ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ Εργαστήριο Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

2 ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΤΟΧΟΙ: 1. Κατανόηση της σημασίας της εξέτασης 2. Διαφορές συστημάτων αιμοκαλλιέργειας 3. Μακροσκοπική εικόνα ανάπτυξης 4. Ταυτοποίηση

3 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΑΙΜΑΤΟΣ Η καλλιέργεια του αίματος γίνεται σε υγρό υλικό γιατί είναι μικρός ο αριθμός των μικροβίων στο δείγμα, συνήθως κάτω του ενός ζωντανού μικροβίου ανά ml (<1 cfu/ml) στις διάφορες μικροβιαιμικές ή σηψαιμικές νόσους. Ο αριθμός αυτός είναι μεγαλύτερος στις μικροβιαιμίες των παιδιών. Το αίμα εμβολιάζεται αμέσως και επί τόπου στο θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας του μετά τη λήψη του. Το θρεπτικό υλικό είναι πάντα ένας ζωμός που εκτός από τις θρεπτικές ουσίες περιέχει αντιπηκτική ουσία, ουσίες σταθεροποιητικές της ωσμωτικής πίεσης και εξουδετερωτικές των αντιβιοτικών αν ο άρρωστος παίρνει αντιβιοτικά. Αυτά φέρονται σε φιαλίδια έτοιμα στο εμπόριο ή παρασκευάζονται στο Εργαστήριο.

4

5 ΤΡΟΠΟΣ ΛΗΨΗΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Πριν από την απολύμανση του δέρματος, επιλέγεται με ψηλάφηση η φλέβα που θα παρακεντηθεί. Ο ιατρός ή ο νοσηλευτής φορά αποστειρωμένα γάντια μιας χρήσης. Η περιοχή του δέρματος καθαρίζεται με 70% αλκοόλης. Η περιοχή του δέρματος καθαρίζεται με βάμμα ιωδίου 2% ή ιωδιούχο ποβιδιόνη. Το ιώδιο αφήνεται να στεγνώσει για τουλάχιστον 1min (ΠΡΟΣΟΧΗ! ο χρόνος παραμονής του ιωδίου είναι σημαντικός). Γίνεται η αιμοληψία με τη σύριγγα και τη βελόνη.

6 ΤΡΟΠΟΣ ΛΗΨΗΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Σε περίπτωση που δε βρεθεί φλέβα και χρειαστεί δεύτερη παρακέντηση, τότε πρέπει οπωσδήποτε να χρησιμοποιηθεί καινούργια σύριγγα και βελόνη και να γίνει από την αρχή η διαδικασία απολύμανσης της περιοχής του δέρματος. Το πώμα της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας απολυμαίνεται με 70% αλκοόλη, αλλάζεται η βελόνη της αιμοληψίας με μία καινούργια και το αίμα της σύριγγας εμβολιάζεται στη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας. Το δέρμα του ασθενούς καθαρίζεται με αλκοόλη. Η περιοχή δεν πρέπει να επιδένεται ή να καλύπτεται με συγκολλητική ταινία, γιατί μπορούν να προκληθούν εγκαύματα από το βάμμα ιωδίου.

7 ΤΡΟΠΟΣ ΛΗΨΗΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Η φιάλη της αιμοκαλλιέργειας ανακινείται ελαφρά για να μην πήξει το αίμα. Επάνω στη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας αναγράφονται καθαρά: τα στοιχεία του ασθενούς, η κλινική στην οποία νοσηλεύεται, η ημερομηνία κι η ώρα λήψης του αίματος, όπως επίσης, ολογράφως, το όνομα του ιατρού που παρακολουθεί τον ασθενή.

