ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ Δ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ.ΤΣΑΛΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ Δ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ.ΤΣΑΛΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ.3140 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΜΕ Ή ΧΩΡΙΣ ΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΤΗ ΒΛΑΒΗ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑ / ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΛΕΠΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ (Πειραματική μελέτη σε αρουραίους) ΥΠΟ ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΡΟΪΔΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΧΡΙΣΤΟΦΟΡΙΔΗΣ, Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Χ. ΛΑΖΑΡΙΔΗΣ, Ομότιμος Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Κ. ΤΣΑΛΗΣ, Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΧΡΙΣΤΟΦΟΡΙΔΗΣ, Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Χ. ΛΑΖΑΡΙΔΗΣ, Ομότιμος Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Κ. ΤΣΑΛΗΣ, Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Κ. ΚΟΥΖΗ-ΚΟΛΙΑΚΟΥ, Καθηγήτρια Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ. Ι. ΓΑΛΑΝΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Κ. ΣΑΠΑΛΙΔΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. Δ. ΠΑΡΑΜΥΘΙΩΤΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Α.Π.Θ. 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ 22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΛΕΠΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΟ ΛΕΠΤΟ ΕΝΤΕΡΟ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ 30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΑΣ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΑΡΤΗΡΙΑΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΠΑΡΑΠΛΕΥΡΗ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΟΥ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΦΛΕΒΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΟΥ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ 38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ 42 4

5 4.3.ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΛΑΒΩΝ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ 69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ- ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΤΟ ΝΕΦΡΟ 5.1.ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑ- ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ 5.2. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ/ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΛΕΠΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΔΟΜΗ, ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ Η ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΗ H ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΣΤΗ ΔΙΑΧΥΤΗ ΕΝΔΑΓΓΕΙΑΚΗ ΠΗΞΗ ΕΞ ΑΙΤΙΑΣ ΣΗΠΤΙΚΗΣ ΣΥΝΔΡΟΜΗΣ 6.4. ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΕ ΕΝΔΟΤΟΞΙΝΑΙΜΙΑ 81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ (PRECONDITIONING) ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ 7.1. ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΚΛΑΣΙΚΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΗ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ (PRECONDITIONING) ΤΟΥ 96 ΕΝΤΕΡΟΥ 5

6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο Ο ΕΠΙΜΥΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ WISTAR ΑΝΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥ ΕΥΘΑΝΑΣΙΑ 99 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 101 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΑΞΗ ΑΝΑΙΣΘΗΣΙΑ ΕΓΧΕΙΡΗΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΥΤΟΚΙΝΕΣ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΥΕΛΟΫΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΑΛΟΝΙΚΗΣ ΔΙΑΛΔΕΫΔΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 118 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IL-1β IL TNF-α MDA MPO ΔΟΜΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΥΠΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ 129 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ο 6

7 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 133 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ο ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ για τη γυναίκα μου Όλγα και τα παιδιά μας, Ελευθερία, Κωνσταντίνο-Μάξιμο και Αχιλλέα 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι βλάβες που προκαλούνται μετά από οξεία ισχαιμία-επαναιμάτωση του εντέρου αποτελούν ένα ιδιαίτερα σημαντικό πρόβλημα στην καθημερινή ιατρική πράξη, τόσο διαγνωστικά όσο και θεραπευτικά. Παρά τη μακροχρόνια έρευνα, η φαρμακευτική αντιμετώπιση της οξείας εντερικής ισχαιμίας και επαναιμάτωσης εξακολουθεί να αποτελεί αντικείμενο έρευνας και αυτό πιθανώς οφείλεται στη μη πλήρη κατανόηση της παθοφυσιολογίας του διαφορετικού τύπου προσβολών, καθώς και των δράσεων των διαφόρων φαρμάκων. Τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στην έρευνα των βλαβών του εντέρου μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση, καθώς και των τρόπων αντιμετώπισής τους. Σημαντική έρευνα γίνεται στην πρόληψη των ιστικών βλαβών μελετώντας διάφορες αντιοξειδωτικές ουσίες, δεσμευτές των ελευθέρων ριζών, συμπληρώματα οξειδίων του αζώτου, γλουταμίνης και γλυκίνης, καθώς και θεραπειών του συμπληρώματος και των λευκών αιμοσφαιρίων, χωρίς όμως ικανοποιητικά αποτελέσματα. 1,2,3,4 Ο όρος ισχαιμία χρησιμοποιείται για να περιγράψει την ελάττωση της αιματικής ροής και την ανεπαρκή παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών σε διάφορους ιστούς και όργανα. Σε κυτταρικό επίπεδο η ισχαιμία προκαλεί δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, μείωση του ΑΤΡ, απώλεια της ομοιόστασης των ιχνοστοιχείων και ενδοκυττάρια οξείδωση. Αυτά έχουν ως αποτέλεσμα διαταραχές της κυτταρικής διαπερατότητας και ενεργοποίηση των πρωτεασών και λιπασών. Στους ιστούς παρατηρείται ενδιάμεσο οίδημα, δημιουργία φυσαλίδων στην επιφάνεια των κυττάρων, εσχαροποίηση των λαχνών του εντέρου και αιμορραγία του βλεννογόνου. Αν δεν επέλθει άμεση επαναιμάτωση, ακολουθεί ο κυτταρικός θάνατος και κατά συνέπεια η ιστική νέκρωση που επεκτείνεται ολοτοιχωματικά από το βλεννογόνο προς τον ορογόνο. 5,6,7,8 Οι βλάβες που προκαλούνται από την ισχαιμία των διαφόρων ιστών και οργάνων δεν είναι αποτέλεσμα μόνο της διαταραχής της αιματικής ροής και εξαρτώνται από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Κύριοι υπεύθυνοι για τις βλάβες αυτές είναι διάφορα τοξικά προϊόντα που παράγονται κατά την ισχαιμία, αλλά κυρίως κατά την επαναιμάτωση των ίσχαιμων ιστών κι οργάνων και μεταφέρονται με την κυκλοφορία σε άλλα όργανα. Έτσι λοιπόν, ενώ η επαναιμάτωση είναι αναγκαία για τη βιωσιμότητα του εντέρου, έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να προκαλέσει μια σειρά αντιδράσεων που οδηγούν στην ιστική βλάβη. Η επαναφορά του οξυγόνου στους ίσχαιμους ιστούς οδηγεί στην παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου, που προκαλούν άμεση κυτταρική 8

9 καταστροφή διαμέσου της λιπιδικής υπεροξείδωσης και προάγουν τη μαζική άθροιση στο εντερικό τοίχωμα πολυμορφοπύρηνων. Αυτά με τη σειρά τους, παράγουν ελεύθερες ρίζες και προκαλούν ενεργοποίηση των κυτταροκινών (TNF-a, IL-1, IL-6) και των πρωτεασών. Αποτέλεσμα των ανωτέρω είναι μια φλεγμονώδης αλυσιδωτή αντίδραση που προκαλεί επιπλέον αποσταθεροποίηση της κυτταρικής μεμβράνης, αύξηση της κυτταρικής διαπερατότητας, ευαισθησία στα εντερικά παθογόνα μικρόβια και τελικά απώλεια της εντερικής βιωσιμότητας. 5,8,9,10 Η καταστροφή του εντερικού βλεννογόνου εξαιτίας της ισχαιμίας/επαναιμάτωσης οδηγεί στην είσοδο μικροοργανισμών κι ενδοτοξινών από τον εντερικό αυλό στην κυκλοφορία με αποτέλεσμα τη συστηματική αντίδραση στη βλάβη που τελικά οδηγεί στο σύνδρομο ανεπάρκειας πολλών οργάνων. Ο εντερικός βλεννογόνος είναι ιδιαίτερα ευάλωτος στην ισχαιμία με αποτέλεσμα την διαταραχή της κυτταρικής διαπερατότητας και της λειτουργίας του τριχοειδικού φραγμού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της λειτουργίας του φυσιολογικού εντερικού φραγμού (βλεννογονοεντερικός φραγμός) και την αύξηση της μικροαγγειακής διαπερατότητας. Η διαταραχή του βλεννογόνου και του μικροαγγειακού φραγμού είναι εξαιρετικής σημασίας, καθώς μπορεί να επιτρέψει την είσοδο ενδοτοξίνης στη συστηματική κυκλοφορία με αποτέλεσμα τη συστηματική αντίδραση στη βλάβη που τελικά οδηγεί στο σύνδρομο ανεπάρκειας πολλών οργάνων. 11 Πολλοί παράγοντες έχουν χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη ή την αντιμετώπιση των συνεπειών του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στο έντερο. Η χρήση αντιοξειδωτικών παραγόντων, η αναστολή του συμπληρώματος και η αναστολή της δράσης των λευκών αιμοσφαιρίων είναι μέθοδοι, που έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς κυρίως, όμως, σε πειραματικό επίπεδο. Η χορήγηση αντιθρομβίνης έχει προταθεί ως μία από τις εναλλακτικές θεραπευτικές προσεγγίσεις. Πρόκειται για μία γλυκοπρωτεΐνη η οποία παράγεται στο ήπαρ, που λειτουργεί ως φυσιολογικός αναστολέας της θρομβίνης, και κάποιων ακόμη πρωτεασών. Σε κλινικές και πειραματικές μελέτες, η αντιθρομβίνη έχει βρεθεί ότι καταστέλλει την οξεία φλεγμονώδη αντίδραση και προφυλάσσει από την διάχυτη ενδαγγειακή πήξη, μετά από σήψη, τραύμα, ή έκλυση ενδοτοξινών. 12,13 Η ισχαιμική προετοιμασία (preconditioning) είναι το φαινόμενο κατά το οποίο, μία μικρής διάρκειας έκθεση των ιστών σε συνθήκες ισχαιμίας, τους προστατεύει από τις βλαπτικές επιδράσεις μίας επικείμενης παρατεταμένης ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. 14 9

