ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘ. Ι. Γ. ΒΛΑΧΟΓΙΑΝΝΗΣ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕΣΟΛΑΒΗΤΩΝ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΑ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ ΝΕΦΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΥΑΓΓΕΛΟΥ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΙΑΤΡΟΥ ΝΕΦΡΟΛΟΓΟΥ ΠΑΤΡΑ 2009 [1]

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘ. Ι. Γ. ΒΛΑΧΟΓΙΑΝΝΗΣ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕΣΟΛΑΒΗΤΩΝ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΑ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΑ ΝΕΦΡΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΥΑΓΓΕΛΟΥ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ ΙΑΤΡΟΥ ΝΕΦΡΟΛΟΓΟΥ ΠΑΤΡΑ 2009 [2]

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Δημήτριος Σ. Γούμενος Καθηγητής Νεφρολογίας, επιβλέπων καθηγητής 2. Ιωάννης Γ. Βλαχογιάννης Καθηγητής Νεφρολογίας, μέλος Τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής 3. Κωνσταντίνος Φουρτούνας Αναπληρωτής Καθηγητής Νεφρολογίας, μέλος Τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Δημήτριος Σ. Γούμενος Καθηγητής Νεφρολογίας, επιβλέπων καθηγητής 2. Ιωάννης Γ. Βλαχογιάννης Καθηγητής Νεφρολογίας, μέλος Τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής 3. Κωνσταντίνος Φουρτούνας Αναπληρωτής Καθηγητής Νεφρολογίας, μέλος Τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής 4. Παναγιώτης Κατσώρης Αναπληρωτής Καθηγητής Βιολογίας, μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. 5. Ιωάννης Τσολάκης Καθηγητής Αγγειοχειρουργικής, μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. 6. Πέτρος Περιμένης Καθηγητής Ουρολογίας, μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. 7. Χριστόδουλος Φλωρδέλλης Καθηγητής Φαρμακολογίας, μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. [3]

4 Στην οικογένεια μου, για την πολύτιμη στήριξη που απλόχερα μου προσφέρει [4]

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΝΕΦΡΟΥ ΜΙΚΡΟΑΓΓΕΙΩΣΗ ΤΟ ΝΕΦΡΟΥ ΝΕΦΡΩΝΑΣ ΣΠΕΙΡΑΜΑ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΕΣΑΓΓΕΙΟ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΑ ή ΕΠΙΘΗΛΙΟ ΦΡΑΓΜΟΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ 1.2 ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΓΓΥΣ ΕΣΠΕΙΡΑΜΕΝΟ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟ ΑΓΛΥΛΗ HENLE ΑΠΩ ΕΣΠΕΙΡΑΜΕΝΟ ΣΛΗΝΑΡΙΟ ΑΘΡΟΙΣΤΙΚΟ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟ ΠΑΡΑΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΣΥΣΚΕΥΗ 1.3 ΔΙΑΜΕΣΟΣ ΝΕΦΡΙΚΟΣ ΧΩΡΟΣ 1.4 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΝΕΦΡΟΥ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΝΕΦΡΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΗΘΗΣΗ ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΕΠΑΝΑΡΟΦΗΣΗ ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΑΠΕΚΚΡΙΣΗ ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ 2 ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ 2.1 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ 2.2 ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΠΕΚΚΡΙΣΗ 2.3 ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ 2.4 ΝΕΦΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ 2.5 ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΙΣΧΑΙΜΙΑ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑ ΡΕΝΙΝΗΣ ΑΓΓΕΙΟΤΕΝΣΙΝΗΣ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝΔΙΝΕΣ [5]

6 3 ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ 3.1 ΣΥΝΘΕΤΑΣΕΣ ΤΟΥ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ 3.2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ 3.3 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΣΥΝΘΕΤΑΣΩΝ ΤΟΥ ΝΟ 3.4 ΓΟΥΑΝΥΛΙΚΗ ΚΥΚΛΑΣΗ 3.5 ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ ΚΑΙ ΝΕΦΡΟΣ 4 ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ 4.1 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ 4.2 ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ 4.3 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ 4.4 ΕΤ 1 ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 4.5 ET 1 ΚΑΙ ΝΕΦΡΟΣ 4.6 Η ΕΤ 1 ΣΕ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΥΠΕΡΤΑΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ ΑΘΗΡΟΣΚΛΗΡΥΝΣΗ ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΙ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ STRESS ΠΡΩΤΕΙΝΟΥΡΙΑ 5 ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ 5.1 ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΡΙΤΗΡΙΑ 5.2 ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6 ΕΡΩΤΗΜΑ ΠΡΟΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ 7 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 7.1 Καλλιέργειες ΗΚ 2 κυττάρων Ανακαλλιέργεια κυττάρων Μέτρηση κυττάρων σε αιµοκυτταρόµετρο Neubauer Συλλογή πρωτεϊνικού εκχυλίσματος από κυτταροκαλλιέργεια 7.2 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS PAGE) 7.3 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Διαλύματα 7.4 Ανοσοστύπωμα (western blotting) Πειραματική πορεία Διαλύματα [6]

7 7.5 Απομόνωση RNA Πειραματικό μέρος 7.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT PCR) Διαλύματα 7.7 Προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ Πειραματική πορεία 7.8 ELISA (Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay) Προσδιορισμός της ET 1 με ELISA τύπου sandwich 7.9 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλύματος νουκλεϊκών οξέων 7.10 Προσδιορισμός νιτρωδών ιόντων µε τη μέθοδο Griess 7.11 Ανοσοφθορισμός Πειραματική πορεία 8 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8.1 ΤΟΞΙΚΗ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗΣ ΣΤΑ HK 2 ΚΥΤΤΑΡΑ. 8.2 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗΣ ΣΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ ΚΑΙ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ Επίδραση της κυκλοσπορίνης στην ενδοθηλίνη 1 και στους ETR A και ETR B υποδοχείς Επίδραση της κυκλοσπορίνης στο νιτρικό οξείδιο και στις συνθετάσες του enos και inos [7]

8 8.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΩΝ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΚΑΛΟΥΜΕΝΗ ΑΠΟ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ enos και inos 8.4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ ΣΤΗΝ ΠΡΟΚΑΛΟΥΜΕΝΗ ΑΠΟ ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ ETR A ΚΑΙ ETR B 8.5 ΣΥΝΟΨΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 9 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 11 SUMMARY 12 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 13 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΣΕ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΑ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕΔΡΙΑ [8]

9 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ACE: μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης AngII: αγγειοτενσίνη ΙΙ BH4: τετραϋδροβιοπτερίνη BSA: αλβουμίνη ορού βοός CaM: καλμοδουλίνη cgmp: κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη CsA: κυκλοσπορίνη ECE: μετατρεπτικό ένζυμο της ΕΤ ECM: εξωκυττάρια ύλη EDRF: προερχόμενος από το ενδοθήλιο παράγοντας χαλάρωσης enos: ενδοθηλιακή συνθετάση του ΝΟ ET: ενδοθηλίνη ETR A, Β: υποδοχέας της ενδοθηλίνης Α, Β inos: επαγώγιμη συνθετάση του ΝΟ MCP 1: μονοκυτταρική χημειοτακτική πρωτεΐνη 1 nnos: νευρωνική συνθετάση του ΝΟ NO: μονοξείδιο του αζώτου ONA: οξεία νεφρική ανεπάρκεια ROS: ελεύθερες ρίζες οξυγόνου sgc: διαλυτή γουανυλική κυκλάση TGF β: μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας β [9]

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ [10]

11 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ [11]

12 1.1 ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΝΕΦΡΟΥ Οι νεφροί βρίσκονται στον οπισθοπεριτοναϊκό χώρο εκατέρωθεν της σπονδυλικής στήλης στο ύψος του 3 ου οσφυϊκού σπονδύλου, ενώ περιβάλλονται από ινώδη κάψα, περινεφρικό λίπος και τέλος από την νεφρική περιτονία η οποία περιβάλλει και τα επινεφρίδια. Σε εγκάρσια διατομή αναγνωρίζονται δύο στοιβάδες, ο φλοιός, που περιλαμβάνει τα σπειράματα και αρκετά τμήματα του σωληναριακού συστήματος και ο μυελός που περιλαμβάνει τα σκέλη της αγκύλης του Henle, τα ανάστροφα φλεβίδια και το τελικό τμήμα των αθροιστικών σωληναρίων. Η κύρια λειτουργία του μυελού είναι η αραίωση και συμπύκνωση των ούρων, ενώ στον φλοιό επιτελείται η σπειραματική διήθηση, η σωληναριακή επαναρόφηση και η σωληναριακή απέκκριση. Εικόνα 1 Κάθετη τομή νεφρού. Διακρίνεται η φλοιώδης μοίρα, η μυελώδης μοίρα και το πυελοκαλυκικό σύστημα ΜΙΚΡΟΑΓΓΕΙΩΣΗ ΝΕΦΡΟΥ Περίπου το 20% του κατά λεπτού όγκου αίματος διοχετεύεται στους νεφρούς παρότι αυτοί αποτελούν μόνο το 0.5% της συνολικής μάζας του ανθρώπινου σώματος. Η νεφρική αρτηρία μετά τη δίοδό της από την νεφρική πύλη διαιρείται στις μεσολόβιες αρτηρίες που κατανέμονται μέσα στον φλοιό ανάμεσα στους κάλυκες. Στο τμήμα μεταξύ φλοιού και μυελού οι μεσολόβιες αρτηρίες διαιρούνται σε τοξοειδείς αρτηρίες που επίσης διακλαδίζονται σε μεσολοβίδιες αρτηρίες μέσα στη φλοιώδη μοίρα. Στην μυελώδη μοίρα δεν εισέρχονται αρτηρίες. Τα προσαγωγά αρτηρίδια των σπειραμάτων γενικά προέρχονται από τις μεσολοβίδιες αρτηρίες, ενώ σπάνια συναντάται προσαγωγό αρτηρίδιο που δεν συνδέεται σε σπείραμα. Ως αποτέλεσμα αυτού, η αιματική παροχή της φλοιώδους και μυελώδους [12]

