνων. Τα γεννητικά κύτταρα και των δύο φύλων τοποθετούνται κατά οµάδες οι οποίες σχηµατίζουν δοκίδες. Οι δοκίδες αυτές στον άνδρα εξελίσσονται σε σπερµατικά σωληνάρια, ενώ στη γυναίκα σχηµατίζουν, µέσα στη µυελώδη ουσία της ωοθήκης, τις µυελώδεις δοκίδες. Οι µυελώδεις δοκίδες δεν έχουν σχέση µε την

16 παραγωγή ωαρίων και η υπερτροφία τους προκαλεί εµφάνιση δευτερευόντων ανδρικών χαρακτήρων στις γυναίκες. Τα αρχέγονα ωάρια προέρχονται από κύτταρα του βλαστικού επιθηλίου της ωοθήκης. Μετά την εγκατάσταση των αρχεγόνων γεννητικών κυττάρων, αρχίζει η διαφοροποίηση του φύλου µε το σχηµατισµό του όρχεως ή της ωοθήκης. Ωοθήκες και ωάρια Οι γεννητικοί αδένες του αναπαραγωγικού συστήµατος στις γυναίκες, οι ωοθήκες, έχουν αµυγδαλοειδές σχήµα, µήκος 2,5-3,5 cm και πάχος 1 cm. Οι ωοθήκες βρίσκονται στις δύο πλευρές της µήτρας µέσα στον ωοθηκικό βόθρο, αναρτηµένες από το οπίσθιο πέταλο των πλατεών συνδέσµων της µήτρας. Η εξωτερική επιφάνειά τους δεν καλύπτεται από περιτόναιο αλλά από βλαστικό ή καλυπτήριο επιθήλιο, κάτω από το οποίο υπάρχει ο ινώδης χιτώνας της ωοθήκης. Κάθε ωοθήκη στο εσωτερικό της αποτελείται από ευδιάκριτες περιοχές, τη φλοιώδη και τη µυελώδη µοίρα ή ουσία: Η µυελώδης µοίρα αποτελεί το κεντρικό τµήµα της ωοθήκης, το οποίο φέρει τα αγγεία και τα νεύρα της Η φλοιώδης ουσία περιβάλλει σαν κέλυφος τη µυελώδη µοίρα των ωοθηκών και αποτελείται από συνδετικό ιστό, στα διάκενα του οποίου περιέχονται τα ωοθυλάκια σε διαφορετικές φάσεις ωρίµανσης, µέσα στα οποία βρίσκονται τα ωοκύτταρα και τα ωχρά σωµάτια. Εµβρυολογικά, οι ωοθήκες προέρχονται από τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, που εξελίσσονται σε ωάρια, το περιτοναϊκό επιθήλιο, που εξελίσσεται στο φλοιό των ωοθηκών, και από τον έσω µεσόνεφρο, που εξελίσσεται στο µυελό των ωοθηκών. Οι κύριες λειτουργίες των ωοθηκών αφορούν στην ωρίµανση και απελευθέρωση ενός ωαρίου περίπου κάθε 28 ηµέρες και την παραγωγή κυρίως των ορµονών του φύλου των γυναικών. Όπως και οι όρχεις, οι ωοθήκες παρουσιάζουν µια εξωκρινή λειτουργία για την παραγωγή των ωαρίων και µια ενδοκρινή για την παραγωγή στεροειδών ορµονών, οιστρογόνων κυρίως και λίγων ανδρογόνων, ανασταλτίνης και ρελαξίνης (Γκίµπα-Τζιαµπίρη Ο, 2001). Όρχεις και σπερµατοζωάρια Οι γεννητικοί αδένες του αναπαραγωγικού συστήµατος στον άνδρα, οι όρχεις, βρίσκονται µέσα στο όσχεο, περιβάλλονται από διάφορα έλυτρα και καθένας τους κρέµεται από το σπερµατικό τόνο. Κάθε όρχις αποτελείται από δύο διαφορετικά

17 όργανα: τον βασικό όρχι, όπου παράγονται ορµόνες και σπερµατοζωάρια, και την επιδιδυµίδα, που αποτελεί το αρχικό τµήµα της εκφορητικής οδού του σπέρµατος. Οι όρχεις εµφανίζονται την 5 η εµβρυϊκή εβδοµάδα και κατάγονται από το µέσο βλαστικό δέρµα (γεννητική ταινία), ενώ η επιδιδυµίδα από το µεσέγχυµα. Η λειτουργία τους περιλαµβάνει µια εξωκρινή και µια ενδοκρινή λειτουργία: - η εξωκρινής λειτουργία πραγµατοποιείται µε τα κύτταρα του Sertoli, από τα οποία παράγονται οι αρσενικοί γαµέτες, και µε τα σπερµατικά σωληνάρια, τα οποία µεταφέρουν το σπέρµα - η ενδοκρινής λειτουργία των όρχεων επιτελείται µε τα διάµεσα κύτταρα του Leydig, τα οποία διαθέτουν και τα απαραίτητα ένζυµα για την παραγωγή των στεροειδών ορµονών, µε σηµαντικότερη την τεστοστερόνη. Καθένας από τους όρχεις περιβάλλεται από έναν ινώδη χιτώνα, ο οποίος παχύνεται και σχηµατίζει το µεσοαύλιο. Από εκεί εκπορεύονται ακτινοειδώς τα διαφραγµάτια του όρχεως σχηµατίζοντας θαλάµους, όπου περιέχονται τα ορχικά λοβία. Τα ορχικά λοβία είναι η δοµική µονάδα του ορχικού παρεγχύµατος και αποτελούνται από τα σπερµατικά σωληνάρια και τη διάµεση ουσία (κύτταρα Leydig). (Γκίµπα-Τζιαµπίρη, 2001). Όσον αφορά στα σπερµατικά σωληνάρια, πρόκειται για επιµήκεις εσπειραµένους σωληνίσκους, µε ελικοειδή πορεία, οι οποίοι αρχίζουν, συνήθως τυφλά, κάτω από τον ινώδη χιτώνα. Αποτελούνται από ένα βασικό υµένα και από τα βασικά κύτταρα του Sertoli. Το µήκος των σωληναρίων φθάνει έως τα 70 cm και η διάµετρος του αυλού τους είναι περίπου 0,12-0,30mm. Κοντά στο µεσοαύλιο, τα σπερµατικά σωληνάρια εµφανίζονται ευθύγραµµα, αναστοµώνονται και σχηµατίζουν πόρους, που εκβάλλουν στο δίκτυο του Haller, και οι οποίοι εξερχόµενοι από τον όρχι συσσωρεύονται και σχηµατίζουν την κεφαλή της επιδιδυµίδας. Μέχρι την ηλικία των 6 ετών τα σωληνάρια είναι συµπαγή και δεν φέρουν αυλό, ενώ στην εφηβεία εκεί εξελίσσεται η σπερµατογένεση. Τα κύτταρα Sertoli βρίσκονται διάσπαρτα µεταξύ των σπερµιογόνων κυττάρων, περιέχουν γλυκογόνο, φέρουν µέσα στο κυτταρόπλασµά τους µιτοχόνδρια, λυσοσωµάτια, µικροσωληνάρια, αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο και έκκεντρο πυρήνα, κοντά στη βάση του κυττάρου. Η βασική επιφάνειά τους προσφύεται στον βασικό υµένα, ενώ η ελεύθερη εµφανίζει διάφορες προεκβολές, στα διάκενα των οποίων βρίσκονται οι κεφαλές των νεαρών σπερµατοζωαρίων. Τα κύτταρα του Sertoli είναι

