NOVA Lite ANCA Anti-neutrophil Cytoplasmic Autoantibody Reagents Σκοπό Χρήση Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αρχη Μεθοδου

Transcript

1 NOVA Lite ANCA A n t i-neutrophil Cytoplasmic Autoantibody Reagents Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση Κωδικός Προϊόντος: , , , , , , CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού χρησιμοποιεί πλακίδια με μονιμοποιημένο με αιθανόλη υπόστρωμα για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι κυτταροπλασματικών αντιγόνων των ουδετερόφιλων (ANCA) στον ανθρώπινο ορό. Η ανίχνευση των ANCA όταν συνδυάζεται με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα αποτελεί χρήσιμο εργαλείο στην συστηματοποίηση και διάγνωση διαφόρων συστηματικών αγγειοπαθειών (systemic vasculitides). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου H ανίχνευση των αντισωμάτων έναντι κυτταροπλασματικών αντιγόνων των ουδετερόφιλων έχει προκαλέσει επανάσταση στη διάγνωση και στη θεραπεία διαφόρων αυτοάνοσων αγγειοπαθειών (autoimmune mediated vasculitides). 1-4 Τα περιπυρηνικά ή panca και τα κυτταροπλασματικά canca αυτοαντισώματα έχει βρεθεί ότι είναι χρήσιμα για την ανίχνευση νοσημάτων όπως κοκκιωμάτωση Wegener και crescentic σπειραματονεφρίτιδα. Έχουν αναγνωριστεί τουλάχιστον 6 ANCA αντιγόνα και υπάρχουν πολλά μη αναγνωρισμένα ακόμη. 1,5 Τα περισσότερα από αυτά φαίνεται ότι είναι ένζυμα που βρίσκονται στα κοκκία των ουδετερόφιλων. Τα ένζυμα αυτά συμπεριλαμβάνουν την μυελοπεροξειδάση (myeloperoxidase - MPO) την πρωτεάση σερίνης 3 (serine protease 3) την ελακτάση (elactase), την λακτοφερίνη (lactoferin), την καθεψίνη G (cathepsin G) και την κατιονική πρωτεΐνη 57 (cationic protein 57 - CAP 57). Υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις για τη μέθοδο ELISA που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των πιο σημαντικών αντισωμάτων των ουδετεροφίλων ιδιαίτερα στον τομέα των αυτοάνοσων αγγειοπαθειών (vasculitis) για αυτό τον λόγο η μέθοδος του ανοσοφθορισμού προτείνεται και χρησιμοποιείται από τους περισσότερους για το αρχικό βασικό έλεγχο. Έχουν ανιχνευθεί δύο τύποι ANCA με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Ο κλασσικός τύπος εμφανίζεται ως κοκκιωματώδης κυτταροπλασματικός φθορισμός. Αυτός ο τύπος, canca, είναι ύποπτος για κοκκιωμάτωση του Wegener και σε μικρότερο βαθμό για μικροσκοπική πολυαρτηριίτιδα (microscopic polyarteritis). Έχει περιγραφεί ένα δεύτερο σχήμα ANCA 7,8 το οποίο χρωματίζει την περιοχή γύρω από τον πυρήνα μονιμοποιημένων με αλκοόλη ουδετερόφιλων. Αυτό το σχήμα έχει οριστεί ως panca. Το σχήμα panca σχετίζεται με περισσότερο περιορισμένη σε όργανα αγγειίτιδα, συγκεκριμένα, με την μηνοειδή ή ταχέως προοδευτική σπειραματονεφρίτιδα. 9 Έχει τεκμηριωθεί η συσχέτιση μεταξύ canca και της κοκκιωμάτωσης Wegener. 3,10 Η κοκκιωμάτωση Wegener χαρακτηρίζεται από μια νεκρωτική φλεγμονώδη διεργασία με δημιουργία κοκκιώματος και αγγειίτιδα, η οποία κυρίως επηρεάζει την ανώτερη και κατώτερη αναπνευστική οδό και τα νεφρά. Αυτή η τριάδα κλινικής εμπλοκής θεωρείται το τυπικό χαρακτηριστικό της κοκκιωμάτωσης Wegener. Τα canca ανιχνεύονται στο 96% των ασθενών με κοκκιωμάτωση του Wegener σε γενικευμένη μορφή, αλλά μειώνεται στο 65% στην ενεργή περιορισμένη μορφή (active limited disease) ενώ ανευρίσκεται στο 30 40% των ασθενών σε ύφεση. Ο τίτλος των canca είναι επίσης ανάλογος με την πορεία της ασθένειας και μειώνεται κατά τη ύφεση ενώ αυξάνεται κατά την έξαρση. 