8

9 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 1. ΚΛΑΣΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ 2. ΣΥΣΤΗΜΑ ISOLATOR Η ΣΥΣΤΗΜΑ ΛΥΣΕΩΣ ΚΑΙ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΕΩΣ 3. ΣΥΣΤΗΜΑ BACTER ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ 4. VITAL σύστημα της Merieux 5. ΣΥΣΤΗΜΑ SIGNAL

10 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 1. ΚΛΑΣΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Μετά την αιμοληψία το αίμα μεταγγίζεται σε ένα ή δύο φιαλίδια με δύο διαφορετικούς ζωμούς, το ένα για την ανάπτυξη των αερόβιων (ΒΗΙ ζωμός) και το άλλο για προαγωγή αναπτύξεως αναερόβιων (Columbia ή θειογλυκολικός ζωμός). Προκειμένου για βραδείας αναπτύξεως μικρόβια το αίμα μπολιάζεται σε φιαλίδιο με διφασικό υλικό (ζωμός και άγαρ κατά Castaneda). Στο υλικό αυτό το μικρόβιο αναπτύσσεται διάχυτα στο ζωμό και αναπτύσσει αποικίες στο άγαρ. Νεώτερα συστήματα διαμορφώθηκαν με στόχο την αύξηση της ευαισθησίας της αιμοκαλλιέργειας δηλαδή περισσότερες θετικές και την ταχύτητα του αποτελέσματος.

11

12 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 2. ΣΥΣΤΗΜΑ ISOLATOR Η ΣΥΣΤΗΜΑ ΛΥΣΕΩΣ ΚΑΙ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΕΩΣ Το δείγμα αίματος λαμβάνεται απευθείας σε σωληνάριο στο οποίο υπάρχει όχι ζωμός αλλά μίγμα ουσιών που θα προκαλέσουν λύση όλων των κυττάρων του αίματος όπως οι ουσίες SPS, EDTA, σαπωνίνη κ.ά. Ανακατεύεται το αίμα με αναποδογυρίσματα ώστε να γίνει η λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των άλλων κυττάρων. Στο εργαστήριο φυγοκεντρείται σε γωνιακή φυγόκεντρο για 30 min σε 3000 g.

13 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ (συνέχεια) To ίζημα περιέχει τα μη λυθέντα στοιχεία μεταξύ των οποίων είναι και τα μικρόβια. Αυτό εμβολιάζεται πια στην επιφάνεια δύο τρυβλίων με αιματούχο άγαρ ή άλλα εκλεκτικά υλικά. Με το σύστημα αυτό βγαίνουν θετικές οι αιμοκαλλιέργειες και με λίγα μικρόβια κάτω των 3 cfu/ml αίματος. Η απομόνωση και η ταυτοποίηση του μικροβίου γίνεται από το υλικό της πρώτο καλλιέργειας.

14

15 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 3. ΣΥΣΤΗΜΑ BACTER ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Aναγνωρίζεται ταχύτατα η έναρξη αναπτύξεως μικροβίων στο ζωμό της αιμοκαλλιέργειας με την ανίχνευση παραγωγής CO2 από το μεταβολισμό τους. Η ανακαλλιέργεια γίνεται μόνο από τις φιάλες στις οποίες εμφανίσθηκε η παραγωγή CO2. Κατάλληλο σύστημα για εργαστήρια με μεγάλο αριθμό αιμοκαλλιεργειών περί τις 100 ημερησίως. Το σύστημα προσφέρει έτοιμα τα φιαλίδια με τους ζωμούς και το μηχάνημα όπου θα τοποθετηθούν τα πολυάριθμα φιαλίδια και θα επωασθούν. Υπάρχουν φιαλίδια με ζωμούς χωριστά για την ανάπτυξη των αναερόβιων και των μυκοβακτηριδίων.

16 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ (συνέχεια) Στα παλαιά BACTEC η ανίχνευση του CO2 γινόταν ραδιομετρικά. Ο ζωμός περιείχε ανθρακούχο ουσία σημασμένη με ραδιενεργό άνθρακα. To CO2 που παράγεται από το μεταβολισμό της ουσίας αυτής φέρει το σήμα CO2 και αναγνωρίζεται με εξέταση στο ραδιόμετρο. Μειονέκτημα: ραδιενεργά κατάλοιπα Το νεότερο BACTEC χρησιμοποιεί υπέρυθρες ακτίνες για την ανίχνευση παρουσίας CO2 στον αέρα της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας. Τόσο το CO2 όσο και το αέριο CO2 αναγνωρίζονται με εξέταση δείγματος που παίρνεται από τη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας. Υπάρχουν πιθανότητες επιμολύνσεων

17

18 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 4. VITAL σύστημα της Merieux Στο σύστημα αυτό προστίθεται ουσία φθορίζουσα στον θρεπτικό ζωμό. Καθώς τα μικρόβια αναπτύσσονται, το CO2 και τα οξέα που παράγονται από το μεταβολισμό του, αδρανοποιούν τη φθορίζουσα ουσία. Η μείωση ή εξαφάνιση του φθορισμού αναγνωρίζεται κοιτάζοντας τις φιάλες αιμοκαλλιέργειας με λάμπα υπεριωδών ακτινών.

