NOVA LITE TM Thyroid Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 NOVA LITE TM Thyroid Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το NOVA Lite TM Thyroid είναι μια έμμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού για τη διαλογή και τον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό των θυρεοειδικών μικροσωματικών αντισωμάτων και των αντισωμάτων κολλοειδούς/ θυρεοσφαιρίνης στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία μικροσωματικών αντισωμάτων ή/και αντισωμάτων κολλοειδούς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες οροδιαγνωστικές δοκιμασίες και κλινικά ευρήματα για τη διάγνωση της αυτοάνοσης νόσου του θυρεοειδούς. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα θυρεοειδικά αντισώματα ευρέως χαρακτηρίζονται σάν το αίτιο της αυτοάνοσης θυρεοειδικής νόσου, και τά δύο αντισώματα, μικροσωμιακά και θυρεοσφαιρίνης ερευνώνται σε ρουτίνα. 1,2 Αντισώματα ορού κατά θυρεοειδικών μικροσωμιακών αντιγόνων συχνά ανιχνεύονται σε ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα θυρεοειδούς, και η παρουσία τους σχετίζεται με ιστολογικές μεταβολές σε θυρεοειδίτιδα Hashimoto. 3 Ο Έμμεσος ανοσοφθορισμός ανίχνευσης αντισωμάτων σε θυρεοειδικό μικροσωμιακό αντιγόνο είναι θετικός σε ποσοστό 70-90% σε ασθενείς με χρόνια θυρεοειδίτιδα.τα αντισώματα αυτά εμφανίζονται επίσης σε ποσοστό 65% σε ασθενείς αρχικό υποθυρεοειδισμό, 50% σέ θυρεοτοξίκωση, 10% σε βρογχοκήλη καί 17% σε διόγκωση θυρεοειδού. 4 Αντισώματα θυρεοσφαιρίνης ανιχνεύονται σε υψηλούς τίτλους κυρίως στην αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα καί στη νόσο Grave. Με ανοσοφθορισμό αντισώματα ορού θυρεοσφαιρίνης /κολλοειδή ανιχνεύθησαν σε ποσοστό 40-70% σε ασθενείς με χρόνια θυρεοειδίτιδα καί σπανιότερα σε ασθενείς με θυρεοτοξίκωση και μη τοξική βρογχοκήλη. 5, 6 Τα θυρεοειδικά αντισώματα ανιχνεύονται κλασικά με αντιδράσεις καθίζησης, 7 latex, 8 αιμοσυγκόλυση 9 και με ανοσοφθορισμό. 10,11 O ανοσοφθορισμός είναι μία ευαίσθητη και ειδική δοκομασία ανίχνευσης θυρεοειδικών αντισωμάτων. Σε αντίθεση με τις συνήθεις τεχνικές αιμοσυγκόλλησης, ο ανοσοφθορισμός ανιχνεύει αντισώματα τα οποία δεν καθιζάνουν, ενώ δεν επηρεάζεται αρνητικά από την παρουσία ανασταλτικών παραγόντων συγκόλλησης 12 ή ετερόφιλο αντίσωμα. Αρχη Μεθοδου Στην τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού, τα δείγματα επωάζονται με υπόστρωμα αντιγόνου και τα αντισώματα που δεν έχουν αντιδράσει ξεπλένονται. Το υπόστρωμα επωάζεται με ειδικό απορροφούμενο σύζευγμα πρωτευόντων σημασμένο με φθοριεσκίνη και στη συνέχεια το μη δεσμευμένο αντιδραστήριο απομακρύνεται με πλύση. Όταν προβάλλονται μέσω μικροσκοπίου φθορισμού, τα θετικά δείγματα αυτοαντισωμάτων εμφανίζουν φθορισμό στο χρώμα του πράσινου μήλου που αντιστοιχεί στις περιοχές του θυρεοειδικού ιστού όπου έχει δεσμευτεί το αυτοαντίσωμα. Αντιδραστηρια 1. Πλακίδια με υπόστρωμα Monkey thyroid : 8 οπές ανά πλακίδιο με desiccant 2. Αντι ανθρώπινο IgG σύζευγμα Απορροφούμενο πρωτευόντων (αίγας) συνδεδεμένο με φλουoροσκεινη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει χρωστική Evans Blue και 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 7 ml 3. Thyroid Positive, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 0.09% αζιδιούχο νάτριο και αντισώματα σε θυρεοειδή ανθρώπινου ορού, προαραιωμένο, 0.5mL 4. Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (control) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 0.5 ml 5. Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης PBS (40x) 1000 ml 6. Λάδι που περιέχει 0.09% αζίδιο του νατρίου σε φιαλίδιο των 7 ml 7. Καλυπτρίδες 1