4,12 Σε αντίθεση με τα canca τα οποία συσχετίζονται κυρίως με τη συστηματική νόσο του Wegener τα panca συχνά συσχετίζονται με τη νεκρωτική σπειραματονεφρίτιδα Τα p ANCA δεν συσχετίζονται με συστηματικά σύνδρομα. Το πιο συνηθισμένο αντιγόνο-στόχος που συσχετίζεται με τα p ANCA είναι η μυελοπεροξειδάση αλλά υπάρχουν και περιπτώσεις όπου ανιχνεύεται αντίδραση έναντι της λακτάσης και της λακτοφερίνης (lactoferrin). Σχεδόν το 90% των θετικών panca δειγμάτων σε ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδα αντιδρούν στη μυελοπεροξειδάση. Σε ασθενείς όμως με άλλα νοσήματα εκτός της σπειραματονεφρίτιδας, που παρουσιάζουν θετικά panca το ποσοστό της αντίδρασης στη μυελοπεροξειδάση είναι κατά πολύ μικρότερο. 11,13 Το γεγονός αυτό υποδηλώνει την ύπαρξη πολλαπλών αντιγόνων τα οποία ανιχνεύονται ως περιπυρηνικός φθορισμός στα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα συμπεριλαμβανομένων και ορών με θετικά αντιπυρηνικά αντισώματα. Η επιβεβαίωση του περιπυρηνικού τύπου των panca στα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα, μπορεί να γίνει με την εξέταση ανοσοφθορισμού σε μονιμοποιημένα με φορμαλίνη ουδετερόφιλα. Στην περίπτωση των μονιμοποιημένων με φορμαλίνη ουδετερόφιλων, το κύριο αντιγόνο στόχος η μυελοπεροξειδάση, παραμένει στο κυτταρόπλασμα ενώ στα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα η μυελοπεροξειδάση μεταναστεύει στον πυρήνα προκαλώντας τη σύγχυση του περιπυρηνικού τύπου. Αρχη Μεθοδου Στη τεχνική του Έμμεσου Ανοσοφθορισμού τα δείγματα επωάζονται με το υπόστρωμα του αντιγόνου και τα ασύνδετα αντισώματα ξεπλένονται. Το υπόστρωμα κατόπιν επωάζεται με ειδική φθορίζουσα σφαιρίνη και το ασύνδετο αντιδραστήριο ξεπλένεται.όταν παρατηρούμε μέσω μικροσκοπίου φθορισμού τα θετικά δείγματα εμφανίζουν φθορισμό πράσινου μήλου σε περιοχές του ιστού που το αντίσωμα έχει συνδεθεί. 1

2 Αντιδραστηρια 1. ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα: 6 ή 12οπές ανά πλακίδιο με αφυγραντικό Διαγνωστικά σύνολα μόνο 2. Αντι ανθρώπινο IgG σύζευγμα (αίγας) συνδεδεμένο με φλουοροσκεινη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χρωστική Evans Blue και 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο 3. Θετικός canca πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο 4. Θετικός panca πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο 5. Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο 6. Συμπυκνωμένο διάλυμα PBS II (40x) 7. Λάδι που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο 8. Καλυπτρίδες Προσοχή 1. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 3. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 4. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η υποκατάσταση των συστατικών με άλλα από αυτά που παρέχονται σε αυτή τη συσκευασία μπορεί να οδηγήσουν σε αντιφατικά αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές η αναποτελεσματικό πλύσιμο της πλάκας ανοσοφθορισμού μπορεί να δημιουργήσει έντονο υπόβαθρο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής,μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία.είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου,η ένταση της λυχνίας του μικροσκοπίου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση της μικροπλάκας, οι χρόνοι επώασης.προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Με το χρόνο η σφαιρίνη μπορεί να αλλάξει χρώμα λόγω της έκθεσης του στο φώς.η χρωματική αλλαγή δέν επηρεάζει τα αποτελέσματα. 7. Συνιστάται αυστηρή προσκόλληση στο πρωτόκολλο. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια σ τ ο υ ς 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Το αραιωμένο PBS II διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για τέσσερα εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση,θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται.αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (στο παρελθόν NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 2

3 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται (διαγνωστικά σύνολα) ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα: 6 οπές 1 4ml FITC Αντι ανθρώπινο IgG Σύζευγμα 1 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 10 καλυπτρίδες ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα: 12 οπές 1 15ml FITC Αντι ανθρώπινο IgG Σύζευγμα 2 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 20 καλυπτρίδες ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα: 12 οπές 1 15ml FITC Αντι ανθρώπινο IgG Σύζευγμα 2 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 20 καλυπτρίδες ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα: 6 οπές 1 4ml FITC Αντι ανθρώπινο IgG Σύζευγμα 1 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 10 καλυπτρίδες Παρεχόμενα υλικά (αντικειμενοφόρες πλάκες) x Πλακίδια με υπόστρωμα από ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα, 6 οπές x Πλακίδια με υπόστρωμα από ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα, 12 οπές x Πλακίδια με υπόστρωμα από ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα, 12 οπές x Πλακίδια με υπόστρωμα από ANCA Πλακίδια με ανθρώπινα μονιμοποιημένα σε αιθανόλη ουδετερόφιλα, 6 οπές Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέττες όγκου μL Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό Pasteur πιπέττες ή μπουκάλια που λυγίζουν Θάλαμος Υγρασίας 1L δοχείο για PBS II Δοχείο Coplin Μικροσκόπιο φθορισμού με διεγέρτη 495nm ή και 515nm προστατευτικό φίλτρου Πρόσθετα υλικά που διατίθενται ξεχωριστά ANCA (Μονιμοποιημένα με φορμαλίνη ανθρώπινα ουδετερόφιλα), πλάκα 6 κοιλοτήτων, αρ. καταλόγου INOVA ANCA (Μονιμοποιημένα με φορμαλίνη ανθρώπινα ουδετερόφιλα), πλάκα 12 κοιλοτήτων, αρ. καταλόγου INOVA

4 Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος αραίωσης/πλύσης ( PBS II ): ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS II 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο από το φιαλίδιο με το συμπυκνωμένο διάλυμα PBS II σε 975 ml απεσταγμένου νερού και ανακατέψτε το καλά. Το αραιωμένο διάλυμα PBS II θα χρησιμοποιηθεί για την αραίωση των δειγμάτων καθώς επίσης και για διάλυμα πλύσεων. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί έως και 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία συντήρησης 2-8 ο C. 3. Αραίωση δειγμάτων α. Αρχικός βασικός έλεγχος : Αραίωσε τα δείγματα 1:20 με αραιωμένο διάλυμα PBS II (π.