10 Η αδενοσίνη, η βραδυκινίνη και οι κατεχολαμίνες φαίνεται να αποτελούν σημαντικό παράγοντα έναρξης της προσαρμογής μετά από πρόκληση ισχαιμικής προετοιμασίας μέσω της ενεργοποίησης των φωσφολιπασών C ή D, οι οποίες αντιστρόφως ενεργοποιούν την C πρωτεϊνική κινάση. 14 Η ισχαιμική προετοιμασία προάγει επίσης την εξαρτώμενη από την πρωτεϊνική κινάση C μετακίνηση της 5'- νουκλεοτιδάσης στην κυτταρική επιφάνεια, γεγονός που αυξάνει την παραγωγή της κυτταρικής αδενοσίνης, που ίσως συμβάλλει στην προστασία κατά την ισχαιμίαεπαναιμάτωση, αυξάνοντας τα κυτταρικά ενεργειακά αποθέματα, και/ή αναστέλλοντας την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων. Οι επιπτώσεις της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου στο νεφρό δεν έχουν μελετηθεί ιδιαίτερα. Σκοπός της πειραματικής αυτής εργασίας σε επίμυες είναι η μελέτη της επίδρασης της ισχαιμικής προετοιμασίας του εντέρου με ή χωρίς τη χορήγηση της αντιθρομβίνης στη βλάβη των νεφρών μετά από ισχαιμία/επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου. Η διδακτορική διατριβή διακρίνεται σε δύο μέρη: το Γενικό και το Ειδικό. Στο Ειδικό μέρος περιγράφονται οι μέθοδοι που εφαρμόσθηκαν στο πείραμα, τα αποτελέσματα της πειραματικής μελέτης καθώς και η στατιστική τους ανάλυση. Ακολουθεί η συζήτηση, τα συμπεράσματα, η περίληψη στα ελληνικά και στα αγγλικά καθώς και η βιβλιογραφία. Αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες και την ευγνωμοσύνη μου: Προς τον Επιβλέποντα την παρούσα διατριβή, κ.εμμανουήλ Χριστοφορίδη, Καθηγητή Χειρουργικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου στον οποίο οφείλω την εκπόνηση της. Τον ευχαριστώ θερμά τόσο για την εμπιστοσύνη του, την αμέριστη βοήθεια του σε κάθε δυσκολία καθώς και για την εξαιρετική μας συνεργασία στην προσπάθεια ολοκλήρωσης της παρούσας διατριβής. Προς τον Ομότιμο Καθηγητή Χειρουργικής, μέλος της Τριμελούς Επιτροπής και πνευματικό μου πατέρα κ.χαράλαμπο Λαζαρίδη, για τις ουσιαστικές συμβουλές καθώς και για τη συνεχή επίβλεψη στην πρόοδο μου. Προς τον Διευθυντή και Καθηγητή μου κ.κωνσταντίνο Τσαλή, Καθηγητή Χειρουργικής, που ως μέλος της Τριμελούς Επιτροπής συνέβαλε αποτελεσματικά με συνεχή επίβλεψη καθώς και με ουσιαστικές συμβουλές στη βελτίωση της παρούσας διατριβής. 10

11 Προς την Καθηγήτρια Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, κα Κοκκώνα Κουζή-Κολιάκου για τη συμμετοχή της στην Επταμελή Επιτροπή και για την αμέριστη υποστήριξη της στη μελέτη των δειγμάτων του νεφρού καθώς και στη λήψη των εικόνων του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Προς τον Καθηγητή Βιοχημείας κ.γεώργιο Κολιάκο, για την εξαιρετική συνεργασία του και τις συμβουλές του στην διεξαγωγή του επίπονου σκέλους των βιοχημικών αναλύσεων. Προς τον Καθηγητή Κτηνιατρικής κ.ιωάννη Ταιτζόγλου για τις ουσιαστικές συμβουλές και παρεμβάσεις στη διεξαγωγή του πειραματικού σκέλους της διατριβής μου. Προς τον Στατιστικολόγο κ.ανέστη Λαδά για την ουσιαστική βοήθεια του στη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων. Τέλος ευχαριστώ θερμά τον Επίκουρο Καθηγητή Χειρουργικής κ. Ιωάννη Μαντζώρο, καθώς και τον συνάδελφο χειρουργό κ. Γιώργο Βρακά για την πολύτιμη συνδρομή τους στη διεξαγωγή του πειραματικού σκέλους της διατριβής μου. Γεώργιος Ρόιδος Νοέμβριος

12 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 12

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ 1.1.ΑΝΑΤΟΜΙΑ Οι νεφροί βρίσκονται στον οπισθοπεριτοναϊκό χώρο εκατέρωθεν της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Εκτείνονται συνήθως από το 12ο θωρακικό μέχρι το 3ο οσφυϊκό σπόνδυλο, με το δεξιό νεφρό να βρίσκεται χαμηλότερα από τον αριστερό. Κάθε νεφρός περιβάλλεται εξωτερικά από ινώδη χιτώνα που αποτελείται από συνδετικό ιστό με λίγες ελαστικές ίνες. Οι διαστάσεις του νεφρού είναι, πάντα κατά προσέγγιση, (μήκος x πλάτος x πάχος) 11 x 6 x 3 cm και το βάρος τους στους άνδρες είναι περίπου 150 gr και στις γυναίκες 135 gr. Κάθε νεφρός έχει σχήμα φασολιού με δύο επιφάνειες (την πρόσθια και την οπίσθια), δύο χείλη (το έξω και το έσω) και δύο πόλους (τον άνω και κάτω). Οι άνω πόλοι συγκλίνουν προς τη μέση γραμμή παρουσιάζοντας περιστροφή γύρω από τον επιμήκη άξονά τους, ώστε το έσω χείλος φέρεται προς τα εμπρός και έσω και το έξω χείλος προς τα πίσω και έξω. Στον άνω πόλο του νεφρού επικάθεται το σύστοιχο επινεφρίδιο. Σε επιμήκη διατομή του νεφρού διακρίνεται μια κοκκώδης περιφερική μοίρα, η φλοιώδης ουσία και μια κεντρική γραμμωτή μοίρα, η μυελώδης ουσία του νεφρού. 15,16,17 Η μυελώδης ουσία αποτελείται από κωνοειδείς περιοχές, με τη βάση στραμμένη προς τη φλοιώδη ουσία του νεφρού και την κορυφή προς τη νεφρική πύελο. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται νεφρικές πυραμίδες ή πυραμίδες του Malpighi. Από τη βάση τους ξεκινούν προσεκβολές, οι μυελώδεις ακτίνες ή ακτίνες του Ferrein, οι οποίες προεκτείνονται στη φλοιώδη ουσία. Η κορυφή των νεφρικών πυραμίδων ονομάζεται θηλή και εμφανίζει τρήματα, τα οποία αποτελούν τις εκβολές των ουροφόρων σωληναρίων (θηλαίοι πόροι). Η φλοιώδης ουσία περιβάλλει από έξω τη μυελώδη ουσία και προσεκβάλλει ανάμεσα στις νεφρικές πυραμίδες. Οι προσεκβολές αυτές ονομάζονται νεφρικοί στύλοι (του Bertini). Μέσα στη φλοιώδη ουσία παρατηρούνται ακόμη και με γυμνό οφθαλμό μικρά κοκκινωπά στίγματα που αντιστοιχούν στα νεφρικά σωμάτια. Επομένως, οι δύο ουσίες (φλοιώδης και μυελώδης) δεν είναι χωρισμένες αλλά προσεκβάλλει η μία στην άλλη. 16,17 Αν εξετάσουμε λεπτομερώς την κατασκευή του νεφρού θα δούμε ότι αποτελεί σύνθετο σωληνοειδή αδένα που παράγει το ούρο και αποτελείται από τα ουροφόρα σωληνάρια, μεταξύ των οποίων υπάρχει διάμεσος συνδετικός ιστός, αγγεία και νεύρα. Κάθε ουροφόρο σωληνάριο αρχίζει από 13

