QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η ανοσοενζυμική μέθοδος QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA χρησιμοποιείται για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των IgG αντισωμάτων αντι-ccp IgG (Κυκλικό Κιτρουλινικό Πεπτίδιο) στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων, σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα, είναι μια βοήθεια στη διάγνωση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η ρευματοειδής αρθριτίδα (ΡA) είναι ένα από τα πιο κοινά συστεμικά αυτοάνοσα νοσήματα. Η αιτιολογία της ασθένειας είναι άγνωστη. Περίπου το 0.5% του πληθυσμού στον κόσμο μολύνεται, και σε διπλάσιο ποσοστό νοσούν οι γυναίκες από τους άνδρες. 1 Η διάγνωση της ΡΑ στηρίζεται αρχικά σε κλινικές εκδηλώσεις της νόσου. Μέχρι πρόσφατα, η μόνη ορολογική εξέταση που χρησιμοποιείται με διαδικασίες ρουτίνας ήταν ο καθορισμός της παρουσίας των ρευματικών παραγόντων (RF) στον ορό. Tα RF είναι αντισώματα που κατευθύνονται στην περιοχή του Fc των ανοσοσφαιρίνων της τάξης του IgG. Το RF μπορεί να είναι τάξης ανοσοσφαιρίνης IgM, IgG και IgA. Η παρουσία του IgM RF είναι επισφράγιση για την ΡΑ, που βρέθηκε στο 50%-90% περίπου των ασθενών. 1,2 Ωστόσο, το IgM RF βρίσκεται σε άτομα με μολύνσεις, άλλες αυτοάνοσες ασθένειες, και σε κάποια υγιή άτομα. 1,2 Τα IgG RF είναι λιγότερο ευαίσθητα αλλά πιο ειδικά για την ΡΑ από ότι τα IgM RF. 2 Είναι σημαντικό για την διαχείριση της ασθένειας να γίνει διάγνωση και θεραπεία στα άτομα με ΡΑ όσο το δυνατόν πιο νωρίς. 3 Είναι γνωστό, εδώ και χρόνια, ότι τα αντι-περιπυρηνικά αυτοαντισώματα, γνωστά και ως αντι-κερατίνη, βρίσκονται σε άτομα με ΡΑ. 4,5 Πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι αυτά τα αυτοαντισώματα αναγνωρίζουν ένα επίτοπο το οποίο περιέχει μορφή της αργινίνης που ονομάζεται κιτρουλίνη. 6 Ένα συνθετικό κυκλικό πεπτίδιο που περιέχει κιτρουλίνη ονομάζεται CCP IgG (Κυκλικό Κιτρουλινικό Πεπτίδιο) ανακαλύφθηκε ότι είναι καλύτερο στο χαρακτηρισμό των ασθενών με ΡΑ από άλλους ασθενείς, από ότι το τεστ περιπυρηνικού αυτοαντισώματος ή το τεστ για ρευματικό παράγοντα Στη βιβλιογραφία, το 70% περίπου των ασθενών με ΡΑ είναι θετικοί για αντι-ccp IgG, ενώ μόνο το 2% περίπου τυχαίων αιμοδοτών είναι θετικό. Πρόσφατη έρευνα βρήκε κιτρουλινικές πρωτεΐνες στις αρθρώσεις των ασθενών με ΡΑ, αλλά όχι στις αρθρώσεις ανθρώπων με άλλες μορφές νόσων των αρθρώσεων. 12 Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια θεωρητική βάση για την παρουσία του αντι-ccp IgG στους ασθενείς με ΡΑ και ένα πιθανό παθογενή ρόλο για αυτά τα αντισώματα. Αρχη Μεθοδου Το αντιγόνο στη μέθοδο QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA CCP είναι συνθετικό Κυκλικό Κιτρουλινικό Πεπτίδιο που έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα στην ανίχνευση αντισωμάτων σε ασθενείς με ΡΑ. Αυτο είναι συνδεδεμένο στις εμβαθύνσεις της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι προτυποι οροί (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στις εμβαθύνσεις επιτρέποντας τα αντισώματα CCP IgG να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινη IgG σφαιρίνη. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG ενζύμου με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου CCP. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων CCP. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων CCP συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των προτύπων ορών αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο συνθετικό Κυκλικό Κιτρουλινικό (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα CCP IgG) 3. CCP IgG ELISA Low Positive, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG θετικό πρότυπο ελέγχου (control) που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 4. CCP IgG ELISA High/Positive/Calibrator A, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα Α που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 5. CCP IgG ELISA Calibrator B, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα Β που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 6. CCP IgG ELISA Calibrator C, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα C που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 7. CCP IgG ELISA Calibrator D, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα D που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 8. CCP IgG ELISA Calibrator E, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml CCP IgG πρότυπο διάλυμα E που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε 1

2 9. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 10. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 12. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 13. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 2

