QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η δοκιμασία QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA είναι μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αντισωμάτων ενδογενούς παράγοντα στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αντισωμάτων ενδογενούς παράγοντα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες για τη διάγνωση της κακοήθους αναιμίας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κακοήθης αναιμία (Biermer's αναιμία) είναι μια χρόνια ασθένεια, όπως επίσης και το τελικό στάδιο της χρόνιας ατροφικής γαστρίτιδας τύπου Α (αυτοάνοσης). Ο τύπος A είναι αυτοάνοσης φύσης και σχετίζεται με την κακοήθη αναιμία. Ο τύπος B (μη αυτοάνοσος) σχετίζεται με μόλυνση H. pylori. 1,2,3 Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της χρόνιας ατροφικής γαστρίτιδας τύπου A, τα γαστρικά τοιχωματικά κύτταρα, τα οποία παράγουν ενδογενή παράγοντα και HCl, και τα ζυμογόνα κύτταρα, τα οποία παράγουν πεψινογόνο, καταστρέφονται και η παραγωγή ενδογενούς παράγοντα (IF) και HCl εξαλείφεται. Ο ενδογενής παράγοντας είναι σημαντικός για την απορρόφηση της βιταμίνης B 12 από το έντερο, και η απουσία του οδηγεί σε έλλειψη βιταμίνης B 12 και μεγαλοβλαστική αναιμία. Η διάγνωση της κακοήθους αναιμίας είναι σημαντική για τη θεραπεία της ίδιας της αναιμίας και την πρόληψη μη αναστρέψιμης νευρολογικής βλάβης. 1,4 Ασθενείς με κακοήθη αναιμία αναφέρθηκε ότι έχουν κατά 3 φορές αυξημένο κίνδυνο γαστρικού καρκινώματος, κατά 13 φορές αυξημένο κίνδυνο γαστρικού καρκινοειδούς, καθώς και αυξημένο κίνδυνο καρκίνου των οισοφάγειων πλακωδών κυττάρων. 5-7 Τα κυκλοφορούντα αντισώματα στον ενδογενή παράγοντα είναι σε υψηλό βαθμό ειδικά και μπορούν να ανιχνευθούν σε >50% των ασθενών με κακοήθη αναιμία. 1,3 Αυτά τα αντισώματα είναι 2 τύπων: Τύπου 1, αντισώματα αποκλεισμού, τα οποία εμποδίζουν τη δέσμευση της βιταμίνης B 12 στο μόριο IF, και τύπου 2, αντισώματα τα οποία μπορεί να επηρεάσουν τη δέσμευση του συμπλόκου IF-βιταμίνης B 12 στον ειλεακό υποδοχέα. 1,8 Η δοκιμασία QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA, αντίθετα με τις μεθόδους με βάση ακτινοανοσοπροσδιορισμό, ανιχνεύει τόσο τα αντισώματα τύπου 1 όσο και τα αντισώματα τύπου 2. Μαζί με άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα, ένα θετικό αποτέλεσμα αντισωμάτων ενδογενούς παράγοντα μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση της αυτοάνοσου κακοήθους αναιμίας από άλλες μεγαλοβλαστικές αναιμίες, καθώς και στη διάκριση της ατροφικής γαστρίτιδας τύπου A από άλλες μορφές μη ειδικής ιστολογικής γαστρίτιδας. 1,3,9 Αρχη Μεθοδου Ένα κεκαθαρμένο πλήρους μήκους ανασυνδυασμένο ανθρώπινο αντιγόνο ενδογενούς παράγοντα δεσμεύεται στις κοιλότητες μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Έτοιμοι πρότυποι οροι (control ) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο Intrinsic Factor, αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα που προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων (conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετριέται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια μαρτύρων (control). Αντιδραστήρια 1. Μικροπλάκα πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ενδογενή παράγοντα (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Intrinsic Factor αντιγόνο) 3. Intrinsic Factor ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Intrinsic Factor αντιγόνο, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Intrinsic Factor ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Intrinsic Factor αντιγόνο, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 1

2 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 11 2

3 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Intrinsic Factor ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος Intrinsic Factor ELISA High Υψηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος Intrinsic Factor ELISA Low Χαμηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας αντισωμάτων στον ενδογενή παράγοντα χρησιμοποιώντας αυθαίρετες μονάδες απαιτεί δύο κοιλότητες για καθέναν από τους τρεις ορούς ελέγχου, και μία ή δύο κοιλότητες για κάθε δείγμα ασθενούς. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. 3