14 τη φλοιώδη ουσία και απολήγει στη θηλή της νεφρικής πυραμίδας. 18,19 Εμφανίζει τα εξής μέρη: 1. Το έλυτρο του Bowman που αποτελεί το αρχικό, τυφλό και διευρυσμένο άκρο του ουροφόρου σωληναρίου που πτυχώνεται από αγγεία (αγγειώδες σπείραμα). Εμφανίζει δύο πέταλα, το έσω και το έξω πέταλο, ανάμεσα στα οποία υπάρχει σχισμοειδής κοιλότητα που ονομάζεται ουροφόρος κοιλότητα και υποδέχεται το πρόουρο. Από το έσω πέταλο του ελύτρου αφορίζεται μία άλλη κοιλότητα, η αγγειώδης κοιλότητα που υποδέχεται το αγγειώδες σπείραμα ή θαυμάσιο δίκτυο (προσαγωγό αρτηρίδιο, τριχοειδή, απαγωγό αρτηρίδιο). Το έλυτρο του Bowman μαζί με το αγγειώδες σπείραμα αποτελούν ένα νεφρικό σωμάτιο Το εγγύς εσπειραμένο (ή σπειροειδές) σωληνάριο αποτελεί συνέχεια του ελύτρου του Bowman και πορεύεται αρχικά σπειροειδώς γύρω από το νεφρικό σωμάτιο και στη συνέχεια σε μια παρακείμενη μυελώδη ακτίνα όπου πορευόμενο ευθέως (ευθεία μοίρα του εσπειραμένου σωληναρίου) μεταπίπτει στο αγκυλωτό σωληνάριο. 3. Το αγκυλωτό σωληνάριο ή αγκύλη του Henle πορεύεται στην αρχή μέσα στη μυελώδη ακτίνα, κατέρχεται στη νεφρική πυραμίδα και στη συνέχεια ανακάμπτει προς τα επάνω. Εμφανίζει ένα κατιόν σκέλος, την κορυφή και ένα ανιόν σκέλος. Το ανιόν σκέλος φέρεται πλησίον του νεφρικού σωματίου όπου και μεταπίπτει στο άπω εσπειραμένο σωληνάριο. 4. Το άπω εσπειραμένο (ή σπειροειδές) ή εμβόλιμο σωληνάριο είναι σπειροειδές, πορεύεται στη φλοιώδη ουσία και εισέρχεται σε ένα από τα αθροιστικά σωληνάρια. 5. Τα αθροιστικά σωληνάρια που πορεύονται στη μυελώδη ουσία διακρίνονται στα πρωτογενή που υποδέχονται τα άπω εσπειραμένα σωληνάρια και τα οποία αναστομώνονται το ένα με το άλλο και σχηματίζουν τα δευτερογενή, τα τριτογενή, τα τεταρτογενή και τέλος τους θηλαίους πόρους που εκβάλλουν στα τρήματα της ηθμοειδούς άλω της θηλής. Επομένως, η φλοιώδης ουσία αποτελείται από τα νεφρικά σωμάτια, τα εγγύς εσπειραμένα, τα άπω εσπειραμένα και τα πρωτογενή αθροιστικά σωληνάρια. Η μυελώδης ουσία περιλαμβάνει τα αγκυλωτά σωληνάρια και τα αθροιστικά σωληνάρια. Κάθε νεφρός περιέχει περίπου 1-4 εκατομμύρια λειτουργικές μονάδες που ονομάζονται νεφρώνες. Κάθε νεφρώνας αποτελείται από το νεφρικό σωμάτιο, το εγγύς εσπειραμένο και την ευθεία μοίρα του, το αγκυλωτό και το άπω εσπειραμένο σωληνάριο και χρησιμεύει για την απέκκριση του ούρου ενώ τα αθροιστικά σωληνάρια για την αποχέτευση του ούρου. 18,19 14

15 Το νεφρικό σωμάτιο αποτελείται από το αγγειώδες σπείραμα το οποίο περιβάλλεται από το διπέταλο έλυτρο του Bowman. 18,19 Το έσω πέταλο του ελύτρου βρίσκεται σε άμεση σχέση με τα τριχοειδή του σπειράματος και αποτελεί την αγγειακή στιβάδα, ενώ το έξω πέταλο αποτελεί το τοίχωμα του νεφρικού σωματίου και ονομάζεται τοιχωματική στιβάδα. Μεταξύ των δύο πετάλων υπάρχει σχισμοειδής κοιλότητα, η οποία δέχεται το πρόουρο, δηλαδή το υγρό που διηθείται από το τοίχωμα των τριχοειδών και του έσω πέταλου του ελύτρου του Bowman. Κάθε νεφρικό σωμάτιο έχει αγγειακό δίκτυο που αποτελείται από το προσαγωγό αρτηρίδιο το οποίο εισερχόμενο στο σωμάτιο αναλύεται σε τριχοειδή τα οποία συνενώνονται για να σχηματίσουν το απαγωγό αρτηρίδιο. Η υδροστατική πίεση του αρτηριακού αίματος των τριχοειδών ρυθμίζεται από το προσαγωγό αρτηρίδιο. Το τοίχωμα του αρτηριδίου αυτού περιέχει σημαντικό αριθμό λείων μυϊκών ινών ώστε να έχει τη δυνατότητα να μεταβάλλει τη διάμετρο του αυλού του. Αντίθετα ο αυλός του απαγωγού αρτηριδίου παραμένει σταθερός. Το έξω πέταλο του ελύτρου του Bowman αποτελείται από πλακώδες επιθήλιο που περιβάλλεται από βασική μεμβράνη και ένα λεπτό στρώμα δικτυωτών ινών που αναστομώνονται με τις δικτυωτές ίνες που περιβάλλουν τα γύρω σωληνάρια του οργάνου. Το επιθήλιο του έξω πετάλου παραμένει αμετάβλητο ενώ το επιθήλιο του έσω πετάλου τροποποιείται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και αποκτά μια ιδιαίτερη μορφή. Τα κύτταρα του έσω πετάλου ονομάζονται ποδοκύτταρα 18,19 και αποτελούνται από το κυτταρικό σώμα από το οποίο προεξέχουν πρωτογενείς προσεκβολές, οι οποίες αποσχίζονται σε πολυάριθμες δευτερογενείς προσεκβολές που περιβάλλουν τα τριχοειδή του σπειράματος (Σχήμα 1). Οι δευτερογενείς προσεκβολές βρίσκονται σε απόσταση 25 nm η μία από την άλλη και σε άμεση επαφή με τη βασική μεμβράνη των τριχοειδών, ενώ τα περισσότερα κυτταρικά σώματα και οι πρωτογενείς προσεκβολές τους δεν έρχονται σε επαφή με τη βασική μεμβράνη των τριχοειδών. Μεταξύ των δευτερογενών προσεκβολών των ποδοκυττάρων καταλείπονται στενοί χώροι που ονομάζονται σχισμές διήθησης (filtration slits). Στις σχισμές διήθησης υπάρχει λεπτή μεμβράνη, πάχους περίπου 6 nm, η οποία είναι ανάλογη με τα διαφράγματα των ενδοθηλιακών κυττάρων των θυριδωτών τριχοειδών αγγείων. Το κυτταρόπλασμα των ποδοκυττάρων αποτελείται από ελεύθερα ριβοσωμάτια, μικροσωληνάρια και μικρονημάτια. Παρά τη συνεχή έρευνα ο ακριβής ρόλος των κυττάρων αυτών δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. 15

16 Τα τριχοειδή του αγγειακού σπειράματος είναι θυριδωτού τύπου. Τα θυριδωτά ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών έχουν πολύ λεπτό κυτταρόπλασμα το οποίο είναι παχύτερο γύρω από τον πυρήνα. Οι πόροι των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι περισσότεροι από τους πόρους που παρατηρούνται στα τριχοειδή θυριδωτού τύπου άλλων οργάνων και σύμφωνα με κάποιους ερευνητές, δεν έχουν συνήθως τη λεπτή μεμβράνη που παρατηρείται συνήθως στους πόρους των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών άλλων οργάνων. Κάποιοι αναφέρουν την ύπαρξη απλής πρωτεϊνικής πύκνωσης στην περιοχή αυτή. Μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών του σπειράματος και των ποδοκυττάρων παρεμβάλλεται η βασική μεμβράνη. Η μεμβράνη αυτή είναι η μοναδική συνεχής δομή που διαχωρίζει το αίμα του τριχοειδούς από την ουροφόρο κοιλότητα. Εκτός των ενδοθηλιακών κυττάρων και των ποδοκυττάρων, στα τριχοειδή του σπειράματος παρατηρούνται μεσαγγειακά κύτταρα τα οποία προσκολλώνται στα τοιχώματα των τριχοειδών σε περιοχές όπου η βασική μεμβράνη δεν περιβάλλει πλήρως ένα τριχοειδές. Έτσι σχηματίζεται χώρος ο οποίος μοιράζεται μεταξύ δύο ή τριών παρακείμενων τριχοειδών και ονομάζεται μεσαγγειακός χώρος 18,19. Μεσαγγειακά κύτταρα βρίσκονται μερικές φορές και μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και της βασικής μεμβράνης των τριχοειδών. Τα μεσαγγειακά κύτταρα έχουν μικρές προσεκβολές και καλύπτονται από στιβάδα άμορφης ουσίας. Δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος ο ρόλος τους αλλά στηρίζουν ή/ και υποβοηθούν στη λειτουργία του το αγγειώδες σπείραμα. Το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο αποτελεί συνέχεια του νεφρικού σωματίου και μεταπίπτει στην αγκύλη του Henle. Κατά τη μελέτη στο κοινό μικροσκόπιο παρατηρείται κυρίως στη φλοιώδη ουσία του νεφρού. Επαλείφεται από κυβοειδές επιθήλιο, η ψηκτροειδής παρυφή του οποίου αποτελείται από πλήθος μικρολαχνών ύψους 1μm. Το μέγεθος των κυττάρων είναι μεγάλο και σε κάθε εγκάρσια τομή παρατηρούνται 3-4 σφαιρικοί πυρήνες τοποθετημένοι στο κέντρο του κάθε κυττάρου. Τα επιθηλιακά κύτταρα περιέχουν μεγάλο αριθμό σωληναρίων που καταλήγουν στη βάση των μικρολαχνών. Μεταξύ των σωληναρίων παρατηρούνται μικρά κενοτόπια. Τα μιτοχόνδρια είναι πολυάριθμα, τοποθετούνται κατά τον επιμήκη άξονα του κυττάρου και μέσα σε αναδιπλώσεις της βασικής κυτταρικής μεμβράνης. Αναδιπλώσεις της βασικής κυτταρικής μεμβράνης παρατηρούνται και πλευρικά των κυττάρων που εισδύουν στα γειτονικά κύτταρα. Με τις αναδιπλώσεις τόσο προς τη βάση του κυττάρου, όσο και προς τα πλάγια, πολλαπλασιάζεται η επιφάνεια της κυτταρικής 16

