NOVA LITE TM HEp-2 ANA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 NOVA LITE TM HEp-2 ANA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού NOVA LITE TM HEp-2 χρησιμοποιείται για δοκιμασία ομαδικού ελέγχου και ημιποσοτικού προσδιορισμού Αντιπυρηνικών (ΑΝΑ) σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των ΑΝΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλους ορολογικούς ελέγχους και κλινικά ευρήματα και αποσκοπεί στη διάγνωση του Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου (Systemic Lupus Erythematosus SLE) ή άλλες ρευματοειδής μολύνσεις ή του συνδετικού ιστού. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Ο όρος Αντιπυρηνικά Αντισώματα περιγράφει τά αντισώματα που αντιδρούν με συνιστώσες του πυρήνος του κυττάρου συμπεριλαμβανομένων DNA, RNA και αρκετές πρωτείνες και ριβονουκλεοπρωτείνες. 1 Τα αντισώματα αυτά συναντώνται συχνότατα σε ασθενείς συνδετικού ιστού η ρευματικών νόσων, ειδικά στον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (SLE). Κάτ ουσία όλοι οι ασθενείς με SLE είναι θετικοί κατά ΑΝΑ. Αυτή η διαγνωστική ευαισθησία έχει καταστήσει πρωταρχικό τον έλεγχο κατά ΑΝΑ αφότου το 1982 ορίσθησαν από την υποεπιτροπή American college of Reumatology. (Revised Criteria for the Classification of SLE ). 2 Ενώ ο έλεγχος κατά ΑΝΑ είναι ένας πολύ καλός ομαδικός έλεγχος για SLE (ένα αρνητικό αποτέλεσμα κατ ουσία αποκλείει ενεργό SLE 3 ) δεν αποτελεί εξειδικευμένο έλεγχο. Ασθενείς με άλλες νόσους του συνδετικού ιστού όπως ρευματοειδείς αρθριτιδες, σκληρόδερμα, και δερματομυίτιδα είναι συχνά θετικοί. Περιστασιακά θετικοί κατά ΑΝΑ (ειδικά σε μικρούς τίτλους) δεν είναι ασύνηθες σε άλλες νόσους και σε φυσιολογικό πλυθησμό. Θετικά αποτελέσματα κατά ΑΝΑ μπορεί να εμφανισθούν σε ασθενείς ακολουθούντες σοβαρά εγκαύματα η λοιμώξεις από ιούς και έχουν αναφερθεί σε μερικούς φυσιολογικούς, υγιείς ανθρώπους ειδικά σε ηλικιωμένους. Λόγω αυτης της έλλειψης ειδικότητας συνιστάται τά θετικά κατά ΑΝΑ δείγματα να τιτλοποιούνται μέχρι το τελικό σημείο, και να πραγματοποιούνται πιο ειδικοί έλεγχοι για αντισώματα κατά ds DNA και ΈΝΑ. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός είναι μέθοδος αναφοράς για τον έλεγχο κατά ΑΝΑ. Συνήθη υποστρώματα είναι λεπτα μέρη οργάνων τρωκτικών ή κάποιου τύπου κυττάρων. Στα νέα υποστρώματα προτιμώνται τα όργανα καθότι έχουν υψηλότερες στάθμες αντιγόνων συμπεριλαμβανομένων του κεντρομεριδίου, SS-Α (Ro), Scl-70, PCNA/Cyclin. Εκτός του υποστρώματος άλλοι τρεις παράγοντες είναι κρίσιμοι για την απόδοση του ελέγχου ΑΝΑ: 1) το στερεωτικό κατά τη προετοιμασία της πλάκας 2) ο λόγος φθορισμού πρωτεϊνης (F/P) η 3) ειδικότητα υπόταξης ανοσοσφαιρίνης του συζεύγματος (conjugate). Μερικά στερεωτικά ή συνδυασμοί καταστρέφουν τον πυρήνα του αντιγόνου και πρέπει να αποφεύγονται. Η ευαισθησία και η μη ειδική χρώση του φόντου του συζεύγματος (conjugate) προσδιορίζεται από το λόγο φθορισμού πρωτεϊνης (F/P) ενώ η ειδικότητα του συζεύγματος (conjugate) προσδιορίζεται από την αντίδραση υπόταξης ανοσοσφαιρίνης. Κατ ουσία τα κλινικώς σημαντικά αυτοαντισώματα είναι τα IgG. 4 Τα ΑΝΑ αντισώματα που