13 μοίρας προέρχεται στο μεγαλύτερο ποσοστό της από μετασπειραματικά απαγωγά αρτηρίδια τα οποία είναι δύο τύπων: τα απαγωγά αρτηρίδια του φλοιού και αυτά της παραμυελώδους μοίρας. Τα απαγωγά αρτηρίδια του φλοιού δημιουργούν το τριχοειδικό πλέγμα του φλοιού, ενώ αυτά της παραμυελώδους μοίρας αντιπροσωπεύουν τα τροφοφόρα αγγεία του μυελού που διακλαδίζονται σε κατιόντα ευθέα αρτηρίδια. Ανιόντα ευθέα αγγεία αποχετεύουν το αίμα από την μυελώδη μοίρα και καθώς ανέρχονται προς τον φλοιό δημιουργούν τριχοειδικά πλέγματα που περιβάλουν τα σωληνάρια (περισωληναριακά τριχοειδικά πλέγματα) και τελικά παροχετεύονται στα τοξοειδή φλεβίδια. Αυτά τα τριχοειδικά δίκτυα αντιπροσωπεύουν τον ανάστροφης ροής ανταλλάκτη μεταξύ του αίματος που εισέρχεται και αυτού που εξέρχεται της μυελώδους μοίρας. Είναι τέτοια η κατανομή των τριχοειδών της μυελώδους μοίρας που αυτά ανέρχονται απευθείας στην έξω στιβάδα αυτής με αποτέλεσμα το αίμα που εισέρχεται στην έσω στιβάδα του μυελού να μην έχει εκτεθεί προηγούμενα στα σωληνάρια της έξω στιβάδας. Αυτό πιστεύεται ότι συμβάλει στην προστασία του οργανισμού από απώλειες ηλεκτρολυτών στην μυελώδη μοίρα του νεφρού. Εικόνα 2 Σχηματική απεικόνιση της νεφρικής μικροκυκλοφορίας Οι ενδονεφρικές φλέβες συνοδεύουν τις αρτηρίες και αντίστοιχα προς τις τοξοειδείς αρτηρίες, οι τοξοειδείς φλέβες σχηματίζουν αναστομωτικά δίκτυα στην περιοχή μεταξύ φλοιού και μυελού παροχετεύοντας αίμα τόσο από την φλοιώδη, όσο και από την μυελώδη μοίρα. Οι τοξοειδείς φλέβες συνενώνονται σε μεσολοβίδιες φλέβες που εκβάλουν στη νεφρική φλέβα. Οι ενδονεφρικές αρτηρίες και τα προσαγωγά και απαγωγά αρτηρίδια συνοδεύονται από συμπαθητικές νευρικές ίνες που αντιπροσωπεύουν την προσαγωγό νεύρωση του νεφρού. Τα σωληνάρια έχουν απευθείας επαφή με νευρικές απολήξεις μόνον εάν βρίσκονται πλησίον αρτηριδίου. [13]

14 1.2 ΝΕΦΡΩΝΑΣ Η μικρότερη ανατομικά και λειτουργικά μονάδα του νεφρού είναι ο νεφρώνας που αποτελείται από το νεφρικό σωμάτιο ή σπείραμα και από το ουροφόρο σωληνάριο (εικόνα 3). Κάθε ανθρώπινος νεφρός απαρτίζεται από περίπου ένα εκατομμύριο σπειράματα, ενώ ο αριθμός αυτός ποικίλει από άτομο σε άτομο. Το σωληναριακό τμήμα του νεφρώνα αρχίζει με το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο (εσπειραμένο α τάξης) που συνεχίζει ως αγκύλη του Henle με το λεπτό κατιόν σκέλος, την αγκύλη και το παχύ ανιόν σκέλος και συνεχίζει ως άπω εσπειραμένο (εσπειραμένο β τάξης) το οποίο καταλήγει στο αθροιστικό σωληνάριο. Πολλοί νεφρώνες εκβάλουν σε ένα αθροιστικό σωληνάριο, ενώ πολλά αθροιστικά σωληνάρια συνενώνονται και εκβάλουν μέσω των νεφρικών θηλών στην πύελο. Οι νεφρώνες, ανάλογα με το μήκος και τη θέση τους μέσα στο νεφρικό παρέγχυμα, διακρίνονται σε νεφρώνες της φλοιώδους και σε νεφρώνες της εν τω βάθει μυελώδους μοίρας (εικόνα 4). Οι πρώτοι έχουν μικρό μήκος και τα σπειράματά τους βρίσκονται στην φλοιώδη μοίρα του νεφρού, η δε αγκύλη του Henle μόλις και εισέρχεται στην εξωτερική στοιβάδα της μυελώδους μοίρας. Οι νεφρώνες της εν τω βάθει μυελώδους μοίρας έχουν μεγάλο μήκος, τα σπειράματά τους βρίσκονται στο έσω τριτημόριο της φλοιώδους μοίρας (παραμυελικοί νεφρώνες) και η αγκύλη του Henle εκτείνεται βαθιά μέσα στη μυελώδη μοίρα και μπορεί να φθάνει μέχρι και τις νεφρικές θηλές. Εικόνα 3: Νεφρώνας και περισωληναριακό τριχοειδικό σύστημα [14]

15 Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση των διαφόρων τύπων νεφρώνων ανάλογα με την εντόπισή τους και το μήκος της αγκύλης του Henle ΣΠΕΙΡΑΜΑ Τα σπειράματα αποτελούνται από εξειδικευμένα τριχοειδή τα οποία είναι σε συνέχεια των προσαγωγών αρτηριδίων, ενώ περιβάλλονται από επιθήλιο το οποίο σχηματίζει την κάψα του Bowman. Μετά την ενδοκάψια πορεία των σπειραματικών αγκυλών αυτές συνενώνονται σε ένα αγγείο, το απαγωγό αρτηρίδιο. Η κάψα του Bowman αποτελείται από δύο πέταλα, ένα περίσπλαχνο που επικαλύπτει τα σπειραματικά τριχοειδή κα ένα περίτονο που καλύπτει όλη την κάψα πλην του αγγειακού πόλου. Ο χώρος μεταξύ του περίσπλαχνου και περίτονου χώρου ονομάζεται ουροφόρος χώρος μέσα στον οποίο εισέρχεται το πρώιμο διήθημα. Εικόνα 5 Το σπείραμα σχηματικά και όπως φαίνεται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. [15]

16 Εικόνα 6 Σχηματική απεικόνιση ενός σπειράματος. Διακρίνονται οι τριχοειδικές αγκύλες με το ενδοθήλιο και τα ποδοκύτταρα, η παρασπειραματική συσκευή με τα κοκκώδη κύτταρα, ο ουροφόρος χώρος του Bowman, το μεσάγγειο, το προσαγωγό και απαγωγό αρτηρίδιο ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Η σπειραματική βασική μεμβράνη αποτελεί μία πολύπλοκη κατασκευή που προσφέρει στηρικτική λειτουργία και συμβάλει στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των σπειραματικών τριχοειδών. Στην έσω επιφάνεια αυτής έρχεται σε άμεση επαφή με τα τριχοειδή και το μεσάγγειο. Η μεμβράνη αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη και πρωτεογλυκάνες ενώ είναι αρνητικά φορτισμένη λόγω της ύπαρξης των πολυανικών πρωτεογλυκανών ΜΕΣΑΓΓΕΙΟ Τρεις τύποι κυττάρων απαντώνται εντός των τριχοειδικών αγκυλών και οι οποίοι είναι σε άμεση επαφή με τη βασική μεμβράνη: τα μεσαγγειακά κύτταρα με την μεσαγγειακή ουσία, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα ποδοκύτταρα ή επιθηλιακά κύτταρα (εικ. 5). Τα μεσαγγειακά κύτταρα με ειδικές προσεκβολές προσκολλώνται στη βασική μεμβράνη και μαζί με την μεσαγγειακή ουσία καθορίζουν μέσω μηχανισμών σύσπασης και χάλασης το μέγεθος της βασικής μεμβράνης και κατά συνέπεια την επιφάνεια διήθησης. [16]

