QUANTA Lite TM sp Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM sp Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM sp100 αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό του αντισώματος anti-sp100 της τάξης IgG στον ορό ανθρώπων. Αυτή η δοκιμασία προορίζεται για την υποβοήθηση της διάγνωσης πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση (PBC). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) είναι μια χρόνια νόσος του ήπατος που χαρακτηρίζεται από την αποδόμηση των μικρών ενδοηπατικών χοληφόρων. Η προοδευτική αποδόμηση των πόρων οδηγεί σε αυξανόμενη λειτουργική αδυναμία τους ήπατος, και με την πάροδο του χρόνου, μπορεί να προκαλέσει ηπατική ανεπάρκεια για την οποία είναι αναγκαία η μεταμόσχευση ήπατος. 1,2 Η αιτιολογία της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης παραμένει άγνωστη, αν και η γενετική προδιάθεση καθώς και άλλοι παράγοντες μπορεί να συμβάλλουν σημαντικά στην εξέλιξη της νόσου. 1,3,4 Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) επηρεάζει τις γυναίκες πιο συχνά από ότι τους άνδρες, με την αναλογία γυναικών:ανδρών να υπολογίζεται σε 9:1, ενώ συμβαίνει συνήθως στις ηλικίες από 30 έως 65 έτη. 3,4 Ο επιπολασμός της PBC σε πρώτου βαθμού συγγενείς ασθενών με PBC κυμαίνεται από 1.3 έως 6.4%. 3,5 Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση παρουσιάζεται σε όλες τις φυλές και εμφανίζεται σε όλο τον κόσμο. Έχουν αναφερθεί μεγάλες διακυμάνσεις στο γεωγραφικό επιπολασμό της PBC, που ποικίλουν από υπολογισμούς χαμηλού επιπολασμού 2 ανά 100,000 στην Ιαπωνία και την Αυστραλία, μέχρι 40 ανά 100,000 στις Ηνωμένες Πολιτείες. 4,6 Δεν είναι σαφές εάν ο βαθμός των μεγάλων διακυμάνσεων του επιπολασμού που αναφέρεται σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές οφείλεται σε πραγματικές γεωγραφικές διακυμάνσεις ή σε 3, 4, 7 διαφορές στο σχεδιασμό μελέτης και τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται. Οι ορολογικές αναλύσεις αποτελούν σημαντικά βοηθήματα για την αναγνώριση και τη διάγνωση PBC, καθώς πολλά αντισώματα που συσχετίζονται με την PBC είναι παρόντα στον ορό πριν από την εκδήλωση των συμπτωμάτων. 8 Με την πάροδο του χρόνου, μειώνεται η αναλογία των ασθενών που παραμένουν ασυμπτωματικοί. 8 Τα αντι-μιτοχονδιακά αντισώματα (AMA), που ανιχνεύονται τυπικά σε τεμάχια του νεφρικού-στομαχικού ιστού ή σε κύτταρα HEp-2 με έμμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού (IFA), αποτελούν τους κλασικούς ορολογικούς δείκτες των ασθενών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Οι πρώιμες μελέτες διαχώριζαν τα AMA σε υποομάδες βάσει της αντιδραστικότητάς τους με αντιγονικά κλάσματα (M1-M9) που απομονώθηκαν από ήπαρ αρουραίου ή μιτοχονδριακές μεμβράνες καρδιάς βοδινού. 9 Η αντιδραστικότητα anti-m2 είναι η επικρατέστερη ειδικότητα, αφού παρουσιάζεται μέχρι και στο 95% των ασθενών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Οι εξετάσεις ELISA που στηρίζονται στα M2 είναι πιο ευαίσθητες από την IFA 10, 11 για την ανίχνευση AMA. Παρά το γεγονός ότι διατίθενται πιο ευαίσθητες αναλύσεις ELISA, η ανίχνευση AMA με IFA παραμένει η συνήθης ανάλυση που εκτελούν πολλά εργαστήρια. Υπάρχει, όμως, μια υποομάδα που αποτελείται από το 10% τουλάχιστον των ασθενών PBC, οι οποίοι έχουν αρνητικά αποτελέσματα AMA. Αυτή η ομάδα ασθενών έχει αναφερθεί ως αρνητική ως προς AMA PBC ή αυτοάνοση χολαγγειίτιδα, αλλά δεν είναι ακόμη σαφές εάν θα πρέπει να θεωρείται ξεχωριστή κλινική οντότητα σε σχέση με την θετική ως προς AMA PBC. 12,13 Εκτός από τα AMA, περίπου 50-72% των ορών από ασθενείς PBC περιέχουν αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) Δύο σχήματα ANA που σχετίζονται ειδικά με την πρωτοπαθή χολική κίρρωση περιλαμβάνουν διάστικτη χρώση της πυρηνικής στεφάνης/μεμβράνης που χαρακτηρίζει την πρωτεΐνη της μεμβράνης του πυρηνικού πόρου gp210 και ένα σχήμα πολλαπλών πυρηνικών κηλίδων (MND) που χαρακτηρίζει την πρωτεΐνη που σχετίζεται με το πυρηνικό σώμα sp , 14 Τα anti-sp100 αντισώματα έχουν βρεθεί στο 25% περίπου των ασθενών με PBC και είναι εξαιρετικά ειδικά για την πρωτοπαθή χολική κίρρωση Επιπλέον, τα anti-sp100 αντισώματα βρίσκονται σε ορισμένους ασθενείς που εξετάζονται αρνητικοί για τους συμβατικούς δείκτες της PBC, όπως τα AMA και τα M2. 