3 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 CCP ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP High/Calibrator A Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP Calibrator B Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP Calibrator C Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP Calibrator D Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος CCP Calibrator E Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας) 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. 5. Εναλλακτικά μπορείτε να υπολογίσετε ποσοτικά τη δοκιμασία με τη χρήση καμπύλης 5 σημείων. Προετοιμασία της καμπύλης αναφοράς πέντε σημείων που βασίζεται στις τιμές των προαραιωμένων CCP διαλυμάτων αναφοράς. Σημείο Μονάδες Α πρότυπος ορός CCP A 250 Β πρότυπος ορός CCP Β 125 C πρότυπος ορός CCP C 62.5 D πρότυπος ορός CCP D E πρότυπος ορός CCP E Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 3

4 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το CCP IgG ELISA (Low Positive), το CCP IgG ELISA Υψηλο Θετικό(High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το CCP IgG ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το CCP IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του CCP IgG ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του CCP IgG ELISA Low. Η τιμή του CCP IgG ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X CCP IgG oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. CCP IgG ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. 4

5 Προαιρετική Μέθοδος Υπολογισμών: Ημι-Ποσοτικά Αποτελέσματα με τη χρήση μιας Καμπύλης αναφοράς Υπολογισμός των αποτελεσμάτων με την προαιρετική κανονική καμπύλη. 1. Καθορίστε μια μέση τιμή για όλα τα διπλά δείγματα και ορούς. 2. Σημειώστε τη μέση απορροφητικότητα Ο.Α. των δειγμάτων στην καμπύλη έναντι των τιμών σε Μονάδες. Χρησιμοποιήστε Cubic Spline (third order polynomial) ή σημείο σε σημείο για να σχεδιάσετε την καμπύλη. 3. Καθορίστε την άγνωστη συγκέντρωση του CCP IgG σε μονάδες από τον άξονα «Υ» διαβάζοντας την ανταποκρινόμενη απορροφητικότητα στον άξονα «Χ». Υπολογίστε τις άγνωστες μονάδες. 4. Σημείωση: Οι τιμές που υπολογίστηκαν με τη ποσοτική μέθοδο θα είναι διαφορετικές από αυτές που καθορίστηκαν την κανονική καμπύλη. Οι υψηλές τιμές θα διαφέρουν περισσότερο από τις χαμηλές τιμές. Το CCP IgG High Positive δεν θα αντιστοιχεί σε 250 μονάδες με τη ποσοτική μέθοδο. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα τότε μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως αρνητικό, ασθενές θετικό, σχετικά θετικό ή ισχυρό θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενές θετικό Σχετικά θετικό Ισχυρά θετικό Ένα θετικό αποτέλεσμα δείχνει την παρουσία των αντισωμάτων του CCP IgG και προτείνει την πιθανότητα του RA. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει την απουσία των αντισωμάτων του CCP IgG ή επίπεδα χαμηλότερα από την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. 3. Προτείνεται να συμπεριλαμβάνεται στα αποτελέσματα που βγαίνουν από το εργαστήριο η παρακάτω δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA. Οι τιμές CCP IgG που επιτεύχθηκαν με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένης σύνδεσης και να παράγουν ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με RA θετικοί στα αντισώματα CCP IgG. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. 5. Η διαγνωστική αξία του αντι-ccp IgG στους ασθενείς με Νεαρή Ρευματική Αρθρίτιδα δεν έχει καθοριστεί. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της μεθόδου QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA να ανιχνεύει τα αντισώματα IgG CCP IgG εκτιμήθηκε τόσο μετά από σύγκριση με μια μέθοδο ELISA που μετράει το IgG RF, όσο και μετρώντας το anti-ccp IgG στους ασθενείς με κλινική διάγνωση για RA ή άλλων συστεμικών αυτοάνοσων ασθενειών σε δύο εξωτερικές κλινικές εκτιμήσεις και μια μεγάλη εσωτερική μελέτη. Φυσιολογικές Τιμές Εξετάστηκε ένα σύνολο από 216 δείγματα (118 θηλυ και 98 άρενες, μέση ηλικία 39 ετών) τυχαίων αιμοδοτών. Δύο (1%) από τα δείγματα ήταν θετικά για αντι-ccp IgG. Ένα ήταν υψηλό θετικό anti-ccp IgG και ήταν επίσης και ένα υψηλό θετικό για IgG RF, ένα συγκεκριμένο δείκτη της RA. Το άλλο ήταν ένα χαμηλό θετικό και μόνο 21 μονάδες. Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τα ευρήματα από όλες τις κλινικές μελέτες μας. Η διάγνωση στους ασθενείς με RA βασίστηκε πάνω στα ARA κριτήρια 14 και στην καλύτερη κρίση των παρευρισκομένων ρευματολόγων. 5