17 1.2.4 ΕΝΔΟΘΗΛΙΟ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα του σπειράματος σε αντίθεση με τα αντίστοιχα των αγγείων στερούνται διαφραγμάτων στις μεταξύ τους συνδέσεις και έτσι δημιουργούνται πόροι διαμέτρου nm επιτρέποντας την διέλευση διηθήματος, ενώ η αυλική τους πλευρά είναι αρνητικά φορτισμένη ΠΟΔΟΚΥΤΤΑΡΑ ή ΕΠΙΘΗΛΙΟ Τα ποδοκύτταρα αποτελούν υψηλής διαφοροποίησης κύτταρα τα οποία δεν μπορούν να πολλαπλασιαστούν(εικ. 6). Κατά συνέπεια απώλειά τους από οιονδήποτε βλαπτικό παράγοντα δεν μπορεί να αναπληρωθεί. Η διαφοροποίησή στην τελική τους μορφή με τις χαρακτηριστικές προσεκβολές οφείλεται στην ύπαρξη εξειδικευμένων πρωτεϊνών όπως είναι η ποδοκαλυξίνη, η νεφρίνη, η ποδοσίνη, η συναπτοποδίνη και η πρωτεΐνη GLEPP 1. Προσεκβολές γειτνιαζόντων ποδοκυττάρων αλληλοσυμπλέκονται αφήνοντας μεταξύ τους ελικοειδείς σχισμές (σχισμές διήθησης) οι οποίες γεφυρώνονται μέσω της διαφραγματικής σχισμής. Η διαφραγματική σχισμή έχει πλάτος 30 40nm επιτρέποντας την συνεχή δίοδο διηθήματος από το τριχοειδές προς τον ουροφόρο χώρο ΦΡΑΓΜΟΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ Διήθηση στα σπειραματικά τριχοειδή επιτελείται διαμέσου μιας εξωκυτταρίου οδού που περιλαμβάνει τους ενδοθηλιακούς πόρους, τη σπειραματική βασική μεμβράνη και τέλος την σχισμή διήθησης. Ο φραγμός διήθησης επιτρέπει ελεύθερα τη δίοδο ύδατος, ενώ υπάρχουν περιορισμοί μεγέθους, σχήματος και φορτίου για μικρο και μεγαλομοριακές ουσίες (εικ. 7). Εικόνα 7 Απεικόνιση του φραγμού διήθησης με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και σχηματικά [17]

18 1.3 ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το σωληναριακό σύστημα αποτελείται από το εγγύς εσπειραμένο, την αγκύλη του Henle, το άπω εσπειραμένο και το αθροιστικό σωληνάριο. Τα νεφρικά σωληνάρια αποτελούνται από μία στοίβα επιθηλίου που προσκολλάται σε βασική μεμβράνη, ενώ είναι κυβοειδή και συνδέονται μεταξύ τους μέσω στενών συνδέσεων (tight junctions) και σπανίως μέσω δεσμοσωματίων. Κατά συνέπεια δύο οδοί διέλευσης ουσιών υφίστανται: η διακυτταρική οδός που περιλαμβάνει την μεταφορά δια της αυλικής και βασικής επιφάνειας και του κυτταροπλάσματος του επιθηλίου και η παρακυτταρική οδός που περιλαμβάνει μεταφορά ουσιών δια των σχισμών των επιθηλιακών κυττάρων ΕΓΓΥΣ ΕΣΠΕΙΡΑΜΕΝΟ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟ Το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο (εικ. 8, 9) είναι υπεύθυνο για την επαναρόφηση του μεγαλύτερου ποσοστού του διηθημένου ύδατος μέσω των ακουαπορινών 1 (aquaporin 1) και των ηλεκτρολυτών όπως νάτριο, κάλιο, ασβέστιο, ενώ επαναροφά και το μεγαλύτερο ποσοστό της διηθούμενης γλυκόζης. Η αυλική του επιφάνεια φέρει ψηκτροειδή παρυφή που αυξάνει σημαντικά την επιφάνεια επαναρόφησης, ενώ η βασικοπλάγια του πλευρά φέρει πολλές συνδέσεις που αλληλοσυμπλέκονται μεταξύ τους. Τα επιθήλια του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου φέρουν πολλά μιτοχόνδρια ώστε να καλύπτονται οι ενεργειακές ανάγκες της αντλίας Na + K + ATPάση που είναι κυρίως υπεύθυνη για την διακυτταρική οδό μεταφοράς. Το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο φέρει επίσης και ένα σημαντικό σύστημα λυσοσωματίων που είναι υπεύθυνο για την επαναρόφηση μακρομορίων όπως πολυπεπτίδια και πρωτεΐνες όπως είναι η αλβουμίνη. Το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο διαιρείται σε επιμέρους τμήματα τα οποία διαφέρουν σε κυτταρική οργάνωση αλλά και λειτουργία (S 1, S 2, S 3 ). Εικόνα 8 Διαγραμματική απεικόνιση επιθηλιακού κυττάρου του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου. Διακρίνεται η ψηκτροειδής παρυφή κα η βάση της αποτελούμενη από νημάτια ακτίνης. [18]

19 Εικόνα 9: Κύτταρο εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου σε σχηματική απεικόνιση. Διακρίνεται ο μεγάλος αριθμός μιτοχονδρίων ΑΓΛΥΛΗ HENLE Η αγκύλη Henle αποτελείται από το ευθύ τμήμα σε συνέχεια του εγγύς εσπειραμένου, το λεπτό κατιόν, το λεπτό ανιόν και το παχύ ανιόν τμήμα. Το λεπτό κατιόν όπως και το εγγύς εσπειραμένο είναι υψηλά διαπερατό στο ύδωρ λόγω της παρουσίας ακουαπορινών, ενώ το λεπτό ανιόν τμήμα είναι αδιαπέραστο στο ύδωρ. Αυτή η ιδιαιτερότητα συμβάλλει στη δημιουργία ωσμωτικής διαφοράς πίεσης στη μυελώδη μοίρα. Το παχύ ανιόν τμήμα που είναι αδιαπέραστο στο ύδωρ επαναροφά σημαντικές ποσότητες νατρίου με συνέπεια το νάτριο να εξέρχεται στη μυελώδη μοίρα ενώ το ύδωρ μεταφέρεται στη φλοιώδη μοίρα και από εκεί στη συστηματική κυκλοφορία ΑΠΩ ΕΣΠΕΙΡΑΜΕΝΟ ΣΛΗΝΑΡΙΟ Το άπω εσπειραμένο σωληνάριο (εικ. 10) είναι επίσης ένα υψηλής διαφοροποίησης κύτταρο, ενώ λόγω αυξημένων ενεργειακών αναγκών περιέχει σε πολύ μεγάλη πυκνότητα μιτοχόνδρια. Ο ειδικός μεταφορέας Na + για αυτό το τμήμα του σωληναριακού συστήματος είναι ο Na + Cl συμμεταφορέας. [19]

20 Εικόνα 10 Κύτταρο άπω εσπειραμένου σωληναρίου ΑΘΡΟΙΣΤΙΚΟ ΣΩΛΗΝΑΡΙΟ Το αθροιστικό σωληνάριο υποδιαιρείται σε αυτό της μυελώδους και σε αυτό της φλοιώδους μοίρας, ενώ καθ όλο το μήκος του φέρει ακουαπορίνες 2 (aquaporin 2) που βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της αντιδιουρητικής ορμόνης (κύρια κύτταρα, principal cells). Η αντιδιουρητική ορμόνη ρυθμίζει την διαπερατότητα του αθροιστικού από πλήρως διαπερατό έως αδιαπέραστο στο ύδωρ καθορίζοντας έτσι την τελική ωσμωτικότητα των ούρων. Τα τελικά τμήματα των αθροιστικών της μυελώδους μοίρας φέρουν υποδοχείς ουρίας (UTB1) που με μηχανισμό ανεξάρτητο της αντιδιουρητικής ορμόνης συμμετέχουν στην ανακύκλωση ουρίας, μία διαδικασία σημαντική για την συμπύκνωση των ούρων. Ένας άλλος τύπος κυττάρων του αθροιστικού σωληναρίου είναι τα IC κύτταρα (intercalate cells) τύπου Α και Β. Τα τύπου Α IC κύτταρα εκφράζουν H + ATPάση στην αυλική τους επιφάνεια και εκκρίνουν πρωτόνια, ενώ τα τύπου Β IC κύτταρα εκφράζουν H + ATPάση στην βασική τους επιφάνεια με αποτέλεσμα να εκκρίνουν διττανθρακικά και να επαναροφούν πρωτόνια. Με αυτά τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, τα αθροιστικά σωληνάρια είναι οι τελικού ρυθμιστές της ομοιοστασίας ύδατος και ηλεκτρολυτών έχοντας έναν σημαντικό ρόλο στον χειρισμό Na +, Cl, K + και οξεοβασικής ισορροπίας. [20]

21 1.3.5 ΠΑΡΑΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΣΥΣΚΕΥΗ Η παρασπειραματική συσκευή αποτελείται από την πυκνή κηλίδα, το εξωσπειραματικό μεσάγγειο, το τελικό τμήμα του προσαγωγού αρτηριδίου με τα ρενινοπαραγωγά κοκκώδη κύτταρα και τέλος το αρχικό τμήμα του απαγωγού αρτηριδίου (εικ. 11). Η σημαντικότερη ανοσοϊστοχημική διαφορά των κυττάρων της πυκνής κηλίδας και των άλλων επιθηλιακών κυττάρων του νεφρώνα είναι η υψηλή περιεκτικότητα σε κυκλοοξυγενάση 2 και νευρωνική συνθετάση του νιτρικού οξειδίου (NOS 1). Το εξωσπειραματικό μεσάγγειο λόγω της ειδικής του θέσης μέσα στην παρασπειραματική συσκευή διασυνδέει κατά κάποιον τρόπο όλες τις λειτουργικές δομές του νεφρώνα. Τα κοκκώδη κύτταρα παράγουν ρενίνη που εξωκυττώνεται προς τον γειτνιάζοντα διάμεσο χώρο, ενώ συνδέονται με μεσαγγειακά, λεία μυϊκά και ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ επίσης διαθέτουν συμπαθητικές συνάψεις. Η παρασυμπαθητική συσκευή διαδραματίζει έναν σπουδαίο ρόλο τόσο στη ρύθμιση της σπειραματικής διήθησης, όσο και μέσω της έκκρισης ρενίνης στην ρύθμιση του αγγειακού τόνου. Εικόνα 11: Σπείραμα σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Διακρίνονται η πυκνή κηλίδα (MD), η παρασπειραματική συσκευή (JG) καθώς και το προσαγωγό αρτηρίδιο (AA). 1.4 ΔΙΑΜΕΣΟΣ ΝΕΦΡΙΚΟΣ ΧΩΡΟΣ Ο διάμεσος νεφρικός χώρος καταλαμβάνει σχετικά μικρή έκταση συνολικά του νεφρού. Στον φλοιό αντιπροσωπεύει το 5 7% του συνολικού όγκου, ενώ αυξάνει προς την μυελώδη μοίρα φθάνοντας το μέγιστο 30% στην έσω στοιβάδα του μυελού. Τα κυτταρικά συστατικά του διάμεσου νεφρικού χώρου περιλαμβάνουν ινοβλάστες, σωληνάρια και αγγεία. Επιπρόσθετα απαντώνται αρκετά μεταναστευτικά κύτταρα του [21]