4 Ποιοτικός έλεγχος 1. Το Intrinsic Factor ELISA (Low Positive), το Intrinsic Factor ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το Intrinsic Factor ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το Intrinsic Factor ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους - 20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου Intrinsic Factor ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου Intrinsic Factor ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προαραιωμένου ELISA Negative Control. β. Το προ-αραιωμένο Intrinsic Factor ELISA High Positive πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του Intrinsic Factor ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από δ. Το ELISA Negative Control και το Intrinsic Factor ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To Intrinsic Factor ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο CLSI (NCCLS) Document C24-A2 για επιπλέον οδηγίες. 12 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Intrinsic Factor ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Intrinsic Factor ELISA Low. Η τιμή του Intrinsic Factor ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Intrinsic Factor oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. Intrinsic Factor ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η δοκιμασία ELISA είναι πολύ ευαίσθητη τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει τα δικά του όρια βασισμένα πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά, ισότιμα ή θετικά σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό 20 Αμφίβολο Θετικό >25 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία αντισωμάτων στον ενδογενή παράγοντα και υποδηλώνει την πιθανότητα κακοήθους αναιμίας. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την απουσία αντισωμάτων στον ενδογενή παράγοντα ή επίπεδα κάτω από το αρνητικό όριο αποκοπής της ανάλυσης. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα ενδογενούς παράγοντα δεν αποκλείει τη διάγνωση κακοήθους αναιμίας, εφόσον μόνο 60% των ασθενών με κακοήθη αναιμία έχουν αυτό το αντίσωμα Ένα δείγμα με αμφίβολες συγκεντρώσεις αντισώματος στον ενδογενή παράγοντα δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Αν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά την επαναληπτική δοκιμασία, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο ή/και πρέπει να ληφθεί πρόσθετο δείγμα σε μεταγενέστερο χρόνο. 5. Η παρουσία αντι-γαστρικών αντισωμάτων τοιχωματικών κυττάρων μπορεί να είναι ή να μην είναι 4

5 σύμφωνη με εκείνη των αντισωμάτων στον ενδογενή παράγοντα, και οι μετρήσεις τους, επιπρόσθετα σε, ή σε συνδυασμό με μετρήσεις των αντισωμάτων στον ενδογενή παράγοντα, μπορεί να βοηθήσει στην αξιολόγηση ασθενών με υποψία κακοήθους αναιμίας Συνιστάται τα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν την εξής δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα αποκτήθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Οι τιμές Intrinsic Factor που αποκτήθηκαν με διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης του κατασκευαστή μπορεί να μην χρησιμοποιηθούν αμοιβαία. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορούν να συσχετιστούν με την τελευταία τιτλοποίηση.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρευμάτων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο από μη-συγκεκριμένο δέσιμο και να παράγει ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. Ασθενείς με κακοήθη αναιμία μπορεί να έχουν αντισώματα στον ενδογενή παράγοντα ή/και γαστρικά αντισώματα τοιχωματικών κυττάρων. Ενώ ή παρουσία και των δύο αντισωμάτων προσθέτει στην αξιοπιστία της διάγνωσης της κακοήθους αναιμίας, οι ασθενείς με κακοήθη αναιμία μπορεί να έχουν μόνο ένα από τα δύο αντισώματα. 1,9 3. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης δεν ισχύουν για άλλα καλούπια εκτός από ορό. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Tιμές Ένα σύνολο 476 δειγμάτων που συλλέχθηκαν από ασυμπτωματικά, υγιή άτομα εξετάστηκαν με το κιτ QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA. Το εύρος ηλικίας ήταν ετών (διάμεση τιμή 43). Από τα 276 δείγματα με πληροφορίες ηλικίας και φύλου, 150 προέρχονταν από άνδρες και 126 από γυναίκες. Από τα 476 δείγματα, ένα ήταν ισχυρό θετικό στις μονάδες, 1 ήταν οριακό θετικό στις 25.5 μονάδες και ένα ήταν οριακό αμφίβολο στις 20.2 μονάδες. Η ειδικότητα της ανάλυσης ήταν 99.4% (473/476). Η συχνότητα της κακοήθους αναιμίας υπολογίστηκε περίπου στο %. Με την εξαίρεση του ενός ισχυρού θετικού αποτελέσματος, η μέση και διάμεση τιμή για την υγιή ομάδα ελέγχου ήταν 5.7 μονάδες και 5.0 μονάδες. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Ένα σύνολο 177 δειγμάτων από ασθενείς με υποψία, ένδειξη ή επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία όπως περιγράφεται παρακάτω στην ενότητα Κλινικές μελέτες και 499 δείγματα από υγιή άτομα ελέγχου (476) και άτομα ελέγχου με άλλες νόσους (23) εξετάστηκαν με το κιτ QUANTA LiteTM Intrinsic Factor ELISA για την αξιολόγηση της ευαισθησίας και ειδικότητας της δοκιμασίας. Η μέση και η διάμεση τιμή της ομάδας μη κακοήθους αναιμίας ήταν 5.9 και 4.9 μονάδες αντίστοιχα. Κλινικές μελέτες Τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε 3 κατηγορίες ανάλογα με το βαθμό εμπιστοσύνης στη διάγνωση της κακοήθους αναιμίας: 1) Υποψία κακοήθους αναιμίας γαστρικό αντίσωμα τοιχωματικών κυττάρων θετικό ή/και χαμηλή βιταμίνη B12, αλλά τα αποτελέσματα αντισώματος στον ενδογενή παράγοντα ήταν ασύμβατα; 2) Ένδειξη κακοήθους αναιμίας εργαστηριακές μετρήσεις σύμφωνες με την κακοήθη αναιμία συμπεριλαμβάνομένου θετικού αποτελέσματος γαστρικού αντισώματος τοιχωματικών κυττάρων, χαμηλά επίπεδα βιταμίνης B12, και αυξημένος μέσος όγκος αιμοσφαιρίων (χαρακτηριστικό της κακοήθους αναιμίας); 3) Επιβεβαιωμένη κακοήθης αναιμία εργαστηριακές μετρήσεις σύμφωνες με την κακοήθη αναιμία συμπεριλαμβάνομένου θετικού αποτελέσματος γαστρικού αντισώματος τοιχωματικών κυττάρων, χαμηλά επίπεδα βιταμίνης B12 και αυξημένος μέσος όγκος αιμοσφαιρίων (χαρακτηριστικό της κακοήθους αναιμίας), και αιματολογική επιβεβαίωση μεγαλοβλαστικής αναιμίας. Η ευαισθησία υπολογίστηκε ως εξής: 1) θεωρώντας τα δείγματα επιβεβαιωμένης ή με ένδειξη κακοήθους αναιμίας ως θετικά για τη νόσο και τα δείγματα με υποψία κακοήθους αναιμίας ως αρνητικά για τη νόσο και 2) θεωρώντας τα επιβεβαιωμένα, με ένδειξη και με υποψία κακοήθους αναιμίας δείγματα ως θετικά για τη νόσο. Κανένα από τα δείγματα με υποψία αναιμίας δεν βρέθηκε θετικό για αντισώματα στον ενδογενή παράγοντα. Πίνακας 1:Ευαισθησία και Ειδίκευση QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA n = pos eq neg Επιβεβαιωμένη κακοήθης αναιμία (n=43) και ένδειξη κακοήθους αναιμίας (n=55)* Όλα τα δείγματα κακοήθους αναιμίας** Με υποψία (n=79), με ένδειξη (n=55) & επιβεβαιωμένη κακοήθης αναιμία (n=43) Μη κακοήθης αναιμία (υγιή άτομα ελέγχου και άτομα ελέγχου με άλλες νόσους) * δείγματα με υποψία κακοήθους αναιμίας θεωρήθηκαν ως αρνητικά για τη νόσο ** δείγματα με υποψία κακοήθους αναιμίας θεωρήθηκαν ως θετικός για τη νόσο Ευαισθησία 1) Οι ομάδες με ένδειξη & επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία συμπεριλήφθηκαν ως θετικές για τη νόσο: 93.9% (92/98), 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 87.1%- 97.7% Σημείωση: Τα αμφίβολα αποτελέσματα θεωρήθηκαν αρνητικά στην ανάλυση 2) Οι ομάδες με υποψία, ένδειξη η επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία συμπεριλήφθηκαν ως θετικές για τη νόσο: 52.0% (92/177); 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 44.4%- 59.5% Σημείωση: Τα αμφίβολα αποτελέσματα θεωρήθηκαν αρνητικά στην ανάλυση 5

