«Idas, μια νέα πρωτεΐνη συγγενική του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin: λειτουργική μελέτη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ζωικά μοντέλα»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙKΏΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Idas, μια νέα πρωτεΐνη συγγενική του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin: λειτουργική μελέτη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ζωικά μοντέλα» ΠΕΦΑΝΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΔΑΦΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΏΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Idas, μια νέα πρωτεΐνη συγγενική του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin: λειτουργική μελέτη σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ζωικά μοντέλα» ΠΕΦΑΝΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΔΑΦΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπουσα καθηγήτρια Λυγερού Ζωή Αναπληρώτρια καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και ια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 2

3 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή Λυγερού Ζωή Νικόλαος Μοσχονάς Ταλιανίδης Ιωάννης Αναπληρώτρια καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Ερευνητής Α Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών Αλέξανδρος Φλέμινγκ Eπταμελής εξεταστική επιτροπή Λυγερού Ζωή Νικόλαος Μοσχονάς Ταλιανίδης Ιωάννης Ζαρκάδης Ιωάννης Σταθόπουλος Γεώργιος Ταραβήρας Σταύρος Σπυρούλιας Γεώργιος Αναπληρώτρια καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Ερευνητής Α Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών Αλέξανδρος Φλέμινγκ Αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστήμιο Πατρών 3

4 Περιεχόμενα Πρόλογος 8 Περίληψη 9 1. Εισαγωγή Ο κυτταρικός κύκλος Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου O διαχωρισμός του γενετικού υλικού στα δύο θυγατρικά χρωμοσώματα κατά τη μίτωση και η ρύθμιση της από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης (ΑPC/C) Το ΑPC/C και η σωστή χρονικά πρωτεόλυση των υποστρωμάτων του εξασφαλίζουν την ορθή πορεία της μίτωσης H απενεργοποίηση του APC/C Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου για βλάβη στο DNA Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στα σημεία ελέγχου για βλάβες στο DNA και η γενική οργάνωση τους To σημείο ελέγχου από τη G1 στην S Το σημείο ελέγχου της φάσης S To σημείο ελέγχου από την G2 στη μίτωση Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου σαν φραγμοί στην καρκινογένεση Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA To Cdt1, η δράση του και η ρύθμιση του στον κυτταρικό κύκλο Η ρύθμιση του Cdt1 κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Η Geminin και η δράση της ως ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου Ρύθμιση της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Το σύμπλοκο Geminin: Cdt Geminin και γονιδιωματική αστάθεια Aδειοδότηση και μίτωση: Δύο διαδικασίες με κοινούς ρυθμιστές Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση είναι δύο συντονισμένες διαδικασίες Μόρια ρυθμιστές κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης Αλληλεπιδράσεις της Geminin με μεταγραφικούς παράγοντες Αλληλεπιδράσεις της Geminin με παράγοντες που ρυθμίζουν την δομή της χρωματίνης Μελέτη των δράσεων της Geminin στην διαφοροποίηση in vivo με διαγονιδιακούς ποντικούς Idas, μία νέα πρωτεΐνη ομόλογη με τη Geminin Σκοπός Υλικά και Μέθοδοι 60 4

5 3.1 Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA-κλωνοποιήσεις Πρωτόκολλα προετοιμασίας δειγμάτων για Real Time PCR Μέθοδοι κυτταροκαλλιέργειας Μέθοδοι κατεργασίας κυττάρων Mέθοδοι Βιοχημείας Μέθοδοι Ιστολογίας Υβριδοποίηση ιn situ σε ολόκληρα έμβρυα Danio rerio Μεταφορά DNA σε έμβρυα Danio rerio με την τεχνική των μικροενέσεων Αποτελέσματα 91 Μέρος Α: Μελέτη τoυ Idas, μία νέα πρωτεΐνη συγγενική με το ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin στον κυτταρικό κύκλο Ιδας (Idas) μία νέα πρωτεΐνη συγγενική με το ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου Geminin Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης Idas σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Μελέτη των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης Idas σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Η ενδογενής πρωτεΐνη Idas αλληλεπιδρά με τη Geminin Χαρτογράφηση των απαραίτητων τμημάτων του πρωτεϊνικού μορίου της Geminin για την αλληλεπίδραση με τον Idas Η παρουσία του Ιdas αναστέλλει τον ομοδιμερισμό της Geminin Λειτουργικός χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης Geminin-Idas κατά την αντιγραφή του γονιδιώματος Μελέτη της δράσης του συμπλόκου Geminin-Ιdas in vitro, χρησιμοποιώντας το ελεύθερο κυττάρων σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής στο Xenopus laevis Μελέτη της δράσης του συμπλόκου Geminin-Ιdas in vivo σε ανθρώπινα κύτταρα Λειτουργική μελέτη της πρωτεΐνης Idas μέσω της αποσιώπησης της σε καρκινικές κυτταρικές σειρές Η αποσιώπηση του Idas σε καρκινικές κυτταρικές σειρές οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται σε φάση S Η αποσιώπηση του γονίδιου Idas οδηγεί σε αδυναμία των κυττάρων να εξέλθουν από την S και να προχωρήσουν φυσιολογικά στο κυτταρικό κύκλο Χαρακτηρισμός της ενδοκυτταρικής ρύθμισης της πρωτεΐνης Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Idas μειώνονται κατά την μίτωση Η υπερέκφραση του IdasGFP σε κύτταρα προκαλεί ανώμαλους μιτωτικούς φαινοτύπους Από τον Iδα στον Λυγκέα: Lynkeas, μία νέα πρωτεΐνη συγγενική με τον Idas και τη Geminin Κατασκευή κατάλληλων μοριακών εργαλείων για τη μελέτη της πρωτεΐνης Lynkeas σε κυτταρικές σειρές 122 5

6 4.7.2 Μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του Lynkeas 123 Μέρος Β: Μελέτη της πρωτεΐνης Idas και του παραλόγου της Lynkeas κατά την ανάπτυξη με τη χρήση οργανισμών μοντέλων Μελέτη του προτύπου έκφρασης των oρθολόγων των πρωτεϊνών Idas και Lynkeas κατά την εμβρυική ανάπτυξη του μυός Μελέτη του προτύπου έκφρασης των oρθολόγων των πρωτεϊνών Idas και Lynkeas κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του εγκεφάλου του μυός Μελέτη του προτύπου έκφρασης του mrna των Ιdas και Lynkeas σε εγκέφαλο εμβρύου μυός ηλικίας Ε Μελέτη του προτύπου έκφρασης του mrna των Ιdas και Lynkeas σε εγκέφαλο εμβρύου μυός ηλικίας Ε Μελέτη του προτύπου έκφρασης του mrna των Ιdas και Lynkeas σε εγκέφαλο εμβρύου μυός ηλικίας Ε Μελέτη του προτύπου έκφρασης του mrna των Ιdas και Lynkeas σε εγκέφαλο εμβρύου μυός ηλικίας Ε Το ορθόλογο του Ιdas στον μύ εκφράζεται στην περιοχή του χοριοειδούς πλέγματος της τέταρτης κοιλίας που εδράζονται τα διαιρούμενα προγονικά κύτταρα Μελέτη του προτύπου έκφρασης των Idas και Lynkeas κατά την εμβρυική ανάπτυξη του αναπνευστικού συστήματος του μυός Μελέτη του ορθολόγου του Idas σε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα από αυγά Xenopus laevis Μελέτη της αλληλεπίδρασης των ορθολόγων του Idas και της Geminin στο Xenopus laevis Μελέτη της συμπεριφοράς του ορθολόγου του Idas στο Xenopus με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Μελέτη του πιθανού ορθολόγου του Ιdas στον ιχθύ Danio rerio (zebrafish) και χρήση του Danio rerio ως ετερόλογο σύστημα για την μελέτη του Idas in vivo Προσδιορισμός του πιθανού ορθολόγου του Idas στον ιχθύ Danio rerio Μελέτη του προτύπου έκφρασης του πιθανού ορθολόγου του Idas κατά την ανάπτυξη του ιχθύος Danio rerio Προκαταρκτική μελέτη του Idas in vivo χρησιμοποιώντας τον ιχθύ Danio rerio σαν ετερόλογο σύστημα Συζήτηση H Geminin και ο πολυδιάστατος ρόλος της H υπεροικογένεια των Geminin Ιdas και Lynkeas Ο Idas και οι δράσεις του στην αντιγραφή του DNA O Ιdas δρα ανασταλτικά επί της Geminin κατά την αδειοδότηση της αντιγραφής Ο Idas είναι απαραίτητος για την ορθή διέλευση από τη φάση S 159 6