22 ανοσοποιητικού συστήματος και ιδιαίτερα δενδριτικά κύτταρα. Το μεσοκυττάριο διάστημα αποτελείται από εξωκυττάρια θεμέλια ουσία που είναι κυρίως πρωτεογλυκάνες και γλυκοπρωτεϊνες, ινιδίλια και διάμεσο υγρό. Από μορφολογικής άποψης οι ινοβλάστες είναι τα κύρια κύτταρα του διάμεσου νεφρικού χώρου, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με ειδικές συνδέσεις και προσκολλώνται στη βασική μεμβράνη που περιβάλλει τα σωληνάρια, τα σπειράματα, τα τριχοειδή και τα λεμφαγγεία. Μία ειδική υποομάδα των ινοβλαστών του παραμυελώδους διάμεσου νεφρικού χώρου, οι 5 NT(+) ινοβλάστες συνθέτουν την ερυθροποιητίνη κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ενώ όταν υπάρχουν αυξημένες ανάγκες ινοβλάστες από πιο επιφανειακά τμήματα του φλοιού δύναται να παράγουν ερυθροποιητίνη. 1.5 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΝΕΦΡΟΥ Η κύρια λειτουργία των νεφρών είναι η διατήρηση σταθερού εσωτερικού περιβάλλοντος μέσω της εκλεκτικής κατακράτησης ή αποβολής ύδατος, ηλεκτρολυτών και άλλων ουσιών. Αυτό επιτυγχάνεται με τρεις τρόπους: 1) διήθηση του κυκλοφορούντος αίματος στο σπείραμα και δημιουργία ενός πρώιμου διηθήματος στην βωμάνειο κάψα, 2) εκλεκτική επαναρόφηση μέσω του σωληναριακού συστήματος από το υγρό του σωληναριακού αυλού προς τα περισωληναριακά τριχοειδή και την συστηματική κυκλοφορία και 3) εκλεκτική απέκκριση και αποβολή άχρηστων ουσιών από το περισωληναριακό τριχοειδικό δίκτυο προς το υγρό του σωληναριακού υγρού ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ 1. Ρύθμιση ύδατος και ηλεκτρολυτών 2. Αποβολή άχρηστων μεταβολικών προϊόντων 3. Απέκκριση εξωγενών χημικών ουσιών και φαρμάκων 4. Ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης 5. Ρύθμιση της ερυθροποίησης 6. Ρύθμιση της βιταμίνης D 7. Γλυκονεογένεση ΝΕΦΡΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ 1. Αγγειοτενσίνη ΙΙ 2. Προσταγλαδίνες 3. Κινίνες 4. Ερυθροποιητίνη 5. Βιταμίνη D [22]

23 1.5.3 ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΗΘΗΣΗ Η μέση τιμή της σπειραματικής διήθησης για έναν ενήλικα άνδρα 70 Kg σωματικού βάρους είναι 180 lit/24h ή 125 ml/min. Αυτό αντιπροσωπεύει περίπου το 20% του πλάσματος που εισέρχεται στα σπειραματικά τριχοειδή. Κατά συνέπεια ο ολικός όγκος πλάσματος που είναι περίπου 3 l διηθείται 60 φορές την ημέρα, ενώ το 99% αυτού του διηθήματος τελικά επαναροφάται. Το πρώιμο διήθημα περιέχει ύδωρ και κρυσταλοειδείς ουσίες με ΜΒ< Οι πρωτεΐνες δεν διηθούνται, αν και ένα μικρό ποσοστό αλβουμίνης όπως και μυοσφαιρίνη ή αιμοσφαιρίνη διέρχονται τον φραγμό διήθησης και τελικά επαναροφούνται στο σωληνάριο. Η πίεση διήθησης (net filtration pressure, NFP) προκύπτει από το αλγεβρικό άθροισμα της υδροστατικής και ωσμωτικής πίεσης εντός και εκτός του σπειραματικού τριχοειδούς όπως φαίνεται από τον παρακάτω τύπο: NFP = ( P GC + Π BC ) ( P BC + Π GC ) Όπου: P GC = Υδροστατική πίεση σπειραματικού τριχοειδούς Π BC = Ωσμωτική πίεση κάψας Bowman P BC = Υδροστατική πίεση κάψας Bowman Π GC = Ωσμωτική πίεση σπειραματικού τριχοειδούς Τόσο η υδροστατική, όσο και η ωσμωτική πίεση μεταβάλλονται κατά μήκος του σπειραματικού τριχοειδούς και έχουν τις εξής τιμές: Προσαγωγό Απαγωγό αρτηρίδιο αρτηρίδιο P GC mmhg P BC mmhg Π GC mmhg NFP mmhg [23]

24 Εικόνα 12 Διαγραμματική απεικόνιση των διαφόρων πιέσεων που εξασκούνται κατά μήκος του νεφρώνα (από το προσαγωγό έως και το απαγωγό). Λόγω απουσίας πρωτεϊνών στην κάψα του Bowman η ωσμωτική πίεση είναι 0 mmhg (Π BC ). Ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης (glomerular filtration rate, GFR) εξαρτάται από την πίεση διήθησης καθώς και από την υδραυλική διαπερατότητα στο ύδωρ και την επιφάνεια διήθησης. Οι δύο τελευταίες εάν συνδυαστούν δίνουν τον συντελεστή διήθησης ( K f ). Ειδικά η επιφάνεια διήθησης εξαρτάται από την σύσπαση ή μη των μεσαγγειακών κυττάρων. Κατά συνέπεια ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης GFR είναι το γινόμενο του συντελεστή διήθησης (K f ) και της πίεσης διήθησης (NFP): GFR = K f x NFP [24]

25 1.5.4 ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ Κάθαρση μιας ουσίας είναι ο όγκος του πλάσματος που καθαίρεται από την ουσία αυτή στην μονάδα του χρόνου. Κατά συνέπεια μπορεί να υπολογιστεί από τον παρακάτω τύπο: C x = U x x V / P x Όπου: C x = κάθαρση ουσίας x, U x = Συγκέντρωση ουσίας x στα ούρα και P x = Συγκέντρωση ουσίας x στο πλάσμα. Η ιδεώδης ουσία x θα πρέπει να πληροί τις ακόλουθες προϋποθέσεις: Να διηθείται ελεύθερα από το σπείραμα Να μην επαναροφάται από το σωληνάριο Να μην απεκκρίνεται από το σωληνάριο Να μην συντίθεται στο σωληνάριο Να μην μεταβολίζεται στο σωληνάριο Μία τέτοια ουσία είναι η ινουλίνη, κατά συνέπεια, ο υπολογισμός της κάθαρσης ινουλίνης ισούται με τον ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR). Για λόγους πρακτικούς η ινουλίνη έχει αντικατασταθεί από την κρεατινίνη η οποία παράγεται από την κρεατίνη στους σκελετικούς μύες και απελευθερώνεται απευθείας στην κυκλοφορία, όπου διατηρείται σε σταθερά επίπεδα ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΕΠΑΝΑΡΟΦΗΣΗ Η επαναρόφηση ουσιών από το σωληνάριο επιτελείται με τους εξής μηχανισμούς μεταφοράς: [25]