18 απαραίτητα για τη σπερµατογένεση προσφέροντας θρεπτική και στηρικτική υποστήριξη. Επίσης παράγουν την πρωτεΐνη ΑΒΡ που δεσµεύει τα ανδρογόνα αλλά και ορµόνες όπως τις ανασταλτίνες (Α και Β), που αναστέλλουν την έκκριση της FSH, τις ακτιβίνες (Α, ΑΒ και Β), που διεγείρουν την έκκριση της FSH και τα οιστρογόνα. Η διάµεση ουσία (κύτταρα του Leydig), αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό και περιέχει τα διάµεσα κύτταρα του Leydig. Τα κύτταρα αυτά βρίσκονται κατά οµάδες στα διάκενα, τα οποία σχηµατίζονται µεταξύ των σπερµατικών σωληναρίων. Τα κύτταρα αυτά είναι πολυγωνικά µε έκκεντρο πυρήνα, αναπτυγµένο ενδοπλασµατικό δίκτυο, άφθονα ένζυµα, λιπίδια και µιτοχόνδρια (Γκίµπα-Τζιαµπίρη, 2001). Τα ανώριµα βλαστικά κύτταρα, δηλαδή τα διπλοειδή σπερµατογόνια, βρίσκονται τοποθετηµένα ανάµεσα στα κύτταρα Sertoli και στην υποκείµενη βασική µεµβράνη. Στη θέση αυτή, τα σπερµατογόνια δρουν ως στελεχιαία κύτταρα και διαιρούνται µε συνεχείς µιτώσεις. Μερικά από τα θυγατρικά κύτταρα διακόπτουν τον πολλαπλασιασµό τους, µετατρέπονται σε πρωτοταγή σπερµατοκύτταρα και αρχίζουν τις µειωτικές διαιρέσεις. Κατά τη διάρκεια των διαιρέσεων κάθε πρωτοταγές σπερµατοκύτταρο διαιρείται αρχικά σε δύο δευτεροταγή σπερµατοκύτταρα και µετά σε τέσσερις σπερµατίδες, οι οποίες διαθέτουν απλοειδή αριθµό χρωµοσωµάτων. Οι σπερµατίδες διαφοροποιούνται σε ώριµα σπερµατοζωάρια, τα οποία διαρρέουν µέσα στον αυλό του σπερµατοφόρου σωληναρίου. Από εκεί µεταφέρονται µέσα στην επιδιδυµίδα, όπου αποθηκεύονται και υπόκεινται σε περαιτέρω ωρίµανση. Στους άνδρες, η µείωση των σπερµατοκυττάρων συµπληρώνεται σε 24 µέρες και η όλη διαδικασία της ανάπτυξης ενός σπερµατογόνιου σε ώριµο σπερµατοζωάριο απαιτεί 9 εβδοµάδες. Αναλυτικότερα: Σπερµατογένεση Κατά την εµβρυϊκή ζωή, οι δοκίδες που σχηµατίστηκαν µέσα στον όρχι αρχίζουν να παράγουν αρχέγονα γεννητικά κύτταρα κάθε ένα από τα οποία περιβάλλεται από βασικό υµένα. Οι δοκίδες είναι συµπαγείς και δεν έχουν αυλό. Αποτελούνται από κύτταρα δύο διαφορετικών τύπων. Τα µεγαλύτερα από αυτά είναι σφαιρικά ή ωοειδή, εµφανίζουν διαυγές κυτταρόπλασµα γεµάτο µε µιτοχόνδρια και διπλοσωµάτιο. Ο πυρήνας είναι µεγάλος και σφαιρικός, περιέχει άφθονη χρωµατίνη και ευδιάκριτο πυρηνίσκο. Τα κύτταρα αυτά ονοµάζονται σπερµατογόνια και εξελίσσονται, µετά την

19 έναρξη της ήβης, σε σπερµατοζωάρια. Μεταξύ των σπερµατογονίων βρίσκονται άλλα κύτταρα, τα στηρικτικά κύτταρα του Sertoli. Μετά τον τοκετό οι όρχεις αναπτύσσονται και οι δοκίδες αποκτούν αυλό. Με αυτό τον τρόπο µετατρέπονται σε σπερµατικά σωληνάρια. Τα σπερµατογόνα κύτταρα πολλαπλασιάζονται µε αλλεπάλληλες µιτωτικές διαιρέσεις, ως την περίοδο της ήβης. Κατά την έναρξη της ήβης, κάθε σπερµατογόνιο διαιρούµενο µε µιτωτική διαίρεση, παράγει δύο νέα κύτταρα τα οποία έχουν τους χαρακτήρες του µητρικού κυττάρου. Τα θυγατρικά αυτά κύτταρα είτε είναι νέα σπερµατογόνα κύτταρα, (σπερµατογόνα κύτταρα τύπου Α), είτε είναι κύτταρα περισσότερο διαφοροποιηµένα (σπερµατογόνα κύτταρα τύπου Β), τα οποία µε µιτωτική διαίρεση δίνουν τα σπερµατοκύτταρα πρώτης τάξεως. Τα σπερµατοκύτταρα πρώτης τάξεως είναι µεγάλα κύτταρα, µε µεγάλο σφαιρικό πυρήνα, παρουσιάζουν αύξηση του αριθµού των µιτοχονδρίων και εµφανές κεντροσωµάτιο. Κάθε όρχις αποτελείται από 500 περίπου σπερµατικά σωληνάρια. Το µήκος καθενός από αυτά φθάνει τα 0,70 έως 1 µέτρο, ενώ το ολικό µήκος των σπερµατικών σωληναρίων, υπολογίζεται σε µέτρα. Μεταξύ των σπερµατικών σωληναρίων, βρίσκονται οµάδες κυττάρων που ονοµάζονται διάµεσα κύτταρα ή κύτταρα του Leydig. Τα κύτταρα αυτά έχουν σχέση µε την παραγωγή ορµονών. Τα σπερµατογόνια είναι κύτταρα που περιέχουν 46 χρωµατοσώµατα. Με µιτωτική διαίρεση σχηµατίζουν τα σπερµατοκύτταρα πρώτης τάξης, κάθε ένα από τα οποία περιέχει επίσης 46 χρωµατοσώµατα. Κάθε σπερµατοκύτταρο πρώτης τάξης διαιρείται µε µείωση και σχηµατίζει δύο σπερµατοκύτταρα δεύτερης τάξης ή προ-σπερµατίδες. Οι προ-σπερµατίδες περιέχουν η κάθε µία 23 χρωµατοσώµατα. Κάθε σπερµατοκύτταρο δεύτερης τάξης διαιρείται µε µίτωση και σχηµατίζει δύο σπερµατίδες, που περιέχουν επίσης 23 χρωµατοσώµατα. Έτσι, από κάθε αρχικό σπερµατογόνιο κύτταρο, µε αλλεπάλληλες διαιρέσεις, σχηµατίζονται συνολικά 8 σπερµατίδες. Σπερµιογένεση Σπερµιογένεση ονοµάζεται η µετατροπή των σπερµατίδων σε σπερµατοζωάρια. Η µετατροπή αυτή γίνεται µε µία σειρά µορφολογικών µεταβολών στο κύτταρο της σπερµατίδης.