7 5.4 Η υπεροικογένεια των Geminin, Idas και Lynkeas και η δράση της στην αντιγραφή του DNA O Ιdas αποικοδομείται κατά την διάρκεια της ανάφασης και η υπερέκφραση του προκαλεί ανώμαλους μιτωτικούς φαινοτύπους Ο Ιdas και ο Lynkeas εμφανίζουν ειδικό και σημαντικά αλληλεπικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης κατά την εμβρυική ανάπτυξη του μυός Η έκφραση του Idas και του Lynkeas στο αναπτυσσόμενο κεντρικό νευρικό σύστημα Ο Ιdas και ο Lynkeas εκφράζονται στο αναπτυσσόμενο αναπνευστικό επιθήλιο Η δράση των Idas και Lynkeas στα κροσσωτά επιθηλιακά κύτταρα Μελέτη του Idas στον ιχθύ Danio rerio Μελέτη του προτύπου έκφρασης του Idas στον ιχθύ Danio rerio Μελέτη της ανθρώπινης πρωτεΐνης Idas in vivo χρησιμοποιώντας τον Danio rerio σαν ετερόλογο σύστημα Συνοψίζοντας τις δράσεις του Ιdas σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση Βιβλιογραφία 173 7

8 Πρόλογος Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή έλαβε χώρα στα Εργαστήρια Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Ζωής Λυγερού. Με την ολοκλήρωση της θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντας μου την συγκεκριμένη εργασία, την ουσιαστική καθοδήγησή και την ηθική συμπαράστασή που αποτελούν πολύτιμα εφόδια για την μελλοντική μου πορεία. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Νικόλαο Μοσχονά και Ιωάννη Ταλιανίδη για την τιμή που μου έκαναν να συμμετέχουν σε αυτή. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Σταυρό Ταραβήρα, Ιωάννη Ζαρκάδη, Γεώργιο Σταθόπουλο και Γεώργιο Σπυρούλια για τη συμμετοχή τους. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στους συνεργάτες μας Julian Blow και David Wilkinson που με φιλοξένησαν στο πλαίσιο της διδακτορικής μου διατριβής στα ερευνητικά τους εργαστήρια στο Wellcome Trust Centre For Gene Regulation and Expression στο Nταντί και στο National Institute For Medical Research στο Λονδίνο αντίστοιχα. Επίσης θα ήθελα ευχαριστήσω τον Peter Gillespie από το εργαστήριο του Julian Blow και την Qiling Xu από το εργαστήριο του David Wilkinson για την πολύτιμη βοήθειά τους. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στον κ. Σταυρό Ταραβήρα για την στενή παρακολούθηση και πολύτιμη συμβολή του στην εξέλιξη της Διδακτορικής μου Διατριβής. Θα ήθελα να απευθύνω τις ευχαριστίες μου στο Διευθυντή των Εργαστηρίων Γενικής Βιολογίας κ. Νικόλαο Μοσχονά καθώς και τα μέλη ΔΕΠ κ. Αγλαΐα Αθανασιάδου, Ντούλη Παπαχατζοπούλου, Ιωάννη Ζαρκάδη και Διονύση Σπάθα για τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά την εξέλιξη της Διδακτορικής Διατριβής μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους τους Μεταπτυχιακούς Φοιτητές των εργαστηρίων Γενικής Βιολογίας και Φυσιολογίας για το άριστο εργασιακό περιβάλλον που όλοι μαζί δημιουργήσαμε. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στους Μαρία Δημάκη, Ελεάννα Σημεωνίδου, Παναγιώτη Κοτσαντή, Κυρούση Χριστίνα, Σπέλλα Μάγδα, Νικόλα Καραντζέλη, Δημήτρη Καραμήτρο και Νάνσυ Σταθοπούλου για τη συμβολή τους στην εξέλιξη της παρούσας εργασίας. Τελειώνοντας θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη μητέρα μου και τους φίλους μου για την αμέριστη στήριξη, ηθική συμπαράσταση και υπομονή. 8

9 Περίληψη Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο καθώς συμμετέχει τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και την κυτταρική διαφοροποίηση. Στον κυτταρικό κύκλο αλληλεπιδρά και απενεργοποιεί τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, εξασφαλίζοντας με αυτόν τον τρόπο ότι το γονιδίωμα θα αντιγραφεί μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Ο ρόλος της Geminin στην κυτταρική διαφοροποίηση εγκαθιδρύεται από πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με μεταγραφικούς παράγοντες και παράγοντες αναδιάταξης της χρωματίνης. Έχει προταθεί ότι η Geminin, μέσα από ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις, δρα σαν ρυθμιστής της κυτταρικής απόφασης για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Βασικό δομικό χαρακτηριστικό της Geminin αποτελεί ένα κεντρικά τοποθετημένο σπειροειδές σπείραμα το οποίο είναι απαραίτητο για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις της Geminin. Στην παρούσα εργασία περιγράφουμε τη λειτουργία μιας νέας πρωτεΐνης με σημαντική ομολογία για το σπειροειδές σπείραμα της Geminin, την οποία ονομάσαμε Idas (Ξάδελφος των Διόσκουρων (Gemini) στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Από προηγούμενες μελέτες μας γνωρίζαμε ότι ο Idas αλληλεπιδρά με τη Geminin και όχι με το Cdt1, σε επίπεδο εξωγενώς εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Δείχτηκε ότι η ενδογενής Geminin και ο ενδογενής Idas αλληλεπιδρούν στα κύτταρα και χαρακτηρίστηκε η λειτουργική δράση του συμπλόκου Geminin:Idas κατά την αντιγραφή του DNA. Χρησιμοποιώντας ένα ελεύθερο κυττάρων σύστημα αδειοδότησης στο Xenopus δείχθηκε ότι όταν ο Idas είναι σε σύμπλοκο με τη Geminin, η Geminin χάνει την ανασταλτική της δράση επί της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Η ανασταλτική δράση του Idas επί της Geminin φάνηκε και σε πειράματα in vivo σε κυτταρικές σειρές, στα οποία η υπερέκφραση του Idas οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γενετικού υλικού, φαινότυπος ο οποίος διασώζεται από ταυτόχρονη υπερέκφραση της Geminin. Για τον καλύτερο χαρακτηρισμό της δράσης του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, έγινε απoσιώπηση της έκφρασης του σε κύτταρα σε καλλιέργεια. Απουσία έκφρασης του Idas παρεμποδίζεται η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου καθώς αυξάνεται σημαντικά ο πληθυσμός των κυττάρων που βρίσκονται σε φάση S. Τα κύτταρα στα οποία απενεργοποιείται η έκφραση του Idas αδυνατούν να ολοκληρώσουν ορθά τη φάση S και να προχωρήσουν στη μίτωση και τη G1 που ακολουθεί. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση του Idas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση μίας σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς. Βρέθηκε ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα του Idas μειώνονται κατά την ανάφαση της μίτωσης και επανέρχονται νωρίς με την είσοδο στη G1. H σημασία του Idas για τη σωστή διέλευση από τη μίτωση φαίνεται από πειράματα υπερέκφρασής του στα οποία 9