26 1. Απλή διάχυση: Προκαλείται από ηλεκτροχημική κλίση συγκέντρωσης, ενώ εξαρτάται κυρίως από τη λιποδιαλυτότητα της ουσίας. 2. Απλή υποβοηθούμενη μεταφορά: Προκαλείται επίσης από ηλεκτροχημική κλίση συγκέντρωσης, όμως απαιτεί την συμμετοχή ειδικών μεμβρανικών πρωτεϊνών ή μεταφορέων. Πρόκειται για σημαντικό μηχανισμό όσον αφορά υδατοδιαλυτά μόρια, ενώ έχει τα χαρακτηριστικά της ειδικότητας, του κορεσμού και του συναγωνισμού. 3. Δευτερογενής ενεργή μεταφορά: Δύο ή περισσότερα μόρια συνδέονται με ειδικούς πρωτεϊνικούς μεμβρανικούς υποδοχείς με μεταφέρονται διαμέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Αφορά μεταφορά μορίων ενάντια της κλίσης συγκέντρωσης, ενώ η ενέργεια προκύπτει από την αντίθετη μεταφορά κάποιου άλλου μορίου. 4. Πρωτογενής ενεργή μεταφορά: Μεταφορά με συμμετοχή ειδικών μεμβρανικών πρωτεϊνών, αλλά με χρήση της αντλίας ATPάσης. Έχει επίσης τα χαρακτηριστικά της ειδικότητας, του κορεσμού και του συναγωνισμού. 5. Ενδοκύττωση: Σημαντικός μηχανισμός επαναρόφησης μεγαλομορίων, ενώ καταναλώνει ATP λόγω της διάσπασης της κυτταρικής μεμβράνης. Κοινό βήμα όλων των παραπάνω μηχανισμών επαναρόφησης είναι η μετακίνηση των επαναροφούμενων ουσιών από το σωληνάριο προς τα περισωληναριακά τριχοειδή με απλή διάχυση ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΗ ΑΠΕΚΚΡΙΣΗ Όπως και στην σωληναριακή επαναρόφηση, το αρχικό βήμα και εδώ είναι η απλή διάχυση των ουσιών από τα περισωληναριακά τριχοειδή στο υγρό του διάμεσου νεφρικού χώρου. Από εκεί οι ουσίες εισέρχονται στα σωληναριακά κύτταρα είτε παρακυτταρικά μέσω των στενών συνδέσεων, είτε διακυτταρικά με ενεργή μεταφορά. Σε αντίθεση με την σπειραματική διήθηση, η μεταφορά εδώ είναι μία διαδικασία ισορροπίας με αποτέλεσμα ουσίες που είναι συνδεδεμένες με πρωτεΐνες να μπορούν να απεκκριθούν μέσω μη ειδικών συστημάτων μεταφοράς οργανικών ανιόντων και κατιόντων ΣΩΛΗΝΑΡΙΑΚΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ Τα σωληναριακά κύτταρα συνθέτουν ιόντα διττανθρακικών και αμμωνία από γλουταμίνη. [26]

27 2 ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ [27]

28 Η κυκλοσπορίνη (CsA) είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται στη μεταμόσχευση νεφρού από τις αρχές της δεκαετίας του 80 (εικ 13). Η χρήση της έχει βελτιώσει σημαντικά την επιβίωση των νεφρικών μοσχευμάτων, ενώ τα τελευταία έτη χρησιμοποιείται και σε σπειραματονεφρίτιδες και αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα. Πρόκειται για λιπόφιλο κυκλικό πολυπεπτίδιο αποτελούμενο από 11 αμινοξέα που παράγεται από τον μύκητα Tolypocladium inflatum. Εικόνα 13 Χημική δομή μορίου κυκλοσπορίνης 2.1 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ Ο κύριος μηχανισμός δράσης του φαρμάκου περιλαμβάνει την ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση με την φωσφατάση της καλσινευρίνης με αποτέλεσμα την ελάττωση της παραγωγής ιντερλευκίνης 2 (IL 2). Η CsA αρχικά συνδέεται με την κυκλοφυλλίνη, μία ειδική κυτταροπλασματική ομάδα υποδοχέων και το σύμπλοκο αυτό αναστέλλει την ενεργοποίηση της φωσφατάσης της καλσινευρίνης που με τη σειρά της είναι ο δεύτερος διαβιβαστής στην αποφωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων (NF AT). Ο παράγοντας αυτός είναι μία ρυθμιστική πρωτεΐνη που προάγει τη μεταγραφή της IL 2. Άμεσο αποτέλεσμα αυτής της αναστολής της IL 2 είναι η διακοπή του πολλαπλασιασμού και ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων και ειδικά των βοηθητικών και κυτταροτοξικών. [28]

29 Εικόνα 14 Μηχανισμός δράσης κυκλοσπορίνης. Στο κυτταρόπλασμα η κυκλοσπορίνη συνδέεται με την κυκλοφυλλίνη και το σύμπλοκο κυκλοσπορίνης κυκλοφυλλίης συνδέεται και αναστέλλει την λειτουργία της καλσινευρίνης. Αυτό έχει σαν συνέπεια την μη αποφωσφορυλίωση του κυτταροπλασματικού τμήματος του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων λεμφοκυττάρων και κατά συνέπεια την μη μεταφορά του εντός του πυρήνα και την πρόσδεσή του με το αντίστοιχο τμήμα στον πυρήνα. Ο πυρηνικός παράγοντας δρα ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ιντερλευκίνης 2 (IL 2) αυξάνοντας την παραγωγή της. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα Τ λεμφοκύτταρα να μην παράγουν ιντερλευκίνη 2, μία κυτοκίνη απαραίτητη για την πλήρη ενεργοποίηση τους. 2.2 ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΠΕΚΚΡΙΣΗ Η κυκλοσπορίνη μεταβολίζεται στο ήπαρ μέσω του κυτοχρώματος P450 (CYP) 3A4 ενζυμικού συστήματος. Η κύρια οδός απέκκρισης του φαρμάκου είναι μέσω του χοληφόρου συστήματος, ενώ ένα μικρό ποσοστό αποβάλλεται και από τους νεφρούς. 2.3 ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ Η κυκλοσπορίνη έχει νεφροτοξική, ηπατοτοξική και νευροτοξική δράση, ενώ προκαλεί υπέρταση, δυσλιπιδαιμία, υπερτροφία των ούλων και υπερτρίχωση. Προκαλεί επίσης υπερκαλιαιμία, υπομαγνησιαιμία, υπερουριχαιμία και σπανίως ουραιμικό αιμολυτικό σύνδρομο. [29]

30 2.4 ΝΕΦΡΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ Η σημαντικότερη παρενέργεια της κυκλοσπορίνης είναι η νεφροτοξικότητα που εκδηλώνεται ως οξεία ή χρόνια μορφή. Η οξεία νεφροτοξικότητα της κυκλοσπορίνης χαρακτηρίζεται από δυνητικά αναστρέψιμη ελάττωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR) και της νεφρικής ροής πλάσματος (RPF) που προκαλείται από την άμεση τοξική επίδραση στην συστηματική και νεφρική μικροκυκλοφορία 1,2,3,4. Στην νεφρική μικροκυκλοφορία η CsA προκαλεί αγγειοσύσπαση του προσαγωγού αρτηριδίου και ενεργοποίηση του συμπαθητικού και του συστήματος ρενίνηςαγγειοτενσίνης. Κλινικά στις περισσότερες περιπτώσεις η οξεία νεφροτοξικότητα της κυκλοσπορίνης εκδηλώνεται νωρίς μετά την έναρξη της θεραπείας ως επίμονη αύξηση της κρεατινίνης και υπέρταση. Συνήθως με την ελάττωση της δοσολογίας ή την διακοπή του φαρμάκου τόσο η κρεατινίνη, όσο και η αρτηριακή πίεση επανέρχονται στα προηγούμενα επίπεδα. Σε ορισμένες περιπτώσεις μεταμόσχευσης νεφρού είναι δύσκολη η διαφορική διάγνωση μεταξύ οξείας νεφροτοξικότητας της κυκλοσπορίνης και οξείας απόρριψης, αφού και στις δύο περιπτώσεις υπάρχει αύξηση της κρεατινίνης και υπέρταση. Η χρόνια νεφροτοξικότητα της κυκλοσπορίνης είναι το αποτέλεσμα παρατεταμένης νεφρικής ισχαιμίας οφειλόμενης σε αγγειοσύσπαση, ενώ δεν είναι αναστρέψιμη ούτε δοσοεξαρτώμενη. Κλινικά η χρόνια νεφροτοξικότητα από κυκλοσπορίνη εκδηλώνεται με υπέρταση και προοδευτική μέσα σε διάστημα μηνών ή ετών αύξηση της κρεατινίνης πλάσματος που μπορεί να καταλήξει σε τελικού σταδίου χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού η διαφορική διάγνωση μεταξύ νεφροτοξικότητας από κυκλοσπορίνη και χρόνιας νεφροπάθειας του μοσχεύματος απαιτεί τη διενέργεια βιοψίας νεφρικού μοσχεύματος 5. Οι κύριες ιστολογικές αλλοιώσεις που παρατηρούνται στη βιοψία νεφρού αφορούν δομικές αλλοιώσεις των αρτηριολίων και βλάβες του σωληναριοδιάμεσου ιστού. Η αρχική βλάβη περιλαμβάνει την κενοτοπίωση των λείων μυϊκών κυττάρων του προσαγωγού αρτηριδίου, τα οποία σε προχωρημένο στάδιο νεκρώνονται και αντικαθίστανται από πρωτεϊνοειδές υλικό προκαλώντας την τμηματική πάχυνση του τοιχώματος του αγγείου δίκην περιδέραιου. Οι ιστολογικές αυτές αλλοιώσεις είναι [30]