20 Η σπερµατίδη αρχικά έχει πυρήνα σφαιρικό, ευδιάκριτο σύστηµα Golgi και µεγάλο αριθµό µιτοχονδρίων. Περιέχει επίσης ένα εµφανές κεντροσωµάτιο, το οποίο αποτελείται από δύο τµήµατα. Στην αρχή της διαδικασίας της µετατροπής της, σχηµατίζεται µέσα στη συσκευή του Golgi, ένα κοκκίο που ονοµάζεται ακροσωµάτιο. Το κοκκίο αυτό περιέχει ένζυµα που θα διευκολύνουν τη διείσδυση του κυττάρου µέσα στο ωάριο. Το ακροσωµάτιο φέρεται µπροστά από τον πυρήνα, ο οποίος επιµηκύνεται και µετακινείται προς τον ένα πόλο του κυττάρου. Εκεί το ακροσωµάτιο αναπτύσσεται και σχηµατίζει την πρόσθια καλύπτρα του πυρήνα. Συγχρόνως το σύστηµα του Golgi µετατοπίζεται προς τον άλλο πόλο του πυρήνα, όπου σχηµατίζει την οπίσθια καλύπτρα. Από το οπίσθιο κεντροσωµάτιο εκβλαστάνει ένα λεπτό νηµάτιο, το αξονικό νηµάτιο, το οποίο θα σχηµατίσει την ουρά του σπερµατοζωαρίου. Το αξονικό νηµάτιο, επειδή προέρχεται από το κεντροσωµάτιο, περιέχει 9 ζεύγη περιφερικών και 1 ζεύγος κεντρικών µικροσωληναρίων. Στη συνέχεια, το οπίσθιο κεντροσωµάτιο σχηµατίζει το εγκάρσιο δισκίο του αυχένα και τον τελικό δακτύλιο της ουράς, ενώ το πρόσθιο κεντροσωµάτιο σχηµατίζει τα πρόσθια κοµβία του αυχένα, τα οποία εφάπτονται της πυρηνικής µεµβράνης. Συγχρόνως, τα µιτοχόνδρια µετακινούνται προς το αξονικό σηµάτιο και τοποθετούνται σπειροειδώς γύρω από τον άξονά του. Σχηµατίζουν έτσι το µέσο ή ελικοειδές έλυτρο στο συνδετικό τµήµα της ουράς του σπεµατοζωαρίου. Τέλος, το κυτταρόπλασµα σχηµατίζει τα υπόλοιπα έλυτρα της ουράς και κατόπιν εξαφανίζεται (Κεραµέως- Φόρογλου, 1987). οµή του σπερµατοζωαρίου Η κίνηση του σπερµατοζωαρίου συσχετίζεται µε τη γονιµότητα και την αναπαραγωγή τόσο στον άνθρωπο όσο και σε όλα τα ζώα (Dredsner & Katz, 1981, Suarez et al,1984). Έτσι και η µορφολογία του σπερµατοζωαρίου είναι καθαρά λειτουργική. Κάθε µορφολογικό του γνώρισµα αποσκοπεί στο να εκπληρώσει έναν ή και τους δύο σκοπούς του, δηλαδή την κίνηση προς το ωάριο και τη σύντηξή του µε αυτό. Αυτή πρέπει να είναι και η αιτία της απουσίας πολλών κυτταροπλασµατικών οργανιδίων, όπως τα ριβοσώµατα, το ενδοπλασµατικό δίκτυο, το σύστηµα Golgi κ.λ.π., αφού δεν εξυπηρετούν καµία από τις παραπάνω επιδιώξεις, ενώ τα µιτοχόνδρια, που παρέχουν την απαραίτητη ενέργεια για τη µετακίνηση, είναι πολυάριθµα και καταλαµβάνουν κατάλληλες θέσεις. Συνήθως τα σπερµατοζωάρια αποτελούν λεπτές δοµές µε µικρή κεφαλή και µακριά ουρά. Εντούτοις η µορφή τους ποικίλλει στα διάφορα είδη, ώστε να προσαρµόζονται στις συνθήκες γονιµοποίησης κάθε είδους.