10 παρατηρείται αυξημένος αριθμός κυττάρων με ανώμαλου σχήματος πολύ-πολικές μιτωτικές ατράκτους. Στην προσπάθεια για εύρεση και άλλων πρωτεϊνών με ομολογία για τoν Idas και τη Geminin, εντοπίσαμε ένα νέο γενετικό τόπο ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη που αποτελεί το κοντινότερο παράλογο του Idas στα σπονδυλωτά καθώς μοιράζεται δύο περιοχές ομολογίας με τον Idas, στο σπειροειδές σπείραμα και στο καρβολυτελικό άκρο των πρωτεϊνών. Λόγω αυτής της ομοιότητας ονομάσαμε την πρωτεΐνη Lynkeas (Δίδυμος αδελφός του Idas στην αρχαία ελληνική μυθολογία). Ο Lynkeas αλληλεπιδρά με τον Idas και τη Geminin αλλά όχι με το Cdt1. Τα παραπάνω δεδομένα προτείνουν ότι ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Geminin, Idas και Lynkeas είναι πιθανό να ρυθμίζουν χρονικά την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής. Παράλληλα με τη μελέτη της δράσης του Idas στον κυτταρικό κύκλο έγινε μελέτη της πιθανής εμπλοκής του στη διαφοροποίηση με τη χρήση οργανισμών μοντέλων. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης του σε τομές εμβρύων μυός και συγκρίθηκε με αυτό του παραλόγου του Lynkeas. Oι Ιdas και Lynkeas εμφανίζουν ένα ειδικό και σημαντικά αλληλεπικαλυπτόμενο πρότυπο έκφρασης σε αναπτυσσόμενα κροσσωτά επιθήλια όπως το αναπνευστικό και του χοριοειδούς πλέγματος, μαρτυρώντας την πιθανή εμπλοκή τους στη διαφοροποίησή τους. Προκαταρκτικές μελέτες του Idas έγιναν και σε άλλα συστήματα και οργανισμούς μοντέλα. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από αυγά Xenopus επιβεβαιώθηκε η αλληλεπίδραση του Ιdas με τη Geminin. Επίσης, εντοπίστηκε και μελετήθηκε η έκφραση του ορθολόγου του Idas στον ιχθύ Danio rerio. Τέλος, έμβρυα Danio rerio χρησιμοποιήθηκαν σαν ετερόλογο σύστημα για προκαταρκτική μελέτη in vivo της υπερέκφρασης ανθρώπινης πρωτεΐνης Idas και μεταλλαγμένων μορφών αυτής. Τα παραπάνω αποτελέσματα μαρτυρούν ότι η Geminin, o Idas και o Lynkeas ανήκουν σε μία υπεροικογένεια η οποία αποτελείται από πρωτεΐνες με όμοια σπειροειδή σπειράματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin, μέσα από ισορροπημένες αλληλεπιδράσεις συμμετέχουν στη ρύθμιση τόσο του κυτταρικού κύκλου όσο και της κυτταρικής διαφοροποίησης και πιθανά στο συντονισμό αυτών των δύο διαδικασιών. 10

11 Abstract Geminin is a bifunctional protein which participates both in cell cycle and development. Geminin regulates the cell cycle by directly binding and inhibiting the licensing factor Cdt1, thus ensuring once per cell cycle DNA replication. Geminin also interacts with transcriptional regulators of differentiation and chromatin remodelling factors, thus affecting cell cycle decisions. It has been proposed that Geminin s balanced interactions are implicated in proliferation differentiation decisions. Geminin possesses s a central coiled coil region which mediates the majority of Geminin s interactions. Herein, we describe a novel protein named Ιdas which exhibits homology to Geminin s coiled coil. In previous studies from our lab it was shown that Idas and Geminin interact in cells when ectopically expressed. In this study we generated and used a specific polyclonal antibody against Idas to study endogenous Geminin:Idas interaction. Moreover we functionally characterized the Geminin:Idas complex in DNA replication. Using a Xenopus in vitro licensing system it was shown that Geminin, when in complex with Idas loses it s inhibitory activity on DNA replication. Idas inhibitory function over Geminin was also revealed by ectopic expression of Idas in cell lines: Idas overexpression causes DNA over-replication a phenotype rescued by Geminin s concomitant ectopic expression. To better characterize Ιdas s function, we depleted Idas from cells. Idas ablation affects cell cycle progression and cells accumulate in S phase. Idas depleted cells show a reduced ability to normally proceed through the cell cycle to Mitosis and G1. To study Idas protein levels throughout the cell cycle we generated a cell line stably expressing IdasGFP. In this cell line Idas protein levels were found to be reduced in anaphase of Mitosis and increase again upon entry to G1. The importance of Idas for normal passage through Mitosis was revealed by ectopic expression experiments: An increased number of cells with abnormal multipollar spindle formation was evident when Idas was ectopically expressed. By searching for other proteins with homology to Idas and Geminin, we found another genomic locus that encodes for a protein that shares two homology regions with Idas: the coiled coil region and the C-terminal region. This protein is the closest prologue of Idas in vertebrates and we named it Lynkeas (Lynkeas being the twin brother of Idas in ancient Greek mythology). Lynkeas interacts with Geminin and Idas but not Cdt1. The above suggest that competing interactions between Idas, Lynkeas Geminin and Cdt1 may provide a switch regulating the timing of DNA replication. Moreover, we studied Idas during differentiation and development. Idas expression pattern was assessed during mouse embryonic development and compared to the expression pattern of Idas prologue, Lynkeas. Idas and Lynkeas exhibit a 11

12 specific and overlapping expression pattern in the developing ciliated epithelia and specifically in the choroid plexus and respiratory epithelium, indicating their possible implication in the differentiation of motile cilia. The function of Idas was also determined in other systems and model organism. Endogenous Idas was studied in total extracts from Xenopus eggs where it was shown to interact with Geminin. Danio rerio was used as a model organism to study Idas s function during development. We identified the orthologue of Idas in Danio rerio and examined it s expression pattern during embryogenesis of Danio rerio. Danio rerio was also used as a heterologous system in preliminary studies for the ectopic expression of human Idas and it s mutanst during zebrafish development. The above results indicate that Geminin, Idas and Lynkeas consistute a superfamily of proteins with similar coiled coils. Through balanced interactions Geminin, Idas and Lynkeas participate in cell cycle and cell differentiation and could balance these two processes. 12

13 1. Εισαγωγή 1. Εισαγωγή 13

14 1. Εισαγωγή 1.1 Ο κυτταρικός κύκλος Κάθε σωματικό κύτταρο του ανθρώπινου οργανισμού πρέπει να εξασφαλίζει τον ορθό διπλασιασμό των 6 δισεκατομμύρια ζευγών βάσεων του γενετικού του υλικού και τον ισότιμο διαχωρισμό των αντιγράφων στα θυγατρικά κύτταρα. Αυτός ο κύκλος διπλασιασμού και διαίρεσης καλείται κυτταρικός κύκλος. Ο κυτταρικός κύκλος διακρίνεται στη Μεσόφαση και τη μίτωση. Η Μεσόφαση περιλαμβάνει τις φάσεις G1, S και G2. Κατά τη G1 (Gap 1) το κύτταρο ανταποκρινόμενο σε μιτογόνα ή ανασταλτικά σήματα τα οποία λαμβάνει από το περιβάλλον του, παίρνει αποφάσεις σχετικά με την αντιγραφή του γενετικού υλικού και τη συνέχεια του κύκλου, την παύση του ή ακόμα και την έξοδο από αυτόν. Η λήψη μιτογόνων ερεθισμάτων οδηγεί στη φάση S (Synthesis) κατά την οποία γίνεται η αντιγραφή του γενετικού υλικού και ακολουθείται από τη G2 (Gap2), κατά την οποία το κύτταρο προετοιμάζεται για την κυτταρική διαίρεση. Ο κύκλος κλείνει με το διαχωρισμό του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα κατά τη μίτωση (Εικόνα 1.1). Εικόνα 1.1 H εναλλαγή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. 1.2 Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Για να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας απαιτείται αυστηρή χωροχρονική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Αυτή η ρύθμιση εγκαθιδρύεται με την ανάπτυξη μηχανισμών ελέγχου οι οποίοι εξασφαλίζουν την ορθή ολοκλήρωση των γεγονότων που εξελίσσονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου πριν το κύτταρο μεταβεί στην επόμενη. Κεντρικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου αποτελούν οι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες (Cyclin Dependent Kinases, CDKs). Πρόκειται για κινάσες σερίνης/θρεονίνης, η καταλυτική ενεργότητα των οποίων εξαρτάται από την πρόσδεσή τους σε ρυθμιστικές υπομονάδες που καλούνται κυκλίνες. Η διακύμανση των επιπέδων έκφρασης των κυκλινών κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου προσδίδει τη χρονική ειδικότητα στη δράση των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (Morgan, 1997). Στο ζυμομύκητα υπάρχει μία κυκλινοεξαρτώμενη κινάση, η Cdk1 (που αντιστοιχεί στις p34 cdc28 στον Saccharomyces cerevisiae και p34 cdc2 στον 14