19 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 5. ΣΥΣΤΗΜΑ SIGNAL Στη φιάλη αιμοκαλλιέργειας, μετά τη λήψη του αίματος, προσαρμόζεται ένας «σημαντήρας» (signal) αναπτύξεως. Είναι μια κατασκευή που εφαρμόζεται στο στόμιο της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας. Αποτελείται από ένα κλειστό ευρύστομο σωλήνα με βιδωτό πώμα που το κάτω μέρος του συνδέεται με μια βελόνη. Η βελόνη του ανιχνευτή βυθίζεται στο ζωμό και το φιαλίδιο επωάζεται σε κλίβανο με ανακινητήρα. Σε περίπτωση που αρχίζει ανάπτυξη μικροβίων τα αέρια που παράγονται κατά τον μεταβολισμό των αυξάνουν την πίεση στη φιάλη και ο ζωμός μέσα από τη βελόνη ανεβαίνει στο σωλήνα του Signal.

20 ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ (συνέχεια) Η άνοδος αυτή γίνεται ορατή. Από το ζωμό αυτό που μπήκε στο σωλήνα της συσκευής γίνονται οι ανακαλλιέργειες απομονώσεως και ταυτοποιήσεως. Το σύστημα (035^.) προσφέρεται έτοιμο μαζί με τις φιάλες αιμοκαλλιέργειας που περιέχουν τον ειδικά πολυεμπλουτισμένο ζωμό.

21

22 ΧΡΟΝΟΣ ΛΗΨΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Σε περιπτώσεις παροδικής βακτηριαιμίας (π.χ. από ένα απόστημα), το αίμα πρέπει να λαμβάνεται ακριβώς πριν από την αναμενόμενη εμφάνιση του πυρετού. Αν ο ασθενής αναφέρει στο ιστορικό του πυρετικά κύματα που εμφανίζονται σε κανονικά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της μέρας, τότε το αίμα πρέπει να λαμβάνεται ακριβώς πριν από την αναμενόμενη εμφάνιση του πυρετικού κύματος. Σε βακτηριακή ενδοκαρδίτιδα και άλλες ενδαγγειακές λοιμώξεις, η συνεχής βακτηριαιμία δεν επιβάλλει κάποιο συγκεκριμένο χρόνο λήψης του αίματος.

23 ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Η πιθανότητα απομόνωσης ενός παθογόνου μικροοργανισμού στο αίμα αυξάνεται αν αυξηθεί η ποσότητα του αίματος που καλλιεργείται. Το αίμα πρέπει να αραιώνεται αρκετά ώστε να εξουδετερώνονται επαρκώς τόσο οι μικροβιοκτόνοι παράγοντες του ορού όσο και τα αντιμικροβιακά χημειοθεραπευτικά που πιθανόν υπάρχουν σε αυτό. Η αναλογία 1:10 (αίμα : ζωμός καλλιέργειας) είναι η κατάλληλη αραίωση που εξασφαλίζει τις παραπάνω προϋποθέσεις.

24 Αριθμός αιμοκαλλιεργειών Οταν η κλινική κατάσταση του ασθενούς επιβάλλει την άμεση έναρξη θεραπευτικής αγωγής, τότε - πριν από τη χορήγηση οποιασδήποτε αντιβιοτικής αγωγής: εφάπαξ συνολική λήψη 30 ml αίματος, που λαμβάνονται ανά 10 ml με 3 διαφορετικές φλεβοκεντήσεις από 3 διαφορετικές φλέβες με διαφορετικές σύριγγες και βελόνες και που εμβολιάζονται σε 3 διαφορετικές φιάλες αιμοκάλλιέργειας. Αν η θεραπεία του ασθενούς μπορεί να καθυστερήσει, τότε: λαμβάνονται 3 αιμοκαλλιέργειες σε μεσοδιαστήματα μίσης ως μιας ώρας και μετά από παρακέντηση διαφορετικών φλεβών (π.χ. αριστερό χέρι,δεξιό χέρι) και άλλες 3, με τον ίδιο τρόπο, την επόμενη μέρα.

