ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ Εργαστήριο Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

2 ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ - ΕΝΥ ΣΤΟΧΟΙ: 1. Κατανόηση της σημασίας της εξέτασης 2. Πρωτόκολλα επεξεργασίας και συντήρησης 3. Σημασία μικροσκοπικής εξέτασης

3 ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ - ΕΝΥ

4 ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ - ΕΝΥ Χαρακτηριστικά Το ΕΝΥ παράγεται στις κοιλίες του εγκεφάλου από το χοριοειδές πλέγμα, το οποίο σχηματίζουν τα τριχοειδή αγγεία του αίματος Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο όγκος του είναι σταθερός, περίπου 150 ml Αχρωμο, διαυγές και στείρο βακτηρίων Περιέχει όλα τα στοιχεία του αίματος Προστατεύει το ΚΝΣ

5

6 ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ - ΕΝΥ Η λειτουργία του ΕΝΥ Παρέχει προστασία στους υποκείμενους ιστούς Ρυθμίζει την ενδοκρανιακή πίεση Κυκλοφορεί θρεπτικά συστατικά στο ΚΝΣ Αποβάλλει άχρηστα προϊόντα από το ΚΝΣ Περιέχει αντιμικροβιακές ουσίες που αναστέλλουν την ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό μικροοργανισμών

7 Συμπτώματα εγκεφαλίτιδας 1. Πυρετός 2. Επίμονος πονοκέφαλος 3. Ευαισθησία στο φως 4. Δυσκαμψία αυχένα και πλάτης 5. Αναγούλες και πυρετοί 6. Σύγχυση και ταραχή 7. Υπερβολική υπνηλία 8. Αδυναμία 9. Δυσκολία βάδισης 10. Δυσκολία ομιλίας 11. Λιποθυμία 12. Σπασμοί

8 Κλινικό γιατρο ΛΗΨΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΝΥ Σχολαστική απολύμανση του δέρματος με betadine ή οινόπνευμα και μετά με ιώδιο Οσφυονωτιαία παρακέντηση μεταξύ 3ου και 4ου οσφυϊκού σπονδύλου (2-4ml) ανακατανέμεται σε 3-4 αποστειρωμένα σωληνάρια wasserman M. tuberculosis (περίπου 10ml)

9 Λαμβάνονται τρία δείγματα: 1. Kυτταρολογική εξέταση 2. Kαλλιέργεια 3. Bιοχημικοί προσδιορισμοί

10

11 ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΝΥ Αμέσως και ιδιοχείρως στο εργαστήριο Η εξέταση του ΕΝΥ αρχίζει αμέσως και πρέπει να ολοκληρώνεται σε 30 Τα αποτελέσματα δίνονται τηλεφωνικά στο θεράποντα ιατρο

12 ΦΥΛΑΞΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΝΥ ο C (κλίβανο) και όχι στο ψυγείο για να μην αυτολυθούν οι Ναϊσσέριες Υπόλοιπο ή άλλο άθικτο δείγμα φυλάσσεται μέχρι την επόμενη στον κλίβανο, για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των τυχόν ολιγάριθμων μικροβίων Αρνητική καλλιέργεια: εκ νέου καλλιέργεια από το επωασθέν δείγμα

13 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Απαραίτητη και αναντικατάστατη εξέταση, και προηγείται ή γίνεται ταυτόχρονα με την καλλιέργεια Φυγοκέντρηση δείγματος σε 3000rpm περίπου για 8-10min Μεταφορά υπερκείμενου σε άλλο σωληνάριο Τοποθετούμε σταγόνα από το ίζημα σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφού στεγνώσει χρωματίζουμε κατά Gram Ελέγχουμε την ύπαρξη βακτηρίων εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια

14 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Μικρή ποσότητα ΕΝΥ: μπορεί να μην δημιουργηθεί ίζημα κατά την φυγοκέντρηση Τότε τοποθετούμε μια σταγόνα του ΕΝΥ σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφού στεγνώσει προσθέτουμε μια δεύτερη σταγόνα δημιουργώντας έτσι ένα επίχρισμα σε στιβάδες

15 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Ευαισθησία της χρώσης Gram μπορεί να αυξηθεί με την κυτταροφυγοκέντρηση Κυτταροφυγοκέντρηση: τεχνική με την οποία συγκεντρώνονται τόσο τα κύτταρα όσο και τα μικρόβια σε μια πολύ μικρή περιοχή αντικειμενοφόρου πλάκας, έτοιμης για χρώση και μικροσκόπηση (συσκευές όπως Cytospin 2 ή Aerospray Gram Slide stainer/cytocentrifuge)

16

17 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Μικρόβια που αναζητούνται: Διπλόκοκκοι Gram αρνητικοί, ενδοκυττάριοι ή εξωκυττάριοι (Neisseria meningi,dis) Διπλόκοκκοι λογχοειδείς ή μη, ή κόκκοι σε κοντές αλυσίδες, Gram θετικοί (Streptococcus pneumoniae) Gram αρνητικά βακτηρίδια, λεπτά, με έντονο πολυμορφισμό (κόκκοι κοντοί και μακριά βακτηρίδια) (Haemophilus influenza) Μύκητες (σε ανοσοκατασταλμένα άτομα)