17 μεμβράνης, μέσω της οποίας λειτουργεί η αντλία νατρίου. Τα παραπάνω αποτελούν χαρακτηριστικά γνωρίσματα των κυττάρων αυτών. 18,19 Η αγκύλη του Henle αποτελεί συνέχεια του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου. Βρίσκεται κυρίως στη μυελώδη ουσία του νεφρού. Έχει σχήμα U και αποτελείται από ένα λεπτό κατιόν και ένα πιο παχύ ανιόν τμήμα. Ο αυλός του κατιόντος τμήματος επαλείφεται από πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα, οι πυρήνες των οποίων προβάλλουν στον αυλό της αγκύλης. Το τμήμα αυτό ομοιάζει με τον αυλό τριχοειδούς αγγείου. Το ανιόν τμήμα έχει παρόμοια δομή με το άπω εσπειραμένο σωληνάρο. 18,19 Το άπω εσπειραμένο σωληνάριο αποτελεί τη συνέχεια του ανιόντος τμήματος της αγκύλης του Henle. Εισέρχεται στη φλοιώδη ουσία του νεφρού και επαλείφεται, όπως και το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο από κυβοειδές επιθήλιο. 18 Όμως υπάρχουν διαφορές μεταξύ τους. Τα κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου είναι μεγάλα, με πολυάριθμες μικρολάχνες στην παρυφή τους και άφθονα μιτοχόνδρια. Τα κύτταρα του άπω εσπειραμένου σωληναρίου είναι μικρότερα και έχουν λίγες, παχιές και μικρού ύψους μικρολάχνες. Σε εγκάρσια τομή του, παρατηρούνται λιγότεροι πυρήνες από εκείνους του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου. Το ευθύ τμήμα του άπω εσπειραμένου σωληναρίου, στην αρχή της πορείας του, πορεύεται πλησίον του αγγειώδους πόλου του οικείου νεφρικού σωματίου, ανάμεσα στο προσαγωγό και το απαγωγό αρτηρίδιο με τα οποία έρχεται σε επαφή. Το έναντι των δύο αυτών αρτηριδίων τμήμα του σωληναρίου παρουσιάζει διαφορετική υφή. Στο σημείο αυτό τα κύτταρά του γίνονται κυλινδρικά και παρατηρείται συμπλησίαση των πυρήνων, ενώ τα περισσότερα κύτταρα παρουσιάζουν συσκευή Golgi. Αυτό το τμήμα του άπω εσπειραμένου σωληναρίου κατά την εξέταση στο οπτικό μικροσκόπιο έχει σκοτεινότερη όψη (εξαιτίας της συμπλησίασης των πυρήνων) και ονομάζεται πυκνή κηλίδα 18. Η ακριβής λειτουργία του τμήματος αυτού δεν είναι γνωστή. Είναι πιθανό να συμμετέχει στη μεταβίβαση πληροφοριών στο σπείραμα σχετικά με τη σύνθεση του υγρού στο άπω εσπειραμένο σωληνάριο. Τα αθροιστικά σωληνάρια αποτελούν συνέχεια των άπω εσπειραμένων σωληναρίων. Ενώνονται μεταξύ τους σε μεγαλύτερα ουροφόρα σωληνάρια, τους πόρους του Bellini. Τα περισσσότερα από τα σωληνάρια αυτά βρίσκονται στη μυελώδη μοίρα του νεφρού. Τα μικρότερα σωληνάρια επαλείφονται από κυβοειδές επιθήλιο, ενώ τα μεγαλύτερα από κυλινδρικό. 18,19 17

18 Η αιμάτωση του νεφρού Κάθε νεφρός αιματώνεται φυσιολογικά από μια νεφρική αρτηρία, η οποία εκφύεται από την κοιλιακή αορτή στο ύψος του 2ου οσφυϊκού σπονδύλου και ένα εκατοστό κάτω από την έκφυση της μεσεντερίου αρτηρίας. Η δεξιά νεφρική αρτηρία εκφύεται λίγο πιο κάτω από την αριστερή και κατά τη διαδρομή της διασταυρώνεται με την κάτω κοίλη, ενώ συγχρόνως έρχεται σε επαφή με τη νεφρική φλέβα. Η νεφρική αρτηρία διαιρείται στην πύλη του νεφρού σε δυο κύριους κλάδους. Από κάθε έναν από τους κλάδους αυτούς εκφύονται οι μεσολόβιες αρτηρίες, που ανέρχονται μεταξύ των νεφρικών πυραμίδων προς τη συμβολή μυελού και φλοιού. Διακλαδίζονται σχηματίζοντας τις τοξοειδείς αρτηρίες από τις οποίες εκφύονται πολυάριθμες αρτηρίες του φλοιού, οι μεσολοβίδιες, που διακλαδίζονται και σχηματίζουν τα προσαγωγά αρτηρίδια των νεφρικών σπειραμάτων. Τα απαγωγά αρτηρίδια μεταπίπτουν στο τριχοειδικό δίκτυο του φλοιού. Από τα τριχοειδή αυτά αρχίζουν οι μεσολοβίδιες φλέβες και στη συνέχεια οι τοξοειδείς και οι μεσολόβιες φλέβες. Αυτές με τη σειρά τους καταλήγουν στους κύριους νεφρικούς κλάδους στην πύλη του νεφρού και η κύρια νεφρική φλέβα εκβάλλει στην κάτω κοίλη φλέβα. 15,16 Εικόνα 1:Αιμάτωση του νεφρού 18

19 1.2.Φυσιολογία Η κυριότερη λειτουργία του νεφρού είναι η διατήρηση της ομοιόστασης των υγρών του σώματος. Η λειτουργία αυτή πραγματοποιείται με τη διήθηση, την ενεργητική και την παθητική απορρόφηση και την απέκκριση. Η διήθηση πραγματοποιείται στο σπείραμα, όπου διηθείται το πλάσμα του αίματος και μεταφέρονται από το αίμα στον αυλό των σωληναρίων τελικά προϊόντα του μεταβολισμού και τοξίνες που αποβάλλονται με τα ούρα. Τα σωληνάρια του νεφρού επαναρροφούν τις ουσίες που είναι απαραίτητες για το μεταβολισμό (του μεγαλύτερου μέρους του νερού και των ηλεκτρολυτών που διηθήθηκαν), με αποτέλεσμα τη διατήρηση της ομοιόστασης του σώματος. Τα αθροιστικά σωληνάρια επαναρροφούν νερό με αποτέλεσμα τη ρύθμιση της πυκνότητας των ούρων, τα οποία συνήθως είναι πιο υπέρτονα από το πλάσμα του αίματος. Ο νεφρός εκτός από τη ρύθμιση του όγκου των υγρών του σώματος, έχει και ορισμένες μεταβολικές και ορμονικές λειτουργίες. 18 Εκκρίνει ορμόνες που συμμετέχουν στην αιμοδυναμική ρύθμιση, τοπικά στο νεφρό, αλλά και σε συστηματικό επίπεδο (ρενίνη, αγγειοτενσίνη ΙΙ, προσταγλανδίνες, νιτρικό οξείδιο, ενδοθηλίνες και βραδυκινίνη), στην παραγωγή ερυθρών αιμοσφαιρίων (ερυθροποιητίνη) και στη ρύθμιση του μεταβολισμού του ασβεστίου, φωσφόρου και των οστών (καλσιτριόλη). Ακόμη, επιτελεί διάφορες άλλες λειτουργίες, όπως ο καταβολισμός των ορμονικών πεπτιδίων 20,21 και η σύνθεση γλυκόζης (γλυκονεογένεση) σε περιπτώσεις ασιτίας. 22,23 Το κάθε νεφρικό σπείραμα αποτελείται από αρτηριακά τριχοειδή των οποίων η υδροστατική πίεση είναι περίπου το 80% της μέσης αρτηριακής πίεσης. Στην ουροφόρο κοιλότητα η υδροστατική πίεση είναι χαμηλότερη. Η διαφορά των δύο αυτών τιμών πίεσης (πίεση διήθησης) πρέπει να υπερνικήσει μία αντίθετη οσμωτική πίεση που οφείλεται στη συγκέντρωση των πρωτεϊνών του πλάσματος. Η οσμωτική αυτή πίεση τείνει να εμποδίσει την κίνηση του νερού από το εσωτερικό των αιμοφόρων τριχοειδών στην ουροφόρο κοιλότητα. Η οσμωτική πίεση στην ουροφόρο κοιλότητα είναι μηδαμινή. 24 Το διήθημα του σπειράματος σχηματίζεται από τη διαφορά πίεσης μεταξύ των προαναφερθέντων πιέσεων. Τα συστατικά του σπειραματικού διηθήματος είναι ανάλογα αυτών του πλάσματος εκτός των πρωτεϊνών, οι οποίες δεν μπορούν να περάσουν το τοίχωμα του σπειράματος. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα των σπειραματικών τριχοειδών, όπως προαναφέρθηκε είναι θυριδωτού τύπου, ώστε το ενδοθήλιο να είναι εύκολα διαπερατό. Σύμφωνα με τους περισσότερους συγγραφείς η διήθηση επιτελείται στη βασική μεμβράνη και μικρά μόρια είναι δυνατό να διέλθουν και μέσω των ποδοκυττάρων. Το 19

