Αυτό το χαρακτηριστικό είναι ζωτικής σημασίας για μια δοκιμασία αντισώματος δείκτη.

Transcript

1 NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση Κωδικός Προϊόντος: , , , CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού NOVA LITE dsdna χρησιμοποιείται για ομαδικό έλεγχο και ημιποσοτικό προσδιορισμό των αυτοαντισωμάτων έναντι της διπλής έλικας του DNA (dsdna) στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα ορολογικά τεστ και κλινικά ευρήματα μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Το τεστ της NOVA Lite dsdna είναι ένα τεστ έμμεσου ανοσοφθορισμού που χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα τα μαστιγοφόρα πρωτόζωα Crithidia luciliae. Ο μονοκύτταρος οργανισμός περιέχει ένα γιγάντιο μιτοχόνδριο με συμπυκνωμένη μάζα κυκλικού dsdna γνωστή 1 και ως κινητοπλάστης που φαίνεται ότι δεν περιέχει ιστόνες ή άλλα πυρηνικά αντιγόνα. 1,2 Χρησιμοποιείται ως ευαίσθητο και ειδικό υπόστρωμα για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι της διπλής έλικας του DNA (dsdna). Τα αντισώματα έναντι dsdna ανιχνεύονται σχεδόν αποκλειστικά σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) και γιαυτό θεωρούνται αντισώματα δείκτες.τα αυτοαντισώματα έναντι dsdna έχουν συμπεριληφθεί στα κριτήρια του 1982 για την κατάταξη του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου από την επιτροπή Arthritis and Rheumatrism Association. 3 Ε ν ώ ο έ λ ε γ χ ο ς τ ω ν Α Ν Α ε ί ν α ι έ ν α π ο λ ύ κ α λ ό τ ε σ τ γ ι α τ ο ν β α σ ι κ ό έ λ ε γ χ ο α σ θ ε ν ώ ν ύ π ο π τ ω ν γ ι άλλα νοσήματα συνδετικού ιστού σε καμία περίπτωση ο έλεγχος των ΑΝΑ δεν είναι ειδική εξέταση. Λόγω έλλειψης ειδικότητας, προτείνεται όλα τα θετικά ΑΝΑ δείγματα να τιτλοποιούνται και στη συνέχεια να γίνεται πιο ειδικός έλεγχος για dsdna. Τα τελευταία χρόνια έχουν χρησιμοποιηθεί μια ποικιλία μεθόδων για την ανίχνευση των dsdna. Αυτές οι μέθοδοι συμπεριλαμβάνουν complement fixation 4, passive agglutination 5 and RIA. 6-8 Το κύριο πλεονέκτημα της παρούσας μεθόδου είναι η ειδικότητά της εξαιτίας της φύσης του υποστρώματος και της μάζας του DNA Αυτό το χαρακτηριστικό είναι ζωτικής σημασίας για μια δοκιμασία αντισώματος δείκτη. Αρχη Μεθοδου Στη τεχνική του Έμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) τα δείγματα επωάζονται με το υπόστρωμα του αντιγόνου και τα ασύνδετα αντισώματα ξεπλένονται. Το υπόστρωμα κατόπιν επωάζεται με ειδική φθορίζουσα σφαιρίνη και το ασύνδετο αντιδραστήριο ξεπλένεται.όταν παρατηρούμε μέσω μικροσκοπίου φθορισμού τα θετικά δείγματα εμφανίζουν φθορισμό πράσινου μήλου σε περιοχές του ιστού που το αντίσωμα έχει συνδεθεί. Αντιδραστηρια 1. Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae : 6 ή 12 οπές ανά πλακίδιο με αφυγραντικά Διαγνωστικά σύνολα μόνο 2. Αντι ανθρώπινο IgG σύζευγμα (αίγας) χωρίς Evan s μπλε συνδεδεμένο με φλουoροσκεινη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χρωστική Evans Blue κ α ι.09% 0 αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 3. Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 4. Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 5. Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης PBS II (40x) 6. Λάδι που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 7. Καλυπτρίδες Προσοχή 1. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σ ε θ έ σ η ν α α π ο κ λ ε ί σ ε ι παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Όταν απορρίπτονται τα αντιδραστήρια να ρίχνεται μεγάλη ποσότητα νερού έτσι ώστε να αποφεύγεται η συσσώρευση κατάλοιπων στις υδραυλικές εγκαταστάσεις. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. 3. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 4. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. 1