15 1. Εισαγωγή Schizosaccharomyces pombe) η οποία καθορίζει τα γεγονότα μετάβασης των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μέσω της σύνδεσης της με κυκλίνες που εκφράζονται ειδικά σε κάθε φάση του κύκλου. Στον S. pombe υπάρχουν δύο κυκλίνες ειδικές για τη φάση S, οι Cig1 και Cig2 και η μιτωτική κυκλίνη Cdc13. Από αυτές έχει δειχθεί ότι μόνο η Cdc13 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα του κυττάρου (Fisher and Nurse, 1996), οδηγώντας στη θεώρηση πως στον S.pombe, το σύμπλοκο Cdc2/Cdc13 επαρκεί για την ορθή πρόοδο του κύκλου. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στο συμπέρασμα ότι δεν απαιτούνται διαφορετικές κυκλίνες για την επιλογή ειδικών υποστρωμάτων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Η εναλλαγή των φάσεων του κύκλου θεωρείται ότι καθορίζεται από την ολική ενεργότητα της κινάσης και όχι από ύπαρξη διαφορετικών συμπλόκων κινάσης/κυκλίνης (Stern and Nurse, 1996). Με βάση αυτό το μοντέλο, «ποσοτικό μοντέλο», η φάση S ξεκινάει όταν τα επίπεδα ενεργότητας της κινάσης εμφανίσουν μία μέτρια αύξηση, ενώ περαιτέρω αύξηση των επιπέδων της οδηγεί σε είσοδο στη μίτωση (Stern and Nurse, 1996). Αυτό που καθορίζει τη φωσφορυλίωση του κατάλληλου υποστρώματος την κατάλληλη χρονική στιγμή είναι η διαφορετική συγγένεια των υποστρωμάτων της φάσης S σε σχέση με τα μιτωτικά υποστρώματα (Stern and Nurse, 1996) αλλά και η παράλληλη δράση φωσφατασών (Bouchoux and Uhlmann, 2011). Εκτός από τη Cdk1 στους ζυμομύκητες έχουν περιγραφεί και άλλες CDKs όπως οι Pho85 και Kin28 οι οποίες ενδέχεται να επηρεάζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με έναν έμμεσο τρόπο (Huang et al., 2007; Morgan, 1997). Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν ταυτοποιηθεί πολλά λειτουργικά ομόλογα της Cdk1. Αυτές οι κινάσες που είναι ειδικές για τις φάσεις G1, G1/S, S και G2/M έχουν αντικαταστήσει την πολυλειτουργική Cdk1 του ζυμομύκητα. Η ανακάλυψη περίπου 20 ορθολόγων των Cdks και τουλάχιστον 29 πρωτεϊνών που φέρουν το χαρακτηριστικό «μοτίβο των κυκλινών» (cyclin box) και κωδικοποιούνται από το ανθρώπινο γονιδίωμα οδήγησε στο συμπέρασμα ότι διαφορετικοί συνδυασμοί κινάσης/κυκλίνης δρουν σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσφέροντας έναν επιπλέον έλεγχο στην ορθή πρόοδο του κύκλου (Εικόνα 1.2). Με βάση το παραπάνω μοντέλο οι κυκλίνες προσφέρουν όχι μόνο τη χρονική ρύθμιση της δράσης του συμπλόκου αλλά και την ειδικότητα στην αναγνώριση των υποστρωμάτων του, καθώς και τη χωρική ρύθμιση της δράσης του (υποκυτταρικός εντοπισμός, ενεργοποίηση, απενεργοποίηση κ.α) (Satyanarayana and Kaldis, 2009). Τέσσερεις είναι οι βασικοί τύποι των κυκλινών που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και έχουν ταυτοποιηθεί στα θηλαστικά: οι κυκλίνες τύπου D-, E-, A- και Β-, οι όποιες εμφανίζουν δυναμικής φύσης ενδοκυτταρικό εντοπισμό. Σε κύτταρα θηλαστικών, η κυκλίνη Β είναι κατά βάση κυτταροπλασματική ενώ οι κυκλίνες Α, D και Ε είναι πυρηνικές (Pines and Hunter, 1994). Τρείς τύποι κυκλίνης Β έχουν βρεθεί στα κύτταρα των θηλαστικών, οι Β1, Β2 και Β3. Οι κυκλίνες Β1 και Β2 εκφράζονται στο σύνολο των κύτταρων ενός οργανισμού, ενώ η έκφραση της κυκλίνης Β3 περιορίζεται στους όρχεις και τις ωοθήκες (Nguyen et al., 2002). Η κυκλίνη Β1 συνδέεται με τους μικροσωληνίσκους και πριν την έναρξη της μίτωσης 15

16 1. Εισαγωγή εισέρχεται στον πυρήνα, ενώ η κυκλίνη Β2 συνδέεται με ενδοκυτταρικές μεμβράνες και το πρότυπο ενδοκυτταρικής της κατανομής παραμένει σταθερό καθ όλη την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Yang et al., 1998). Επίσης στα θηλαστικά υπάρχουν δύο τύποι κυκλίνης Α, η Α1 και Α2, όπως και δύο τύποι κυκλίνης Ε, η Ε1 και Ε2. Τέλος οι κυκλίνες τύπου D (D1, D2, D3) εκφράζονται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, με την κυκλίνη D1 να είναι η πιο διαδεδομένη (Waclaw and Chatot, 2004). Εικόνα 1.2 Οι εμπλεκόμενες στον κυτταρικό κύκλο των θηλαστικών κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες (CDKs) και οι κυκλίνες με τις οποίες αλληλεπιδρούν. (Τροποποιημένη εικόνα από (Satyanarayana and Kaldis, 2009) Με βάση το μοντέλο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου από ειδικά σύμπλοκα κυκλινοεξαρτώμενων κινασών σε κάθε φάση του, νωρίς στη G1 οι Cdk4/6 ενεργοποιούνται ύστερα από πρόσδεση της κυκλίνης D και επάγουν την είσοδο στο κυτταρικό κύκλο. Βασικό υπόστρωμα της Cdk4/6/cyclin D θεωρείται η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (prb) (Sherr and Roberts, 2004). Το Rb είναι γνωστό σαν ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, του οποίου η ογκοκατασταλτική δράση έγκειται στην παρεμπόδιση του κυτταρικού κύκλου κατά την είσοδο στη φάση S, καταστέλλοντας γονίδια που ενεργοποιούνται από την οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων E2F 16