20 διήθημα περνά από το νεφρικό σωμάτιο στο εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο όπου αρχίζει η διαδικασία επαναρρόφησης και απέκκρισης. Παρατηρείται επαναρρόφηση γλυκόζης, ύδατος, χλωριούχου νατρίου, αμινοξέων, ασκορβικού οξεός και πρωτεϊνών καθώς και έκκριση διαφόρων ουσιών ξένων προς τον οργανισμό, όπως το παρααμινοϊππουρικό οξύ (σωληναριακή έκκριση). Όταν το διήθημα φθάνει στην αγκύλη του Henle είναι υπότονο αλλά μετατρέπεται σε υπέρτονο. Η διαδικασία αυτή οφείλεται σε μια διαβάθμιση υπερτονικότητας που επιτελείται στη μυελώδη ουσία του νεφρού. Το κατιόν σκέλος της αγκύλης επιτρέπει τη διακίνηση ύδατος και νατρίου. Επειδή το διάμεσο υγρό της μυελώδους ουσίας είναι υπέρτονο, παρατηρείται είσοδος νατρίου και έξοδος ύδατος από το κατιόν σκέλος. Το ανιόν σκέλος δεν είναι διαπερατό στο νερό, ενώ παρατηρείται ενεργητική μεταφορά νατρίου (αντλία νατρίου) προς το διάμεσο υγρό. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται η υπερτονικότητα του διάμεσου υγρού της μυελώδους ουσίας. Εξαιτίας της μεταφορά νατρίου προς το διάμεσο υγρό, το διήθημα κατά τη μεταφορά του στο άπω εσπειραμένο σωληνάριο είναι υπότονο. Στο άπω εσπειραμένο σωληνάριο παρατηρείται ανταλλαγή ιόντων νατρίου και καλίου, με την ενεργοποίηση της αλδοστερόνης. Το νάτριο επαναρροφάται ενώ το κάλιο απεκκρίνεται. Το άπω εσπειραμένο σωληνάριο εκκρίνει επίσης ιόντα υδρογόνου και αμμωνίας στα ούρα. Η λειτουργία αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική στη διατήρηση της οξεοβασικής ισορροπίας του οργανισμού. Στα αθροιστικά σωληνάρια ολοκληρώνεται η τελική διαδικασία αραίωσης ή συμπύκνωσης των ούρων. Η ADH συμμετέχει στην ελεύθερη διακίνηση νερού μέσω των σωληναρίων Η εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας - Ρυθμός Σπειραματικής Διήθησης (ΡΣΔ) Η εκτίμηση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη προκειμένου να εκτιμηθεί η νεφρική βλάβη και να παρακολουθηθεί η πορεία της νεφρικής νόσου. Για την ποσοτική εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας, θα ήταν χρήσιμο να γνωρίζαμε πόσος όγκος του πλάσματος καθαρίζεται από τις άχρηστες ουσίες στη μονάδα του χρόνου. Η παράμετρος αυτή ονομάζεται ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ ή GFR, Glomerular Filtration Rate) και θα αποτελούσε ένα χρήσιμο δείκτη για την εξέλιξη της πορείας χρόνιων νοσημάτων, που καταστρέφουν προοδευτικά τους νεφρώνες (χρόνια νεφρική ανεπάρκεια). Η τιμή του ΡΣΔ στον υγιή άνδρα είναι περίπου 120 ml/min και λίγο λιγότερο για τις γυναίκες. Τιμή του ΡΣΔ κάτω από 30 ml/min σημαίνει σοβαρή διαταραχή της νεφρικής λειτουργίας. Σε τιμές του ΡΣΔ κάτω των 15 ml/min πρέπει να εφαρμοστούν μέθοδοι υποκατάστασης της νεφρικής 20

21 λειτουργίας, ή να γίνει μεταμόσχευση νεφρού. Η μέτρηση του ΡΣΔ μπορεί να γίνει με τη μέτρηση της κάθαρσης μιας συγκεκριμένης ουσίας που δεν επαναρροφάται, ούτε απεκκρίνεται από τα ουροφόρα σωληνάρια. Ο ρυθμός κάθαρσης μιας τέτοιας ουσίας, θα ήταν ανάλογος με το ρυθμό σπειραματικής διήθησης. Τις προϋποθέσεις αυτές βρέθηκε να ικανοποιεί σε μεγάλο βαθμό η κρεατινίνη. Η κρεατινίνη είναι μια ουσία που παράγεται φυσιολογικά με το μεταβολισμό των μυών, και απεκκρίνεται από τους νεφρούς. Η ημερήσια παραγωγή της είναι σχετικά σταθερή και ανάλογη της μυϊκής μάζας. Ο ρυθμός κάθαρσης της κρεατινίνης είναι μια ικανοποιητική προσέγγιση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης. Για τον ακριβή υπολογισμό της κάθαρσης της κρεατινίνης είναι απαραίτητη η συλλογή ούρων ολόκληρου του εικοσιτετραώρου 25,26,27. Έτσι, μετράται η συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό (P) σε mg/dl, η συγκέντρωση της κρεατινίνης των ούρων (U) σε mg/dl και ο όγκος των ούρων του εικοσιτετραώρου σε ml/24ωρο, οπότε η κάθαρση της κρεατινίνης (CrCl σε ml/min) δίνεται από τη σχέση 28,29 : CrCl = U/P V Ενώ τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρησιμοποίηση του παραπάνω τύπου εκτιμούν ικανοποιητικά τη νεφρική λειτουργία, στην καθημερινή κλινική πράξη συναντούμε αρκετές δυσκολίες κυρίως σε σχέση με τη συλλογή των ούρων του εικοσιτετραώρου. Έτσι, οι πλέον διαδεδομένες εξετάσεις για την εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας, είναι η απλή μέτρηση της κρεατινίνης και της ουρίας του ορού. Η φυσιολογική τιμή της κρεατινίνης είναι από 0.7 έως 1.4 mg/dl και είναι ελαφρά μικρότερη στις γυναίκες. Η τιμή της κρεατινίνης αυξάνεται καθώς μειώνεται ο ΡΣΔ, και κατά συνέπεια η κάθαρση της κρεατινίνης. Για την εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας, μέσω της συγκέντρωσης της κρεατινίνης του ορού, ως προϋπόθεση λαμβάνεται το ότι η έκκριση της κρεατινίνης (ΡΣΔ Συγκέντρωση κρεατινίνης ορού) ισούται με την παραγωγή της κρεατινίνης, και ότι η παραγωγή κρεατινίνης είναι σχετικά σταθερή, για μία συγκεκριμένη δίαιτα 28,29,30,31. Κατά συνέπεια ισχύει: ΡΣΔ Συγκέντρωση κρεατινίνης ορού = σταθερή Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η συγκέντρωση της κρεατινίνης του ορού είναι αντιστρόφως ανάλογη του ΡΣΔ. Εάν για παράδειγμα ο ΡΣΔ μειωθεί στο 50%, η απέκκριση της κρεατινίνης αρχικά θα μειωθεί. Αυτό θα οδηγήσει σε κατακράτηση της κρεατινίνης, και η συγκέντρωσή της στον ορό θα αυξηθεί, έως ότου να διπλασιαστεί 21

22 και σε αυτό το σημείο, το διηθούμενο φορτίο θα ισούται και πάλι με την απέκκριση 28,29,30,31,32 : ΡΣΔ/2 (2 Creat ορού) = ΡΣΔ Creat ορού= σταθερή 1.3 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ Οι νεφροί των επίμυων παρουσιάζουν πολλά κοινά μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά με τους νεφρούς άλλων θηλαστικών καθώς και με του ανθρώπου. Βρίσκονται οπισθοπεριτοναϊκά και διαφέρουν, όσον αφορά την ανατομική τους θέση, από αυτή στον άνθρωπο, στο ότι ο επίμυς, έχει τον αριστερό νεφρό υψηλότερα του δεξιού, λόγω πίεσης που δέχεται από το μείζον γαστρικό τόξο. Μια σημαντική ακόμη μορφολογική διαφορά μεταξύ ανθρώπου και επίμυος, είναι η ύπαρξη μόνο μίας νεφρικής θηλής, και ως εκ τούτου, η νεφρική πύελος εμφανίζεται ενιαία, χωρίς τον σχηματισμό νεφρικών καλύκων. 33 Όπως και στα άλλα θηλαστικά, το νεφρικό παρέγχυμα διακρίνεται σε φλοιό και μυελό. Βασική λειτουργική μονάδα αποτελεί ο νεφρώνας που αποτελείται κυρίως από την σπειραματική συσκευή, το μαλπιγγιανό σωμάτιο, το εγγύς και το άπω εσπειραμένο σωληνάριο. Η αρτηριακή παροχή του νεφρού του επίμυος επιτελείται από τις νεφρικές αρτηρίες, οι οποίες εκφύονται από το πλάγιο τοίχωμα της κατιούσας αορτής και οι οποίες δίνουν τις μεσολόβιες αρτηρίες, που φέρονται ανάμεσα στις νεφρικές πυραμίδες και μεταπίπτουν στις τοξοειδείς αρτηρίες. Από τις τελευταίες εκπορεύονται οι μεσολοβίδιες αρτηρίες, που φέρονται ανάμεσα στις μυελώδεις ακτίνες και δίνουν τα προσαγωγά αρτηρίδια. Οι φλέβες του νεφρού διακρίνονται κατά σειρά, στις αστεροειδείς, τις μεσολοβίδιες, τις τοξοειδείς, και τις μεσολόβιους. Οι τελευταίες, ενώνονται και σχηματίζουν σε κάθε νεφρό, τη μονοφυή νεφρική φλέβα, που εκβάλλει στην κάτω κοίλη φλέβα. 34 Ο νεφρός στον επίμυ έχει ως κύρια λειτουργία τον σχηματισμό και την απέκκριση των ούρων και της διαλυμένης σε αυτά ουρίας, καθώς και άλλων αζωτούχων υποπροϊόντων του μεταβολισμού, όπως είναι το ουρικό οξύ. Στον επίμυ, όπως και σε άλλα κατώτερα θηλαστικά, οι νεφροί απεκκρίνουν και αλλαντοΐνη, που αποτελεί προϊόν του περαιτέρω μεταβολισμού του ουρικού οξέος. Επιπλέον, μέσω της διαδικασίας αραίωσης ή συμπύκνωσης των παραγόμενων ούρων, παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του ισοζυγίου ύδατος και ηλεκτρολυτών. 33,34,35 22