15, 20, 21 Η παρουσία αντισωμάτων sp100 μπορεί να ενισχύσει τη διάγνωση της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης σε περιπτώσεις που μπορεί να μην είναι σαφής η κλινική και/ή η ορολογική εικόνα. 22 Τα αντισώματα anti-sp100 παράγουν γενικά ένα στικτό σχήμα που αποτελείται από πυρηνικές κηλίδες περίπου στα κύτταρα HEp-2. Το στικτό σχήμα που σχετίζεται με το sp100 μπορεί να είναι δύσκολο ή ακόμη κι αδύνατο να διαβαστεί λόγω των συνακόλουθων χρώσεων AMA, ANA ή άλλων χρώσεων τύπου στίξης. Ο στόχος των αντισωμάτων anti-sp100 έχει ταυτοποιηθεί ως πρωτεΐνη μοριακού βάρους 100 kda περίπου που εντοπίζεται στην ίδια θέση με την πρωτεΐνη της προμυελωματικής λευχαιμίας (PML) σε συμπλέγματα πολλαπλών πρωτεϊνών που ονομάζονται πυρηνικά σώματα. 14, 23 Συμπληρωματικές μελέτες οδήγησαν στη μοριακή κλωνοποίηση της πρωτεΐνης sp100 και την εξέλιξη των αναλύσεων ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων anti-sp

2 Αρχη Μεθοδου Ένα καθαρό κλάσμα της πρωτεΐνης sp100 δεσμεύεται στις υποδοχές μιας πλάκας μικροϋποδοχών πολυστυρενίου. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στις πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα sp100 να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με πεπτίδιο sp100 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα sp100) 3. sp100 ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο sp100, προαραιωμένο, 1.2ml 4. sp100 ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο sp100, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 2

3 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 sp100 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος sp100 Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος sp100 High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας) 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 3

4 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm και αναφοράς 620 nm. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 25 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του sp100 ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του sp100 ELISA Low. Η τιμή του sp100 ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X sp100 oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. sp100 ορού ελέγχου 4

5 Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά (αρνητικά για το αντίσωμα IgG έναντι sp100), ισότιμα ή θετικά (εντοπίζεται αντίσωμα IgG έναντι sp100) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Αρνητικό Μονάδες Ισότιμο Μονάδες Θετικό 25 Μονάδες 1. Το θετικό αποτέλεσμα δηλώνει την παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι sp100 και υποδηλώνει το ενδεχόμενο πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση. 2. Ένα δείγμα με ισότιμες συγκεντρώσεις IgG έναντι sp100 δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Αν τα αποτελέσματα παραμένουν ισότιμα μετά την επαναληπτική δοκιμασία, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως ισότιμο ή/και πρέπει να ληφθεί πρόσθετο δείγμα. 3. Το αρνητικό δείγμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα IgG έναντι sp100 ή ότι υπάρχουν συγκεντρώσεις κάτω από το όριο εντοπισμού της ανάλυσης. 4. Τα δείγματα που παρέχουν μετρήσεις Ο.Α. πάνω από τις μετρήσιμες τιμές του φωτόμετρου μικροπλάκας μπορεί να αναφερθούν ως μεγαλύτερες από την υψηλότερη μετρήσιμη Ο.Α. δια της μικρότερης θετικής Ο.Α. επί 25 ή μπορούν να αραιωθούν, να εξεταστούν ξανά και να επιτευχθεί μια υπολογισμένη τιμή. 5. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM sp100 ELISA. Οι τιμές sp100 που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για sp100 δεν αποκλείει την παρουσία πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση. 2. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για αντισώματα έναντι sp100 δεν αποκλείει την παρουσία αντισωμάτων έναντι sp100, καθώς η συγκέντρωση αντισωμάτων μπορεί να είναι χαμηλότερη από το ανιχνεύσιμο όριο της ανάλυσης. 3. Το θετικό αποτέλεσμα της εξέτασης δηλώνει μόνο την παρουσία αντισωμάτων έναντι sp100 και όχι απαραίτητα την παρουσία πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση. 4. Για τη διάγνωση πρωτοπαθούς χολικής κίρρωση είναι απαραίτητη η συγκέντρωση σχετικής τεκμηρίωσης για τον εξεταζόμενο, όπως τα δημογραφικά στοιχεία, η κλινική παρουσίαση και άλλοι διαγνωστικοί έλεγχοι. 5. Η απόδοση της ανάλυσης αυτής δεν έχει προσδιοριστεί για τον παιδιατρικό πληθυσμό. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Ο επιπολασμός της PBC σε πρώτου βαθμού συγγενείς ασθενών με PBC κυμαίνεται από 1.3 έως 6.4%. 3,5 Η πρωτοπαθής χολική κίρρωση παρουσιάζεται σε όλες τις φυλές και εμφανίζεται σε όλο τον κόσμο. Έχουν αναφερθεί μεγάλες διακυμάνσεις στο γεωγραφικό επιπολασμό της PBC, που ποικίλουν από υπολογισμούς χαμηλού επιπολασμού 2 ανά 100,000 στην Ιαπωνία και την Αυστραλία, μέχρι 40 ανά 100,000 στις Ηνωμένες Πολιτείες. 4,6 Ευαισθησία και Ειδικότητα Μια ομάδα 272 ασυμπτωματικών, υγιών ατόμων που διαμένουν στις Ηνωμένες Πολιτείες εξετάστηκε για αντισώματα sp100 με το QUANTA Lite TM sp100 ELISA. Οι ηλικίες των ατόμων κυμαίνονταν από έτη και αποτελούνταν από 105 άνδρες και 87 γυναίκες. Η μέση τιμή αυτού του πληθυσμού ήταν 5.8 μονάδες και η διάμεση τιμή ήταν 4.8 μονάδες. Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 99.3% (270/272). Από τα 2 δείγματα που ερμηνεύτηκαν ως θετικά, ένα ήταν ασθενώς θετικό (28.5 μονάδες) και το άλλο έντονα θετικό (134 μονάδες). Η εξέταση IFA σε κύτταρα HEp-2 έδειξε ότι το έντονα αντιδραστικό δείγμα είχε μονοσήμαντο κλασικό πυρηνικό στικτό σχήμα, ενώ το ασθενώς θετικό δείγμα είχε ασαφές σχήμα. 5

6 Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Η συχνότητα των αντισωμάτων sp100 που ανιχνεύτηκαν με το QUANTA Lite TM sp100 ELISA σε σύνολο 273 δειγμάτων PBC και PBC επικάλυψης παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Η ανάλυση συγκέντρωσε τα αποτελέσματα που προέκυψαν με το QUANTA Lite TM sp100 ELISA σε 3 κλινικές ομάδες. Η συνολική ευαισθησία της ανάλυσης ήταν 24.5% (67/273). Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 99.5% (381/383). Η θετική προγνωστική τιμή ήταν 97.1% και η αρνητική προγνωστική τιμή ήταν 64.9%. Οι μέση και διάμεση τιμή για όλες τις περιπτώσεις μη PBC ή PBC/Αυτοάνοση Ηπατίτιδα (AIH) ήταν 5.14 και 4.55 μονάδες, αντίστοιχα. Πίνακα 1: Απόδοση του QUANTA Lite TM sp100 ELISA σε Συνδυασμένα Δεδομένα όλες οι Ομάδες sp100 ELISA N= θετική eq αρνητική PBC PBC/AIH PBC?,PBC/AIH?,AIH?/PBC HBV, HCV SLE AIH-1,AIH/PSC?,AIH Ρευματοειδής αρθρίτιδα Πρωτοπαθής σκληρυντική χολαγγειίτιδα (PSC), PSC? Διάφορα : Sm(1), SS-B(1), Ιστόνη (3), Jo-1(1), Scl-70(1),riboP(1), GBM(2), RNP(1), 383 Χρωματίνη (2), Κεντρόμερο (1), ASCA(2) Αβέβαιη διάγνωση Φυσιολογικό Σύνολο Ευαισθησία PBC & PBC/AIH = 24.5% (67/273) (95% Διάστημα Εμπιστοσύνης [(CI)] = %) Ειδικότητα Όλα τα μη-pbc = 99.5% (381/383) (95% CI = %) Θετική προγνωστική τιμή = 97.1% Αρνητική προγνωστική τιμή = 64.9% Μέση τιμή όλων των μη-pbc = 5.12 μονάδες Διάμεση τιμή όλων των μη -PBC = 4.55 μονάδες Οροί από 111 ασθενείς με μη PBC ηπατική νόσο, αυτοάνοση νόσο και άλλες παθήσεις εξετάστηκαν με το QUANTA Lite TM sp100 ELISA για την αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης Κανένα μη PBC ή μη PBC/AIH δείγμα δεν ερμηνεύτηκε θετικό με το QUANTA Lite TM sp100 ELISA όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Η συνολική ειδικότητα για την ανάλυση QUANTA Lite TM sp100, συμπεριλαμβανομένων των δύο υγιών μαρτύρων και των ορών μη PBC νόσου ήταν, επομένως, 99.5% (381/383). Πίνακας 2: Μελέτη Διασταυρούμενης Αντιδραστικότητας QUANTA