βρίσκονται σε υγιείς δωρητές αίματος είναι γενικώς για IgM & IgA. 5 Λόγω αυτού η σφαιρίνη για IgG είναι πλέον ειδική. Το επιλεχθέν υπόστρωμα για NOVA Lite TM HEp-2 είναι ανθρώπεια επιθηλιακά κύτταρα (HEp-2) και η σφαιρίνη είναι κεκκαθαρμένη αντιανθρώπινη IgG έχουσα προσεκτικά επιλεγέντα λόγο φθορισμού πρωτεϊνης (F/P). Αυτό επιτρέπει στο NOVA Lite TM HEp-2 να ανιχνεύει αντισώματα (συμπεριλαμβανομένων SS-Α καί Scl-70) τα οποία δεν ανιχνεύονται από άλλα εμπορικά κιτ. Επιπλέον η ειδική σφαιρίνη IgG εξαλειφει τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα λογω του μικρού τίτλου αυτοαντισωμάτων IgM που συναντώνται συχνά σε ηλικιωμένους άλλα υγιείς. Αρχη Μεθοδου Στη τεχνική του Έμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) τα δείγματα επωάζονται με το υπόστρωμα του αντιγόνου και τα ασύνδετα αντισώματα ξεπλένονται. Το υπόστρωμα κατόπιν επωάζεται με ειδική φθορίζουσα σφαιρίνη και το ασύνδετο αντιδραστήριο ξεπλένεται. Όταν παρατηρούμε μέσω μικροσκοπίου φθορισμού τα θετικά δείγματα εμφανίζουν φθορισμό πράσινου μήλου σε περιοχές του ιστού που το αντίσωμα έχει συνδεθεί. Αντιδραστηρια 1. HEp-2 (ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα). Πλάκες 12 θέσεων (wells) 2. Αντι ανθρώπινο IgG σύζευγμα (αίγας) συνδεδεμένο με φλουοροσκεινη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χρωστική Evans Blue και 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 4 ml 3. Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 0.5 ml 4. Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 0.5 ml 5. Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης PBS(40x) 1000 ml 6. Λάδι(mounting medium) που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 7 ml 7. Καλυπτρίδες Προσοχή 1. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 6 1

2 2. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 3. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 4. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η υποκατάσταση των συστατικών με άλλα από αυτά που παρέχονται σε αυτή τη συσκευασία μπορεί να οδηγήσουν σε αντιφατικά αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές η αναποτελεσματικό πλύσιμο της πλάκας ανοσοφθορισμού μπορεί να δημιουργήσει έντονο υπόβαθρο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου,η ένταση της λυχνίας του μικροσκοπίου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση της μικροπλάκας, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Με το χρόνο η σφαιρίνη μπορεί να αλλάξει χρώμα λόγω της έκθεσης του στο φώς. Η χρωματική αλλαγή δέν επηρεάζει τα αποτελέσματα. 7. Συνιστάται αυστηρή προσκόλληση στο πρωτόκολλο. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Το αραιωμένο PBS διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για τέσσερα εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία, Υλικά που παρέχονται 5 Πλάκες 12 θέσεων (12well) 1 4ml FITCH IgG ανοσοσφαιρίνη 1 0.5mL ANA μάρτυρας τιτλοποίησης τελικού σημείου 1 0.5mL IFA αρνητικός μάρτυρας 1 25ml PBS υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 7ml γλυκερίνη 1 10 καλυπτρίδες Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέττες όγκου μL Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό Pasteur πιπέττες ή μπουκάλια που λυγίζουν Θάλαμος Υγρασίας 1L δοχείο για PBS Δοχείο Coplin Μικροσκόπιο φθορισμού με διεγέρτη 495nm ή και 515nm προστατευτικό φίλτρου Μεθοδολογια, Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος αραίωσης/πλύσης (PBS ): ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο από το φιαλίδιο με το συμπυκνωμένο διάλυμα PBS σε 975 ml απεσταγμένου νερού και ανακατέψτε το καλά. Το αραιωμένο διάλυμα PBS θα χρησιμοποιηθεί για την αραίωση των δειγμάτων καθώς επίσης και για διάλυμα πλύσεων. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί έως και 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία συντήρησης 2-8 ο C. 3. Αραίωση δειγμάτων: 2

3 α. Αρχικός βασικός έλεγχος : Αραίωσε τα δείγματα 1:40 με αραιωμένο διάλυμα PBS (π.χ 50 μl oρού σε 1.95 ml PBS). β. Τιτλοποίηση (titration) Κάντε διαδοχικές αραιώσεις από την αρχική αραίωση σε όλα τα θετικά δείγματα (πχ 1: 80, 1:160,... 1: 2560). Διαδικασία 1. Προετοιμασία των πλακιδίων : Αφήστε τα πλακίδια να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν ανοίξετε τις συσκευασίες τους. Σημαδέψτε τα,τοποθετήστε τα σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε 1 σταγόνα (20-25 μl) από τον θετικό και τον αρνητικό πρότυπο ελέγχου (control) στη 1 και 2 θέση αντιστοίχως. Πρόσθεσε 1 σταγόνα (20-25 μl) του αραιωμένου δείγματος στις υπόλοιπες θέσεις. 2. Επώαση: Επωάστε τα πλακίδια για λεπτά σε υγρό περιβάλλον (μία βρεγμένη χαρτοπετσέτα σε ένα πλαστικό κουτί θα μπορεί να κρατήσει την κατάλληλη υγρασία). Μην επιτρέψετε να στεγνώσει το υπόστρωμα κατά τη διαδικασία. 3. Πλύσιμο των πλακιδίων: Μετά την επώαση, χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό μπουκάλι ή πλαστική πιπέττα ξεπλύνετε τον ορό με αραιωμένο PBS. Τοποθετήστε το πλακίδια σε τέτοια θέση έτσι ώστε να αποφεύγετε τη μεταφορά του δείγματος από τη μια θέση στην άλλη κατά το πλύσιμο. Αποφύγετε να στέλνετε με πίεση το PBS απευθείας πάνω στις θέσεις έτσι ώστε να μην καταστραφεί το υπόστρωμα. Εάν επιδιώκεται, τοποθετήστε τα πλακίδια σε μπανάκι (Coplin jar) με αραιωμένο PBS για επιπλέον 5 λεπτά. 4. Προσθήκη φθορίζοντος συζεύγματος (conjugate): Απομακρύνετε όσο PBS έχει απομείνει στο πλακίδιο (π.χ.με απορροφητικο χαρτί). Τοποθετήστε το πλακίδιο σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε αμέσως από μια σταγόνα συζεύγματος (conjugate)σε κάθε θέση. Επωάστε για λεπτά. 5. Πλύσιμο πλακιδίων: Επανέλαβε τη διαδικασία του σταδίου Καλυπτρίδα: Η διαδικασία τοποθέτησης καλυπτρίδας διαφέρει σε κάθε εργαστήριο. Παρ όλα αυτά προτείνεται η παρακάτω διαδικασία: α. Τοποθετήστε την καλυπτρίδα σε μια χαρτοπετσέτα. β. Προσθέστε λάδι (mounting medium) σε μια γραμμή στο κάτω άκρο της καλυπτρίδας. γ. Αφαιρέστε το επιπλέον PBS και τοποθετήστε με προσοχή το κάτω μέρος του πλακιδίου στην άκρη της καλυπτρίδας με τέτοιο τρόπο ώστε το λάδι να μεταφερθεί στο πάνω μέρος του πλακιδίου χωρίς να δημιουργηθούν φυσαλίδες. Ποιοτικός έλεγχος Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) (ANA Titratable Pattern Control) και ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (IFA System Negative Control) θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε πλάκα έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασία λειτουργούν σωστά. Επιπλέον κατάλληλοι οροί ελέγχου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη, < -70 C. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Σε περίπτωση που κάποιο από τα δύο κριτήρια δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η εξέταση. 1. Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) θα πρέπει να βαθμολογείται > Ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) θα πρέπει να είναι αρνητικός. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Αρνητική αντίδραση. Ένα δείγμα θεωρείται αρνητικό όταν ο φθορισμός του πυρήνα είναι ανάλογος ή λιγότερο φωτεινός από τον αρνητικό μάρτυρα. Κάποια δείγματα μπορούν να εμφανίσουν διάφορες χρώσεις υποστρώματος που να οφείλεται σε ετερόφιλα αντισώματα (heterophile) ή σε χαμηλά επίπεδα αυτοαντισωμάτων σε κυτταροπλασματικά στοιχεία όπως οι δομικές πρωτεΐνες. Θετική αντίδραση. Ένα δείγμα χαρακτηρίζεται σαν θετικό αρνητικό αν συγκεκριμένη χρώση του πυρήνα είναι περισσότερη από τον αρνητικό μάρτυρα. Προσδιορίστε το βαθμό ή την ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: 4+ Πολύ έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 3+ Έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 2+ Ευδιάκριτος θετικός φθορισμός 1+ Χαμηλότερος ειδικός φθορισμός ο οποίος επιτρέπει τη σαφή διαφοροποίηση της πυρηνικής ή/και κυτοπλασματικής χρώσης από το φθορισμό φόντου Επεξήγηση τύπου. Μια ποικιλία τύπων χρώσης πυρήνα και κυτταροπλάσματος ανάλογως του τύπου και της ποσότητος των αυτοαντισωμάτων στο δείγμα. Ομοιογενής φθορισμός(homogeneous): Σταθερή χρώση του πυρήνα. Πυρηνικά αντιγόνα: dsdna, ssdna, Histones Σχεση ασθενειών. Υψηλός τίτλος είναι ενδεικτικός Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου (Systemic Lupus Erythematosus SLE), Χαμηλότερος τίτλος είναι ενδεικτικός SLE η άλλης νόσου του συνδετικού ιστού. Περιφερειακός φθορισμός(peripheral): Σταθερή χρώση της περιφέρειας του πυρήνα με ασθενέστερη χρώση του κέντρου. Πυρηνικά αντιγόνα: dsdna, ssdna, DNP, Histone Σχεση ασθενειών: Υψηλός τίτλος είναι ενδεικτικός Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου ΣΕΛ. (Systemic Lupus Erythematosus, ΣΕΛ); Χαμηλότερος τίτλος είναι ενδεικτικός ΣΕΛ η άλλης νόσου του συνδετικού ιστού. Στικτός φθορισμός (Speckled): Ο φθορισμός του πυρήνα είναι ανομοιογενής και κοκκιώδης χωρίς φθορισμό των μιτωτικών κυττάρων. Πυρηνικά αντιγόνα: Sm, RNP,Scl-70 SS-A, SS-B και άλλα αντιγόνα/αντισώματα αχαρακτήριστα έως τώρα. 3