25 Αριθμός αιμοκαλλιεργειών Σε περιπτώσεις "πυρετού άγνωστης αιτιολογίας : 4 συνολικές αιμοκαλλιέργειες είναι κατά κανόνα αρκετές για να απομονωθεί ο λοιμώδης αιτιολογικός παράγοντας. Οι αιμοκαλλιέργειες λαμβάνονται ανά δύο σε διάστημα δύο ημερών. Από τα παιδιά συνήθως λαμβάνονται 5 ml αίματος/ αιμοκαλλιέργεια, ενώ από τα νεογνά και τα πρόωρα 1-2 ml/ αιμοκαλλιεργεία. οι παιδικές σηψαιμίες κατά κανόνα συνοδεύονται από υψηλή βακτηριαιμία ( > 10 CFU βακτηρίων/ml αίματος).

26 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΦΙΑΛΩΝ ΤΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Οι φιάλες αιμοκαλλιέργειας επωάζονται, στους 35 C, για 7 ημέρες, ελέγχονται καθημερινά για την παρουσία μακροσκοπικά ορατών σημείων ανάπτυξης (αιμόλυση, θόλωση, παραγωγή αερίου, σχηματισμός υμενίου ή θρόμβου). Απαιτητικά παθογόνα μικρόβια, η αιμοκαλλιέργεια διαφοροποιείται ανάλογα με τις συνθήκες ανάπτυξης των μικροβίων.

27 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΦΙΑΛΩΝ ΤΗΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Ετσι: οι αιμοκαλλιέργειες για Brucella ελέγχονται για 28 μέρες οι καλλιέργειες για Leptospira ελέγχονται για 4-6 εβδομάδες σε κλίβανο με θερμοκρασία 28-30οC οι καλλιέργειες για Listeria παρακολουθούνται για περισσότερες από 7 μέρες και μετά από επώαση των φιαλών στους 35-37οC και άλλων φιαλών στους 4οC.

28 ΘΕΤΙΚΕΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Από το ζωμό που έχει θολώσει ή από την ανάπτυξη στη στερεή φάση του υλικού γίνονται παρασκευάσματα και χρωματίζονται με τη χρώση Gram. Xρώση Gram: η πρώτη εργασία που γίνεται σε μια θετική αιμοκαλλιέργεια και δίνει πολύτιμες πληροφορίες, που επιτρέπουν στον κλινικό ιατρό να αρχίσει αμέσως τη θεραπεία της σηψαιμίας, πριν τα αποτελέσματα της καλλιέργειας είναι διαθέσιμα. Από το ζωμό ή από την ανάπτυξη στη στερεή φάση του υλικού γίνονται ανακαλλιέργεια σε στερεά θρεπτικά υλικά (αιματούχο, σοκολατόχρωμο, MacCnkey άγαρ, Chapman και αναερόβιο αιματούχο άγαρ) για να διαπιστωθεί με βεβαιότητα ότι ένα και μόνο είδος βακτηρίου ήταν το αίτιο της σηψαιμίας.

29 ΘΕΤΙΚΕΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Η συχνότητα της πολυμικροβιακής βακτηριαιμίας ανέρχεται σε 3-20% του αριθμού των θετικών αιμοκαλλιεργειών. Τυφλή ανακαλλιέργεια σε κατάλληλα θρεπτικά υλικά για αερόβια μικρόβια, επιβάλλεται να γίνει μετά από 48 ώρες επώασης ακόμα και στην περίπτωση που δεν υπάρχουν ενδείξεις μικροβιακής ανάπτυξης. Η διαδικασία αυτή θεωρείται απαραίτητη γιατί πολλά μικρόβια, όπως οι αιμόφιλοι και οι ναϊσσέριες, δεν προκαλούν μακροσκοπικά ευρήματα θετικότητας, ούτε αναπτύσσονται στα διφασικά υλικά αιμοκαλλιεργειών.

30 ΘΕΤΙΚΕΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Ειδικότερα, επί υποψίας πνευμονιοκοκκικής μικροβιαιμίας επιβάλλεται να γίνει ανακαλλιέργεια πριν τις 18 ώρες επώασης, γιατί το μικρόβιο μπορεί να αυτολυθεί. Δεύτερη τυφλή ανακαλλιέργεια θεωρείται περιττή εκτός από ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. ενδοκαρδίτιδα (7η ημέρα). Προκαταρκτικές δοκιμασίες μπορούν και πρέπει να γίνουν αμέσως με τις αποικίες ή τον τάπητα που έχει αναπτυχθεί στη στερεή φάση του υλικού. Το είδος των δοκιμασιών θα εξαρτηθεί από το αποτέλεσμα της χρώσης Gram.

31 ΘΕΤΙΚΕΣ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ αν πρόκειται για Gram θετικό κόκκο: παραγωγή καταλάσης (+) σταφυλόκοκκος (- ) στρεπτόκοκκος δοκιμασία της πηκτάσης (+) S.aureus (- ) S.epidermidis αν πρόκειται για Gram αρνητικό βακτηρίδιο: δοκιμασία της οξειδάσης (+) κάποιο είδος ψευδομονάδας (- )κάποιο είδος της οικογένειας των εντεροβακτηριοειδών Τυποποίηση και ευαισθησία του συγκεκριμένου στελέχους στα αντιβιοτικά. Πιθανή τροποποίηση της αντιμικροβιακής θεραπείας.

32 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ STAPHYLOCOCCUS AUREUS i. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Ο S. aureus είναι Gram θετικός κόκκος που διατάσσεται σε μικρές ομάδες (τσαμπιά σταφυλιού) ή σε σειρά τεσσάρων το πολύ κόκκων

33 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ii. ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Αιματούχο άγαρ: αποικίες σχετικά μεγάλες και περιβάλλονται από ζώνη αιμόλυσης. MacConkey (Νο3): αποικίες με ελαφρό ροζ χρώμα από τη διάσπαση της λακτόζης. Αλατούχο άγαρ Chapman: κίτρινες αποικίες, ενώ παρατηρείται αλλαγή του χρώματος του υποστρώματος (από φούξια κίτρινο). Αυτό και μόνο αρκεί ίσως για ο χαρακτηρισμό ενός μικροβίου ως Staphylococcus aureus, διότι μόνο αυτό το είδος από τους σταφυλόκοκκους διασπά την μαννιτόλη και προκαλεί την αλλαγή του χρώματος.

34 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ iii. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ Δοκιμή παραγωγής καταλάσης ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Είναι η πρώτη κατατοπιστική διαχωριστική δοκιμή προκειμένου για Gram θετικούς κόκκους. Είναι θετική για όλους τους Σταφυλόκοκκους.

35 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Δοκιμή παραγωγής κοαγκουλάσης Η κοαγκουλάση είναι μια εξωκυτταρική πρωτείνη, προκαλεί πήξη του πλάσματος του κουνελιού και του ανθρώπου, χωρίς την παρουσία ασβεστίου (αντίθετα με την προθρομβίνη). Γίνεται με δύο μεθόδους, μια ταχεία πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα και μια βραδεία στο σωληνάριο. Με την πρώτη ανιχνεύουμε τη συνδεδεμένη κοαγκουλάση ενώ με τη δεύτερη την ελεύθερη κοαγκουλάση. Η ελεύθερη εκκρίνεται από το σταφυλόκοκκο που αναπτύσσεται σε ζωμό, ενώ η συνδεδεμένη βρίσκεται πάνω στο μικροβιακό κύτταρο σταφυλοκόκκων που αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υλικό και λέγεται παράγων αδροσυγκολλήσεως.

36 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ α) Δοκιμή πάνω στην πλάκα ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα βάζουμε μια ρανίδα νερό και σ αυτήν ομοιογενοποιούμε 1-2 αποικίες του σταφυλόκοκκου. Στο πυκνότατο αυτό εναιώρημα μεταφέρουμε με ένα σύρμα ελάχιστη ποσότητα από πλάσμα ανθρώπου ή κουνελιού και ανακατεύουμε. Αν ο σταφυλόκοκκος παράγει κοαγκουλάση παράγοντα αδροσυγκολλήσεως στο εναιώρημα θα σχηματισθούν πήγματα μικρά και μεγάλα καθώς ανακατεύουμε ακόμη με το σύρμα.