χ 50 μl oρού σε 950 μl PBS II). β. Τιτλοποίηση (titration) Κάντε διαδοχικές αραιώσεις από την αρχική αραίωση σε όλα τα θετικά δείγματα (πχ 1: 40, 1:80, 1: 1280). Διαδικασία 1. Προετοιμασία των πλακιδίων :Αφήστε τα πλακίδια να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν ανοίξετε τις συσκευασίες τους. Σημαδέψτε τα,τοποθετήστε τα σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε 1 σταγόνα (20-25 μl) από τον θετικό και τον αρνητικό πρότυπο ελέγχου (control) στη 1 και 2 θέση αντιστοίχως. Πρόσθεσε 1 σταγόνα (20-25 μl) του αραιωμένου δείγματος στις υπόλοιπες θέσεις. 2. Επώαση: Επωάστε τα πλακίδια για λεπτά σε υγρό περιβάλλον (μία βρεγμένη χαρτοπετσέτα σε ένα πλαστικό κουτί θα μπορεί να κρατήσει την κατάλληλη υγρασία). Μην επιτρέψετε να στεγνώσει το υπόστρωμα κατά τη διαδικασία. 3. Πλύσιμο των πλακιδίων: Μετά την επώαση, χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό μπουκάλι ή πλαστική πιπέττα ξεπλύνετε τον ορό με αραιωμένο PBS II. Τοποθετήστε το πλακίδια σε τέτοια θέση έτσι ώστε να αποφεύγετε τη μεταφορά του δείγματος από τη μια θέση στην άλλη κατά το πλύσιμο. Αποφύγετε να στέλνετε με πίεση το PBS II απευθείας πάνω στ ι ς θ έ σ ε ι ς έ τ σ ι ώ σ τ ε ν α μ η ν κ α τ α σ τ ρ α φ ε ί τ ο υπόστρωμα. Εάν επιδιώκεται, τοποθετήστε τα πλακίδια σε μπανάκι (Coplin jar) με αραιωμένο PBS II για επιπλέον 5 λεπτά. 4. Προσθήκη φθορίζοντος συζεύγματος (conjugate): Απομακρύνετε όσο PBS II έχει απομείνει στο πλακίδιο(π.χ.με απορροφητικο χαρτί). Τοποθετήστε το πλακίδιο σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε αμέσως από μια σταγόνα συζεύγματος (conjugate)σε κάθε θέση. Επωάστε για λεπτά. 5. Πλύσιμο πλακιδίων: Επανέλαβε τη διαδικασία του σταδίου Καλυπτρίδα: Η διαδικασία τοποθέτησης καλυπτρίδας διαφέρει σε κάθε εργαστήριο. Παρ όλα αυτά προτείνεται η παρακάτω διαδικασία. α. Τοποθετήστε την καλυπτρίδα σε μια χαρτοπετσέτα. β. Προσθέστε λάδι (mounting medium) σε μια γραμμή στο κάτω άκρο της καλυπτρίδας. γ. Αφαιρέστε το επιπλέον PBS II και τοποθετήστε με προσοχή το κάτω μέρος του πλακιδίου στην άκρη της καλυπτρίδας με τέτοιο τρόπο ώστε το λάδι να μεταφερθεί στο πάνω μέρος του πλακιδίου χωρίς να δημιουργηθούν φυσαλίδες. Ποιοτικός έλεγχος Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) (ANA Homogeneous Pattern) και ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (IFA System Negative Control) θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε πλάκα έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασία λειτουργούν σωστά. Επιπλέον κατάλληλοι οροί ελέγχου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη < -70 C. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Σε περίπτωση που κάποιο από τα δύο κριτήρια δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η εξέταση. 1. Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) θα πρέπει να βαθμολογείται > Ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) θα πρέπει να είναι αρνητικός. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Αρνητική αντίδραση Ένα δείγμα θεωρείται αρνητικό όταν ο φθορισμός του πυρήνα είναι ανάλογος ή λιγότερο φωτεινός από τον αρνητικό μάρτυρα. Κάποια δείγματα μπορούν να εμφανίσουν διάφορες χρώσεις υποστρώματος που να οφείλεται σε ετερόφιλα αντισώματα (heterophile) ή σε χαμηλά επίπεδα αυτοαντισωμάτων σε κυτταροπλασματικά στοιχεία όπως οι δομικές πρωτεΐνες. Θετική αντίδραση Ένα δείγμα θεωρείται θετικό όταν η ειδική πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση που παρατηρείται είναι εντονότερη από τον αρνητικό μάρτυρα. Προσδιορίστε το βαθμό ή την ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: 4+ Πολύ έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 3+ Έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 2+ Ευδιάκριτος θετικός φθορισμός 1+ Χαμηλότερος ειδικός φθορισμός ο οποίος επιτρέπει τη σαφή διαφοροποίηση της πυρηνικής ή/και κυτοπλασματικής χρώσης από το φθορισμό φόντου. Α ν ά λ υ σ η τ ύ π ω ν Pattern ( interpretation) Μια ποικιλία τύπων πυρηνικής και κυτταροπλασματικής χρώσης μπορούν να παρατηρηθούν που εξαρτάται από το είδος και την ποσότητα των αυτοαντισωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα. Οι παρακάτω τύποι μπορούν να παρατηρηθούν 4

5 canca ή κυτταροπλασματική χρώση: Ο τύπος αυτός εμφανίζεται κυρίως με στικτό φθορισμό του κυτταροπλάσματος που μπορεί να συνοδεύεται από φθορισμό μέσα και γύρω από τους πυρηνικούς λοβούς. Αυτός ο τύπος ανιχνεύεται συνήθως από αντισώματα που αντιδρούν με το ένζυμο πρωτεάση σερίνης 3 (PR3). panca ή περιπυρηνική χρώση: Ο τύπος αυτός εμφανίζεται κυρίως με ομοιογενή φθορισμό των πυρηνικών λοβών και κυρίως με έντονο περιπυρηνικό φθορισμό. Επειδή κάποια αντιπυρηνικά αυτοαντισώματα μπορούν επίσης να αντιδράσουν με τους πυρήνες των ουδετερόφιλων, προτείνεται τα δείγματα να ελέγχονται και για αντιπυρηνικά αντισώματα. Επιπλέον τα δείγματα θα πρέπει να ελέγχονται έναντι και ουδετερόφιλων μονιμοποιημένων με φορμαλίνη. Η φορμαλίνη καταστρέφει τα περισσότερα πυρηνικά αντιγόνα και αλλάζει τη χρώση από πυρηνική σε κυτταροπλασματική εάν στο δείγμα υπάρχουν panca. Όρια της Διαδικασίας 1. Αιμολυμένα, θερμοαπενεργοποιημένα, επιμολυσμένα, δείγματα με ινική, μπορεί να προκαλέσουν έντονο μη ειδικό φθορισμό και να οδηγήσουν σε λάθος αποτελέσματα. Προτείνεται να γίνει επανέλεγχος με καινούργιο δείγμα ή να γίνει προσθήκη 2% αλβουμίνης ή βόιου ορού σε PBS II ώστε να αραιωθούν τα δείγματα. 2. Τα θετικά ΑΝΑ δείγματα μπορεί να δώσουν θετικές αντιδράσεις στα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα. Τα δείγματα με θετικό πυρηνικό τύπο προτείνεται να ελέγχονται για ΑΝΑ ή να γίνεται έλεγχος και σε μονιμοποιημένα με φορμαλίνη ουδετερόφιλα. 3. Επειδή είναι γνωστό ότι τα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα περιέχουν πολλαπλά αντιγόνα όπως η ελακτάση, η λακτοφερρίνη, η καθεψίνη G (cathepsin G), η κατιονική πρωτεΐνη 57, και πιθανόν και άλλα αντιγόνα τα οποία δεν έχουν ακόμα αναγνωριστεί, υπάρχει η πιθανότητα ορισμένα δείγματα που θεωρούνται θετικά canca ή panca να μην είναι πάντοτε θετικά έναντι της μυελοπεροξειδάσης (MPO) ή της πρωτεάσης 3 της σερίνης (PR3). 4. Εκτός των ΑΝΑ κάποια άλλα αυτοαντισώματα μπορεί επίσης να αντιδράσουν με τα μονιμοποιημένα με αιθανόλη ανθρώπινα ουδετερόφιλα., όπως τα αντισώματα έναντι των λείων μυικών ινών και ακτίνης (anti-smooth muscle, actin) και κάποια αλλοαντισώματα όπως Mart ή NB1 15. Η ακτίνη ή τα αντισώματα έναντι των λείων μυικών ινών, αντιδρούν με το κυτταρόπλασμα των ουδετεροφίλων αλλά προκαλούν ομοιογενή φθορισμό και όχι τον στικτό τύπο που είναι χαρακτηριστικός στα canca. Τα αλλοαντισώματα μπορεί επίσης να δώσουν κυτταροπλασματικό τύπο φθορισμού αλλά είναι περισσότερο λεπτό σε σύγκριση με τον τύπο που δίνουν τα θετικά canca και συνήθως μόνο ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων φθορίζει (40% ). 