4 Σχεση ασθενειών: Υψηλός τίτλος είναι ενδεικτικός ΣΕΛ (Sm αντισώματα), νόσος του συνδετικού ιστού (RNP αντισώματα), σκληρόδερμα (Scl-70 αντισώματα), ή σύνδρομο Sjogren s (SS-B αντισώματα), Χαμηλότερος τίτλος είναι ενδεικτικός άλλης νόσου του συνδετικού ιστού. Φθορισμός πυρηνιδίου (Nucleolar): Φθορισμός μεγάλων κοκκίων του πυρήνα λιγότερα των 6 ανά κύτταρο, με ή χωρίς κηλίδες. Πυρηνικά αντιγόνα: 4-6S RNA και άλλα άγνωστα πυρηνικά αντιγόνα. Σχεση ασθενειών: Υψηλός τίτλος είναι αμφανίζεται σε σύνδρομο Sjogren s και σκληρόδερμα. Φθορισμός κεντρομεριδίου (Centromere): Ξεχωριστός στικτός τύπος. Παρατηρούνται κοκκία περισσότερα των 46. Πυρηνικά αντιγόνα: Χρωματόσωμα κεντρομεριδίου. Σχεση ασθενειών: Υψηλή σχέση με το σύνδρομο CREST, μια παραλλαγή της προοδευτικής συστηματικής σκλήρυνσης (PSS). CREST είναι μια μορφή PSS με έντονη ασβέστωση, καθώς και φαινόμενο Raynaud, οισοφάγεια δυσκινητικότητα και περιορισμένη εμπλοκή του δέρματος (περιορισμένη συνήθως στα δάκτυλα ή στο πρόσωπο), τελαγγειεκτασία. Μιτοχονδριακός φθορισμός: Λαμπερός φθορισμός του κυττοπλάσματος με ασθενη τη περιοχή του πυρήνα. Πυρηνικά αντιγόνα: Διάφοροι τύποι μιτοχονδριακών αντιγόνων. Σχεση ασθενειών: Υψηλός τίτλος δείχνει πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Είναι σημαντικό ο χρήστης να βασίζεται στο τύπο φθορισμού για το προσδιορισμό των αντισωμάτων,εκτός του πυρηνιδίου και κεντρομεριδίου όπου τα αντιγόνα προσδιορίζονται εύκολα και ο τύπος θφορισμού είναι χαρακτηριστικός. Καθότι πολλά αντισώματα η συνδιασμός μπορεί να περιλαμβάνεται στον ομογενή ή στικτό φθορισμό συνίσταται να ακολουθεί περαιτέρω έλεγχος αντισωμάτων (όπως dsdna, ENA). Όρια της Διαδικασίας 1. Υψηλός τίτλος ΑΝΑ είναι συνδεδεμένος με μολύνσεις του συνδετικού ιστού αλλά δεν πρέπει να θεωρείται διαγνωστικό. Τα αποτελέσματα του ΑΝΑ πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν σε σχέση με άλλες ορολογικές εξετάσεις καθώς και με το κλινικό ιστορικό του ασθενή. 2. Ο τύπος φθορισμού ΑΝΑ αλλάζει συχνά καθώς το δείγμα σταματά την τιτλοποίηση. Αυτό το φαινόμενο είναι λόγω του χαμηλού τίτλου αντισωμάτων που πέφτουν κάτω από την ευαισθησία του συστήματος καθώς ελέγχεται αραιότερο δείγμα. 3. Μια ποικιλία παραγόντων εκτός των περιεχομένων στη συσκευασία επηρεάζουν την ευαισθησία του ελέγχου. Συμπεριλαμβάνεται ο τύπος του μικροσκοπίου φθορισμού, η δύναμη και η ηλικία του λαμπτήρα, η μεγέθυνση, το σύστημα του φίλτρου και ο παρατηρητής. 4. Αν χρησιμοποιείται άλλου είδους φίλτρο εκτός του 515 barrier filter, παρατηρείται αυξημένη χρώση. 5. Μόνο μολύβι πρέπει να χρησιμοποιείται για να γραφούν οι πλάκες. Η χρήση άλλου υλικού μπορεί να προκαλέσει αυξημένη τεχνητή χρώση. 6. Όλα τα δοχεία Coplin που χρησιμοποιούνται για το πλύσιμο πρέπει να μην έχουν κατάλοιπα βαφής. Χρήση δοχείων με κατάλοιπα βαφής μπορεί να προκαλέσει τεχνητή χρώση. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 8. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. Αναμενόμενες Τιμές Το NOVA Lite HEp-2 χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθούν μια ποικιλία ασθενών με ασθένεια του συνδετικού ιστού, και 200 τυχαίοι δωρητές αίματος. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται παρακάτω. Ομάδα Ασθενών Αριθμός Αριθμός θετικών NOVA Lite HEp-2 ΣΕΛ Φαρμακοεπαγώμενος Λύκος Ρευματοειδής Αρθρίτιδα Σκληροδερμία Δερματομυοσίτιδα Σύνδρομο Sjogren s Φυσιολογικοί

5 Βιβλιογραφία 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Fourth Edition, 1999 (HHS Pub. #(CDC) ). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service November 2007 Revision GRC16 5