6 Ειδίκευση 99.6% (497/499); 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): % Σημείωση: Τα αμφίβολα αποτελέσματα θεωρήθηκαν αρνητικά στην ανάλυση Αποδοτικότητα 1) Οι ομάδες με ένδειξη & επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία συμπεριλήφθηκαν ως θετικές για τη νόσο: 98.7% 2) Οι ομάδες με υποψία, ένδειξη, επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία συμπεριλήφθηκαν ως θετικές για τη νόσο: 87.1% Σύγκριση με ομοειδείς συσκευές Η δοκιμασία QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA συγκρίθηκε με μια εγκεκριμένη από το FDA δοκιμασία γαστρικού αντισώματος τοιχωματικών κυττάρων (GPA) ELISA και με μια ανάλυση RIA αντισώματος στον ενδογενή παράγοντα (IF). Η συμφωνία αρνητικού ποσοστού ήταν μεταξύ 97.5 και 100% και για τις τρεις αναλύσεις. Η συμφωνία θετικού ποσοστού μεταξύ της ανάλυσης QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA και της ανάλυσης IF RIA που διενεργήθηκε στο σημείο 1 ήταν 93.3%, αλλά 30.3% στο σημείο 2. Όλα τα θετικά αποτελέσματα RIA στο σημείο 1 προέρχονταν από άτομα με αιματολογικά επιβεβαιωμένη κακοήθη αναιμία. Δεν υπήρχαν διαθέσιμες κλινικές πληροφορίες για τα δείγματα στο σημείο 2. Πίνακας 2: Συμφωνία μεταξύ αναλύσεων QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA και επιβεβαιωτικών αναλύσεων Κατηγόρημα GPA ELISA Κατηγόρημα Intrinsic Factor RIA Περιοχή 1 Κατηγόρημα Intrinsic Factor RIA Περιοχή 2 QUANTA Lite TM θετικός % συμφωνία 29.7% (22/74) 93.2% (41/44) 30.3% (24/79) Intrinsic Factor Aρνητικός % συμφωνία 97.5% (193/198) 100% (25/25) 100% (26/26) Antibody ELISA Γενική συμφωνία 49.1% (220/278) 95.6% (66/69) 63.3% (50/79) Μελέτη Aληλεπίδρασης Οροί από 23 ασθενείς με αντισώματα αυτοάνοσου ή μολυσματικής νόσου, συμπεριλαμβανομένου H. pylori, μιτοχονδριακού M2, κυτταρομεγαλοϊού, ιού απλού έρπητα, ASCA, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, dsdna, τρανσγλουταμινάσης ιστού και μεμβράνης σπειραματικής βάσης εξετάστηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τη δοκιμασία QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA. Κανένα από τα δείγματα δεν βρέθηκε θετικό με τη δοκιμασία QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας 7 δείγματα και τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ 5 φορές το καθένα. Πίνακας 3: Διαδικασία μεταξύ αναλύσεων για τη QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Δείγμα A (HPC) Δείγμα B Δείγμα C Δείγμα D Δείγμα E Δείγμα F Δείγμα G Δείγμα H Μέσες τιμές SD CV % Η απόδοση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 5 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ και τον αρνητικό ορό ελέγχου (NC) δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Πίνακας 4: Διαδικασία της ενδοανάλυσης για την QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA (HPC) NC Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέσες τιμές SD CV %

7 Βιβλιογραφία 1. Toh, B. H. & Alderuccio, F. Pernicious anaemia. Autoimmunity 37, (2004). 2. Gleeson, P. A. & Toh, B. H. Molecular targets in pernicious anaemia. Immunol Today 12, (1991). 3. Toh, B. H., van Driel, I. R. & Gleeson, P. A. Pernicious anemia. N Engl J Med 337, 1448 (1997). 4. Tefferi, A. Anemia in adults: a contemporary approach to diagnosis. Mayo Clin Proc 78, (2003). 5. Ye, W. & Nyren, O. Risk of cancers of the oesophagus and stomach by histology or subsite in patients hospitalised for pernicious anaemia. Gut 52, (2003). 6. Hsing, A. W. et al. Pernicious anemia and subsequent cancer. A population-based cohort study. Cancer 71, (1993). 7. Mellemkjaer, L. et al. Pernicious anaemia and cancer risk in Denmark. Br J Cancer 73, (1996). 8. Waters, H. M., Smith, C., Howarth, J. E., Dawson, D. W. & Delamore, I. W. New enzyme immunoassay for detecting total, type I, and type II intrinsic factor antibodies. J Clin Pathol 42, (1989). 9. ASCIA. (Australian Society of Clinical Immunology and Allergy in conjunction with the Royal Australian College of Pathologists); November, Consensus Guidelines on Anti-Intrinsic Factor Antibody Testing. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Fourth Edition), CDC/NIH, (HHS Pub#(CDC) ) CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38) CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5) Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service /JAN Revision GRC0 7