2 Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν (διαγνωστικά σύνολα) είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η υποκατάσταση των συστατικών με άλλα από αυτά που παρέχονται σε αυτή τη συσκευασία μπορεί να οδηγήσουν σε αντιφατικά αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές η αναποτελεσματικό πλύσιμο της πλάκας ανοσοφθορισμού μπορεί να δημιουργήσει έντονο υπόβαθρο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής,μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία.είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου,η ένταση της λυχνίας του μικροσκοπίου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση της μικροπλάκας, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται αυστηρή προσκόλληση στο πρωτόκολλο. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια και πλάκες 2-8οC. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Το αραιωμένο PBS II διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για τέσσερα εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση,θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται.αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS (CLSI) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται (διαγνωστικά σύνολα) Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae : 6 οπές 1 4ml FITC IgG ανοσοσφαιρίνη 1 0.5mL dsdna μάρτυρας τιτλοποίησης τελικού σημείου 1 0.5mL IFA αρνητικός μάρτυρας 1 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 7ml γλυκερίνη 1 10 καλυπτρίδες Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae : 12 οπές 1 4ml FITC IgG ανοσοσφαιρίνη 1 0.5mL dsdna μάρτυρας τιτλοποίησης τελικού σημείου 1 0.5mL IFA αρνητικός μάρτυρας 2 25ml PBS II υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 7ml γλυκερίνη 1 20 καλυπτρίδες Παρεχόμενα υλικά (αντικειμενοφόρες πλάκες) x Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae, 6 οπές x Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae, 12 οπές x Πλακίδια με υπόστρωμα από Crithidia luciliae, 12 οπές Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέττες όγκου μL Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό Pasteur πιπέττες ή μπουκάλια που λυγίζουν Θάλαμος Υγρασίας 1L δοχείο για PBS II Δοχείο Coplin Μικροσκόπιο φθορισμού με διεγέρτη 495nm ή και 515nm προστατευτικό φίλτρου 2

3 Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος αραίωσης/πλύσης ( PBS II ): ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS II 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο από το φιαλίδιο με το συμπυκνωμένο διάλυμα PBS II σε 975 ml απεσταγμένου νερού και ανακατέψτε το καλά. Το αραιωμένο διάλυμα PBS II θα χρησιμοποιηθεί για την αραίωση των δειγμάτων καθώς επίσης και για διάλυμα πλύσεων. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί έως και 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία συντήρησης 2-8 ο C. 3. Αραίωση δειγμάτων: α. Αρχικός βασικός έλεγχος : Αραίωσε τα δείγματα 1:10 με αραιωμένο διάλυμα PBS II (π.χ 100 μl oρού σε 900 μl PBS II). β. Τιτλοποίηση Κάντε διαδοχικές αραιώσεις από την αρχική αραίωση σε όλα τα θετικά δείγματα (πχ 1: 20, 1:40, 1: 640). Διαδικασία 1. Προετοιμασία των πλακιδίων :Αφήστε τα πλακίδια να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν ανοίξετε τις συσκευασίες τους. Σημαδέψτε τα,τοποθετήστε τα σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε 1 σταγόνα (20-25 μl) από τον θετικό και τον αρνητικό πρότυπο ελέγχου στη 1 και 2 θέση αντιστοίχως. Πρόσθεσε 1 σταγόνα (20-25 μl) του αραιωμένου δείγματος στις υπόλοιπες θέσεις. 2. Επώαση: Επωάστε τα πλακίδια για λεπτά σε υγρό περιβάλλον (μία βρεγμένη χαρτοπετσέτα σε ένα πλαστικό κουτί θα μπορεί να κρατήσει την κατάλληλη υγρασία). Μην επιτρέψετε να στεγνώσει το υπόστρωμα κατά τη διαδικασία. 3. Πλύσιμο των πλακιδίων: Μετά την επώαση, χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό μπουκάλι ή πλαστική πιπέττα ξεπλύνετε τον ορό με αιωμένο αρ PBS II. Τοποθετήστε το πλακίδια σε τέτοια θέση έτσι ώστε να αποφεύγετε τη μεταφορά του δείγματος από τη μια θέση στην άλλη κατά το πλύσιμο. Αποφύγετε να στέλνετε με πίεση το PBS II α π ε υ θ ε ί α ς π ά ν ω σ τ ι ς θ έ σ ε ι ς έ τ σ ι ώ σ τ ε ν α μ η ν κ α τ α σ τ ρ α φ ε ί τ ο υπόστρωμα. Εάν επιδιώκεται, τοποθετήστε τα πλακίδια σε μπανάκι (Coplin jar) με αραιωμένο PBS II για επιπλέον 5 λεπτά. 4. Προσθήκη φθορίζοντος συζεύγματος (conjugate): Απομακρύνετε όσο PBS II έχει απομείνει στο πλακίδιο(π.χ.με απορροφητικο χαρτί). Τοποθετήστε το πλακίδιο σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε αμέσως από μια σταγόνα συζεύγματος (conjugate)σε κάθε θέση. Επωάστε για λεπτά. 5. Πλύσιμο πλακιδίων: Επανέλαβε τη διαδικασία του σταδίου Καλυπτρίδα: Η διαδικασία τοποθέτησης καλυπτρίδας διαφέρει σε κάθε εργαστήριο. Παρ όλα αυτά προτείνεται η παρακάτω διαδικασία. α. Τοποθετήστε την καλυπτρίδα σε μια χαρτοπετσέτα. β. Προσθέστε λάδι σε μια γραμμή στο κάτω άκρο της καλυπτρίδας. γ. Αφαιρέστε το επιπλέον PBS II και τοποθετήστε με προσοχή το κάτω μέρος του πλακιδίου στην άκρη της καλυπτρίδας με τέτοιο τρόπο ώστε το λάδι να μεταφερθεί στο πάνω μέρος του πλακιδίου χωρίς να δημιουργηθούν φυσαλίδες. Ποιοτικός έλεγχος dsdna θετικός πρότυπος ορός ελέγχου και αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε πλακίδιο έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. Επιπλέον κατάλληλοι οροί πρότυποι οροί ελέγχου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη < -70 C. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Σε περίπτωση που κάποιο από τα δύο κριτήρια δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η εξέταση. 1. Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου θα πρέπει να βαθμολογείται > Ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου θα πρέπει να είναι αρνητικός. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Αρνητική αντίδραση Ένα δείγμα θεωρείται αρνητικό όταν ο φθορισμός του κινητοπλάστη είναι ανάλογος ή λιγότερο φωτεινός από τον αρνητικό μάρτυρα. Χρώση άλλων οργανιδίων όπως ο πυρήνας ή το μαστίγιο χωρίς φθορισμό του κινητοπλάστη θα πρέπει να θεωρείται ως αρνητικό αποτέλεσμα. Θετική αντίδραση. Ένα δείγμα θεωρείται θετικό όταν υπάρχει χρώση του κινητοπλάστη ή του πυρήνα και του κινητοπλάστη. Σε όλα τα θετικά δείγματα θα πρέπει να γίνεται τιτλοποίηση. Προσδιορίστε το βαθμό ή την ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: 4+ Πολύ έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 3+ Έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 2+ Ευδιάκριτος θετικός φθορισμός 1+ Χαμηλότερος ειδικός φθορισμός ο οποίος επιτρέπει τη σαφή διαφοροποίηση της πυρηνικής ή/και κυτοπλασματικής χρώσης από το φθορισμό φόντου 3