17 1. Εισαγωγή (Hatakeyama and Weinberg, 1995). Αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης της prb είναι η απενεργοποίησή της και η απελευθέρωση του μεταγραφικού παράγοντα E2F από το ανασταλτικό σύμπλοκο με την prb. Ο Ε2F είναι στη συνέχεια επάγει τη μεταγραφή των Ε2F εξαρτώμενων γονιδίων, τα οποία και είναι απαραίτητα για τη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (Dyson, 1998). Μεταγραφικό στόχο του E2F αποτελεί και η κυκλίνη Ε, η οποία στο τέλος της G1 προσδένεται στη Cdk2 και την ενεργοποιεί. Το σύμπλοκο Cdk2/cyclin E ενεργοποιεί περαιτέρω τη μεταγραφική δράση του E2F, μέσω φωσφορυλίωσης του αναστολέα του prb και ωθεί τη μετάβαση από τη G1 στη φάση S (Sherr and Roberts, 2004). Με την είσοδο στην S αυξάνουν τα επίπεδα της κυκλίνης A, η οποία συμπλοκοποιείται με τη Cdk2. Οι κυκλίνες τύπου Α συντίθενται στην αρχή της φάσης S και στόχο τους αποτελούν οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA (Coverley et al., 2000; Petersen et al., 1999). Κατά τη μετάβαση από τη G2 στη μίτωση, η δράση του συμπλόκου Cdk1/Cyclin A είναι απαραίτητη για την είσοδο στη μίτωση ενώ για την ορθή ολοκλήρωσή της ευθύνεται το σύμπλοκο Cdk1/cyclin B (Furuno et al., 1999; Riabowol et al., 1989). H δράση των συμπλόκων Cdk/cyclin τόσο υπό φυσιολογικές όσο και υπό συνθήκες κυτταρικού στρες, ελέγχονται από δύο οικογένειες αναστολέων: την οικογένεια ΙΝΚ4 (p16, p15, p18, p19), τα μέλη της oποίας ρυθμίζουν ανασταλτικά τις Cdk4 και Cdk6 παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο τη δράση της κυκλίνης D, και την οικογένεια Cip/Kip (p21, p27, p57), τα μέλη της οποίας ρυθμίζουν αρνητικά τα σύμπλοκα Cdk2/cyclin E, Cdk2/cyclin Α, Cdk1/cyclin Α και τη δράση του συμπλόκου Cdk1/cyclin B (Aprelikova et al., 1995; O'Connor, 1997; Toyoshima and Hunter, 1994). Καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών παίζει και το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης/κυκλόσωμα (ΑPC/C), ο ρόλος του οποίου περιγράφεται εκτενώς στην παράγραφο 1.2. Η παρουσία πολλών διαφορετικών Cdks και κυκλινών έχει οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι οι ανώτεροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί διαθέτουν διαφορετικά σύμπλοκα κυκλινοεξαρτώμενων κινασών για την εκτέλεση συγκεκριμένων λειτουργιών σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Το γεγονός ωστόσο ότι στον ζυμομύκητα υπάρχει μία βασική κινάση για τη ρύθμιση του κύκλου, ενώ τα θηλαστικά κωδικοποιούν περίπου 20 κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες χωρίς γνωστή λειτουργία οδήγησε στη δημιουργία ποντικών μοντέλων για να μελετηθεί η δράση των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών και των κυκλινών. Με τη μελέτη in vivo της δράσης των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών ελέγχθηκε η αναγκαιότητα σχηματισμού όλων αυτών των συμπλόκων κατά τη διάρκεια του κύκλου ή αν η δράση τους μπορεί να αντικατασταθεί και από άλλα σύμπλοκα. Σε ότι αφορά τις κυκλίνες Α, έχουν δημιουργηθεί διαγονιδιακοί μύες στους οποίους απουσιάζει είτε η κυκλίνη A1 είτε η κυκλίνη A2. Οι μύες στους οποίους απουσιάζει η κυκλίνη A1 είναι βιώσιμοι και αναπτύσσονται κανονικά σε αντίθεση με τους μύες στους οποίους απουσιάζει η κυκλίνη A2 που πεθαίνουν νωρίς κατά την εμβρυογένεση αμέσως μετά την εμφύτευση της βλαστοκύστης, στο εμβρυικό στάδιο Ε5.5 (Liu et al., 1998). Από τα παραπάνω δεδομένα φαίνεται πως η δράση της 17

18 1. Εισαγωγή κυκλίνης Α2 δεν μπορεί να αντικατασταθεί από τη δράση άλλων κυκλινών. Δεδομένα από διαγονιδιακούς μύες για τις κυκλίνες τύπου Β έδειξαν ότι σε αντίθεση με τους μύες από τους οποίους απουσιάζει η κυκλίνη B1 και πεθαίνουν στο εμβρυικό στάδιο Ε10, οι μύες οι οποίοι δεν εκφράζουν την κυκλίνη B2 είναι βιώσιμοι και δεν εμφανίζουν αναπτυξιακές ανωμαλίες, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η δράση της κυκλίνης B2 μπορεί να αντικατασταθεί πλήρως από αυτή της B1 (Argraves and Drake, 2005; Brandeis et al., 1998). Σε ότι αφορά τις κυκλίνες τύπου Ε, μόνο οι μύες οι οποίοι δεν εκφράζουν και τις δύο κυκλίνες τύπου Ε, Ε1 και Ε2 εμφανίζουν αναπτυξιακές ανωμαλίες. Εμβρυικοί ινοβλάστες από αυτούς τους μύες εμφανίζουν προβληματική είσοδο στον κυτταρικό κύκλο ύστερα από έξοδο από αυτόν, όμως πολλαπλασιάζονται φυσιολογικά στην καλλιέργεια υποδεικνύοντας πως η δράση των κυκλινών Ε δεν είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καθώς μπορεί να αντικατασταθεί από αυτή των κυκλινών τύπου Α και D (Geng et al., 2003). Η αποσιώπηση των κινασών Cdk1 ή Cdk2 από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καταλήγει σε σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου, υποδεικνύοντας ότι η δράση της κάθε μιας από αυτές είναι ειδική και δεν μπορεί να αντικατασταθεί από άλλη (Van de Heuvel and Horlow 1993). Η δημιουργία διαγονιδιακών μυών ωστόσο την τελευταία δεκαετία άλλαξε αυτή τη θεώρηση. Έτσι δείχθηκε ότι η Cdk4 μπορεί να δράσει στη θέση της Cdk6 και αντίστροφα (Tsutsui et al., 1999), ωστόσο αυτό το αποτέλεσμα δεν προκάλεσε μεγάλη αίσθηση καθώς και οι δύο κινάσες δρουν νωρίς κατά τη G1. Μεγάλη έκπληξη αποτέλεσε η βιωσιμότητα των διαγονιδιακών μυών από τους οποίους απουσιάζει η Cdk2, οι οποίοι αναπτύσσονται κανονικά με μειωμένο σωματικό μέγεθος (Berthet et al., 2006). To γεγονός αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι η Cdk1 είναι σε θέση να αντικαταστήσει τη δράση της Cdk2. Ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι γνωστός, καθώς προβλήματα που αφορούν τη διαφορετική ενδοκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνών αλλά και πώς η Cdk1 μπορεί να προάγει τόσο τη μετάβαση από τη G1 στην S όσο και από τη G2 στη μίτωση βρίσκονται υπό εξέταση. Μελέτες σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους όπως τα νευρικά προγονικά κύτταρα έδειξαν ότι η δράση της Cdk4 και όχι της Cdk1 μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια της Cdk2 (Jablonska et al., 2007). Σε αντίθεση με τη δράση άλλων κινασών, η δράση της Cdk1 δεν φαίνεται να μπορεί να αντικατασταθεί από άλλες κινάσες καθώς ακόμα και όταν η Cdk2 εκφράζεται υπό τον υποκινητή της Cdk1 δεν μπορεί να αντικαταστήσει τη δράση της (Satyanarayana and Kaldis, 2009). Τα παραπάνω δεδομένα ανατρέπουν την αρχική θεώρηση της αναγκαιότητας όλων των κινασών και κυκλινών για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών και θέτουν τις κυκλίνες Α2 και Β1 και την κινάση Cdk1 ως τους βασικούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, ενισχύοντας την υπόθεση ότι η Cdk1 είναι σε θέση να προάγει τον κυτταρικό κύκλο αλληλεπιδρώντας με διαφορετικές κυκλίνες σε ένα μοντέλο πιο κοντά στο «ποσοτικό μοντέλο» του ζυμομύκητα, με βάση το οποίο αλλαγή στα επίπεδα ενεργότητας της Cdk1 θα μπορούσαν να καθοδηγήσουν τον κυτταρικό κύκλο. Ωστόσο περαιτέρω μελέτες με 18