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΛΕΠΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ 2.1.ΑΝΑΤΟΜΙΑ Το λεπτό έντερο είναι το μεγαλύτερο σε μήκος τμήμα του πεπτικού σωλήνα. Το μήκος του στο ζώντα ενήλικα κυμαίνεται γύρω στα 3-5 μ., ενώ σε πτωματικό παρασκεύασμα φτάνει μέχρι και τα 7 μ. Παρά το γεγονός ότι το λεπτό έντερο είναι 4-5 φορές μεγαλύτερο σε μήκος από το παχύ έντερο, την ονομασία του τη δικαιολογεί η μικρότερή του διάμετρος σε σχέση με το παχύ, η οποία φτάνει μόλις στα 2,5-3 εκ. Το λεπτό έντερο οι έλικες του οποίου καταλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος της κοιλιακής κοιλότητας, αρχίζει αμέσως μετά τον πυλωρικό σφιγκτήρα και τελειώνει στην ειλεο-τυφλική συμβολή. Υποδιαιρείται σε τρία διαφορετικά ανατομικά και λειτουργικά τμήματα: το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό. 36 Το δωδεκαδάκτυλο αποτελεί το πρώτο και ευρύτερο τμήμα του λεπτού εντέρου, το οποίο βρίσκεται ανατομικά σε άμεση σχέση με το πάγκρεας. Με εξαίρεση τα πρώτα 2-5 εκ., το δωδεκαδάκτυλο βρίσκεται σχεδόν ολόκληρο στον οπισθοπεριτοναϊκό χώρο, στο οπίσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Για περιγραφικούς λόγους το δωδεκαδάκτυλο διαιρείται σε τέσσερεις μοίρες: 1) την πρώτη μοίρα ή άνω (βολβός), η οποία βρίσκεται ως επί τω πλείστον ενδοπεριτοναϊκώς και περιβάλλεται από τον ηπατοδωδεκαδακτυλικό σύνδεσμο, 2) την κατιούσα ή δεύτερη μοίρα, στο έσω τοίχωμα της οποίας εκβάλλουν ο χοληδόχος και ο παγκρεατικός πόρος, 3) την οριζόντια ή τρίτη ή προαορτική μοίρα και 4) την ανιούσα ή τέταρτη μοίρα, η οποία καταλήγει στη νηστιδο-δωδεκαδακτυλική καμπή και κατά την οποία το λεπτό έντερο επανέρχεται μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα. 39 Για λόγους ευκολίας νήστιδα και ειλεός θα περιγραφούν μαζί καθώς αποτελούν τα πιο πολυέλικτα τμήματα, καλύπτονται πλήρως από περιτόναιο και δεν υπάρχει σαφές διαχωριστικό όριο μεταξύ τους μακροσκοπικά. Ωστόσο τα χαρακτηριστικά γνωρίσματά τους μεταβάλλονται σταδιακά. Έτσι η νήστιδα είναι περισσότερο αγγειοβριθής και ερυθρωπή και εντοπίζεται συνήθως στην ομφαλική χώρα της κοιλίας, ενώ ο ειλεός καταλαμβάνει το μεγαλύτερο τμήμα της κάτω κοιλίας. Στο 2% περίπου του πληθυσμού, στο λεπτό έντερο παρατηρείται το εκκόλπωμα του Μέκελ. Το τελικό τμήμα του ειλεού εντοπίζεται συνήθως στη μείζονα πύελο και περνάει πάνω από τον μείζονα ψοϊτη μυ και τα δεξιά λαγόνια αγγεία για να εκβάλλει στο τυφλό. Η ειλεοτυφλική βαλβίδα είναι 23

24 ένας μυϊκός σφιγκτηριακός σχηματισμός, ο οποίος βρίσκεται στη συμβολή του λεπτού εντέρου και συγκεκριμένα στο περιφερικότερο άκρο του ειλεού και του παχέος εντέρου, του τυφλού. Βρίσκεται στη οπίσθια έσω πλευρά του τυφλού, στο όριο της μετάπτωσης του τυφλού στο ανιόν κόλον. 36,37,38,39 Αγγείωση Το δωδεκαδάκτυλο προέρχεται από το πρόσθιο και το μέσο έντερο του εμβρύου, γι αυτό και έχει πλούσια αγγείωση, καθώς δέχεται αίμα από την κοιλιακή αρτηρία (του προσθίου εντέρου) και την άνω μεσεντέρια αρτηρία (του μέσου εντέρου). Οι κύριες αρτηρίες του δωδεκαδακτύλου είναι η άνω και η κάτω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική. Οι φλέβες του δωδεκαδακτύλου, γενικά, ακολουθούν τις αρτηρίες και εκβάλλουν μέσω της άνω μεσεντερίου φλέβας στην πυλαία. Ωστόσο, κάποιες εκβάλλουν απ ευθείας σε αυτή. Οι αρτηρίες της νήστιδας και του ειλεού εκφύονται από την άνω μεσεντέρια αρτηρία.. Νηστιδικές και ειλεϊκές αρτηρίες πορεύονται μεταξύ των δύο πετάλων του μεσεντερίου. Οι αρτηρίες ενώνονται και σχηματίζουν αγκύλες ή τόξα που λέγονται αρτηριακά τόξα. Από αυτά τα τόξα εκφύονται ευθεία αγγεία, τα οποία δεν αναστομώνονται μέσα στο μεσεντέριο, αλλά πορεύονται από τα αρτηριακά τόξα προς το μεσεντερικό χείλος του εντέρου, απ όπου φέρονται εναλλασσόμενα προς αντίθετες πλευρές του εντερικού τοιχώματος. Οι φλέβες της νήστιδας και του ειλεού διατάσσονται όπως και οι κλάδοι της άνω μεσεντερίου αρτηρίας και απάγουν το αίμα των ιδίων περιοχών, που αρδεύονται από αυτές. Κεντρικότερα η άνω μεσεντέρια φλέβα πορεύεται μπροστά και δεξιά της άνω μεσεντερίου αρτηρίας, στη ρίζα του μεσεντερίου. 36, Δομή του λεπτού εντέρου Το τοίχωμα του λεπτού εντέρου αποτελείται από τέσσερις χιτώνες 40 : α)τον ορογόνο, ο οποίος προέρχεται από το περισπλάχνιο πέταλο του περιτοναίου, β) το μυϊκό, ο οποίος εμφανίζει δύο στιβάδες από λείες μυϊκές ίνες, την έξω (επιμήκη) και την έσω (κυκλοτερή) γ) τον υποβλεννογόνιο, ο οποίος αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό και δ) τον βλεννογόνο, ο οποίος αποτελεί τον κυριότερο χιτώνα του λεπτού εντέρου, διότι από εκεί επιτελείται η απορρόφηση των υδρολυμένων θρεπτικών συστατικών της τροφής. 24