21 Όσον αφορά στη µορφολογία των σπερµατοζωαρίων στα θηλαστικά, ενώ είχε αρχίσει να µελετάται από το 19 ο αιώνα, λόγω του πολύ µικρού του µεγέθους, η δοµή του διαλευκάνθηκε µόνο µετά από παρατηρήσεις στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Το σπερµατοζωάριο αποτελείται από δύο µορφολογικά και λειτουργικά διακριτές περιοχές που περιβάλλονται από µια πλασµατική µεµβράνη: την κεφαλή, που περιέχει τον απλοειδή πυρήνα, και την ουρά, που προωθεί το σπερµατοζωάριο προς το ωάριο. Ειδικά στον άνθρωπο, τα σπερµατοζωάρια έχουν µήκος περίπου 60µm. Η κεφαλή παρουσιάζει µικρή εσωτερική οργάνωση, αφού το κυρίως σώµα του καταλαµβάνεται από τον πυρήνα µέσα στον οποίο η χρωµατίνη είναι ασυνήθιστα έντονα συµπυκνωµένη. Στο πρόσθιο τµήµα της κεφαλής, ο πυρήνας περιβάλλεται από το ακρόσωµα, το οποίο σχηµατίζει ένα κάλυµµα. Το ακροσωµικό κάλυµµα βρίσκεται µεταξύ της πλασµατικής µεµβράνης και του πυρηνικού φακέλου και περιβάλλεται από τη δική του µεµβράνη. Πρόκειται για ένα εκκριτικό κυστίδιο µε διάφορα υδρολυτικά ένζυµα. Όταν το σπερµατοζωάριο πλησιάσει το ωάριο, η εξωτερική ακροσωµική µεµβράνη συντήκεται µε την πλασµατική µεµβράνη του σπερµατοζωαρίου και τα ένζυµα του ακροσώµατος απελευθερώνονται. Το φαινόµενο αυτό είναι γνωστό ως ακροσωµική αντίδραση και έχει ως σκοπό, εξαιτίας της δράσης των ενζύµων, την είσοδο του σπερµατοζωαρίου µέσα από τις προστατευτικές στιβάδες που περιβάλλουν το ωάριο. Η οπίσθια περιοχή του ακροσώµατος, ισηµερινή, αποτελεί λειτουργικά την πιο σηµαντική περιοχή, αφού αποτελεί τη θέση της αρχικής επαφής µεταξύ σπερµατοζωαρίου και ωαρίου κατά τη γονιµοποίηση, ενώ είναι το µοναδικό τµήµα του ακροσώµατος που παραµένει ακέραιο κατά την ακροσωµική αντίδραση. Το ακρόσωµα και ο πυρήνας καθορίζουν το σχήµα της κεφαλής των σπερµατοζωαρίων, το οποίο µπορεί να ποικίλλει. Η λειτουργική όµως σηµασία αυτών των έντονων διαφορών στη µορφή παραµένει άγνωστη µια και, φαινοµενικά τουλάχιστον, το σχήµα δεν έχει κανένα µηχανικό ρόλο κατά τη γονιµοποίηση.

22 Στην ουρά του σπερµατοζωαρίου διακρίνονται 4 τµήµατα: ο λαιµός - η θέση συναρµολόγησης κεφαλής-ουράς-, το µεσαίο τµήµα, το κυρίως τµήµα και το ακραίο τµήµα. Η ουρά παράγει τη µαστιγοειδή κίνηση που προωθεί το σπερµατοζωάριο προς το ωάριο. Η δοµή που είναι υπεύθυνη για τη µορφή αυτή της κίνησης, είναι το αξονήµιο. Το αξονήµιο αποτελείται από δύο κεντρικά µικροσωληνάρια που περιβάλλονται από 9 ζεύγη µικροσωληναρίων. Τα ζεύγη αποτελούνται από δύο υποµονάδες, η µία από τις οποίες είναι κυκλική και η άλλη ηµικυκλική (σχήµατος C). Η κυκλική υποµονάδα φέρει δύο βραχίονες που προεκβάλλουν προς το γειτονικό ζευγάρι των µικροσωληναρίων. Τα µικροσωληνάρια αποτελούνται από πρωτοϊνίδια: τα κυκλικά από 13 και τα ηµικυκλικά από 10. Τα πρωτοϊνίδια διατρέχουν όλο το µήκος των µικροσωληναρίων και αποτελούνται κυρίως από την πρωτείνη τουµπουλίνη. Οι βραχίονες αποτελούνται από µια άλλη πρωτεΐνη, τη δυνεΐνη, που διαθέτει δραστικότητας ΑΤΡ-άσης και είναι υπεύθυνη για τη µετατροπή της χηµικής ενέργειας σε µηχανική κίνηση. Αν και η εσωτερική δοµή του µαστιγίου είναι γνωστή, η συνεισφορά της στη µαστιγοειδή κίνηση, πρέπει να είναι σχετική µε τον καθορισµό της ποιότητας της κίνησης, δεν έχει αποσαφηνισθεί (Fauci & Mc Donald, 1995). Ο µηχανισµός στον οποίο οφείλεται η µαστιγοειδής µοιάζει πολύ µε το µηχανισµό ολίσθησης των ινιδίων της µυϊκής σύσπασης και µάλλον προκαλείται επίσης από την τοπική ολίσθηση µεταξύ γειτονικών ζευγαριών. Το αξονήµιο διατρέχει ολόκληρη την ουρά και η οργάνωση των µικροσωληναρίων του συναντάται στις βλεφαρίδες και τα µαστίγια όλων των ζώων και των φυτών. Φαίνεται πως η εξελικτική διατήρηση της µορφής 9+2 είναι απαραίτητη για τη γένεση της µαστιγοειδούς και βλεφαριδωτής κίνησης. Το αξονήµιο περιβάλλεται από επιπλέον 9 εξωτερικές πυκνές ίνες, προσδίδοντας µια τελική διευθέτηση 9+9+2, ώστε κάθε µια εξωτερική ίνα να είναι παράλληλη µε ένα ζευγάρι του αξονήµατος. Το πάχος των ινών είναι µεγαλύτερο στο πρόσθιο τµήµα της ουράς και ελαττώνεται σταδιακά προς το οπίσθιο άκρο. Αν και πιστεύεται ότι οι πυκνές ίνες ενισχύουν την ουρά, η λειτουργία και η σύστασή τους παραµένουν άγνωστες. Ο λαιµός/αυχένας αποτελεί τη βάση της ουράς. Το κυριότερο δοµικό στοιχείο αυτής της περιοχής είναι το "τµήµα σύνδεσης" (ή συνδετικό κοµµάτι) που βρίσκεται µέσα στην κοιλότητα που σχηµατίζει η βάση της κεφαλής του σπερµατοζωαρίου. Στο χώρο ανάµεσα στο τµήµα σύνδεσης και της κεφαλής υπάρχουν πολύ λεπτές ίνες που