2 Προσοχή 1. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 3. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 4. Να ακολουθούνται όλοι οι κανονισμοί και νόμιμες διαδικασίες για την απόρριψη των αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η υποκατάσταση των συστατικών με άλλα από αυτά που παρέχονται σε αυτή τη συσκευασία μπορεί να οδηγήσουν σε αντιφατικά αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές η αναποτελεσματικό πλύσιμο της πλάκας ανοσοφθορισμού μπορεί να δημιουργήσει έντονο υπόβαθρο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου,η ένταση της λυχνίας του μικροσκοπίου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση της μικροπλάκας, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Με το χρόνο η σφαιρίνη μπορεί να αλλάξει χρώμα λόγω της έκθεσης του στο φώς. Η χρωματική αλλαγή δέν επηρεάζει τα αποτελέσματα. 7. Συνιστάται αυστηρή προσκόλληση στο πρωτόκολλο. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Το αραιωμένο PBS διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για τέσσερα εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 10 Πλακίδια με υπόστρωμα Monkey thyroid: 8 οπές ανά πλακίδιο με desiccant 2

3 1 7ml FITC IgG ανοσοσφαιρίνη Απορροφούμενο πρωτευόντων ml Thyroid Positive, θυρεοειδή θετικός 1 0.5mL IFA αρνητικός πρότυπος ορός 1 25ml PBS υπό ανασύσταση διάλυμα (40x) 1 7ml γλυκερίνη 1 10 καλυπτρίδες Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέττες όγκου μL Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό Pasteur πιπέττες ή μπουκάλια που λυγίζουν Θάλαμος Υγρασίας 1L δοχείο για PBS Δοχείο Coplin Μικροσκόπιο φθορισμού με διεγέρτη 495nm ή και 515nm προστατευτικό φίλτρου Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος αραίωσης/πλύσης ( PBS ): ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο από το φιαλίδιο με το συμπυκνωμένο διάλυμα PBS σε 975 ml απεσταγμένου νερού και ανακατέψτε το καλά. Το αραιωμένο διάλυμα PBS θα χρησιμοποιηθεί για την αραίωση των δειγμάτων καθώς επίσης και για διάλυμα πλύσεων. Το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να αποθηκευτεί έως και 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία συντήρησης 2-8 ο C. 3. Αραίωση δειγμάτων: α. Αρχικός βασικός έλεγχος : Αραίωσε τα δείγματα 1:10 με αραιωμένο διάλυμα PBS (π.χ 100 μl oρού σε 900 μl PBS). β. Τιτλοποίηση (titration) Κάντε διαδοχικές αραιώσεις από την αρχική αραίωση σε όλα τα θετικά δείγματα (πχ 1:20, 1: 40,...1: 2650). Διαδικασία 1. Προετοιμασία των πλακιδίων: Αφήστε τα πλακίδια να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν ανοίξετε τις συσκευασίες τους. Σημαδέψτε τα,τοποθετήστε τα σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε 1 σταγόνα (70-90μL) από τον θετικό και τον αρνητικό πρότυπο ελέγχου (control) στη 1 και 2 θέση αντιστοίχως. Πρόσθεσε 1 σταγόνα (70-90μL) του αραιωμένου δείγματος στις υπόλοιπες θέσεις. 