25 Ο βλεννογόνος αποτελείται από επιθήλιο, χόριο, βλεννογόνιο μυϊκή στιβάδα, λεμφοζίδια, πλάκες του Peyer και αδένες. Στον αυλό του εντέρου, ο βλεννογόνος δημιουργεί κυκλοτερείς πτυχές, οι οποίες φέρονται εγκάρσια. Αρχίζουν από την δεύτερη μοίρα του δωδεκαδακτύλου και φθάνουν μέχρι και την ειλεοκολική βαλβίδα. Στο δωδεκαδάκτυλο και στη νήστιδα οι κυκλοτερείς πτυχές είναι πυκνές και υψηλές και αυξάνουν κατά πολύ την απορροφητική επιφάνεια του βλεννογόνου του λεπτού εντέρου 41. Ο βλεννογόνος επίσης σχηματίζει λάχνες. Οι λάχνες είναι λεπτότατες προσεκβολές του χορίου του βλεννογόνου, βρίσκονται σε όλη την έκταση του λεπτού εντέρου και ο αριθμός τους υπολογίζεται σε Οι λάχνες συμβάλλουν στην αύξηση της απορροφητικής επιφάνειας του βλεννογόνου του λεπτού εντέρου. Αποτελούνται εξωτερικά από επιθήλιο και εσωτερικά από προσεκβολή του χορίου (σώμα). Μέσα στο σώμα βρίσκεται ένα αρτηρίδιο, το οποίο αναλύεται σε τριχοειδή, τα οποία εκβάλλουν σε ένα μικρό φλεβίδιο, που απάγει το αίμα στην άνω μεσεντέρια και τελικά στην πυλαία φλέβα. Επίσης στο χόριο φέρεται ένα λεμφικό αγγείο (χυλοφόρο αγγείο), το οποίο εκβάλλει στα λεμφαγγεία του βλεννογόνου. Στην λάχνη υπάρχουν και λείες μυϊκές ίνες, οι οποίες προέρχονται από την βλεννογόνιο μυϊκή στιβάδα. Οι λάχνες χρησιμεύουν για την απορρόφηση των προϊόντων της πέψης. Τα λίπη με τα χυλοφόρα αγγεία φέρονται στο μείζονα θωρακικό πόρο. Η μεταφορά των λοιπών ουσιών γίνεται με τα αιμοφόρα αγγεία και από εκεί με την πυλαία φλέβα στο ήπαρ. Τα μονήρη λεμφοζίδια βρίσκονται διάσπαρτα στο βλεννογόνο του λεπτού εντέρου, συνίστανται από συσσώρευση κυττάρων τα οποία ανήκουν στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα και εδράζονται στο χόριο του βλεννογόνου ή βαθύτερα στον υποβλεννογόνιο χιτώνα και εν μέρει στο επιθήλιο. Ο αριθμός τους είναι ποικίλος και βρίσκονται περισσότερα στον ειλεό παρά στη νήστιδα. Το επιθήλιο το οποίο καλύπτει τα μονήρη λεμφοζίδια, παρουσιάζει διαφορές σε σχέση με το υπόλοιπο επιθήλιο του βλεννογόνου του εντέρου. Τα απορροφητικά κυλινδρικά κύτταρα του επιθηλίου είναι χαμηλότερα, τα καλυκοειδή κύτταρα είναι σπάνια, ενώ παρατηρείται αφθονία κυττάρων τύπου Μ3. Τα μονήρη λεμφοζίδια αποτελούν τον πρώτο μηχανισμό διήθησης διαφόρων αντιγονικών παραγόντων και αυτήν τη λειτουργία εξυπηρετεί η επικοινωνία τους με τα χυλοφόρα αγγεία. 42 Οι πλάκες του Peyer είναι οργανωμένες συλλογές λεμφοειδών θυλάκων στο λεπτό και παίζουν βασικό ρόλο στην εντερική ανοσολογική αντίδραση. Τα λεμφοκύτταρα των πλακών του Peyer μετά την ενεργοποίηση από τα εντερικά αντιγόνα μεταναστεύουν στη βασική μεμβράνη και στην ενδοεπιθηλιακή περιοχή. Το επιθήλιο 25

26 του λεμφοζιδίου καλύπτει τις πλάκες του Peyer και φέρει περιοχές με μικρή ποσότητα επιμήκων κυττάρων, τα οποία παράγουν βλέννα, περιέχει δε τα M κύτταρα, τα οποία εντοπίζονται ανάμεσα στα κυλινδρικά εντεροκύτταρα σχηματίζοντας κυτταροπλασματικές γέφυρες, οι οποίες διαχωρίζουν τα λεμφοκύτταρα των πλακών του Peyer από τον εντερικό αυλό. Οι πλάκες του Peyer, τα λεμφικά κύτταρα της βασικής μεμβράνης (LPL) και τα ενδοεπιθηλικά λεμφοκύτταρα (IEL) σχηματίζουν το βλεννογόνιο ανοσολογικό σύστημα του εντέρου 42. Αδένες του λεπτού εντέρου Οι αδένες του λεπτού εντέρου διακρίνονται στους αδένες του Lieberkuhn και στους δωδεκαδακτυλικούς αδένες του Brunner 43. Σε ολόκληρη την επιφάνεια του βλεννογόνου του λεπτού εντέρου υπάρχουν μικρά βοθρία, οι κρύπτες του Lieberkuhn. Τα επιθηλιακά κύτταρα των κρυπτών αυτών παράγουν εντερικό υγρό με ρυθμό περίπου ml/24ωρο. Το ph του υγρού αυτού είναι ελαφρώς αλκαλικό (κυμαινόμενο από 7,5 ως 8,0) και επαναρροφάται γρήγορα από τις λάχνες του εντέρου. Για τον ακριβή μηχανισμό, με τον οποίο προκαλείται η εκσεσημασμένη έκκριση υδαρούς υγρού από τις κρύπτες του Lieberkuhn, ευθύνεται η ενεργητική έκκριση ιόντων χλωρίου και η ενεργητική έκκριση διττανθρακικών. Με την έκκριση αυτών των ιόντων (και ιδιαίτερα των ιόντων χλωρίου) προκαλείται μετακίνηση επιπλέον ιόντων νατρίου διαμέσου της μεμβράνης, με αποτέλεσμα όλα αυτά τα ιόντα να προκαλούν οσμωτική μετακίνηση του νερού. Οι αδένες του Brunner, οι οποίοι υπάρχουν μεταξύ πυλωρού και φύματος του Vater παράγουν βλέννα. Αυτό είναι αποτέλεσμα διαφόρων μηχανισμών: α) απτικών ή διεγερτικών ερεθισμάτων τα οποία επιδρούν στον υπερκείμενο βλεννογόνο, β) διέγερση του πνευμονογαστρικού, η οποία προκαλεί συγχρόνως και αύξηση της έκκρισης γαστρικού υγρού και γ) επίδραση γαστρεντερικών ορμονών (εκκριματίνης, γαστρίνης, σωματοστατίνης και πεπτίδιου ΥΥ). Η βλέννη η οποία εκκρίνεται από τους αδένες Brunner, συμβάλλει στην προστασία του δωδεκαδακτυλικού επιθηλίου από τη δυνητικά καταστροφική επίδραση του όξινου γαστρικού περιεχομένου 42, Ιστολογικά στοιχεία του βλεννογόνου του λεπτού εντέρου Το επιθήλιο του λεπτού εντέρου είναι μονόστιβο κυλινδρικό και διακρίνεται στο επιθήλιο των λαχνών και στο επιθήλιο που καλύπτει τις εντερικές κρύπτες

27 Το επιθήλιο των λαχνών παρουσιάζει δύο είδη κυττάρων, τα απορροφητικά, τα οποία είναι τα περισσότερα και τα καλυκοειδή. Τα απορροφητικά είναι υψηλά κυλινδρικά κύτταρα με ραβδιδιωτή παρυφή. Καλύπτονται από το γλυκοκάλυκα, ο οποίος είναι ένα ηωσινόφιλο στρώμα στην ενδοαυλική επιφάνεια των απορροφητικών κυττάρων, το οποίο παράγεται και ανανεώνεται συνεχώς από αυτά. Μέσα στο γλυκοκάλυκα περιέχονται ένζυμα και ο εκκριτικός παράγοντας της ανοσοσφαιρίνης Α. Η ραβδιδιωτή παρυφή των απορροφητικών κυττάρων αντιστοιχεί στις μικρολάχνες, οι οποίες σχηματίζονται ενδοαυλικά από προσεκβολές της κυτταρικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την αύξηση της απορροφητικής επιφάνειας. Το σύμπλεγμα μικρολαχνώνγλυκοκάλυκα χρησιμεύει τόσο στην τελική διεργασία της πέψης, όσο και στους αμυντικούς μηχανισμούς του οργανισμού 40,41. Ανάμεσα στα απορροφητικά κύτταρα διακρίνονται τα καλυκοειδή κύτταρα, τα οποία αποτελούν μονοκύτταρους αδένες, οι οποίοι παράγουν ουδέτερες και όξινες βλέννες. Επίσης στο επιθήλιο των λαχνών σπάνια παρατηρούνται εντεροενδοκρινικά κύτταρα και συχνότερα ενδοεπιθηλιακά λεμφοκύτταρα 42. Αύξηση των τελευταίων παρατηρείται σε παθήσεις του εντέρου όπως η κοιλιοκάκη και η λαμβλίαση 42. Στο επιθήλιο των κρυπτών αναγνωρίζονται τα αδιαφοροποίητα επιθηλιακά μητρικά κύτταρα (stem cells), από τα οποία διαφοροποιούνται οι 4 τύποι των κυττάρων του εντερικού επιθηλίου 40,42,43. Αυτά είναι τα απορροφητικά (υψηλά κυλινδρικά), τα καλυκοειδή, τα κύτταρα Paneth και τα εντεροενδοκρινικά κύτταρα 44. Τα κύτταρα Paneth βρίσκονται μόνο στις εντερικές κρύπτες, περιέχουν λυσοζύμη, πρωτεολυτικά ένζυμα, ανοσοσφαιρίνες και συμμετέχουν στην πέψη των τροφών και στη ρύθμιση της εντερικής χλωρίδας. Τα εντεροενδοκρινικά κύτταρα εντοπίζονται κυρίως στο κατώτερο 1/3 των κρυπτών, αλλά μπορούν να ανευρεθούν και στις λάχνες. Είναι διασκορπισμένα μεταξύ των απορροφητικών κυττάρων, ανανεώνονται από τα αδιαφοροποίητα επιθηλιακά μητρικά κύτταρα (stem cells) και νευρώνονται από νεύρα του αυτόνομου νευρικού συστήματος. Έχουν σχήμα πυραμίδας, η κορυφή τους στρέφεται προς τον αυλό του εντέρου και στις επιφάνειές τους υπάρχουν υποδοχείς. Το κυτταρόπλασμα τους περιέχει νευροενδοκρινή κοκκία, τα οποία εκκρίνουν ορμόνες και πεπτίδια. Τα ενδοκρινικά κύτταρα, τα οποία εντοπίζονται κυρίως στο δωδεκαδάκτυλο και στη νήστιδα, παράγουν χολοκυστοκινίνη, εκκριματίνη, μοτιλίνη και άλλες πεπτιδικές ορμόνες 44. Τα ενδοκρινικά κύτταρα, τα οποία εντοπίζονται στον ειλεό, παράγουν εντερογλουκαγόνο, ουσία P και νευροτενσίνη 39,44. Σε όλο το μήκος του λεπτού εντέρου 27