23 θεωρούνται υπεύθυνες για αυτήν τη σύνδεση. Το τµήµα σύνδεσης φέρει προς τα πίσω 9 στήλες που συνδέονται µε τα πρόσθια άκρα των 9 παχέων ινών. Το µεσαίο τµήµα του σπερµατοζωαρίου φέρει µια χαρακτηριστική κάψα που αποτελείται από µιτοχόνδρια. Αυτά διευθετούνται το ένα πίσω από το άλλο σχηµατίζουν έναν έλικα, που περιβάλλει το αξονήµιο του µεσαίου τµήµατος, και παρέχουν την ενέργεια για την προωθητική κίνηση του σπερµατοζωαρίου. Το µεσαίο τµήµα διακόπτεται από µια δοµή γνωστή ως δακτύλιος. Πίσω από το δακτύλιο το αξονήµιο περιβάλλεται από µια ινώδη κάψα. Η περιοχή αυτή της ουράς αποτελεί το κυρίως τµήµα. Η θέση στην οποία λήγει η ινώδης κάψα αποτελεί το σηµείο σύνδεσης του κυρίου τµήµατος µε το τελικό τµήµα (Γκίµπα-Τζιαµπίρη, 2001). Γονιµοποίηση Πρόκειται για τη συνένωση δύο ώριµων ετερόφυλων γεννητικών κυττάρων και το σχηµατισµό του ζυγωτού. Η µελέτη της γονιµοποίησης στον άνθρωπο και σε όλα τα θηλαστικά είναι ιδιαίτερα δύσκολη εξαιτίας της σύντηξης των γαµετών στο σώµα του θηλυκού. Έτσι, η παρατήρηση των γεγονότων γίνεται in vitro. Από τα πρώτα, όµως, πειράµατα διαπιστώθηκε ότι τα σπερµατοζωάρια είναι αδύνατο να διαπεράσουν τις προστατευτικές µεµβράνες του ωαρίου και να το γονιµοποιήσουν. Την ικανότητα αυτή την αποκτούν µόνο κατά την παραµονή τους για κάποιο χρονικό διάστηµα µέσα στην αναπαραγωγική οδό του θηλυκού. Οι µεταβολές αυτές διευκολύνουν την ακροσωµική αντίδραση, αλλά ακόµα δεν είναι σαφώς καθορισµένες. Ωστόσο, η εκτεταµένη χρήση των τεχνικών υποβοηθούµενης αναπαραγωγής στηρίχθηκε στην ολοένα αυξανόµενη αλλά και διαρκώς αναζητούµενη γνώση για τις διεργασίες που απαιτούνται, προκειµένου να επιτευχθεί η γονιµοποίηση. Η γονιµοποίηση είναι δυνατή µόνο εφόσον προηγουµένως τα σπερµατοζωάρια και τα ωάρια υποστούν τις ακόλουθες ειδικές µεταβολές: Ενεργοποίηση: Τα σπερµατοζωάρια κατά τη διαδροµή τους µέσα στη µήτρα και τους ωαγωγούς παρουσιάζουν µια βιολογική µεταβολή, την ενεργοποίηση. Η διαδικασία της ενεργοποίησης διαρκεί περίπου 7 ώρες και τα καθιστά ικανά να διατρήσουν τη διάφανη ζώνη του ωαρίου και να εισχωρήσουν µέσα σε αυτό.

24 Ακροσωµική αντίδραση: Τη στιγµή της γονιµοποιήσεως, ένα από τα πολλά σπερµατοζωάρια που περιβάλλουν το ωάριο, προσκολλάται µε την κεφαλή και τον αυχένα του επάνω σε αυτό και προσπαθεί, περιστρεφόµενο µε κοχλιοειδείς κινήσεις, να διεισδύσει µέσα στο ωάριο. Συγχρόνως, η κεφαλή του σπερµατοζωαρίου µεταβάλλεται, παρουσιάζει την ακροσωµατική αντίδραση και απελευθερώνει από τις µεµβράνες της διάφορα ένζυµα (υαλουρονιδάσες, πρωτεάσες κ.α.) τα οποία διασπούν τον κοκκιώδη υµένα και τη διαφανή ζώνη του ωαρίου. Με το συνδυασµό των µηχανικών και φυσικοχηµικών αυτών εξελίξεων κατορθώνει η κεφαλή του σπερµατοζωαρίου να συνδεθεί µε την κυτταρική µεµβράνη του ωαρίου και στη συνέχεια, µαζί µε τον αυχένα του, να ενσωµατωθεί µέσα στο ωάριο. Αντίδραση διαφανούς ζώνης: Με τη σύνδεση του ωαρίου και του σπερµατοζωαρίου απελευθερώνονται από το ωάριο ορισµένα πρωτεολυτικά ένζυµα και ξεκινάει η διαδικασία της αντίδρασης της διαφανούς ζώνης. Τα ένζυµα που απελευθερώνονται επενεργούν στη διαφανή ζώνη του ωαρίου και µεταβάλλουν τη σκληρότητά της έτσι ώστε να µην είναι δυνατή η γονιµοποίηση του ωαρίου και από ένα δεύτερο σπερµατοζωάριο (Γκίµπα-Τζιαµπίρη, 2001). Το ωάριο µετά την ωοθυλακιορρηξία παραλαµβάνεται από τους κροσσούς του ωαγωγού. Στη θέση αυτή παραµένει 24 περίπου ώρες και εκεί γίνεται η γονιµοποίηση του. Στη λήκυθο του ωαγωγού τα σπερµατοζωάρια συναντούν το ωάριο. Η κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων αυξάνει µε την παρουσία των οιστρογόνων και ελαττώνεται µε την παρουσία της προγεστερόνης. Τα σπερµατοζωάρια περιβάλλουν το ωάριο, αλλά ένα µόνο διαπερνά τα περιβλήµατά του και µπαίνει µέσα στο κύτταρο. Κατά τη συνένωση ωαρίου-σπερµατοζωαρίου και την ακροσωµική αντίδραση, δεν σχηµατίζεται ακροσωµική απόφυση. Η πλασµατική µεµβράνη του σπερµατοζωαρίου συντήκεται κατά διαστήµατα µε την εξωτερική µεµβράνη δηµιουργώντας πολυάριθµα κυστίδια. Το µόνο τµήµα του ακροσώµατος το οποίο διαφεύγει αυτή τη διαδικασία της κυστιδιοποίησης είναι το ισηµερινό τµήµα, το οποίο παραµένει ακέραιο. Τα ακροσωµικά ένζυµα απελευθερώνονται µέσα από τα χάσµατα που δηµιουργούνται, και βοηθούν το σπέρµα να διαπεράσει τις προστατευτικές στιβάδες του ωαρίου. Οι προστατευτικές στιβάδες που περιβάλλουν το ωάριο διασπώνται από διαφορετικά ακροσωµικά ένζυµα. Η υαλουρονιδάση διασπά το υαλουρονικό οξύ, που συνδέει τα κύτταρα µιας από τις προστατευτικές στιβάδες, και επιτρέπει στο σπερµατοζωάριο να διεισδύσει µέσα από αυτή τη ζώνη.

