QUANTA Lite TM Gliadin IgΑ ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM Gliadin IgΑ ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM Glaidin IgA αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgA έναντι Γλιαδίνης σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα και ορολογικές εξετάσεις μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση συγκεκριμένων εντεροπαθειών ευαίσθητων στην γλουτένη όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η κοιλιοκάκη ή η εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη είναι μια χρόνια κατάσταση, στην οποία ως κύριο χαρακτηριστικό περιλαμβάνεται το φούσκωμα και η χαρακτηριστική ιστολογική «λείανση» του εντερικού βλεννογόνου υμένα, έχοντας ως αποτέλεσμα ένα σύνδρομο δυσαπορρόφησης. Η ακριβής αιτιολογία της ασθένειας παραμένει άγνωστη, αλλά η γλιαδίνη ή το αλκοολούχο διαλυτό κλάσμα της γλουτένης του σίτου είναι σαφέστατα ο τοξικός παράγοντας 1. Αρχικά, μια σειρά από πολλαπλές εντερικές βιοψίες χρησιμοποιήθηκαν για να διαγνώσουν κοιλιακές και άλλες σχετιζόμενες με αυτές δυσλειτουργίες. Πιο πρόσφατα, ορολογικές εξετάσεις έχουν προταθεί για έναν εξεταζόμενο πληθυσμό ασθενών με εντοπισμένη εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη, καθώς και για την διατήρηση υπό έλεγχο μιας διαιτητικής συμβιβαστικότητας 2-5. Η Ευρωπαϊκή Επιτροπή για την Παιδιατρική Γαστρεντερολογία και Διατροφή (ESPGAN) έχει συστήσει τη χρήση ορολογικών δεικτών όπως η γλιαδίνη, καθώς και η ρετικουλίνη και τα ενδομυϊκά αντισώματα, για να μειώσουν τον αριθμό των εντερικών βιοψιών που χρειάζονται για να βγει μια διάγνωση 6. Η γλιαδίνη και των δύο αντισωμάτων IgA και IgG έχουν ανιχνευθεί στον ορό ασθενών με εντεροπάθεια ευαίσθητη στην γλουτένη 2,3. Τα αντισώματα IgG της γλιαδίνης φαίνεται ότι είναι πιο ευαίσθητα αλλά είναι λιγότερο ακριβείς δείκτες για ασθένειες, σε σχέση με την τάξη των αντισωμάτων IgA. Τα αντισώματα IgA της γλιαδίνης είναι λιγότερο ευαίσθητα αλλά πιο ακριβή. Μια ευαίσθητη στρατηγική για πληθυσμούς με κίνδυνο περιλαμβάνει εξετάσεις για αντισώματα IgG και IgA γλιαδίνης, εφόσον μια σημαντική μερίδα των κοιλιακών ασθενών είναι ελλιπής σε IgA 7. Τα αντισώματα IgA της γλιαδίνης έχουν ενδιαφέρον για την επόμενη δραστηριότητα της ασθένειας με τον καιρό και για την διατήρηση υπό συνεχή έλεγχο της σταθερής προσκόλλησης σε μια δίαιτα χωρίς γλουτένη 5. Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο ανθρώπινο ανασυνδιασμένου αντιγόνο είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντι- γλιαδινικά αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgA αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgA αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο Gliadin (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Gliadin IgA) 3. Gliadin IgA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Gliadin IgA, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Gliadin IgA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Gliadin IgA, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgA, 1 φιαλίδιο χρώματος κίτρινος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml 1

2 Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. 2

3 Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία,Υλικά που παρέχονται 1 Gliadin IgA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Gliadin IgA Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Gliadin IgA High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια, Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgA συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. 3

4 Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 ο C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου Gliadin IgA ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου Gliadin IgA ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προαραιωμένου ELISA Negative Control. β. Το προ-αραιωμένο Gliadin IgA ELISA High Positive πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του Gliadin IgA ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από δ. Το ELISA Negative Control και το Gliadin IgA ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To Gliadin IgA ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο NCCLS Document C24-A για επιπλέον οδηγίες στις κατάλληλες πρακτικές QC. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Gliadin IgA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Gliadin IgA ELISA Low. Η τιμή του Gliadin IgA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Gliadin IgA oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. Gliadin IgA ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό, ασθενές θετικό, ισχυρώς θετικό. Αρνητικό <20 μονάδες Ασθενώς Θετικό μονάδες Ισχυρώς θετικό >30 μονάδες 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία Gliadin IgA αντισωμάτων καί την πιθανότητα εντεροπαθειών ευαίσθητων στην γλουτένη όπως η κοιλιοκάκη και η ερπητοειδής δερματίτιδα. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων Gliadin IgA ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM Gliadin IgA ELISA. Οι τιμές Gliadin IgA που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgA δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Το αρνητικό αποτέλεσμα αντισωμάτων Gliadin IgΑ δέν αποκλείει την ύπαρξη εντεροπαθειών ευαίσθητων στην γλουτένη ειδικά όταν εμφανίζει ηψηλές τιμές αντισωμάτων Gliadin IgG. Το εύρημα μπορεί συχνά να επεξηγηθεί από την επιλεκτική έλλειψη IgA, ένα σχετικά συχνό εύρημα στην κοιλιακή νόσο. 2. Σε ασθενείς υπο θεραπεία με υψηλές τιμές αντισωμάτων Gliadin IgΑ ο δείκτης αυτών είναι σημαντικότερος απο τών IgG. 4