19 1. Εισαγωγή ιστοειδική απαλοιφή των Cdks θα πρέπει να λάβουν χώρα και να δώσουν απαντήσεις για το κατά πόσο η Cdk1 μπορεί να καλύψει τον ιστοειδικό ρόλο άλλων κινασών. 1.3 O διαχωρισμός του γενετικού υλικού στα δύο θυγατρικά χρωμοσώματα κατά τη μίτωση και η ρύθμιση της από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης (ΑPC/C) Τα κύτταρα εισέρχονται και εξέρχονται από τη μίτωση κάτω από τον ρυθμιστικό έλεγχο των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών, σε συνεργασία με μέλη των οικογενειών των κινασών Polo, Aurora και ΝΙΜΑ (Nigg, 2001). H δράση αυτών των κινασών ανταγωνίζεται τη δράση φωσφατασών και τελικά η ισορροπία μεταξύ τους ρυθμίζει τα βήματα της μίτωσης Το ΑPC/C και η σωστή χρονικά πρωτεόλυση των υποστρωμάτων του εξασφαλίζουν την ορθή πορεία της μίτωσης Βασικό ρόλο στην ομαλή εξέλιξη της μίτωσης παίζει η καταστροφή του κατάλληλου υποστρώματος την κατάλληλη χρονική στιγμή ώστε να εξασφαλιστεί ο σωστός διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων και ο συντονισμός της μίτωσης με την κυτταροκίνηση (Pines, 2006). Κεντρικό ρόλο σε αυτή την διαδικασία έχει το σύμπλοκο προαγωγής της Aνάφασης/Κυκλόσωμα (ΑPC/C). Το ΑPC/C είναι μία Ε3 λιγάση ουβικουϊτίνης η οποία αποτελείται από 13 διαφορετικές υπομονάδες στους μύκητες και 11 στα θηλαστικά (Passmore and Barford, 2004; Peters, 2002). Οι καταλυτικές υπομονάδες του συμπλόκου είναι οι APC11, η APC2 και η Doc1. Η δράση των άλλων υπομονάδων δεν έχει απόλυτα διαλευκανθεί αλλά υπάρχουν ενδείξεις για τη συμμετοχή τους στην αναγνώριση των υποστρωμάτων. Κάποιες από αυτές φέρουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του μοτίβου TRP για αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, ενώ άλλες φωσφορυλιώνονται και επάγουν την ενεργοποίηση του APC/C ή ρυθμίζουν την αναγνώριση των υποστρωμάτων του (Kraft et al., 2003; Rudner and Murray, 2000). Εκτός από τις πρωτεΐνες που αποτελούν το βασικό σώμα της λιγάσης, υπάρχουν και συμπαράγοντες με τους οποίους αλληλεπιδρά και της προσδίδουν ειδικότητα στην αναγνώριση των υποστρωμάτων της. Τρείς πρωτεΐνες της οικογένειας WD40 δρουν συνεργιστικά με το APC/C, η Cdc20, η Cdh1 και η Αma1. Oι πρωτεΐνες αυτές φέρουν ένα συντηρημένο διπεπτίδιο ισολευκίνης-αργινίνης στο καρβοξυτελικό τους άκρο το οποίο απαιτείται για την πρόσδεση της πρωτεΐνης στις υπομονάδες του APC/C που φέρουν τις TPR επαναλήψεις (Vodermaier et al., 2003). Από αυτές τις WD40 πρωτεΐνες, η Ama1 δρα μόνο κατά τη Μείωση. Συγκεκριμένα στον S.cereviseae έχει βρεθεί ότι μία από τις υπομονάδες του APC/C, η Μnd2, αναστέλλει την πρόωρη δράση της Ama1 κατά τη μίτωση και την πρόωρη ενεργοποίηση της κατά τη Μείωση (Oelschlaegel et al., 2005). 19

20 1. Εισαγωγή Το μοτίβο αναγνώρισης των υποστρωμάτων του APC/C καλείται «μοτίβο αποικοδόμησης» (destruction box) και αρχικά ταυτοποιήθηκε σαν μια συντηρημένη αλληλουχία 9 αμινοξέων (R/KxxLxxxxN) στις B-τύπου κυκλίνες, η οποία είναι απαραίτητη για την πρωτεόλυσή τους, ενώ η μεταφορά της σε άλλη πρωτεΐνη την κάνει ασταθή κατά τη μίτωση (Glotzer et al., 1991). To μοτίβο αυτό (D-box) αναγνωρίζεται από το APC/C/Cdc20 σύμπλοκο, ενώ η σύνδεση του APC/C με το Cdh1 του δίνει μεγαλύτερο εύρος υποστρωμάτων, καθώς το APC/C/Cdh1 αναγνωρίζει και D- αλλά και KEN- αλληλουχίες. Η διαφορική αναγνώριση υποστρωμάτων από τα Cdc20 και Cdh1 υποδηλώνει την άμεση αλληλεπίδρασή τους με τα υποστρώματα. Όντως έχει δειχθεί in vitro oτι το Cdh1 αλληλεπιδρά άμεσα με κάποια υποστρώματα με ένα D- ή KEN- box εξαρτώμενο τρόπο και μέσω της αλληλεπίδρασής του με την υπομονάδα APC3 μεσολαβεί για την πρωτεόλυσή τους (Vodermaier et al., 2003). Σε ότι αφορά το APC/C/Cdc20, δεν είναι απόλυτα ξεκάθαρος ο τρόπος αλληλεπίδρασής του με τα υποστρώματα του. Ενώ έχει δειχθεί η δέσμευση κάποιων υποστρωμάτων στo Cdc20, ωστόσο και το APC/C είναι σε θέση να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που φέρουν D-boxes ανεξάρτητα από την παρουσία του Cdc20. Στον S.cerevisiae η Securin και η Clb5, οι βασικοί στόχοι του APC/C/Cdc20 πρωτεολύονται ταυτόχρονα στο τέλος της μετάφασης και οδηγούν στην ανάφαση. Στα ζωικά κύτταρα όμως η σειρά προωτεόλυσης των υποστρωμάτων του APC/C/Cdc20 εξαρτάται διαφορικά από το σημείο ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle assembly checkpoint, SAC), το οποίο αποτρέπει τη μετάβαση στην ανάφαση της μίτωσης αν δεν έχουν όλα τα χρωμοσώματα ευθυγραμμιστεί στη μεταφασική πλάκα. Έτσι ενώ η πρωτεόλυση κάποιον υποστρωμάτων είναι ανεξάρτητη από την ικανοποίηση του σημείου ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου και πρωτεολύονται κατά την προμετάφαση όπως η κυκλίνη A, η κινάση Nek2A και ο μεταγραφικός παράγοντας HOXC10 (den Elzen and Pines, 2001; Gabellini et al., 2003; Hayes et al., 2006), η πρωτεόλυση άλλων υποστρωμάτων όπως της κυκλίνης B και της securin εξαρτάται αυστηρά από την ικανοποίηση του σημείου ελέγχου και συμβαίνει μετά τη μετάφαση (Musacchio and Salmon, 2007). Με χρήση μικροσκοπίας σε ζωντανά κύτταρα έχει δειχθεί ότι ο πρώτος στόχος του APC/C είναι η κυκλίνη Α, ακριβώς μετά τη ρήξη του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση συγχρονισμένων κυτταρικών πληθυσμών έδειξε ότι η πρωτεόλυση των Nek2A και ΗOXC10 γίνεται παράλληλα και έπεται αυτή της πρωτεόλυσης της κυκλινης Α (Εικόνα1.3) (den Elzen and Pines, 2001; Gabellini et al., 2003; Hayes et al., 2006). Όταν υπάρχουν μη προσδεδεμένα χρωμοσώματα στην άτρακτο κατά την προμετάφαση, η Μad2 σε συνεργασία με άλλες πρωτεΐνες του SAC, αλληλεπιδρά με το Cdc20 και αποτρέπει την πρωτεόλυση της κυκλίνης B και της securin. Αυτό που έχει προταθεί σχετικά με τους προμεταφασικούς στόχους του APC/C είναι ότι μπορούν να αναγνωρίζονται από το APC/C ανεξάρτητα από το Cdc20, ενώ η παρουσία του Cdc20 είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της ικανότητας του 20