25 Όταν το σπερµατοζωάριο διαπεράσει τις προστατευτικές κυτταρικές στιβάδες που περιβάλλουν το ωάριο, έρχεται σε επαφή µε τη διαφανή ζώνη, η οποία είναι ένας παχύς γλυκοπρωτεϊνικός φάκελος. Η δέσµευση µεταξύ εσωτερικής ακροσωµικής µεµβράνης και ζώνης είναι ειδική. Η δέσµευση συνοδεύεται από τη διέλευση του σπερµατοζωαρίου µέσω της διάφανης ζώνης, η οποία διασπάται από την ακροσίνη. Κατά τη συνένωση ωαρίου-σπερµατοζωαρίου, το σπερµατοζωάριο διέρχεται σε γωνία εφαπτόµενη ως προς την επιφάνεια του ωαρίου. Σαν αποτέλεσµα, το τµήµα του σπερµατοζωαρίου, που έρχεται πρώτο σε επαφή µε το ωάριο, είναι το ισηµερινό τµήµα της κεφαλής. Η σύντηξη των κυτταροπλασµατικών µεµβρανών συνοδεύεται από την ενσωµάτωση του σπέρµατος. Το τµήµα που ενσωµατώνεται πρώτο είναι το οπίσθιο τµήµα του κεφαλιού, ακολουθεί το πρόσθιο και τελικά η ουρά, χωρίς να ενσωµατώνεται η πλασµατική του µεµβράνη (Γκίµπα-Τζιαµπίρη, 2001). Αµέσως µετά την είσοδό του, οι δύο πυρήνες του ωαρίου και του σπερµατοζωαρίου, πλησιάζουν µεταξύ τους. Η κυτταρική µεµβράνη του σπερµατοζωαρίου ενώνεται µε αυτήν του ωαρίου και µένει στην περιφέρεια του κυττάρου. Καθώς οι δύο προπυρήνες πλησιάζουν, το πρωτόπλασµα του ωαρίου συσπάται και έτσι σχηµατίζεται ένας χώρος µεταξύ της κυτταρικής µεµβράνας και της διαφανούς ζώνης που περιβάλλει το ωάριο (περιώϊος λεκιθικός χώρος). Μορφολογικώς οι δύο προπυρήνες είναι όµοιοι. Στο διάστηµα που µεσολαβεί πριν από την ένωσή τους ο κάθε ένας από τους δύο προπυρήνες διπλασιάζει το υλικό του σε DNA. Στη συνέχεια οι πυρηνικές µεµβράνες διαλύονται και τα χρωµοσώµατα αναµιγνύονται σχηµατίζοντας την πυρηνική άτρακτο. Η άτρακτος αυτή περιλαµβάνει 23 χρωµοσώµατα από τον ανδρικό προπυρήνα και 23 από τον προπυρήνα της γυναίκας (Κεραµέως- Φόρογλου, 1987). Ο ρόλος της κίνησης στη γονιµοποίηση Η κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων θεωρείται σήµερα ως µια από τις πλέον σηµαντικές παραµέτρους του σπέρµατος, η οποία σχετίζεται µε τη γονιµοποιητική ικανότητά τους (Bongso et al, 1989; Eimers et al, 1994; Donnelly et al, 1998). Επιπλέον, πρόσφατα ερευνητικά δεδοµένα έχουν δείξει πως η εκτίµηση των χαρακτηριστικών της κινητικότητας των σπερµατοζωαρίων, όπως µπορούν να µετρηθούν µε τη χρήση κατάλληλου λογισµικού, µπορούν να συσχετιστούν θετικά µε τη γονιµότητα (Larsen et al; Hirano Y et al, 2001). Είναι γνωστό πως στο τέλος της διαφοροποίησης των γαµετών, µόνο ένας εξαιρετικά περιορισµένος αριθµός ωοκυττάρων που είναι έτοιµος για γονιµοποίηση, έχει

26 απελευθερωθεί από την ωοθήκη, ενώ αντίθετα ένας πολύ µεγάλος αριθµός σπερµατοζωαρίων, που απελευθερώνεται µέσα στο σπερµατικό πόρο, δεν έχει την ικανότητα να κινηθεί ούτε να γονιµοποιήσει. Τα σπερµατοζωάρια τελικά αποκτούν την ικανότητα της προωθητικής κίνησής τους, κατά τη διάρκεια της ωρίµανσής τους στην επιδιδυµίδα, ενώ αποκτούν τη γονιµοποιητική τους ικανότητα µόνο µετά από µια σειρά φυσιολογικών αλλαγών, που αποτελούν το στάδιο της «ενεργοποίησης» και πραγµατοποιούνται, όταν πλέον τα σπερµατοζωάρια κινούνται κατά µήκος της αναπαραγωγικής οδού της γυναίκας (Eddy & O Brien, 1994; Wassarman & Albertini, 1994; Harper, 1994). Ωστόσο, αφού µόνο ένας µικρός αριθµός από σπερµατοζωάρια καταφέρνει να φθάσει στις σάλπιγγες στην περιοχή της ληκύθου, όπου πραγµατοποιείται η γονιµοποίηση, γίνεται φανερό πως το στάδιο της ενεργοποίησης in vivo, συνοδεύεται από σηµαντικές διαδικασίες επιλογής των σπερµατοζωαρίων µέσω της ικανότητάς τους να προσεγγίσουν το ωάριο, ώστε να διασφαλισθεί η γονιµοποίηση και η ανάπτυξη του εµβρύου. Η κινητικότητα των σπερµατοζωαρίων φαίνεται πως παίζει σηµαντικότατο ρόλο στη βιολογία της αναπαραγωγής τόσο σε επίπεδο συστηµάτων όσο και σε κυτταρικό επίπεδο, ενώ τα χαρακτηριστικά της φαίνεται πως συσχετίζονται µε τη γονιµοποίηση τόσο στον άνθρωπο (Dredsner & Katz, 1981) όσο και στα άλλα ζώα (Suarez et al, 1984). Αν και η δοµή του µαστιγίου έχει πλέον µελετηθεί αναλυτικά και είναι γνωστή η σηµασία του ασβεστίου στην κίνηση του σπερµατοζωαρίου, ωστόσο δεν είναι ακόµα πλήρως γνωστός ο τρόπος και οι παράγοντες που επηρεάζουν τη µαστιγοειδή κίνηση (Fauci & McDonald, 1995) και άρα και τη δυνατότητα της κίνησης µέχρι να συναντηθεί µε το ωάριο.