5 3. Λανθασμένα θετικά (υψηλά επίπεδα αντισωμάτων χωρίς χαρακτηριστικά ιστολογικά ευρήματα) είναι πιθανά όπως άλλες γαστρεντερικές δυσλειτουργίες. Είναι γνωστό πως προτρέπουν σε αντισώματα αντιγλιαδίνης κυρίως η αρρώστια του Crohn s, μη ανοχή σε πρωτείνες φαγητού και δυσαπορόφηση μετά το γεύμα. 4. Η σχέση μεταξύ ερπητοειδής δερματίτιδας και ευαισθησίας στην γλουταίνη εντεροπάθειας είναι τόσο δυνατή ώστε έχει συσταθεί ότι και οι δύο αρρώστιες έχουν την ίδια αιτιολογία. Σε αυτούς τους ασθενείς ο ορισμός του αντισώματος της γλουταίνης είναι χρήσιμος για να προσδιοριστούν κοιλιακές αρρώστιες χωρίς συμπτώματα και να εκτιμηθεί η σοβαρότητα της γαστρεντερικής επιπλοκής. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα του QUANTA Lite TM Gliadin IgΑ ELISA να εντοπίζει τα αντισώματα IgΑ της γλιαδίνης αξιολογήθηκε σε σύγκριση με ένα ELISA τεστ που διατίθεται στο εμπόριο. Τα αποτελέσματα του ELISA τεστ καθορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φυσιολογικές Τιμές Εκατον επτά δείγματα αιμοδοτών δοκιμάσθησαν για τα αντισώματα Gliadin IgΑ με QUANTA Lite TM Gliadin IgΑ ELISA. 1 δείγμα (1%) ήταν πάνω απο το όριο αποκοπής, 20 μονάδες, με τιμή 31 μονάδες. Η μέση τιμή των 107 δειγμάτων ήταν 7.9 μον.με απόκλιση 3.9 μον. Η τιμή τών 20 μον. αντιστοιχεί σε παιδικά και ενηλίκων δείγματα. Ευαισθησία και Ειδικότητα Ογδόντα ένα δείγματα ορού και εξετάστηκαν σε εργαστήριο αναφοράς με το kit της QUANTA Lite TM IgΑ Γλιαδίνης ELISA και κάποιο άλλο αντίστοιχο εμπορικό κιτ. Τα αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: INOVA Σχετική Ευαισθησία 88.6% Αναφοράς Σχετική Ειδικότητα 97.8% Σχετική Δράση 93.8% 31 δείγματα ήταν θετικά και 45 ήταν αρνητικά και με τις δύο μεθόδους. 1 δείγμα ήταν θετικό με την μέθοδο INOVA(23) και αρνητικό(20 μον.) με την εμπορική μέθοδο. 4 δείγματα ήταν ασθενώς θετικά (23,23,26 και 29 units) με την εμπορική μέθοδο και αρνητικά με την INOVA(14,15,11,18 μον). Δέκα ασθενείς με κοιλιοκάκη εξετάστηκαν με τι δύο μέθοδους και οι δέκα ασθενείς ήταν θετικοί για αντισώματα γλιαδίνης IgΑ και με τις δύο μεθόδους. 1 δείγμα ήταν ασθενώς θετικό με την εμπορική μέθοδο αναφοράς (26μον) ενώ αρνητικό με INOVA. 12 ασθενείς με διάφορα γαστρεντερικά προβλήματα αλλά όχι ενεργό κοιλιοκάκη, εξετάστηκαν και με τις δύο μεθόδους. Και τα 12 ήταν αρνητικά με την μέθοδο INOVA και μόνο 1 θετικό με την εμπορική μέθοδο αναφοράς Gliadin IgΑ. Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Τα kits αντισωμάτων QUANTA Γλιαδίνης IgG και IgA ELISA υπολογίζονται σε δύο εξωτερικές κλινικές μελέτες. Ο ακόλουθος πίνακας περιλαμβάνει τα ευρήματα τόσο της εξωτερικής όσο και της εσωτερικής μελέτης. περίληψη κλινικών ευρημάτων Group ασθενών Νο. IgA θετ. IgG θετ. IgG&A κοιλιοκάκη χωρίς θεραπεία 62 α 44 (71%) 54 (87%) 59 (95%) κοιλιοκάκη, με θεραπεία δίαιτας 32 5 β (16%) 17 (53%) 17 (53%) Άλλα γαστρεντερικά προβλήματα (2%) 20 (15%) 20 (15%) Αμφίβολοι κοιλιοκάκη 20 2 γ (10%) 4 (20%) 5 δ (25%) SlE 29 1 (3%) 1 (3%) 1 (4%) Sjogrens 26 1 (4%) 0 (0%) 0 Σκληρόδερμα Πολυομυοσήτιδα Φυσιολογικοί (1%) 5 (5%) 5 (5%) α β γ δ Τουλάχιστον δύο ασθενείς στο group καταγράφηκαν σαν IgA ατελείς. Και οι δύο ασθενείς ήταν αρνητικοί για IgA και θετικοί σε IgG. τρεις από τους πέντε θετικούς ασθενείς ήταν μόνο ασθενώς θετικοί (<30 units). και οι δύο ασθενείς ήταν ασθενώς θετικοί (<30 units). O ένας ασθενής θετικός κατά IgG και IgA ενδομυικά αντισώματα μπόρει να έχει ή να αναπτύσει κοιλιοκάκη παρά τα αμφίβολα αποτελέσματα της βιοψίας. Η Ευαισθησία και εξειδίκευση για την γλιαδίνη IgG και IgA όπως και η συνδιασμένη ευαισθησία και εξειδίκευση για τη παραπάνω ομάδα ασθενών φαίνεται παρακάτω: Ευαισθησία Eξειδίκευση Gliadin IgA 71% 97.6% Gliadin IgG 87% 91% IgA & IgG 95% 90% 5