37 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ β) Δοκιμή μέσα σε σωληνάριο ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Σε σωληνάριο βάζουμε 0,5 ml ζωμό (χωρίς γλυκόζη) και κάνουμε εναιώρημα του σταφυλόκοκκου μέσα σ' αυτό ή ακόμη καλύτερα κάνουμε καλλιέργεια του σταφυλόκοκκου σε ζωμό και μετά από 24ωρο μεταφέρουμε 0,1ml από τo καλλιέργημα σε σωληνάριο. Προσθέτουμε 0,5 ml αραιωμένο πλάσμα με ζωμό σε αναλογία 1:5. Ανακατεύουμε και βάζουμε το στατό σε υδατόλουτρο ή κλίβανο 37 C. Στο ίδιο στατό βάζουμε και ένα σωληνάριο με θετικό μάρτυρα (σταφυλόκοκκο γνωστό κοαγκουλάση - θετικό) και ένα με αρνητικό μάρτυρα.

38 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ (συνέχεια) ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Αφήνουμε τα σωληνάρια για επώαση 30 min οπότε κάνουμε την πρώτη ανάγνωση. Αν δεν έχει πήξει το υγρό το αφήνουμε για 4 ώρες συνολικά, και εφ' όσον ακόμη είναι αρνητική η αντίδραση αφήνουμε το στατό στο πάγκο, στη θερμοκρασία του δωματίου, μέχρι το άλλο πρωινό. Θετική είναι η αντίδραση όταν παρατηρηθεί πήξη ομοιογενής σαν από ζελατίνη. Το πήγμα μπορεί να είναι μικρότερο ή αν το δούμε την άλλη ημέρα να είναι απλώς ένα κομμάτι ινικής κατακαθισμένο στον πυθμένα του σωληναρίου. Αν η δοκιμή βγει σαφώς θετική το μικρόβιο χαρακτηρίζεται σαν S. aureus και δεν χρειάζεται να γίνουν άλλες εξετάσεις.

39 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ γ) Δοκιμή παραγωγής θερμοανθεκτικής DN- άσης ή l- DN- άσης Το ένζυμο αυτό είναι θερμοανθεκτικό και δεν αδρανοποιείται με το βρασμό για 15 min. Παράγεται μόνο από το S. aureus. Εκτέλεση Ο υπό εξέταση σταφυλόκκοκος καλλιεργείται σε ζωμό και επωάζεται στους 37ο C. Την άλλη ημέρα το καλλιέργημα τοποθετείται σε βραστό νερό για 15 min. Ταυτόχρονα καλλιεργείται και ένας σταφυλόκοκκος κουαγκουλάση θετικός γνωστός ότι παράγει την t- DN- άση για να χρησιμεύσει σαν θετικός μάρτυρας. Στην επιφάνεια ενός τρυβλίου με το DN- άση υλικό ανοίγονται 3 τρύπες διαμέτρου 3 mm η καθεμιά.

40 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Με πιπέττα Pasteur γεμίζουμε την 1η τρύπα με το βρασμένο καλλιέργημα του εξεταζόμενου σταφυλόκοκκου, τη 2η τρύπα γεμίζουμε με το καλλιέργημα του γνωστού κοαγκουλάση θετικού σταφυλόκοκκου και την 3η τρύπα με ένα άλλο μικρόβιο ή με σταφυλόκοκκο γνωστό που δεν παράγει την t- DN- άση. Μεταφέρουμε το τρυβλίο στον κλίβανο των 37 C, το αφήνουμε για 4 ώρες και διαβάζουμε. Αν ο σταφυλόκοκκος παράγει t- DN- άση θα εμφανισθεί μεταβολή της χροιάς του υλικού γύρω από την τρύπα όπου μπολιάσθηκε αυτό. Ο θετικός μάρτυρας πρέπει να παρουσιάσει τη μεταβολή της χροιάς ενώ ο αρνητικός δεν πρέπει να παρουσιάσει καμία μεταβολή.