27 Κεφάλαιο 2. Υπογονιµότητα Η υπογονιµότητα αποτελεί τόσο προσωπικό όσο και κοινωνικό πρόβληµα. Η συχνότητα της υπογονιµότητας στην Ευρώπη είναι περίπου 14%, µε αποτέλεσµα 1 στα 7 ζευγάρια να βρίσκεται αντιµέτωπο µε το πρόβληµα (National Collaborating Centre for Women's and Children's Health, 2004). Έτσι, τις τελευταίες δεκαετίες έχουν πραγµατοποιηθεί και συνεχίζουν να πραγµατοποιούνται σηµαντικές και ραγδαίες αλλαγές στον ευαίσθητο τοµέα της γονιµότητας. Μέχρι τη δεκαετία του '70, η προσέγγιση του υπογόνιµου ζευγαριού αφορούσε κυρίως τη διερεύνηση της γυναίκας, µε αποτέλεσµα συχνά να παραµελείται η αξιολόγηση της γονιµοποιητικής ικανότητας του άνδρα. Ήδη από τη δεκαετία του '80 ωστόσο, παρατηρήθηκε µια τάση ευαισθητοποίησης όσον αφορά στον εντοπισµό και τη µελέτη για την ύπαρξη προβληµάτων στον άνδρα, µε αποτέλεσµα να δίνεται όλο και µεγαλύτερη έµφαση στην αξιολόγηση της ανδρικής αναπαραγωγικής ικανότητας. Συγχρόνως, η ανάπτυξη της εξωσωµατικής γονιµοποίησης οδήγησε σε µια εντυπωσιακή άνοδο της χρήσης των τεχνολογιών υποβοηθούµενης αναπαραγωγής, για τη θεραπευτική αντιµετώπιση τόσο της ανδρικής όσο και της γυναικείας υπογονιµότητας. Τα τελευταία χρόνια, διάφοροι παράγοντες έχουν οδηγήσει στην αναθεώρηση της χρήσης των τεχνικών υποβοηθούµενης αναπαραγωγής (ARTs) ως αρχικής θεραπείας. Παρά την τεχνολογική εξέλιξη και τις µεταρρυθµίσεις στην υγειονοµική περίθαλψη, το κόστος των παραπάνω τεχνικών παραµένει υψηλό και σε αρκετές χώρες τίθεται το θέµα αν οι µέθοδοι αυτές θα πρέπει να καλύπτονται από τα ασφαλιστικά ταµεία ή να παρέχονται δωρεάν από τα συστήµατα υγείας, σε ποιες ηλικιακές οµάδες και για πόσες προσπάθειες σύλληψης: ένα θέµα για το οποίο αναζητάται µια νοµοθετική ρύθµιση και για τη χώρα µας. Εξάλλου σε πολλά ζευγάρια έχει κλονιστεί η εµπιστοσύνη απέναντι στην εφαρµογή αυτών των µεθόδων, µετά τη δηµοσίευση µελετών που κατέγραψαν αυξανόµενη εµφάνιση καρκίνου των ωοθηκών σε γυναίκες οι οποίες στο παρελθόν υποβλήθηκαν σε ορµονική θεραπεία για την αντιµετώπιση της υπογονιµότητας.

28 Αυτά τα γεγονότα οδήγησαν στη µετατόπιση της έµφασης που δινόταν ερευνητικά, από τη θεραπεία, η οποία στόχευε στη βελτίωση της γονιµότητας, προς τη θεραπευτική εκείνη προσέγγιση που επιδιώκει τη σύλληψη, παρακάµπτοντας τα προβλήµατα γονιµότητας. Η πιθανότητα για σύλληψη σε ένα ζευγάρι που δεν αντιµετωπίζει κάποιο πρόβληµα γονιµότητας είναι περίπου 25% τον πρώτο µήνα των προσπαθειών τους, 75% όταν έχουν περάσει 6 µήνες, και 90% για τον 1 ο χρόνο (Spira, 1986). Επιπλέον, τα ποσοστά γονιµότητας φαίνεται να εµφανίζουν τις µέγιστες τιµές τους στην ηλικία των 24 ετών, τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες, ενώ µετά από αυτήν την ηλικία αρχίζουν να µειώνονται (van Noord-Zaadstra et al, 1991). Τα περισσότερα ζευγάρια επιτυγχάνουν τη σύλληψη κατά τη διάρκεια του πρώτου χρόνου των προσπαθειών τους, ενώ ένα ποσοστό που µπορεί να φθάνει το 15% των ζευγαριών, δεν τα καταφέρνει (Greenhall et al, 1990). Για αυτά τα ζευγάρια, υπολογίζεται πως περίπου το 20-30% των περιπτώσεων της υπογονιµότητας, που εµφανίζουν, οφείλεται εξ ολοκλήρου σε κάποιο πρόβληµα που αντιµετωπίζει ο άνδρας, µε ένα πρόσθετο 30% των περιπτώσεων που περιλαµβάνουν προβλήµατα και στα δύο µέλη του ζευγαριού (Mosher, 1991; WHO 1999). Εποµένως, κατά προσέγγιση, για τα µισά ζευγάρια που αντιµετωπίζουν προβλήµατα υπογονιµότητας, ενοχοποιείται κάποιο πρόβληµα του άνδρα συντρόφου. Από τη δεκαετία του 90, το επιστηµονικό ενδιαφέρον εστίασε στη βελτίωση των µικροχειρισµών που πραγµατοποιούνται κατά το χειρισµό των ανθρώπινων γαµετών. Έχουν πραγµατοποιηθεί σηµαντικότατα βήµατα που αφορούν στη µικρογονιµοποίηση, στην υποβοηθούµενη εκκόλαψη, στη βιοψία των εµβρύων και, πλέον, στη δυνατότητα κλωνοποίησης των εµβρύων. Μελέτες έχουν δείξει πως το 25-35% των υπογόνιµων ζευγαριών που δε θα χρησιµοποιήσουν κάποια θεραπευτική µέθοδο, θα συλλάβουν κάποια στιγµή κατά τη διάρκεια κάποιας επαφής τους (Collins et al, 1983). Το 23% θα συλλάβει κατά τη διάρκεια των πρώτων 2 χρόνων, ενώ ένα επιπλέον 10% θα τα καταφέρει µετά από 2 χρόνια (Aafjes et al, 1978). Η χρησιµότητα των ποσοστών αυτών έγκειται στην αντικειµενική προσέγγιση και στην αξιολόγηση των αποτελεσµάτων κάθε προσπάθειας αντιµετώπισης της υπογονιµότητας για αυτά τα ζευγάρια. Με την ολοένα αυξανόµενη ηλικία των ζευγαριών εκείνων που αναζητούν βοήθεια για την αντιµετώπιση προβληµάτων σύλληψης και µάλλον υπογονιµότητας, κρίνεται µάλλον απαραίτητη η συµβουλευτική, έτσι ώστε οποιοσδήποτε έλεγχος να µην προηγηθεί µιας περιόδου