6 Μελέτη Aληλεπίδρασης Για να προσδιορίσουμε ενδεχόμενα προβλήματα αλληλεπίδρασης με άλλα αυτοαντισώματα μία ποικιλία θετικών δειγμάτων με υψηλούς τίτλους αυτοαντισωμάτων δοκιμάσθησαν με QUΑNTA LITE TM Gliadin IgΑ ELISA. Συνολικά μετρήθηκαν 28 δείγματα Πολλά από τα δείγματα ο υψηλος θετικός πρότυπος ορός από άλλα INOVA QUANTA Lite TM test kits αντισωμάτων. Οι εξειδικεύσεις περιλαμβάνουν (ds)dna, Histones, Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Thyroid, Mitochondria, Smooth Muscle, PR-3, MPO και καρδιολιπίνη (ACA). H μέση τιμή των 28 δειγμάτων ήταν 6.2 μον. Το υψηλότερο δείγμα ήταν 8 μον. Η μέση τιμή απόκλισης είναι 12.9 μονάδες κάτω από το όριο αποκοπής των 20 μον. Η παρακάτω ομάδα ασθενών με νόσο συνδετικού ιστού εξετάστηκαν για αντισώματα Gliadin IgΑ. Μόνο ένας ασθενής SLE ήταν θετικός (22μον) και ένας Sjogren s(22 μον). Όλοι οι ασθενείς ήταν θετικοί στα άλλα αντισώματα. Όλοι οι ασθενείς του SLE ήταν θετικοί για Sm, dsdna ή και τα δύο. Όλοι οι ασθενείς του Sjogren s ήταν θετικοί στο SS-A, SS-B ή και τα δύο. Όλοι οι ασθενείς με σκληρόδερμα ήταν θετικοί στο Scl- 70 και όλοι οι ασθενείς πολυομησίτιδας ήταν θετικοί στο Jo-1. Ομάδε ασθενών Αριθμός Αριθμός θετικό SLE 29 1 Sjogren s Sydrome 26 1 Scleroderma 10 0 Polymyositis 6 0 Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα της μεθόδου δοκιμάζοντας 6 διπλά δείγματα, ισχυρώς θετικό, αμφίβολως θετικό, σε τέσσερεις ημέρες. Η μέση τιμή των ισχυρώς θετικών δειγμάτων ήταν 102 μονάδες, ενώ των αμφιβόλων 35.0 μον. Η κανονική απόκλιση και ο συντελεστής ποικιλίας για κάθε δείγμα συνοψίζεται παρακάτω: ισχυρώς θετικό ανφίβολο θετικό SD CV SD CV Ολικό % % Εντός μετρήσεων % % Μεταξύ μετρήσεων % % Βιβλιογραφία 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al. : Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC July 2009 Revision 12 6