41 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Δοκιμή ζυμώσεως / οξειδώσεως ή F/O δοκιμή Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος ζυμώνει και οξειδώνει, δηλαδή διασπά αναεροβίως και αεροβίως, τη γλυκόζη και τη μαννιτόλη. Κανένας άλλος από τους άλλους σταφυλόκοκκους (S. epidermidis ή S. saprophyfcus) ή κανένας μικρόκοκκος δεν δίνει την αντίδραση αυτή.

42 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ Εκτελεση ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Για την εκτέλεση της δοκιμής μπολιάζονται αποικίες από το 24ωρο καλλιέργημα κάθετα με νύξη σε δύο σωληνάρια. Στο ένα από τα δύο σωληνάρια προσθέτουμε ποσότητα αποστειρωμένης παραφίνης (δοκιμή ζυμώσεως = F). Επωάζονται τα σωληνάρια για 1-3 ημέρες στους 37 C. Η οξείδωση του σακχάρου (Ο), ήτοι παραγωγή οξέος από το σάκχαρο, θα διαβασθεί στο χωρίς παραφίνη υλικό (αλλαγή χροιάς του υλικού). Ζύμωση (F) του σακχάρου θα διαβασθεί στο με παραφίνη σωληνάριο. Αλλαγή χροιάς θα εμφανισθεί και στα δύο σωληνάρια

43 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ BRUCELLA MELITENSIS & BR. ABORTUS Για την διάγνωση της βρουκελλώσεως, η αιμοκαλλιέργεια είναι η πιο αξιολογήσιμη εξέταση. Οταν βγει θετική θέτει τη διάγνωση της νόσου χωρίς καμία αμφιβολία. Επειδή η μικροβιαιμία δεν είναι συνεχής, συνιστάται να λαμβάνονται τουλάχιστον 3 δείγματα αίματος σε 3 συνεχείς ημέρες. Το θρεπτικό υλικό της αιμοκαλλιέργειας θα πρέπει να είναι brucella ή Tryp case soy broth. Προτιμότερα είναι τα έτοιμα φιαλίδια με διφασικό υλικό για να αποφύγουμε τα πολλά ανοίγματα της φιάλης για τις ανακαλλιέργειες και γιατί στα έτοιμα αυτά φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών υπάρχει λίγο κενό και λίγο CO2.

44 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Το κενό βοηθά στη λήψη του αίματος κατ ευθείαν μέσα στο φιαλίδιο με μια συσκευή λήψεως και το CO2 βοηθάς στην ανάπτυξη των Βρουκελλών και ιδιαίτερα της B.abortus. Οι φιάλες πρέπει να επωάζονται σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2 στους 37ο C για 4 τουλάχιστον εβδομάδες. Την τεταρτη μέρα της επώασης γίνονται τυφλές ανακαλλιέργειες και σε περιπτώση αρνητικού αποτελέσματος οι ανακαλλιέργειες επαναλαμβάνονται κάθε 4 μέρες. Οι ανακαλλιέργειες γίνονται σε τρυπτικάση- σόγια άγαρ και βρουκέλλα άγαρ, τα οποία επωάζονται σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2, στους 37ο C για 10 ημέρες.

45 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ i. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Οι Βρουκέλλες είναι Gram(- ) αρνητικά, μικρά, ωοειδή με αποστρογγυλεμένα άκρα βακτηρίδια που διατάσσονται μοναχικά και μοιάζουν σαν κόκκοι (κοκκοβακτηρίδια) ή κατά ζεύγη. ii. ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Στα ειδικά θρεπτικά υλικά που αναπτύσσονται (tryp case soya agar (TSA), Brucella αγαρ) παράγουν αποικίες περιγραμμένες, λίγο φουσκωτές, άχρωμες και με επιφάνεια λεία και γυαλιστερή.

46 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ iii. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ Το μικρόβιο θα δώσει θετικές τις δοκιμές οξειδάσης (όχι πάντοτε), αναγωγής νιτρικών, παραγωγής ουρίας, δεν θα παράγει ούτε οξύ ούτε αέριο από τη γλυκόζη και θα δώσει αρνητικές όλες τις άλλες δοκιμές. Ισως να δώσει θετική τη δοκιμή υδρόθειου.

47

48

49

50

51