5. Περιστασιακά ένα δείγμα μπορεί να είναι θετικό για περισσότερα από ένα αντισώματα όπως canca και panca ή ANCA και ΑΝΑ. 6. Κάποιοι ασθενείς με φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου (inflammatory bowel disease) or σπαστική κολίτιδα (ulcerative colitis) έχουν αντισώματα έναντι ουδετεροφίλων. 16 Αυτά τα δείγματα παρουσιάζουν έναν τυπικό panca τύπο φθορισμού με έντονο περιπυρηνικό φθορισμό. Τυπικά αυτά τα δείγματα είναι αρνητικά ή δίνουν ασθενή ομοιογενή κυτταροπλασματικό φθορισμό σε μονιμοποιημένα με φορμαλίνη πλακίδια 7. Τεχνικά προβλήματα ιδιαιτέρως κατά το στάδιο της χρώσης όπως το να «στεγνώσουν» τα πλακίδια μπορεί να δώσουν αμφίβολα αποτελέσματα. 8. Η χρήση αντιδραστηρίων από άλλα ΚΙΤ ανοσοφθορισμού ειδικά η χρήση άλλου συζεύγματος (conjugate) μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία και την ειδικότητα του υποστρώματος των πλακιδίων που εμπεριέχουν μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα. 9. Μια ποικιλία εξωτερικών παραγόντων μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία της εξέτασης συμπεριλαμβανομένων του τύπου του μικροσκοπίου φθορισμού, της έντασης και χρονικής χρήσης της λάμπας, της μεγέθυνσης, του συστήματος φίλτρων και του παρατηρητή. 10. Εάν χρησιμοποιείται band pass filter αντί για 515 barrier filter, μπορεί να παρατηρηθεί αυξημένη μη ειδική χρώση. 11. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο μολύβι για εγγραφή πάνω στα πλακίδια. Οποιοδήποτε άλλο είδος μπορεί να προκαλέσει μη ειδική χρώση. 12. Όλα τα μπανάκια που χρησιμοποιούνται στο πλύσιμο των πλακιδίων πρέπει να μην έχουν κατάλοιπα χρώσης. Τα κατάλοιπα χρώσης μπορεί να δώσουν μη ειδική χρώση. 13. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 14. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. 15. Τα πλακίδια που πωλούνται χωριστά κατηγοριοποιούνται ως "Ειδικά αντιδραστήρια για αναλυτές". Πέραν τις ιδιότητάς του ως συστατικού του Κιτ NOVA Lite ANCA, τα χαρακτηριστικά ανάλυσης και επιδόσεων δεν έχουν αποδειχτεί. Αναμενόμενες Τιμές Τυχαιός έλεγχος 115 δειγμάτων έγινε σε μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα (ethanol-fixed NOVA Lite ). Τα συγκεκριμένα δείγματα προσκομίστηκαν στα πλαίσια ιατρικού ελέγχου ατόμων πριν από την πρόσληψη. Με αυτό το δεδομένο στα δείγματα δεν συμπεριλαμβάνονται άτομα μεγάλης ηλικίας ή παιδιατρικά περιστατικά. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά στην1/20 αραίωση. Επίσης ελέγχθηκαν 45 διαγνωσμένα Wegener s, 39 με μικροσκοπική πολυαρτηριίτιδα, 20 με crescentic σπειραματονεφρίτιδα όπως επίσης και δείγματα θετικά για διάφορα νοσήματα συνδετικού ιστού. Τα αποτελέσματα έχουν ως εξής: 5

6 Ο Μ ΑΔ Α ΑΣ Θ Ε Ν Ω Ν ΑΡΙΘΜΟΣ ΑΣΘΕΝΩΝ % ΘΕΤΙΚΩΝ Φυσιολογικά Wegener s (όλα canca) Μικροσκοπική πολυαρτιριίτιδα (όλα panca) Σπειραματονεφρίτιδα (όλα panca) ΣΕΛ 27 7 (αμφότερά panca) Σύνδρομο Sjogren 21 0 Σκληρόδερμα 15 0 Πολυμυοσίτιδα 6 0 Οι πλάκες NOVA Lite ANCA δοκιμάσθηκαν μία μία σε πανεπιστημιακό κέντρο αναφοράς για το ANCA.66 θετικοί οροί (23 canca,28 panca,4 aanca) και 14 αρνητικοί δοκιμάσθηκαν.απο τα 55 δείγματα στα 54 εμφανίστηκε χρώση στίς πλάκες INOVA.Ενα δείγμα χαμηλού τίτλου canca εμφάνησε αρνητικό αποτέλεσμα σε πλάκα INOVA.14 αρνητικά δείγματα ήταν αρνητικά καί σε πλάκα INOVA.Τιτλοποίηση 55 θετικών δειγμάτων σε διπλό υπόστρωμα εμφάνησε το ίδιο αποτέλεσμα ή μία διαφορά σε διπλή αραίωση με 53 δείγματα.