31 χαρακτηριστικές για την κυκλοσπορίνη, ενώ εύκολα διαφοροδιαγιγνώσκονται από την κλασσική αρτηριολοσκλήρυνση. Τα τελικά στάδια της νεφροτοξικότητας από κυκλοσπορίνη χαρακτηρίζονται από αύξηση της εναπόθεσης ινώδους πρωτεϊνοειδούς υλικού το οποίο προκαλεί στενώσεις και θρόμβους υαλίνης, οδηγώντας σε υποξία και μη αναστρέψιμη βλάβη τα σπειράματα και το σωληναριοδιάμεσο χώρο. Η εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση, σωληναριακή ατροφία και διάχυτη ή ταινιοειδής ίνωση του διάμεσου χώρου δεν αποτελούν ειδικά γνωρίσματα της νεφροτοξικότητας από κυκλοσπορίνη, αλλά μπορεί να ανευρεθούν σε προχωρημένα στάδια ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Ο μηχανισμός μέσω του οποίου η κυκλοσπορίνη δρα νεφροτοξικά σχετίζεται με την πρόκληση ανισορροπίας μεταξύ αγγειοσυσταλτικών και αγγειοδιασταλτικών συστημάτων σε νεφρικό και συστηματικό επίπεδο. Πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κυκλοσπορίνη προκαλεί ενεργοποίηση των συστημάτων ρενίνηςαγγειοτενσίνης, ενδοθηλίνης και θρομβοξάνης, ενώ καταστέλλεται η παραγωγή προσταγλανδίνης και νιτρικού οξειδίου. Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για τον ακριβή ρόλο του κάθε συστήματος χωριστά ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΙΣΧΑΙΜΙΑ Η κυκλοσπορίνη προκαλεί ελάττωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης και της νεφρικής αιματικής ροής 6. Αυτό έχει σαν συνέπεια την πρόκληση ισχαιμίας που τελικά οδηγεί σε αύξηση των αντιδραστικών ριζών οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) και της οξείδωσης των λιπιδίων. Αυτή η υπόθεση ενισχύεται από το γεγονός ότι αντιοξειδωτικές θεραπείες βελτιώνουν την χρόνια νεφροτοξικότητα από κυκλοσπορίνη ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑ ΡΕΝΙΝΗΣ ΑΓΓΕΙΟΤΕΝΣΙΝΗΣ Η ενεργοποίηση του συστήματος ρενίνης αγγειοτενσίνης σε νεφρικό επίπεδο πιστεύεται ότι παίζει έναν πρωτεύοντα ρόλο στον μηχανισμό νεφροτοξικότητας της κυκλοσπορίνης. Υπάρχουν πειραματικά δεδομένα που δείχνουν ότι η κυκλοσπορίνη αυξάνει την έκκριση ρενίνης και αγγειοτενσίνης ΙΙ σε νεφρικό επίπεδο ενώ προκαλεί επίσης και έντονη υπερπλασία της παρασπειραματικής συσκευής 10. Εκλεκτική υπερπλασία και σύσπαση των προσαγωγών αρτηριδίων, ευρήματα που είναι τυπικά της νεφροτοξικότητας από κυκλοσπορίνη επίσης έχουν βρεθεί σε πειραματικά μοντέλα. [31]

32 Η ενεργοποίηση αυτή του συστήματος ρενίνης αγγειοτενσίνης προκαλεί νεφρική βλάβη μέσω αιμοδυναμικών (αγγειοσύσπαση, νεφρική ισχαιμία) και μη αιμοδυναμικών μηχανισμών (φλεγμονή του σωληναριοδιάμεσου χώρου μέσω της επαγωγής αυξητικών παραγόντων όπως είναι ο TGF β1, ο VEGF και ο MCP 1). Μάλιστα, η χορήγηση αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης ή ανταγωνιστών των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης μετριάζει την νεφροτοξική δραστικότητα σε πειραματικά μοντέλα ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ Υπάρχουν πολλά πειραματικά δεδομένα που δείχνουν ότι οι αιμοδυναμικές επιπτώσεις της κυκλοσπορίνης προκαλούνται μέσω της αλλοιωμένης έκφρασης του συστήματος ενδοθηλίνης. Αυξημένα επίπεδα ΕΤ 1 οδηγούν σε σύσπαση και πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων, ενώ εξωγενώς χορηγούμενη ΕΤ 1 προκάλεσε ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις παρόμοιες με εκείνες που προκαλεί η κυκλοσπορίνη Σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού που λαμβάνουν κυκλοσπορίνη έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα ενδοθηλίνης πλάσματος και του μετατρεπτικού της ενζύμου, ενώ υπάρχουν σαφείς ενδείξεις συμμετοχής της ενδοθηλίνης στην βλάβη από επαναιμάτωση που προκαλείται από την ψυχρή ισχαιμία 18, ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ Το σύστημα του νιτρικού οξειδίου σε νεφρικό επίπεδο μετέχει ενεργά στον μηχανισμό της νεφροτοξικής δράσης της κυκλοσπορίνης. Αυξημένη έκφραση της ενδοθηλιακής συνθετάσης του νιτρικού οξειδίου (enos) έχει βρεθεί σε νεφρικό φλοιό σε πειραματικό μοντέλο νεφροτοξικότητας από κυκλοσπορίνη 20. Είναι επίσης πιθανό η κυκλοσπορίνη να επάγει την έκφραση αντιδραστικών ριζών οξυγόνου ή και του TGF β και κατά συνέπεια να αυξάνει η δεσμευτική ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα AP 1 που λειτουργεί ως επαγωγέας της σύνθεσης του enos και άρα και του νιτρικού οξειδίου. Η χορήγηση L αργινίνης, που λειτουργεί ως υπόστρωμα για την enos, προκάλεσε αγγειοδιαστολή του προσαγωγού αρτηριδίου σε πειραματικό μοντέλο νεφροτοξικότητας κυκλοσπορίνης, καταδεικνύοντας έτσι το γεγονός ότι η ικανότητα του νεφρικού ενδοθηλίου να παράγει νιτρικό οξείδιο δεν αναστέλλεται από την χορήγηση κυκλοσπορίνης 21. Άλλοι μηχανισμοί που θεωρούνται υπεύθυνοι για την αυξημένη παραγωγή ΝΟ από την κυκλοσπορίνη περιλαμβάνουν το μηχανικό στρες διάτμησης κατά την σύσπαση του [32]

33 προσαγωγού αρτηριδίου, την είσοδο ιόντων ασβεστίου και την υποξία. Η ελάττωση του μηχανικού στρες διάτμησης που προκαλείται από τη χορήγηση ανταγωνιστών των διαύλων ασβεστίου όπως είναι η νιφεδιπίνη, βελτίωσε την νεφρική αιμοδυναμική και επανέφερε στο φυσιολογικό τα επίπεδα enos στον νεφρικό φλοιό σε πειραματικό μοντέλο νεφροτοξικότητας κυκλοσπορίνης ΚΥΚΛΟΣΠΟΡΙΝΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝΔΙΝΕΣ Το σύστημα προσταγλανδινών έχει βρεθεί ότι επίσης συμμετέχει στις αιμοδυναμικές επιδράσεις που προκαλεί η κυκλοσπορίνη στους νεφρούς. Η προσθήκη αγγειοτενσίνης ΙΙ μαζί με αναστολείς των υποδοχέων Α ενδοθηλίνης και θρομβοξάνης Α 2 σε επίμυες είχε σαν αποτέλεσμα την σημαντική ελάττωση της προκαλούμενης από την κυκλοσπορίνη νεφρικής αγγειοσυστολής. Επιπρόσθετα, η συνδυασμένη χορήγηση αναστολέων θρομβοξάνης Α 2 με ανταγωνιστές αδρενεργικών και ισταμινεργικών υποδοχέων καθώς και ανταγωνιστές διαύλων ασβεστίου σε πειραματικά μοντέλα νεφροπάθειας από κυκλοσπορίνη είχε ως αποτέλεσμα την διατήρηση του GFR σε φυσιολογικά επίπεδα και την αύξηση των αποβαλλομένων με τα ούρα προσταγλανδινών 23. [33]

34 3 ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ [34]

35 Τα τελευταία 20 έτη διάφορες ανακαλύψεις έχουν αναδείξει τον ιδιαίτερο ρόλο που διαδραματίζει το αγγειακό ενδοθήλιο στην ομοιοστασία του καρδιαγγειακού συστήματος. Σήμερα πιστεύεται ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν λειτουργούν απλά ως ένας φραγμός μεταξύ κυκλοφορίας και διάμεσου χώρου, αλλά εκπληρώνουν σημαντικές μεταβολικές λειτουργίες εκκρίνοντας αγγειοσυσταλτικές και αγγειοδιασταλτικές ουσίες. Η πρώτη ουσία που ανακαλύφθηκε ήταν η προσταγλανδίνη Ι2 (PGI2), η οποία όχι μόνο λειτουργούσε ως αγγειοδιασταλτικό, αλλά είχε και την ικανότητα να αναστέλλει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων 24. Λίγα χρόνια αργότερα, το 1980 οι Furchgott και Zawadzki ανακάλυψαν έναν παράγοντα που προκαλούσε αγγειοδιαστολή και ο οποίος εκκρίνονταν από ενδοθηλιακά κύτταρα. Τον παράγοντα αυτόν ονόμασαν αγγειοδιασταλτικό παράγοντα προερχόμενο από το ενδοθήλιο (endothelium derived relaxing factor, EDRF) 25. Τα επόμενα έτη πολλοί ερευνητές προσπάθησαν να ταυτοποιήσουν αυτόν τον παράγοντα, κάτι το οποίο πέτυχαν τελικά οι Palmer και Ignarro το 1987, οι οποίοι εξέφρασαν την άποψη ότι το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) ως ελεύθερη ρίζα πληροί όλες τις προδιαγραφές να χαρακτηρισθεί ως EDRF 26,27. Η ταυτοποίηση του ΝΟ ως αγγειοδιασταλτικού παράγοντα οδήγησε σε μια ερευνητική έκρηξη γύρω από τη σημασία του στην αγγειακή αιμοδυναμική και φυσιολογία, στην φλεγμονή και σε πολλές ακόμα παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Μάλιστα η ανακάλυψη του μορίου αυτού είχε τέτοια σημασία για την διεθνή επιστημονική κοινότητα που το 1992 απονεμήθηκε το βραβείο Νόμπελ στους Furchgott, Ignarro και Murad για την πρωτοποριακή τους έρευνα αναφορικά με αυτό το μόριο. Σήμερα είναι πλέον γνωστό ότι το νιτρικό οξείδιο αποτελεί ένα θεμελιώδες μόριο του μεταβολισμού και κυτταρικής λειτουργίας μετέχοντας σε πολυάριθμες φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές διεργασίες όπως είναι η απόπτωση, η φλεγμονή, η ισχαιμία, το οξειδωτικό stress και η αγγειακή αιμοδυναμική. 3.1 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ Η βιοσύνθεση του ΝΟ ξεκινά από το αμινοξύ L αργινίνη το οποίο ενσωματώνοντας μοριακό οξυγόνο μετατρέπεται στην ασταθή μορφή Ν ω υδροξυ L αργινίνη και στη συνέχεια σε νιτρικό οξείδιο και L κιτρουλλίνη (εικόνα 16). Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται παρουσία της συνθετάσης του ΝΟ (NOS, NO synthase) η οποία [35]