2. Επώαση: Επωάστε τα πλακίδια για λεπτά σε υγρό περιβάλλον (μία βρεγμένη χαρτοπετσέτα σε ένα πλαστικό κουτί θα μπορεί να κρατήσει την κατάλληλη υγρασία). Μην επιτρέψετε να στεγνώσει το υπόστρωμα κατά τη διαδικασία. 3. Πλύσιμο των πλακιδίων: Μετά την επώαση, χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό μπουκάλι ή πλαστική πιπέττα ξεπλύνετε τον ορό με αραιωμένο PBS. Τοποθετήστε το πλακίδια σε τέτοια θέση έτσι ώστε να αποφεύγετε τη μεταφορά του δείγματος από τη μια θέση στην άλλη κατά το πλύσιμο. Αποφύγετε να στέλνετε με πίεση το PBS απευθείας πάνω στις θέσεις έτσι ώστε να μην καταστραφεί το υπόστρωμα. Εάν επιδιώκεται, τοποθετήστε τα πλακίδια σε μπανάκι (Coplin jar) με αραιωμένο PBS για επιπλέον 5 λεπτά. 4. Προσθήκη φθορίζοντος συζεύγματος (conjugate): Απομακρύνετε όσο PBS έχει απομείνει στο πλακίδιο(π.χ.με απορροφητικο χαρτί). Τοποθετήστε το πλακίδιο σε υγρό περιβάλλον και προσθέστε αμέσως από μια σταγόνα συζεύγματος (conjugate)σε κάθε θέση. Επωάστε για λεπτά. 5. Πλύσιμο πλακιδίων: Επανέλαβε τη διαδικασία του σταδίου Καλυπτρίδα: Η διαδικασία τοποθέτησης καλυπτρίδας διαφέρει σε κάθε εργαστήριο. Παρ όλα αυτά προτείνεται η παρακάτω διαδικασία: α. Τοποθετήστε την καλυπτρίδα σε μια χαρτοπετσέτα. 3

4 β. Προσθέστε λάδι (mounting medium) σε μια γραμμή στο κάτω άκρο της καλυπτρίδας. γ. Αφαιρέστε το επιπλέον PBS και τοποθετήστε με προσοχή το κάτω μέρος του πλακιδίου στην άκρη της καλυπτρίδας με τέτοιο τρόπο ώστε το λάδι να μεταφερθεί στο πάνω μέρος του πλακιδίου χωρίς να δημιουργηθούν φυσαλίδες. Ποιοτικός έλεγχος Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου θυρεοειδή και ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (IFA System Negative Control) θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε πλάκα έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασία λειτουργούν σωστά. Επιπλέον κατάλληλοι οροί ελέγχου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη < -70 C. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Σε περίπτωση που κάποιο από τα δύο κριτήρια δεν ισχύει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η εξέταση. 1. Ο θετικός πρότυπος ορός ελέγχου θυρεοειδή θα πρέπει να βαθμολογείται > Ο αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου θα πρέπει να είναι αρνητικός. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Αρνητική αντίδραση Ένα δείγμα θεωρείται αρνητικό όταν ο φθορισμός των επιθυλιακών κυττάρων κινητοπλάστη(μικροσωμιακά) ή τα κολλοειδή (θυρεοσφαιρίνης) είναι ανάλογος ή λιγότερο φωτεινά από τον αρνητικό πρότυπο ορό ελέγχου. Θετική αντίδραση για Ab μικροσωμιακά. Ένα δείγμα θεωρείται θετικό όταν υπάρχει χρώση του κινητοπλάστη των επιθυλιακών κυττάρων Ο πυρήνα συνήθως δέν έχει χρώση. Θετική αντίδραση για Ab θυρεοσφαιρίνης/κολλοειδών.η αντίδραση λειτουργεί σάν χρώση της κροκύδος ή ομιχλώδη χρώση του κολλοειδούς. Προσδιορίστε το βαθμό ή την ένταση φθορισμού χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: 4+ Πολύ έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 3+ Έντονος φθορισμός πράσινου μήλου 2+ Ευδιάκριτος θετικός φθορισμός 1+ Χαμηλότερος ειδικός φθορισμός ο οποίος επιτρέπει τη χρώση του κυτοπλάσματος επιθηλιακών κυττάρων θυρεοειδούς (μικροσωμάτια) ή κολλοειδούς (θυρεοσφαιρίνη) για τη σαφή διαφοροποίηση από το φθορισμό παρασκηνίου Όρια της Διαδικασίας 1. Οταν δύο η περισσότερα αντισώματα συνυπάρχουν στο ίδιο δείγμα μπορεί να εμφανισθεί το φαινόμενο της αλληλεπίδρασης. Αυτά χαρακτηρίζονται από διαφορετικούς τύπους χρώσης με διαφορετικές αραιώσεις δειγμάτων και ασυνεπή τίτλο.