18 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Διπλόκοκκοι Gram αρνητικοί, ενδοκυττάριοι ή εξωκυττάριοι Μηνιγγιτιδόκοκκο: λίγοι κόκκοι εξωκυττάριοι, δηλαδή ένας ή δύο διπλόκοκκοι, αλλά δεν αποκλείεται να μην βρεθούν καθόλου κόκκοι, παρόλο που ο άρρωστος πάσχει από μηνιγγιτιδοκοκκική μηνιγγίτιδα ΠΡΟΣΟΧΗ: δεν χαρακτηρίζεται το μικρόβιο σαν Μηνιγγιτιδόκοκκος, παρά μόνο όταν αναπτυχθεί στην καλλιέργεια και δοκιμασθεί με βιοχημικές και ορολογικές δοκιμασίες

19 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Διπλόκοκκοι Gram αρνητικοί, ενδοκυττάριοι ή εξωκυττάριοι Περιπτώσεις: άτομα που έχουν υποβληθεί σε χειρουργική επέμβαση στο ΚΝΣ, παιδιά με υδροκέφαλο που υποβλήθηκαν σε παροχέτευση, παιδιά που υποβάλλονται σε συχνές οσφυονωτιαίες παρακεντήσεις παρατηρήθηκαν μολύνσεις των μηνίγγων με μικρόβια της ομάδας των Ανιτροβακτηριδίων, όπως είναι η Mima polymorpha

20 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Διπλόκοκκοι λογχοειδείς ή μη, ή κόκκοι σε κοντές αλυσίδες, Gram θετικοί Πνευμονιόκκοκο: Συνήθως βρίσκονται πολλοί σε κάθε οπτικό πεδίο Δίνεται αμέσως τηλεφωνική απάντηση για την παρουσία Πνευμονιόκοκκου Επόμενη ημέρα ταυτοποιείται το μικρόβιο από την καλλιέργεια που είναι πάντοτε θετική, και Διαχωρίζεται από άλλους Στρεπτόκοκκους

21

22 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΝΥ Gram αρνητικά βακτηρίδια, λεπτά, με έντονο πολυμορφισμό (κόκκοι κοντοί και μακριά βακτηρίδια) Αιμόφιλο: Συνήθως υπάρχουν αρκετά σε κάθε οπτικό πεδίο Η καλλιέργεια, που συνήθως βγαίνει θετική, δίνει τη δυνατότητα να ταυτοποιηθεί Αμέσως μετά δίνεται τηλεφωνική απάντηση για παρουσία Gram αρνητικών βακτηριδίων, για να στραφεί η χημειοθεραπεία προς την ομάδα αυτή των μικροβίων

23

24 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Μερικές σταγόνες του ιζήματος καλλιεργούνται στα ακόλουθα θρεπτικά υλικά: Αιματούχο άγαρ (όλοι οι μικροοργανισμοί) MacConkey 3 άγαρ (όλα τα Gram(- ) βακτήρια) Chapman άγαρ (κόκκοι και ιδιαίτερα ο Staphylococcus aureus) Σοκολατόχρωμο άγαρ Sabouraud άγαρ (μόνο μύκητες) Lewinthal άγαρ και ζωμός (αιμόφιλοι και μηνιγγιτιδόκοκκοι) Θειογλυκολικός ζωμός ή TSB ή ζωμό BHIB Fildes άγαρ ζωμός (αιμόφιλοι) Ειδικό αιματούχο άγαρ, όπως Columbia, Brucella (αναερόβια μικρόβια)

25 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Επωάζονται στους 37 ο C, σε ατμόσφαιρα CO2 5-10% για 24 ώρες, εκτός από σοκολατόχρωμο άγαρ το οποίο επωάζεται παρουσία CO2 και ειδικό αιματούχο άγαρ το οποίο επωάζεται αναερόβια Μετά την 24h επώαση ανακαλλιεργείται το δείγμα, στο οποίο προστέθηκε ζωμός στα ίδια θρεπτικά υλικα

26 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Ηaemophilus influenzae: στο υλικό Levinthal και στο fildes παράγει αποικίες με έντονο ιριδισμο Δοκιμές ταυτοποιήσεως χωρίς να περιμένουμε την απομόνωση του με ανακαλλιέργεια

27 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Δοκιμή δορυφορισμού Στην επιφάνεια τρυβλίου με σοκολατόχρωμο άγαρ ή Columbia αιματούχο άγαρ, μπολιάζουμε ομοιόμορφα τον υπό εξέταση πιθανόν Aιμόφιλο Στην κεντρική περιοχή της καλλιεργημένης επιφάνειας έναν σταφυλόκοκκο, κατά προτίμηση S. aureus Αερόβια επώαση μέχρι την άλλη ημέρα ή το πολύ για 2 ημέρες στους 37 ο C Αν είναι αιμόφιλος: οι αποικίες που είναι κοντά στην περιοχή αναπτύξεως του σταφυλόκοκκου θα είναι μεγαλύτερες από ότι είναι οι αποικίες στην υπόλοιπη περιοχή