4 Όρια της Διαδικασίας 1. Ο υπεύθυνος θα πρέπει να έχει εμπειρία και να γνωρίζει τους διαφορετικούς τύπους φθορισμού για να αναγνωρίζει τα θετικά dsdna. 2. Μια ποικιλία εξωτερικών παραγόντων μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία της εξέτασης συμπεριλαμβανομένων του τύπου του μικροσκοπίου φθορισμού, της έντασης και χρονικής χρήσης της λάμπας, της μεγέθυνσης, του συστήματος φίλτρων και του παρατηρητή. 3. Εάν χρησιμοποιείται band pass filter αντί για 515 barrier filter, μπορεί να παρατηρηθεί αυξημένη μη ειδική χρώση. 4. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο μολύβι για εγγραφή πάνω στα πλακίδια. Οποιοδήποτε άλλο είδος μπορεί να προκαλέσει μη ειδική χρώση. 5. Όλα τα μπανάκια που χρησιμοποιούνται στο πλύσιμο των πλακιδίων πρέπει να μην έχουν κατάλοιπα χρώσης. Τα κατάλοιπα χρώσης μπορεί να δώσουν μη ειδική χρώση. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. Τα πλακίδια που πωλούνται χωριστά κατηγοριοποιούνται ως "Ειδικά αντιδραστήρια για αναλυτές". Πέραν τις ιδιότητάς του ως συστατικού του Κιτ NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae, τα χαρακτηριστικά ανάλυσης και επιδόσεων δεν έχουν αποδειχτεί. Αναμενόμενες Τιμές Τ ο N O V A L i dsdna t e χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθούν μια ποικιλία ασθενών με ασθένεια του συνδετικού ιστού, και 200 τυχαίοι δωρητές αίματος. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται παρακάτω: Ο ΜΑΔΑ ΑΣ Θ Ε Ν ΩΝ ΑΡΙΘΜΟΣ ΘΕΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae ΣΕΛ Φαρμακοεπαγώμενος Λύκος 24 0 Ρευματοειδής Αρθρίτιδα 40 0 Σκληρόδερμα 24 0 Δερματομυοσίτιδα 14 0 Σύνδρομο Sjorgren 14 0 Φυσιολογικοί

5 Βιβλιογραφία 1. Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsdna with immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 254: , Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Arana R, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 46: , Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. J. Immunol. Methods 3: , Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu. Suppl. 11: 12-19, Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: , Pincus T, Schur P, Rose JA, et al.: Measurement of serum DNA-binding activity in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 281: , Somerfield SD, Roberts MW, Booth RJ: Double-stranded DNA antibodies: comparison of four methods of detection. J. Clin. Path. 34: , Sontheimer RD, Gilliam JD: An immunofluorescence assay for double-stranded DNA antibodies using the Crithidia luciliae kinetoplast as a double-stranded DNA substrate. J. Lab Clin. Med. 91: , Stingl G, Meingassner JG, Swelty P, Knapp W: An immunofluorescence procedure for the demonstration of antibodies to native, double-stranded DNA and of circulating DNA-anti DNA complexes. Clin. Immunol. Immunopath. 6: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC December 2012 Revision 16 Οι επωνυμίες NOVA Lite και INOVA Diagnostics, Inc. είναι σήματα κατατεθέντα. Πνευματικά δικαιώματα 2012 Με επιφύλαξη κάθε νόμιμου δικαιώματος 5