36 καταλύει την οξείδωση της L αργινίνης και απαιτεί FAD, FMN, NAPDH, τετραϋδροβιοπτερίνη (BH4), μια πηγή θειόλης και την πρωτεΐνη καλμοδουλίνη (CaM). Τα τελικά προϊόντα της αντίδρασης είναι NADP +, L κιτρουλλίνη και ΝΟ. Εικόνα 15 Βιοσύνθεση του νιτρικού οξειδίου 3.2 ΣΥΝΘΕΤΑΣΕΣ ΤΟΥ ΝΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΙΔΙΟΥ Υπάρχουν τρεις ισομορφές του ενζύμου NOS: 1) η νευρωνική NOS (neuronal NOS, nnos ή NOS1), 2) η επαγώγιμη NOS (inducible NOS, inos, NOS2), και 3) η ενδοθηλιακή NOS (endothelial NOS, enos, ή NOS3) οι οποίες διαφέρουν τόσο στον τρόπο έκφρασης όσο και στον τρόπο που προκαλούν επαγωγή του νιτρικού οξειδίου. Η νευρωνική και η ενδοθηλιακή συνθετάση του ΝΟ εξαρτώνται από την παρουσία ιόντων Ca ++ κάτι το οποίο δεν ισχύει για την επαγώγιμη συνθετάση του ΝΟ η οποία επάγεται συνήθως ως απάντηση σε φλεγμονώδη και προϊνωτικά ερεθίσματα. Η δομή των συνθετασών συγκροτείται από ένα αμινοτελικό άκρο οξυγενάσης που φέρει περιοχές πρόσδεσης για αίμη, BH 4 και L αργινίνη και από ένα καρβοξυτελικό άκρο αναγωγάσης που φέρει περιοχές σύνδεσης για FAD, NADPH και FMN. Η nnos είναι περισσότερο ενεργή όσον αφορά στη σύνθεση ΝΟ και γουανυλικής κυκλάσης (cgmp) από την enos, τόσο σε κύτταρα που διεγείρονται από την παρουσία ιόντων ασβεστίου, όσο και σε κύτταρα τα οποία παραμένουν αδιέγερτα 28. [36]

37 Εικόνα 16 Δομή των τριών τύπων NOSs. 3.3 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΣΥΝΘΕΤΑΣΩΝ ΤΟΥ ΝΟ Για ερευνητικούς σκοπούς έχουν ανακαλυφθεί αρκετοί αναστολείς των συνθετασών του ΝΟ. Από τους γνωστότερους είναι το l NMMA (N G monomethyl L arginine), το l NNA, το l NAME (N G nitro L arginine methyl ester), το ADMA (N G,N G dimethyl Larginine) και η αμινογουανιδίνη. Οι περισσότεροι από τους αναστολείς ανταγωνίζονται την L αργινίνη στις θέσεις πρόσδεσής της στις συνθετάσες. 3.4 ΓΟΥΑΝΥΛΙΚΗ ΚΥΚΛΑΣΗ Η γουανυλική κυκλάση και μάλιστα η διαλυτή μορφή (soluble guanylate cyclase, sgc) αποτελεί τον κυριότερο υποδοχέα του νιτρικού οξειδίου και η οποία βρίσκεται μέσα στο κυτταρόπλασμα. Η sgc αποτελεί ένα ετεροδιμερές που δομείται από δυο διαφορετικές υπομονάδες την α και τη β και μόνο δύο ισομορφές αυτής (α1β1 και α2β1) έχουν βρεθεί σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Στο ένζυμο είναι επίσης συνδεδεμένη μια αίμη ως προσθετική ομάδα, η οποία είναι απαραίτητη για την πρόσδεση του ΝΟ. Μια ιστιδίνη (His 105) που βρίσκεται στη αμινοτελικό άκρο της β1 υπομονάδας συνδέεται με το μόριο σιδήρου της αίμης και αποτελεί το συνδετικό κρίκο ανάμεσα στην αίμη και το ΝΟ. Διέγερση της sgc από το ΝΟ συνεπάγεται σημαντική (μέχρι και 200 φορές) αύξηση της καταλυτικής λειτουργίας, δηλαδή της μετατροπής του GTP σε cgmp. Το προκύπτον cgmp μεταφέρεται ενδοκυτταρικά μέσω της ενεργοποίησης διαφόρων μορίων: i) cgmp εξαρτώμενων κινασών, ii) cgmp ρυθμιζόμενων φωσφοδιεστερασών και iii) cgmp ρυθμιζόμενων ιοντικών καναλιών και δρα ως δεύτερος διαβιβαστής. [37]

38 Εικόνα 17 Μηχανισμός δράσης του νιτρικού οξειδίου 3.5 ΝΙΤΡΙΚΟ ΟΞΕΙΔΙΟ ΚΑΙ ΝΕΦΡΟΣ Το νιτρικό οξείδιο είναι ένας σημαντικός κυτταρικός μεσολαβητής σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες (εικ. 18). Στους νεφρούς μετέχει στην ομοιοστατική ρύθμιση των σπειραματικών, αγγειακών και σωληναριακών λειτουργιών, αλλά και σε μια πλειάδα θεμελιωδών κυτταρικών λειτουργιών όπως είναι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μεταγραφή και ο ενεργειακός μεταβολισμός Εικόνα 18 Συνοπτική απεικόνιση της επίδρασης του νιτρικού οξειδίου στις νεφρικές λειτουργίες. [38]

39 Αν και υπό φυσιολογικές συνθήκες το νιτρικό οξείδιο ασκεί ευεργετικές για τον οργανισμό δράσεις, η υπερβολική του παραγωγή μπορεί να είναι κυτταροτοξική οδηγώντας σε απελευθέρωση ελευθέρων ριζών οξυγόνου και ανιόντων περοξυνιτρίτη. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την επιτάχυνση της κυτταρικής απόπτωσης και τελικά τον θάνατο του κυττάρου (εικ. 19,20). Εκσεσημασμένη παραγωγή νιτρικού οξειδίου έχει διαπιστωθεί σε μία πλειάδα νεφρικών και αγγειακών νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από φλεγμονή όπως είναι οι σπειραματονεφρίτιδες, τα νοσήματα του σωληναριοδιάμεσου χώρου, η οξεία νεφρική βλάβη, η νεφροπάθεια από σκιαγραφικά, η αποφρακτική νεφροπάθεια και η χρόνια νεφροπάθεια του μοσχεύματος Εικόνα 19 Επίδραση του ΝΟ στην κυτταρική λειτουργία. Πολλές από τις δράσεις του ΝΟ μεσολαβούνται μέσω της γουανυλικής κυκλάσης η οποία παράγει το cgmp ως δεύτερο διαβιβαστή. Υπερβολική ή αλλοιωμένη έκφραση της παραγωγής νιτρικού οξειδίου έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή περοξυνιτρίτη ο ποίος ως αντιδραστική ρίζα προκαλεί απόπτωση, νιτροζυλίωση των πρωτεϊνών και οξείδωση των λιπιδίων με τελικό αποτέλεσμα την βλάβη του κυττάρου. [39]

40 Εικόνα 20 Δράσεις του νιτρικού οξειδίου ανάλογα με την συγκέντρωσή του σε ιστικό επίπεδο [40]

41 4 ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗ [41]

42 Η ενδοθηλίνη 1 (ΕΤ 1) ανακαλύφθηκε το 1988 από τον Yanagisawa που την απομόνωσε από ενδοθηλιακά αορτικά κύτταρα χοίρου (εικ. 21). Αποδείχθηκε πως επρόκειτο για έναν πολύ ισχυρό αγγειοσυσπαστικό παράγοντα, ενώ την ανακάλυψή της ακολούθησε η ταυτοποίηση δυο ακόμα πεπτιδίων υψηλής ομολογίας της ΕΤ 2 και της ΕΤ Εικόνα 21 Στερεοτακτική δομή ενδοθηλίνης Η οικογένεια των ενδοθηλινών περιλαμβάνει τρία πεπτίδια τις ΕΤ 1, ΕΤ 2 και ΕΤ Τα τρία αυτά πεπτίδια περιέχουν 2 δισουλφιδικούς δεσμούς και διαφέρουν μεταξύ τους κατά 6 αμινοξέα. Εικόνα 22 Αμινοξικές αλληλουχίες των τριών μελών της οικογένειας των ενδοθηλινών και της δομικά παρεμφερούς τοξίνης venom snake toxin σαραφοτοξίνης. [42]