29 τουλάχιστον 12 µηνών προσπαθειών για σύλληψη. Έτσι ως υπογονιµότητα ορίζεται η µη δυνατότητα τεκνοποίησης ενός ζευγαριού µετά το πέρας 12 µηνών από την έναρξη της ελεύθερης σεξουαλικής τους ζωής. Και, όπως αναφέρθηκε και προηγουµένως, αν και µεταξύ των παραγόντων που ευθύνονται για την υπογονιµότητα ενός ζευγαριού, σήµερα, υπολογίζεται πως περίπου το 50% αφορά στον ανδρικό παράγοντα, τόσο ο γυναικείος παράγοντας όσο και ο αρσενικός µπορούν να συµβάλουν εξίσου στην πρόκληση της υπογονιµότητας ενός ζευγαριού. Η υπογονιµότητα µπορεί να χαρακτηριστεί είτε ως πρωτοπαθής, όταν ποτέ στο παρελθόν δεν έχει αναφερθεί εγκυµοσύνη στο ζευγάρι, είτε ως δευτεροπαθής, όταν έχει υπάρξει κατά το παρελθόν κάποια σύλληψη ανεξάρτητα όµως από το αποτέλεσµά της. Υπολογίζεται πως από πρωτοπαθή και δευτεροπαθή υπογονιµότητα πάσχουν περίπου το 67-71% και το 29-33% των ζευγαριών αντιστοίχως. Η ιδιοπαθής υπογονιµότητα είναι µία κατάσταση κατά την οποία τα ζευγάρια αδυνατούν να συλλάβουν σ ένα διάστηµα µεγαλύτερο των δύο ετών, χωρίς αυτό να µπορεί να αποδοθεί σε κάποια ανωµαλία των ωαγωγών, της ωορρηξίας, της ωχρινοποίησης, της τραχηλικής βλέννας, του σπέρµατος, της αλληλεπίδρασης του αρσενικού µε το θηλυκό γαµέτη ή της συνουσίας. Μεταξύ των κύριων παραγόντων που ευθύνονται για την υπογονιµότητα είναι οι χρωµατοσωµικές ανωµαλίες, τα χρωµατοσωµικά ελλείµµατα, οι µεταλλάξεις του γονιδίου CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) και άλλων γενετικών παραγόντων (π.χ. του υποδοχέα της FSH). Εξαιτίας του γεγονότος ότι ανοσολογικοί παράγοντες λειτουργούν σχεδόν σε κάθε στάδιο της ανθρώπινης αναπαραγωγικής διαδικασίας, είναι δυνατόν να προκαλέσουν τη νέκρωση των σπερµατοζωαρίων ή την αποβολή του εµβρύου. Πλήθος παραγόντων φαίνεται να προκαλεί υπογονιµότητα στο 10-30% των ζευγαριών. Ο σύγχρονος τρόπος ζωής, οι περιβαλλοντικές συνθήκες, συµπεριλαµβανοµένου του καπνίσµατος, µπορούν να επηρεάσουν τη βιωσιµότητα των γαµετών και του αναπτυσσόµενου εµβρύου, και ως εκ τούτου να οδηγήσουν σε υπογονιµότητα ή στείρωση. Αν και ο αριθµός των ζευγαριών που αναζητούν ιατρική βοήθεια στο πρόβληµα της υπογονιµότητας έχει αυξηθεί, η συχνότητα εµφάνισης του προβλήµατος στο γενικό πληθυσµό µάλλον δεν έχει αλλάξει. Στο παρελθόν έχουν διατυπωθεί αρκετές απόψεις για τη µείωση του αριθµού των σπερµατοζωαρίων πιθανώς λόγω περιβαλλοντικών παραγόντων, αλλά µάλλον τα αποτελέσµατα παραµένουν αντιφατικά. Έτσι πιο πιθανή θεωρείται η άποψη της αλλαγής στη συµπεριφορά των ατόµων και κυρίως στην καθυστερηµένη ηλικία έναρξης των προσπαθειών για την

30 απόκτηση παιδιού (Himmel et al, 1997); Templeton, 2000). Για το λόγο αυτό κρίνεται ως καίραιης σηµασίας για τον έλεγχο και του άνδρα και της γυναίκας προκειµένου να ερµηνευθεί η αιτιοπαθογένεια της υπογονιµότητας σε όλη της τη βάση. Γυναικεία υπογονιµότητα Οι γυναικείοι παράγοντες ενοχοποιούνται σε αναλογία 40-50% περίπου των περιπτώσεων και οι ανδρικοί παράγοντες σε 40% των περιπτώσεων, ενώ το υπόλοιπο ποσοστό σχετίζεται µε προβλήµατα γονιµότητας που αναφέρονται και στους δύο συζύγους. Στην αιτιολογία της γυναικείας υπογονιµότητας εµπλέκονται διάφοροι γενικοί παράγοντες, όπως η ηλικία, τα προηγούµενα βαριά νοσήµατα, η ανεπαρκής θρέψη και σπανιότερα το ψυχολογικό ή το συγκινησιακό stress. Τα καθοριστικά ωστόσο προβλήµατα αναφέρονται κυρίως στον ενδοκρινικό ή στο σαλπιγγικό παράγοντα και σε µικρότερο βαθµό στον τραχηλικό παράγοντα. Οι κύριοι παράγοντες που θεωρούνται υπεύθυνοι για το 50% της γυναικείας υπογονιµότητας είναι οι διαταραχές στην ωορρηξία και οι δοµικές ανωµαλίες των ωαγωγών. Τα ποσοστά ευθύνης των παραγόντων αυτών αναλύονται ως εξής: Η υπογονιµότητα µπορεί να οφείλεται σε ανεπάρκεια των ωοθηκών (ωοθηκική ανεπάρκεια) (27%), σε προβλήµατα των σαλπίγγων (σαλπιγγικός παράγοντας)(14%), σε ύπαρξη ενδοµητρίωσης (5%), ενώ σε 10-20% των περιπτώσεων τα αίτια σχετίζονται µε το σώµα της µήτρας, µε µεταβολικούς παράγοντες και µε ανοσολογικά προβλήµατα ή µε προβλήµατα που δεν µπορούν να διευκρινιστούν (National Collaborating Centre for Women's and Children's Health (2004). Ο ενδοκρινικός παράγοντας στην υπογονιµότητα αναφέρεται κυρίως στην ανωοθυλακιορρηξία, που οδηγεί σε ανωµαλίες του εµµηνορρυσιακού κύκλου (ολιγοµηνόρροια και αµηνόρροια, πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή) και σπανιότερα στο σύνδροµο του ωχρινοποιηµένου άρρηκτου ωοθυλακίου (σύνδροµο LUF). Ο σαλπιγγικός παράγοντας, που ενοχοποιείται στις 20-30% των περιπτώσεων γυναικείας στειρότητας αναφέρεται κυρίως σε συγγενείς ανωµαλίες, εγχειρητικά τραύµατα και ενδοπυελικές παθήσεις (φλεγµονές και ενδοµητρίωση) που συνδέονται ή προκαλούν βλάβη στη φυσιολογική λειτουργία των σαλπίγγων. Στους παράγοντες επίσης που θέτουν σε κίνδυνο την επιτυχή τεκνοποίηση ενός ζευγαριού είναι οι λοιµώξεις της πυέλου και τα σεξουαλικά µεταδιδόµενα νοσήµατα.