21 1. Εισαγωγή APC/C στην αναγνώριση πολλαπλών υποστρωμάτων αλλάζοντας τη στερεοδιαμόρφωση του συμπλοκου (Sullivan and Morgan, 2007). Η πρωτεόλυση της κυκλίνης B και η πτώση της ενεργότητας της Cdk επιτρέπουν την πρόσδεση του Cdh1 στο APC/C. H πρόσδεση του Cdh1 στο APC/C έχει σαν αποτέλεσμα την αναγνώριση του Cdc20 ως υπόστρωμα του APC/C, την ουβικουϊτινιλίωση και πρωτεόλυσή του (Pfleger and Kirschner, 2000). Οι πρωτεΐνες στόχοι του APC/C/Cdh1 είναι ρυθμιστικές πρωτεΐνες όπως κινάσες της μίτωσης, ο αναστολέας του κυτταρικού κύκλου Geminin όπως επίσης και λειτουργικά συστατικά της ατράκτου και των κινητοχώρων που αποδιοργανώνονται προκειμένου να επιστρέψει το κύτταρο στην μεσοφασική του κατάσταση. Βασικές κινάσες που στοχεύονται από το APC/C/Cdh1 για πρωτεόλυση είναι η Plk1 και η Aurora A (Lindon and Pines, 2004; Littlepage and Ruderman, 2002). Mε τεχνικές μικροσκοπίας σε ζωντανά κύτταρα αποκαλύφθηκε ότι η πρωτεόλυση των υποστρωμάτων από το APC/C/Cdh1 γίνεται σε διαφορετικό χρόνο κατά την ανάφαση (Εικόνα 1.3). Ωστόσο τόσο η Plk1, όσο και η Aurora A μπορούν να απενεργοποιηθούν και με εναλλακτικούς μηχανισμούς όπως είναι η αποφωσφορυλίωση ή στην περίπτωση της Αurora A αποδέσμευσή της από τον ενεργοποιητή της TPX2 (Tsai et al., 2003). Επομένως η πρωτεόλυση δεν είναι απαραίτητη για την απενεργοποίησή τους αλλά καθιστά πιο αποδοτική και μη αντιστρεπτή την έξοδο από τη μίτωση. Έχει δειχθεί ότι παρουσία ενός μεταλλάγματος της Plk1, το οποίο δεν μπορεί να πρωτεολυθεί, η κυτταροκίνηση δεν διεξάγεται κανονικά καθώς η θέση της ατράκτου και του συσταλτού δακτυλίου δεν ταυτίζονται (Lindon and Pines, 2004). To βασικό πρόβλημα των κυττάρων από τα οποία απουσιάζει η Cdh1 ωστόσο δεν είναι η ικανότητα εξόδου από τη μίτωση, αλλά σε αποφάσεις που λαμβάνονται κατά τη φάση G1 όπως η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο (Peters, 2002; Wirth et al., 2004). 21

22 1. Εισαγωγή Εικόνα 1.3 Η πρωτεόλυση των μιτωτικών υποστρωμάτων είναι μια αυστηρά χρονικά ρυθμιζόμενη διαδικασία. Σχηματική αναπαράσταση της χρονικής σειράς με την οποία αποικοδομούνται τα μιτωτικά υποστρώματα από το APC/C. Το APC/C αναγνωρίζει και οδηγεί προς πρωτεόλυση διαφορετικές πρωτεΐνες σε διαφορετικές χρονικές στιγμές γεγονός που εξαρτάται από παράγοντες όπως η ικανοποίηση του σημείου ελέγχου του σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου και η αντικατάσταση του Cdc20 από το Cdh1. (Τροποιημένη εικόνα από (Sullivan and Morgan, 2007) H απενεργοποίηση του APC/C Στην προηγούμενη παράγραφο αναφέρθηκε ότι το σύμπλοκο APC/C/Cdc20 απενεργοποιείται πριν την έξοδο από τη μίτωση. Η αποφωσφορυλίωση του APC/C οδηγεί σε αποδιοργάνωση του APC/C/Cdc20 και στη συνέχεια το Cdc20 αναγνωρίζεται σαν υπόστρωμα του APC/C/Cdh1 (Sorensen et al., 2000). H απενεργοποίηση του APC/C/Cdh1 συμβαίνει αργότερα, κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S. H απενεργοποίηση αυτή είναι απαραίτητη για τη συσσώρευση των υποστρωμάτων του όπως οι κυκλίνες, οι οποίες είναι απαραίτητες για την έναρξη της αντιγραφής και την ακολουθούμενη είσοδο στη μίτωση (Kramer et al., 2000). Στον S.cerevisiae η απενεργοποίηση του APC/C/Cdch1 εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση του Cdh1 από τη Cdκ1. H κυκλινη Clb5 η οποία αποτελεί στόχο του APC/C/Cdc20 αλλά όχι του APC/C/Cdh1, προσδένεται και ενεργοποιεί την Cdk1 στην αρχή της φάσης S. Η απενεργοποίηση του APC/C/Cdc20 από το APC/C/Cdh1 επιτρέπει τη 22

23 1. Εισαγωγή συσσώρευση της Clb5 και την ενεργοποιήση της Cdk1 με αποτέλεσμα την ανασταλτική φωσφορυλίωση του APC/C/Cdh1 (Shirayama et al., 1999). Αντίστοιχος είναι ο μηχανισμός απενεργοποίησης του APC/C/Cdh1 στην Drosophila melanogaster όπου η Cdk1 κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S ενεργοποιείται από την πρόσδεση της κυκλινης E, η οποία δεν αποτελεί υπόστρωμα ούτε του APC/C/Cdc20 ούτε του APC/C/Cdh1, φωσφορυλιώνοντας ανασταλτικά το σύμπλοκο APC/C/Cdh1 (Knoblich et al., 1994). Ωστόσο στην Drosophila υπάρχει ένας επιπλέον ρυθμιστικός μηχανισμός που συμβάλει στην απενεργοποίηση του APC/C/Cdh1 κατά τις S και G2 φάσεις, η πρωτεΐνη RCA1 η οποία προσδένεται στο APC/C/Cdh1 το απενεργοποιεί και επιτρέπει την συσσώρευση της κυκλίνης A1 (Grosskortenhaus and Sprenger, 2002). Στα σπονδυλωτά έχει βρεθεί σε πειράματα in vitro ότι το σύμπλοκο κυκλίνη A/Cdk2 και όχι κυκλίνη E/Cdk2 είναι υπεύθυνο για την απενεργοποίηση του APC/C/Cdh1 κατά την μετάβαση από τη G1 στην S. Επομένως η συσσώρευση της κυκλίνης Α και όχι της κυκλίνης E είναι ο καθοριστικός παράγοντας για την απενεργοποίηση του APC/C/Cdh1 (Lukas et al., 1999). Το γεγονός όμως ότι η κυκλίνη Α αποτελεί υπόστρωμα τόσο του APC/C/Cdc20 όσο και του APC/C/Cdh1 δημιουργεί το ερώτημα πως είναι εφικτή η συσσώρευση αρκετά υψηλών επιπέδων κυκλίνης A για την επαγωγή της απενεργοποίησης του APC/C/Cdh1. Οι δύο μηχανισμοί που παρατίθενται παρακάτω θα μπορούσαν να δώσουν απάντηση σε αυτό το ερώτημα. Στα σπονδυλωτά υπάρχει το ορθόλογο της RCA1, η Εmi1 (early mitotic inhibitor 1), η οποία επάγεται κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S από τον μεταγραφικό παράγοντα Ε2F (Reimann et al., 2001). H πρόσδεση της Emi1 στο APC/C/Cdh1 οδηγεί στην απενεργοποίηση του και επιτρέπει την συσσώρευση των υποστρωμάτων του. Ένας επιπλέον ρυθμιστικός μηχανισμός εμπλέκει την E2 τρανσφεράση UBCH10, η οποία συνεργάζεται με το APC/C μεταφέροντας την ομάδα της ουβικουϊτίνης στα υποστρώματα του APC/C (Rape and Kirschner, 2004). Mε βάση αυτό το μοντέλο, η UBCH10 αποτελεί η ίδια υπόστρωμα του APC/C/Cdh1 κατά την G1 και με αυτόν τον τρόπο το ίδιο το APC/C/Cdh1 ξεκινάει την απενεργοποίηση του και επιτρέπει την συσσώρευση της κυκλίνης Α, την επικειμένη ενεργοποίηση της Cdk2 από την κυκλίνη Α και τελικά την ανασταλτική φωσφορυλίωση του APC/Cdh1 από την Cdk2 (Rape and Kirschner, 2004) Τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου για βλάβη στο DNA Η σωστή ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου απαιτεί την ύπαρξη μηχανισμών επιτήρησής του, οι οποίοι θα εξασφαλίζουν ότι το κύτταρο δεν θα μεταβεί στην επόμενη φάση αν δεν έχουν ολοκληρωθεί ορθώς τα γεγονότα της προηγούμενης. 23