28 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Δοκιμή δορυφορισμού (συνέχεια) Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στο ότι ο σταφυλόκοκκος καθώς αναπτύσσεται εκκρίνει τον V παράγοντα που διαχέεται γύρω από το σημείο της αναπτύξεως του. Ο παράγων αυτός προάγει την ταχύτερη και αφθονότερη ανάπτυξη του Aιμόφιλου Δοκιμή δορυφορισμού (+): Aιμόφιλοι H.influenzae, H.prainfluenzae, H.haemolyhcus και H.parahaemolyhcus Αλλα γένη μικροβίων όπως μερικοί Στρεπτόκοκκοι και Κορυνοβακτηρίδια, η Pasteurella multocida

29

30 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Δοκιμή εξαρτήσεως από τους Χ και V Στην επιφάνεια τρυβλίου με άγαρ χωρίς τους X και V παράγοντες Μπολιάζουμε το υπό εξέταση μικρόβιο καλλιεργημένο σε ζωμό Lewinthal Πάνω στην καλλιεργημένη αυτή επιφάνεια τοποθετούμε δισκία εμποτισμένα ένα με τον παράγοντας Χ, ένα άλλο δισκίο με τον παράγοντα V και ένα τρίτο με τους δυο παράγοντες XV Επωάζεται το τρυβλίο για h αεροβίως και διαβάζουμε το αποτέλεσμα

31 ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Δοκιμή εξαρτήσεως από τους Χ και V (συνέχεια) Αιμόφιλος: δεν θα αναπτυχθεί σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου θα αναπτυχθεί γύρω από τα δισκία όπου υπάρχουν οι παράγοντες από τους οποίους έχει ανάγκη Ο H. influenzae που έχει ανάγκη και των δυο παραγόντων, θα αναπτυχθεί μόνο γύρω από το XV δισκίο

32

33

34 ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ Οι δοκιμές αυτές είναι οι εξής: Παραγωγή ινδόλης Παραγωγή ουρεάσης Παραγωγή β- γαλακτοσιδάπης Απόκαρβοξυλίωπη της ορνιθίνης Παραγωγή προφυρίνης ή χρησιμοποιήσεως του d- ALA Για τις δοκιμές αυτές χρειάζεται καθαρό και άφθονο καλλιέργημα Παρασκευάζεται πυκνό εναιώρημα αυτού σε λίγης σταγόνες ζωμού μέσα σεσωληνάριο και από αυτό με πιπέττα Pasteur εμβολιάζονται τα υλικά των παραπάνω βιοχημικών δοκιμών

35

36

37 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΑΪΣΣΕΡΙΑ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑΣ - ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΟΚΟΚΚΟΣ ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Μηνιγγιτιδόκοκκος: Υλικά γενικής καλλιέργειας, όπως είναι το Αιματούχο και το Σοκολατόχρωμο άγαρ Ζωμό μετρυπτικάση και σόγια, στο θειογλυκολικό ζωμό καθώς και στο Lewinthal άγαρ (βρασμένο αιματούχο άγαρ) Αποικίες: μεγάλες, στρόγγυλες, φουσκωτές με σαφή περιφέρια, ελαφρά γυαλιστερές, σαφώς γκριζωπές. Οταν είναι πολλές λευκάζουν. Κάτω και γύρω από την αποικία το υλικό μπορεί να πρασινίζει. Εχουν σύσταση μαλακή, κρεμοειδή. Αν παραταθεί η επώαση οι αποικίες σκληραίνουν και μυξιάζουν

38

39 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΑΪΣΣΕΡΙΑ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑΣ - ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΟΚΟΚΚΟΣ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Διακρίνουμε τους Gram αρνητικούς διπλοκόκκους εξωκυττάριους ή και ενδοκυττάριους Σε πυκνό παρασκεύασμα μπορεί να μην αποχρωματισθούν καλά τα μικρόβια και να εμφανισθούν οι μηνιγγιτιδοκόκκοι σαν Gram θετικοι.

40 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΑΪΣΣΕΡΙΑ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑΣ - ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΟΚΟΚΚΟΣ Βιοχημικές δοκιμές Δοκιμή οξειδάσης θετική (όπως όλες οι Ναϊσσέριες) Καταλάση θετικό Διασπά τη γλυκόζη και τη μαλτόζη, όχι όμως τη λακτόζη, τη σουκρόζη και τη φρουκτόζη Δοκιμή διασπάσεως σακχάρων γίνεται όπως περιγράφεται για το γονόκοκκο. Χρησιμοποιούνται έτοιμα αντιδραστήρια του εμπορίου στα οποία μπορεί να διαβασθεί και η αντίδραση DNA- άσης, την οποία ο μηνιγγιτιδόκοκκος δίνει αρνητική

41