τα υπόλοιποα 2 δείγματα διέφεραν με 2 διαδοχικές αραιώσεις. 48 τυχαία δείγματα πρότυπου εργαστηρίου δοκιμάστηκαν ταυτόχρονα με NOVA Lite ANCA και ειδικό MPO και PR3 QUANTA Lite ELISA INOVA με τα εξής αποτελέσματα. % ELISAΘετικά Αποτελεσματα IFA Αρ.Δειγμάτων ΜΡΟ PR3 Aρνητικό panca canca panca & canca Atypical δείγματα ήταν αρνητικά κατά ANCA με Ανοσοφθορισμό, και MPO,PR3 ELISA.Οι τιμές σε MPO,PR3 κυμάνθηκαν από 1-5 μονάδες (units),κάτω τών 20 μονάδων του αποκοπής (cut off).από 13 δείγματα θετικά κατά panca με Ανοσοφθορισμό,11 ευρέθησαν θετικά κατά MPO, και κανένα κατά PR3. Από 21 δείγματα θετικά κατά canca με Ανοσοφθορισμό,20 απο τα 21 ευρέθησαν θετικά κατά PR3, και κανένα κατά MPO. 5 δείγματα εμφάνισαν φθορισμό κατά canca και panca,4 των οποίων ήταν θετικά κατά MPO και κανένα κατά PR3.1 δείγμα χαρακτηρίστηκα σάν ατυπο panca που ήταν αρνητικό κατά MPO και PR3. Συγκριση ANCA Αποτεδεσματων ELISA vs IFA Ενώ τα MPO και PR3 είναι τα κύρια αντιγόνα που μπορούν να αναγνωριστούν σαν p και c ANCA θα πρέπει ν α τ ο ν ι σ τ ε ί ρχουν ό τ ι και υ π άλλα ά ουδετεροφιλικά αντιγόνα που μπορούν να παράγουν c και p ANCA τύπους φθορισμού σε μονιμοποιημένα με αιθανόλη ουδετερόφιλα. Αυτό ισχύει κυρίως για την περίπτωση των panca όπου υπάρχουν τουλάχιστον 3 άλλα αντισώματα έναντι αντιγόνων διαφορετικών από τα MPO τα οποία μπορούν να προκαλέσουν panca τύπο. Για την επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων τα παραπάνω δείγματα συγκρίθηκαν αφού ελέγχθηκαν με δύο διαφορετικές μεθόδους : ELISA και ανοσοφθορισμό. QUANTA Lite PR-3 IgG Σχετική Ευαισθησία 90.9% canca Σχετική Ειδικότητα 98.8% Σχετική Ευκρίνεια 95.4% QUANTA Lite MPO IgG Σχετική Ευαισθησία 61.0% panca Σχετική Ειδικότητα 100% Σχετική Ευκρίνεια 80.3% Σε 66 c ANCA θετικά με IFA,6 ήταν αρνητικά και 1 θετικό κατά PR3. Σε 77 panca θετικά με IFA,30ήταν αρνητικά και 1 θετικό κατά MPO και κανένα αρνητικό με IFA δέν ήταν θετικό με ELISA. 6

7 Βιβλιογραφία 1. Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11: , Specks U, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, van der Woude FJ, et. al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet , Cohen-Tervaert JW, et. al., Association between active Wegener s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149: , Cambridge, et. al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33: , Nolle B, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, Charles LA, Falk RJ, Jennette JC, Clin Immunol Immunopathol 53: , Falk RJ, Jennette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318: , Jennette JC, Wilkman AS, Falk RJ, Am J Path 135: , Gross WL, Ludemann G, et. al., Lancet 1:806, Cohen-Tervaert JW, et. al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arth and Rheum 33(8): , Cohen-Tervaert JW, et. al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37: , Cohen-Tervaert JW, et. al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Stroncek DF, et. al., Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false-positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am J Kidney Dis 21: , Hardarson S, et. al., Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99: No. 3, Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC December 2012 Revision 17 NOVA Lite, QUANTA Lite και INOVA Diagnostics, Inc, είναι σήματα κατατεθέντα. Copyright 2012 All Rights Reserved 7