Lite TM sp100 ELISA N= sp100 ELISA Θετική % Θετική Ιός Ηπατίτιδας Β Ιός Ηπατίτιδας C Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (SLE) Αυτοάνοση Ηπατίτιδα (AIH) Ρευματοειδής αρθρίτιδα Πρωτοπαθής σκληρυντική χολαγγειίτιδα (PSC) or PSC? Διάφορα δείγματα θετικά για: Sm(1), RNP(10), SS-B(1), Scl-70, Jo-1(1), Ριβόσωμα P(1), Χρωματίνη (1), Κεντρόμερο (1), ASCA(1), GBM(2), Σκληροδερμία Αβέβαιη διάγνωση Σύνολο Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 6 φορές συνολικά. Πίνακας 3: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM sp100 ELISA A B C D E F G H I Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης % Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 5 δείγματα, δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 4: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM sp100 ELISA HPC Μέσες Μονάδες Τυπική απόκλιση Συντελεστής διακύμανσης %

7 Βιβλιογραφία 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335, (1996). 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31, (2000). 3. Talwalkar, J. A. & Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362, (2003). 4. Feld, J. J. & Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18, (2003). 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F. & James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30, (1999). 6. Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119, (2000). 7. Prince, M. I. & James, O. F. The epidemiology of primary biliary cirrhosis. Clin Liver Dis 7, (2003). 8. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V. & James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123, (2002). 9. Berg, P. A. & Klein, R. Mitochondrial antigens and autoantibodies: from anti-m1 to anti-m9. Klin Wochenschr 64, (1986). 10. Vergani, D. & Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98, (2003). 11. Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34, (2001). 12. Fritzler, M. J. & Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3, (2002). 13. Neuberger, J. & Thomson, R. PBC and AMA--what is the connection? Hepatology 29, (1999). 14. Worman, H. J. & Courvalin, J. C. Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis. Autoimmun Rev 2, (2003). 15. Muratori, P. et al. Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 98, (2003). 16. Yang, W. H. et al. Do antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis patients identify increased risk for liver failure? Clin Gastroenterol Hepatol 2, (2004). 17. Szostecki, C., Guldner, H. H., Netter, H. J. & Will, H. Isolation and characterization of cdna encoding a human nuclear antigen predominantly recognized by autoantibodies from patients with primary biliary cirrhosis. J Immunol 145, (1990). 18. Evans, J., Reuben, A. & Craft, J. PBC 95k, a 95-kilodalton nuclear autoantigen in primary biliary cirrhosis. Arthritis Rheum 34, (1991). 19. Zuchner, D. et al. Prevalence, kinetics, and therapeutic modulation of autoantibodies against sp100 and promyelocytic leukemia protein in a large cohort of patients with primary biliary cirrhosis. Hepatology 26, (1997). 20. Norman, G. L. et al. Detection of Autoantibodies to sp100 in Primary Biliary Cirrhosis Patients by a new ELISA. Assn Med Lab Immunol Ann. Meeting (2004). 21. Romero-Gomez, M. et al. Serum immunological profile in patients with chronic autoimmune cholestasis. Am J Gastroenterol 99, (2004). 22. Czaja, A. J. & Norman, G. L. Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37, (2003). 23. Szostecki, C., Krippner, H., Penner, E. & Bautz, F. A. Autoimmune sera recognize a 100 kd nuclear protein antigen (sp-100). Clin Exp Immunol 68, (1987). 24. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 25. Internal Quality Control: Principles and Definitions, Approved Guidline, NCCLS Doc C24-A (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1991). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC August 2005 Revision 1 7