43 Η δομή της ET περιλαμβάνει δύο διακριτές υποπεριοχές: την αμινοτελική που διαφέρει ανάμεσα στις διάφορες ισομορφές και τη καρβοξυτελική γραμμική περιοχή (εικ. 22). Οι περιοχές αυτές καθορίζουν τουλάχιστον εν μέρει τις αλληλεπιδράσεις του πεπτιδίου με τους υποδοχείς του. Οι ισομορφές της ΕΤ είναι ευρέως κατανεμημένες σε κύτταρα και ιστούς, ενώ η περισσότερο διαδεδομένη, αλλά και μελετημένη είναι η ενδοθηλιακή ισομορφή ET 1, η οποία παράγεται και από λεία μυικά και περικαρδιακά κύτταρα 45. Στους νεφρούς, έως σήμερα μόνο η ΕΤ 1 έχει δειχθεί ότι παράγεται σε πρωτεϊνικό επίπεδο από μεσαγγειακά, επιθηλιακά σωληναριακά και σπειραματικά κύτταρα 46. Κύτταρα αθροιστικού σωληναρίου της μυελώδους μοίρας έχει δειχθεί ότι εμφανίζουν την υψηλότερη συγκέντρωση ενδοθηλίνης σε κυτταρικό επίπεδο ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ Κάθε ισομορφή της ενδοθηλίνης κωδικοποιείται από ένα ξεχωριστό γονίδιο. Η πρεπροet 1 ισομορφή κωδικοποιεί ένα προ προπεπτίδιο 212 αμινοξέων, το οποίο υφίσταται πρωτεόλυση από μια ενδοπεπτιδάση και δίνει ένα ενδιάμεσο πεπτίδιο 38 αμινοξέων, την επονομαζόμενη μεγάλη ΕΤ 1. Η επεξεργασία των δύο άλλων πρεπροϊσομορφών πραγματοποιείται με ανάλογο τρόπο. Σε in vivo συνθήκες η μεγάλη ΕΤ 1 φέρει μόλις το 1% των συστατικών ιδιοτήτων του ώριμου πεπτιδίου, κατά συνέπεια το μετατρεπτικό ένζυμο της ΕΤ (ET converting enzyme, ECE) αναγάγεται σε ένα ιδιαίτερα σημαντικό μόριο στο βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΕΤ 1 και την εκδήλωση της δράσης της. Η μεγάλη ΕΤ 1 κόβεται ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά από ένα εκ των πολλών μετατρεπτικών ενζύμων για να προκύψει η ώριμη μορφή της ΕΤ 1 (εικ. 23). Εικόνα 23 Βιοσύνθεση ενδοθηλίνης 1 [43]

44 Η ενδοκυτταρική αποθήκευση της ΕΤ είναι μικρή, ενώ ένα μικρό ποσοστό της απελευθερώνεται στα αγγεία (η συγκέντρωση στο πλάσμα είναι ίση με 1 fmol/ml). Μετά την σύνθεση της ώριμης ενδοθηλίνης από ενδοθηλιακά κύτταρα, αυτή εκκρίνεται κυρίως προς την βασικοπλάγια επιφάνεια του κυττάρου σε κατεύθυνση προς τα γειτνιάζοντα λεία μυϊκά κύτταρα 48. Η οδός αυτή έκκρισης προσδίδει στην ενδοθηλίνη αυτοκρινικές ή και παρακρινικές ορμονικές ιδιότητες. Στους ιστούς είναι περίπου 100 φορές περισσότερη από ότι στο πλάσμα, κάτι το οποίο αντικατοπτρίζει την ισχυρή πρόσδεσή της στους αντίστοιχους υποδοχείς και τη μικρή ποσότητα ελεύθερης ΕΤ 1. Η σύνθεση ρυθμίζεται στο μεταγραφικό επίπεδο με de novo σύνθεση του προδρόμου μορίου, την ωρίμανση και την απελευθέρωσή του 49. Αυξημένη παραγωγή ενδοθηλίνης παρατηρείται με μία πλειάδα διεγερτών όπως είναι η αγγειοτενσίνη ΙΙ, η βαζοπρεσσίνη, η IL 1, η οξειδωμένη LDL, η θρομβίνη, η ινσουλίνη, το ελαττωμένο εξωκυττάριο ph και η κυκλοσπορίνη. Επιπρόσθετα, ο ισχυρότερος παράγοντας που ρυθμίζει την παραγωγή της ενδοθηλίνης είναι η αιματική ροή. Αύξηση της αιματικής ροής προκαλεί αγγειοδιαστολή μέσω ειδικών υποδοχέων μηχανικής διάτμησης (shear stress receptors) των ενδοθηλιακών κυττάρων που στη συνέχεια επάγουν την αυξημένη παραγωγή νιτρικού οξειδίου. Αντίθετα η προστακυκλίνη, το νιτρικό οξείδιο και τα νατριοουρητικά πεπτίδια αναστέλλουν την παραγωγή ενδοθηλίνης 50,51 (εικ. 24). Εικόνα 24 Παράγοντες που ρυθμίζουν την σύνθεση της ενδοθηλίνης. [44]

45 4.2 ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ Οι ενδοθηλίνες αποικοδομούνται ταχύτατα μέσω της κυκλοφορίας από τους πνεύμονες, το ήπαρ και τους νεφρούς. Επιπρόσθετα της αγγειοδιασταλτικής του δραστικότητας, ο υποδοχέας ΕΤ Β δρα και ως παράγοντας κάθαρσης της κυκλοφορούσας ΕΤ Ο χρόνος ημιζωής της ΕΤ 1 είναι περίπου 1 min, ενώ ο κύριος μηχανισμός αποδόμησης της ΕΤ 1 είναι μέσω των ΕΤ Β υποδοχέων οι οποίοι συνδέονται με την ενδοθηλίνη και ακολουθεί η ενδοκύττωση του συμπλόκου στο κυτταρόπλασμα με τελικό αποτέλεσμα την πέψη από ειδικά ένζυμα. Κατά συνέπεια, ελάττωση του αριθμού των ΕΤ Β υποδοχέων ή αναστολή αυτών έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων ΕΤ 1 στο πλάσμα χωρίς να αυξηθεί η παραγωγή αυτής ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ Δύο υποδοχείς είναι γνωστό ότι υπάρχουν για την ενδοθηλίνη και οι οποίοι είναι προϊόν δύο διαφορετικών γονιδίων. Οι υποδοχείς αυτοί φέρουν 7 διαμεμβρανικές θηλιές, ενώ η ενδοκυτταρική τους δράση εξαρτάται από διαμεμβρανικές G πρωτεΐνες. Το γονίδιο του υποδοχέα τύπου Α της ενδοθηλίνης (endothelin receptor A, ΕΤ Α ) βρίσκεται στο χρωμόσωμα 4, η αντίστοιχη πρωτεΐνη περιλαμβάνει 427 αμινοξέα και συνδέεται με τις τρεις ισομορφές της ET με την εξής σειρά: ο ΕΤ Α προσδένεται σε μεγάλο βαθμό με την ΕΤ 1 σε μικρότερο με την ΕΤ 2 και σε πολύ μικρότερο με την ΕΤ Το γονίδιο του υποδοχέα τύπου Β της ενδοθηλίνης (endothelin receptor Β, ΕΤ Β ) στον άνθρωπο κωδικοποιείται στο χρωμόσωμα 13, η αντίστοιχη πρωτεΐνη δομείται από 442 αμινοξέα και οι τρεις ισομορφές της ET προσδένονται σε αυτόν στον ίδιο βαθμό 55. Εικόνα 25 Δομή του υποδοχέα ETR A. [45]

46 Η πρόσδεση της ενδοθηλίνης στον υποδοχέα της είναι πολύ ισχυρή και μπορεί να παραμείνει ενεργή για πολλές ώρες 56, ενώ η βιολογική της δράση εξαρτάται τόσο από το είδος του κυτταρικού συστήματος, όσο και από την σχετική πυκνότητα σε υποδοχείς που αυτό εμφανίζει. Ο ΕΤ Α επικρατεί κυρίως σε επιθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα αγγείων, ενώ δεν ανιχνεύεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο ΕΤ Β βρίσκεται σε επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα, σε λεία μυϊκά κύτταρα αγγείων, καθώς επίσης στην αορτή, στον εγκέφαλο και στους πνεύμονες. Εικόνα 26 Δομή του υποδοχέα ETR B. Η χορήγηση εξωγενώς πειραματικά ενδοθηλίνης δεν μπορεί να αποκαλύψει επακριβώς τις δράσεις της και αυτό επειδή η ορμόνη αυτή έχει τόσο αυτοκρινή, όσο και παρακρινή δράση. Αυτό οδήγησε στην ανακάλυψη εξειδικευμένων ανταγωνιστών των υποδοχέων της ενδοθηλίνης. Αυτοί ταξινομούνται σε εκλεκτικούς ανταγωνιστές των Α (BQ 123) και Β υποδοχέων (BQ 788), ενώ υπάρχει και ο από του στόματος χορηγούμενος μη εκλεκτικός ανταγωνιστής Bosentan 57. Βέβαια από φαρμακολογικής άποψης αυτός ο διαχωρισμός δεν είναι ακριβής, απλώς οι εκλεκτικοί ανταγωνιστές έναντι των Α υποδοχέων εμφανίζουν Χ φορές μεγαλύτερη συγγένεια για τον Α έναντι του Β υποδοχέα. Στον άνθρωπο, πειράματα στα οποία χορηγήθηκαν επαγωγείς και ανταγωνιστές των υποδοχέων ενδοθηλίνης σε in vitro και in vivo συνθήκες έδειξαν ότι τα νεφρικά αγγεία εκφράζουν κυρίως ΕΤR Α υποδοχείς 58. [46]