η παρουσία τών δύο αντισωμάτων πρέπει να αναφερθεί. 2. Μια ποικιλία εξωτερικών παραγόντων μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία της εξέτασης συμπεριλαμβανομένων του τύπου του μικροσκοπίου φθορισμού, της έντασης και χρονικής χρήσης της λάμπας, της μεγέθυνσης, του συστήματος φίλτρων και του παρατηρητή. 3. Εάν χρησιμοποιείται band pass filter αντί για 515 barrier filter, μπορεί να παρατηρηθεί αυξημένη μη ειδική χρώση. 4. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο μολύβι για εγγραφή πάνω στα πλακίδια. Οποιοδήποτε άλλο είδος μπορεί να προκαλέσει μη ειδική χρώση. 5. Όλα τα μπανάκια που χρησιμοποιούνται στο πλύσιμο των πλακιδίων πρέπει να μην έχουν κατάλοιπα χρώσης. Τα κατάλοιπα χρώσης μπορεί να δώσουν μη ειδική χρώση. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 7. Η μέθοδος δέν έχει επιβεβαιωθεί για άλλο δείγμα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η δοκιμασία NOVA Lite TM Thyroid χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση 24 ασθενών με χρόνια θυρεοειδίτιδα (Hashimoto). Εξετάστηκαν επίσης δεκαπέντε ασθενείς με διαβήτη τύπου I και 67 τυχαίοι δότες αίματος χωρίς αναφερόμενες ανωμαλίες του θυρεοειδούς. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται παρακάτω. 4

5 ΑΡΙΘΜΟΣ ΘΕΤΙΚΩΝ Αριθμός Μικροσωμιακά Κολλοειδη Χρόνια Θυρεοειδίτιδα Διαβήτης τύπου Φυσιολογικοί Βιβλιογραφία 1. Davies TF and DeBernardo, E: Thyroid autoantibodies and disease. In Autoimmune Endocrine Disease, TF Davies, ed., Wiley, New York, NY, 1983, p Wall JR and Kuroki, T: Immunologic Factors in Thyroid Disease. Medical Clinics of North America 69: 913, Hall R and Evered, DC: Autoimmune thyroid disease: thyroiditis. In Endrocrinology, DeGroot LJ et. al., eds., Grune and Stratton, New York, NY, 1979, p Delespesse G. et. al.: Thyroid autoimmunity. In Thyroiditis and Thyroid Function, P.A. Bastenie and A.M. Evans, eds., Pergamon Press, Oxford, 1972, p Balfour BM, et. al.: Fluorescent antibody studies in human thyroiditis: autoantibodies to an antigen of the thyroid colloid distinct from thyroglobulin. Br. J. Exp. Pathol. 43:307, Tung KSK, et. al.: Antithyroid antibodies in juvenile lymphocytic thyroiditis. Am. J. Clin. Pathol. 61: 549, Doniach D and Roitt, IM: Autoimmunity in Hashimoto's disease and its implications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 17: 1293, Philip JR, et. al.: A latex particle precipitation test in the diagnosis of thyroid disease. J. Clin. Pathol. 15: 148, Fulthorpe AJ, et. al.: A stable sheep cell preparation for detecting thyroglobulin autoantibodies and its clinical applications. J. Clin. Pathol. 14: 654, Holborrow J, et. al.: Cytoplasmic localization of complement-fixing auto-antigen in human thyroid epithelium. Br. J. Exp. Pathol. 40: 583, Doniach D: Thyroid autoimmune disease: symposium on thyroid gland. J. Clin. Pathol. 20: 385, Wilkikn TJ, et. al.: A passive hemagglutination (TRC) inhibitor in thyrotoxic serum. J. Clin. Endocrinol. 10: 507, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC April 2008 Revision 12 5