6 Περίληψη των κλινικών ευρημάτων Ομάδα Ασθενών Νο. CCP IgG ELISA No. 20 Μονάδες (%) CCP IgG ELISA No. 40 Μονάδες (%) Τυχαίοι αιμοδότες 216 2* (1%) 1 (0.5%) Ρευματοειδής Αρθρίτιδα (76%) 158 (63%) Ρευματοειδής Αρθρίτιδα RF (90%) 142 (78%) Ρευματοειδής Αρθρίτιδα RF (40%) 16 (23%) Ρευματική ασθένεια (9%) 16 (5%) SLE * (10%) 3 (3%) Scleroderma 86 10* (12%) 7 (8%) Sjögren s Syndrome 38 0 (0%) 0 (0%) Άλλες ρευματικές ασθένειες 109 9* (8%) 6 (6%) Κρυοσφαιριναιμία 29 2 (7%) 1 (3%) Μολυσματική ασθένεια 87 2 (2%) 1 (1%) Άλλοι ασθενείς 29 1 (3%) 0 (0%) * Μερικά από τα δείγματα που ήταν θετικά για αντισώματα CCP IgG ήταν επίσης θετικά και IgG RF, άλλος ένας δείκτης αντισώματος για την RA. Αυτά συμπεριλάμβαναν 1 αιμοδότη, 2 ασθενείς με SLE, 4 ασθενείς με Σκληρόδερμα και 3 ασθενείς με άλλες ρευματικές ασθένειες. Διασταυρωμένη Αντιδραστικότητα Για να εκτιμηθεί η πιθανή διασταυρωμένη αντιδραστικότητα του αντιγόνου CCP IgG με άλλα αυτοαντισώματα, το QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA εκτιμήθηκε από 22 δείγματα, που έχουν όλα υψηλά επίπεδα από διάφορα άλλα αυτοαντισώματα. Σε αυτή την ομάδα ήταν 2 δείγματα το καθένα από τα οποία αντέδρασε με το SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, TPO, Ribo-P, M2, χρωματίνη και DNA. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά για αντι-ccp IgG. Η παραπάνω μελέτη δεν δείχνει κάποια σημαντική διασταυρωμένη αντιδραστικότητα του QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA με μια ποικιλία από άλλα αυτοαντισώματα. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόκληση της ενδιάμεσης-ανάλυσης μετρήθηκε με την εξέταση διπλών από αρνητικά, χαμηλά θετικά, σχετικά θετικά και ισχυρά θετικά δείγματα με 6 ξεχωριστές αναλύσεις σε 6 διαφορετικές μέρες. Η απόκληση της ενδιάμεσης-ανάλυσης μετρήθηκε εξετάζοντας 5 δείγματα 9 φορές το καθένα στήν ίδια πλάκα ELISA. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: Απόκληση ανάμεσα στις εξετάσεις Neg.1 Neg.2 Low 1 Low 2 Mod.1 Mod.2 High 1 High 2 Μέση τιμή 2.5 U 2.1 U 21 U 31 U 42 U 47 U 103 U 168 U SD CV% 11% 7% 6% 6% 6% 7% 5% 7% Απόκληση κατά τη διάρκεια της εξέτασης Neg.1 Mod.1 High 1 High 2 High 3 Μέση τιμή 2 U 52 U 107 U 109 U 175 U SD CV% 11% 9% 5% 4% 3% Όταν ένα χαμηλά θετικό δείγμα εξετάστηκε 45 φορές σε μία πλάκα υπήρξε 6% CV. 6

7 Βιβλιογραφία 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, Rose NR et al, eds, American Society for Microbiology Press, (2002). 2. Borretzen M, et al: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Y Shoenfeld, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 3. Kim JK and MH Weisman: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: (2000). 4. Vincent C, et al: Immunoblotting detection of autoantibodies to human epidermis filaggrin: a new diagnostic test for rheumatoid arthritis. J Rheumatol 25: (1998). 5. Serre G, et al: Filaggrin (keratin) autoantibodies. Autoantibodies, Peter JB and Y Shoenfeld, eds, Elsevier Science B.V., (1996). 6. Van Venrooj WJ: Citrullination: a small change for a protein with great consequences for rheumatoid arthritis. Arthritis Res 2: (2000). 7. Schellekens GA, et al: The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 43: (2000). 8. van Jaarsveld CHM, et al: The prognostic value of the antiperinuclear factor, anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in early arthritis. Clin Exp Rheum 17: (1999). 9. Bizzaro N, et al: Diagnostic accuracy of the anti-citrulline antibody assay for rheumatoid arthritis. Clin Chem 47: (2001). 10. Kroot E-JJA, et al: The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 43: (2000). 11. Combe B, et al: Prognostic factors for radiographic damage in early rheumatoid arthritis: a multiparameter prospective study. Arthritis Rheum 44: (2001). 12. Baeten D, et al: Specific presence of intracellular citrullinated proteins in rheumatoid arthritis synovium. Arthritis Rheum 44: (2001). 13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition (HHS Pub. #(CDC ). 14. Arnett FC, et al: The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 31: (1988). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service June 2005 Revision GRC9 7