24 1. Εισαγωγή Αυτοί οι μηχανισμοί καλούνται σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Οι μηχανισμοί αυτοί οδηγούν σε καθυστέρηση ή παύση του κυτταρικού κύκλου μέχρι την ολοκλήρωση των απαιτούμενων γεγονότων και την πλήρωση προϋποθέσεων όπως κατάλληλο μέγεθος, ύπαρξη εξωκυττάριων σημάτων πολλαπλασιασμού, απουσία βλαβών στο DNA κ.α. Τα σημεία ελέγχου βασίζονται στη δράση πρωτεϊνών που ρυθμίζουν την ενεργότητα των CDKs, όπως oi κινάσες wee1 και plk1 που φωσφορυλιώνουν και αδρανοποιούν τις CDKs, οι φωσφατάσες της οικογενείας Cdc25 που αφαιρούν την αδρανοποιητική φωσφορική ομάδα από τις CDKs επάγοντας την ενεργοποίηση τους και την πρόοδο του κύκλου. Σημαντικά για την διατήρηση της ακεραιότητας του γενετικού υλικού είναι τα σημεία ελέγχου για βλάβες στο DNA. Παράγοντες όπως η υπεριώδης ή ιονίζουσα ακτινοβολία, έκθεση σε χημικά, λάθη κατά την αντιγραφή του DNA ή ακόμα και προϊόντα του κυτταρικού μεταβολισμού προκαλούν βλάβες στο DNA με τη μορφή μονών ή διπλών θραύσεων ή παρουσία μονόκλωνου DNA, σύνδεσης μεταξύ των δύο κλώνων του DNA (intrastrand crosslinks). Oι βλάβες αυτές πρέπει να διορθωθούν πριν την αντιγραφή του DNA ή το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στα δύο θυγατρικά κύτταρα. Τα βασικά σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου για βλάβες στο DNA είναι από τη G1 στη φάση S, κατά την διάρκεια της S φάσης και κατά τη μετάβαση από τη G2 στη μίτωση και περιλαμβάνουν ένα δίκτυο πρωτεϊνών το οποίο αποτελείται από πρωτεΐνες που αντιλαμβάνονται την βλάβη που έχει προκληθεί στο DNA και μετάγουν σήματα σε πρωτεΐνες διαμεσολαβητές, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν πρωτεΐνες τελεστές. Οι τελευταίες και είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με κεντρικούς ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και να επάγουν την παύση του κύκλου του μέχρι τη διόρθωση της βλάβης. Παρά την ιεραρχική κατανομή που παρουσιάζεται παραπάνω, ο τρόπος δράσης των πρωτεϊνών αυτών δεν είναι γραμμικός αλλά οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με τα σημεία ελέγχου για βλάβες στο DNA εμπλέκονται σε πολύπλοκα δίκτυα ενώ πρέπει ταχύτατα και αποδοτικά να επεξεργάζονται τα σήματα που λαμβάνουν και να απαντούν με τις κατάλληλες ενζυμικές αντιδράσεις με βάση τις ανάγκες του κυττάρου που εκτίθεται στην γενοτοξική βλάβη (Lukas et al., 2004; Nyberg et al., 2002) Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στα σημεία ελέγχου για βλάβες στο DNA και η γενική οργάνωση τους Τα βασικά συστατικά του πρωτεϊνικού δικτύου των σημείων ελέγχου για βλάβες στο DNA στα θηλαστικά μπορούν να διακριθούν σε 5 κατηγορίες. Η πρώτη περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες αισθητήρες (checkpoint sensors), oι οποίες εμπλέκονται στην αναγνώριση της βλάβης και περιλαμβάνουν το σύμπλοκα Rad9-Hus1-Rad1, Rad17-RCF και Μre-Rad50-Nbs1 ή ΜRN. H δεύτερη περιλαμβάνει πρωτεΐνες διαμεσολαβητές (checkpoint mediators) οι οποίες συμμετέχουν σε μονοπάτια 24

25 1. Εισαγωγή μεταγωγής του σήματος όπως οι BRCA1, MDC1/NFBD1, 53BP1 και Clapsin (Petrini and Stracker, 2003). H τρίτη αποτελείται από τις κινάσες μεταγωγής του σήματος (signal transduction kinases) και συγκεκριμένα από τις 3-κινάσες φωσφατιδοϊνοσιτόλης (PI3K), ΑΤΜ και ATR. H τέταρτη περιλαμβάνει τις τελεστικές κινάσες σερίνης/ θρεονίνης (effector kinases) Chk1 και Chk2 (Bartek and Lukas, 2003) και η πέμπτη τις πρωτεΐνες τελεστές, οι οποίες είτε είναι ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου όπως η φωσφατάση Cdc25, είτε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διόρθωση της βλάβης, μεταγραφικοί παράγοντες όπως το p53 ή ο E2F, στοιχεία της χρωματίνης όπως η ιστόνη H2AX καθώς και άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών (Nyberg et al., 2002) To σημείο ελέγχου από τη G1 στην S Το σημείο ελέγχου από τη G1 στην S εξασφαλίζει ότι το κύτταρο δεν θα ξεκινήσει την αντιγραφή του γενετικού του υλικού παρουσία βλαβών στο DNA. Oι δύο βασικοί στόχοι των κινασών ATM/ATR και Chk1/Chk2 είναι η φωσφατάση Cdc25A και ο μεταγραφικός παράγοντας p53. Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση των παραπάνω στόχων συμβαίνει άμεσα και ταυτόχρονα, η επίδραση αυτών των δύο πρωτεϊνών τελεστών στη μηχανή του κυτταρικού κύκλου είναι διαφορετική καθώς τα γεγονότα που σχετίζονται με την φωσφορυλίωση της Cdc25A προσφέρουν ένα γρήγορο μηχανισμό απόκρισης στην βλάβη ενώ αυτά που σχετίζονται με την ενεργοποιήση του p53 απαιτούν περισσότερο χρόνο, καθώς απαιτείται η μεταγραφή των γονιδίων στόχων του (Bartek and Lukas, 2001). Πιο συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση της Cdc25A από τις κινάσες Chk1/Chk2 σε πολλαπλά κατάλοιπα σερίνης οδηγεί στην αποικοδόμηση της μέσω του πρωτεοσώματος. Το αποτέλεσμα είναι η μη ενεργοποιήση της Cdk2 και να αποτρέπεται η φόρτωση του παράγοντα Cdc45, βασικού συστατικού του προεναρκτηριόυ συμπλόκου της αντιγραφής, στις αφετηρίες της αντιγραφής και κατ επέκταση η έναρξη της αντιγραφής του DNA (Falck et al., 2002) (Εικόνα 1.4). To παραπάνω μονοπάτι είναι ανεξάρτητο από τη δράση του p53, ενεργοποιείται άμεσα και προσφέρει μια παροδική καθυστέρηση στην εξέλιξη του κύκλου (Molinari et al., 2000). Αντίθετα η παρατεταμένη παύση του κύκλου κατά τη μετάβαση από τη G1 στην S προσφέρεται από το μονοπάτι που ενεργοποιείται από τη φωσφορυλίωση του p53 από τις κινάσες ATM/ATR και Chk1/Chk2. Παράλληλα οι ATM/ATR στοχεύουν και απενεργοποιούν τη λιγάση της ουβικουϊτίνης Μdm2, η οποία προσδένεται και απενεργοποιεί το p53 εξασφαλίζοντας την άμεση σταθεροποίηση και αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας του p53 σε απόκριση στην βλάβη (Maya et al., 2001). Βασικό μεταγραφικό στόχο του p53 αποτελεί ο αναστολέας της Cdk2, p21. To αποτέλεσμα της συσσώρευσης του p21 είναι η αναστολή της δράσης των Cdk4/6 και Cdk2 και η αδυναμία προόδου της G1 και εισόδου σε S (Sherr and Roberts, 1999) (Εικόνα 1.4). Αυτή η απόκριση μπορεί να πάρει ώρες (εξαρτάται από τον κυτταρικό 25