28 βρίσκονται διάσπαρτα εντεροενδοκρινικά κύτταρα, τα οποία παράγουν σεροτονίνη (εντεροχρωμαφινικά κύτταρα ) και σωματοστατίνη ( D κύτταρα ). Πεπτικά Ένζυμα: Τα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου, και ιδιαίτερα αυτά που επικαλύπτουν τις λάχνες, περιέχουν πεπτικά ένζυμα 43, με τα οποία υδρολύονται συστατικά της τροφής. Τα ένζυμα αυτά είναι τα ακόλουθα: (1) πεπτιδάσες για την διάσπαση μικρών πεπτιδίων προς αμινοξέα (2) δισακχαριδάσες ( ιμβερτάση, μαλτάσηισομαλτάση και λακτάση) για την διάσπαση δισακχαριτών προς μονοσακχαρίτες και (3) εντερική λιπάση, για την διάσπαση ουδετέρου λίπους σε γλυκερόλη και λιπαρά οξέα. Τα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία βρίσκονται στο βάθος των κρυπτών του Lieberkuhn, υφίστανται συνεχείς μιτώσεις και τα καινούργια κύτταρα μεταναστεύουν κατά μήκος της βασικής μεμβράνης προς τις κορυφές των λαχνών, από όπου τελικά απορρίπτονται προς τον αυλό του εντέρου 45,46. Ο κύκλος ζωής επιθηλιακού κυττάρου του εντερικού βλεννογόνου είναι 5 ημέρες περίπου 45. Η έκκριση από το λεπτό έντερο επιτελείται ως απάντηση στην παρουσία χυμού τροφής. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσό του χυμού τόσο αφθονότερη είναι και η έκκριση. Η έκκριση του εντερικού υγρού ρυθμίζεται από διάφορα ερεθίσματα, τα σημαντικότερα από τα οποία είναι νευρικά αντανακλαστικά (ιδιαίτερα αυτά τα οποία εκλύονται με απτικά ερεθίσματα), καθώς και με αύξηση της νευρικής δραστηριότητας του εντέρου, η οποία συμβάλλει στις κινήσεις του γαστρεντερικού σωλήνα 43. Ο γαστρεντερικός σωλήνας διαθέτει τοπικό νευρικό σύστημα, το οποίο εκτείνεται σε όλο το έντερο αρχίζοντας από τον οισοφάγο και καταλήγει στον πρωκτό. Η λειτουργία του γαστρεντερικού σωλήνα ελέγχεται άμεσα από το εντερικό νευρικό σύστημα, διαμέσου των νευρώνων τους οποίους περιέχει 43,46. Από τις νευρικές απολήξεις των εντερικών νευρώνων απελευθερώνονται νευροδιαβιβαστικές ουσίες 42,43. Η ακετυλοχολίνη διεγείρει την κινητικότητα του γαστρεντερικού σωλήνα και η νορεπινεφρίνη την αναστέλλει. Άλλες νευροδιαβιβαστικές ουσίες, οι οποίες αποτελούν μίγμα από διεγερτικούς και ανασταλτικούς παράγοντες, είναι η τριφωσφορική αδενοσίνη, η σεροτονίνη, η ντοπαμίνη, η χολοκυστοκινίνη, η ουσία P, το αγγειοδραστικό εντερικό πολυπεπτίδιο, η σωματοστατίνη, η εγκεφαλίνη και η βομβεσίνη 47,48. Το τοπικό εντερικό νευρικό σύστημα αποτελείται κυρίως από δύο πλέγματα 43 α) Το εξωτερικό νευρικό πλέγμα (μυεντερικό πλέγμα ή πλέγμα Auerbach), το οποίο βρίσκεται μεταξύ της επιμήκους και κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας και ελέγχει κυρίως τις κινήσεις του γαστρεντερικού σωλήνα 28

29 β) Το εσωτερικό πλέγμα (υποβλεννογόνιο πλέγμα ή πλέγμα του Meissner), το οποίο βρίσκεται στον υποβλενογγόνιο χιτώνα και ελέγχει κυρίως την έκκριση και την τοπική αιμάτωση του γαστρεντερικού σωλήνα Εικόνα 2: Σχηματική παράσταση της ιστολογικής εικόνας του τοιχώματος του εντέρου Αισθητικές νευρικές απολήξεις αρχίζουν από το επιθήλιο του γαστρεντερικού σωλήνα ή το εντερικό τοίχωμα και φέρονται ως κεντρομόλες ίνες προς τα δύο πλέγματα, καθώς επίσης και προς τα προσπονδυλικά γάγγλια του νευρικού συστήματος. Μερικές από τις ίνες αυτές δια μέσου των συμπαθητικών νεύρων φέρονται προς τον νωτιαίο μυελό, ενώ άλλες με τα πνευμονογαστρικά νεύρα φέρονται στο εγκεφαλικό στέλεχος. Με τα αισθητικά αυτά νεύρα επιτελούνται αντανακλαστικά στο τοίχωμα του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς και με κέντρα, τα οποία βρίσκονται στα προσπονδυλικά γάγγλια ή μέσα στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Συμπαθητικές και παρασυμπαθητικές ίνες συνδέονται και με τα δύο πλέγματα. Η διέγερση του παρασυμπαθητικού δια μέσου των πνευμονογαστρικών νεύρων προκαλεί γενική αύξηση της δραστηριότητας ολοκλήρου του γαστρεντερικού νευρικού συστήματος, ενώ η διέγερση του συμπαθητικού νευρικού συστήματος αναστέλλει την κινητικότητα του γαστρεντερικού σωλήνα. Γενικότερα, αν και το εντερικό νευρικό σύστημα μπορεί να λειτουργεί αυτοτελώς, ανεξάρτητα από την εξωγενή νεύρωση, η διέγερση τόσο του συμπαθητικού όσο και του παρασυμπαθητικού μπορεί να ενεργοποιεί περαιτέρω ή και να αναστέλλει τις λειτουργίες του γαστρεντερικού σωλήνα. 29

30 Ορμόνες λεπτού εντέρου Οι ορμόνες του πεπτικού συμβάλλουν στη διαδικασία της θρέψης. Επηρεάζουν την έκκριση, την απορρόφηση, την κινητικότητα και τη ροή του αίματος στο γαστρεντερικό σωλήνα και το πάγκρεας. Η κλινική τους σημασία είναι μεγάλη 47 και συμβάλλουν σημαντικά στην εκδήλωση διαφόρων γαστρεντερικών νοσημάτων και κακοηθειών. 48 Η δράση τους επιτυγχάνεται με την έκκρισή τους στην κυκλοφορία του αίματος, οπότε δρουν ως κλασικές ορμόνες, ή με την έκκρισή τους στο μεσοκυττάριο υγρό, οπότε δρουν ως τοπικές ορμόνες 43 ή με έκλυσή τους τοπικά ως νευροδιαβιβαστές ή νευρορυθυμιστές 43,46,49. Βιολογικά ενεργά πεπτίδια με λιγότερα από 100 αμινοξέα, συγκροτούν τη μεγαλύτερη ομάδα διαβιβαστικών μορίων του γαστρεντερικού σωλήνα. Τα περισσότερα γνωστά πεπτίδια εκκρίνονται από νευρώνες, οι οποίοι ευρίσκονται μέσα στον πεπτικό σωλήνα ή έξω σε συμπαθητικούς και παρασυμπαθητικούς νευρώνες 50,51. Εξαίρεση αποτελούν η εκκριματίνη και η γαστρίνη, οι οποίες εντοπίζονται κυρίως σε ενδοκρινικά κύτταρα του εντέρου και του στομάχου. Μερικά πεπτίδια, όπως η χολοκυστοκινίνη και η σωματοστατίνη ανευρίσκονται τόσο σε ενδοκρινικά κύτταρα όσο και σε νευρώνες και έχουν διττή λειτουργία ως ορμόνες και ως νευροδιαβιβαστές 49,51. Άλλα πεπτίδια λειτουργούν κυρίως ως νευροπεπτίδια, όπως το νευροπεπτίδιο Y, η ουσία P, η εγκεφαλίνη, το πεπτίδιο το οποίο ελευθερώνει τη γαστρίνη (GRP) και το πεπτίδιο το σχετιζόμενο με το γονίδιο της καλσιτονίνης (CGRP). Τα πεπτίδια επιτυγχάνουν την δράση τους μέσω υποδοχέων, οι οποίοι βρίσκονται στις κορυφαίες επιφάνειες των επιθηλιακών κυττάρων του πεπτικού σωλήνα ΤΟ ΛΕΠΤΟ ΕΝΤΕΡΟ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ Ανατομία-ιστολογία-φυσιολογία Το λεπτό έντερο του επίμυος βάρους gr, έχει μήκος από εκ. 52 και τα βασικά του αδρά ανατομικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα είναι παρόμοια με αυτά των περισσοτέρων θηλαστικών. Έτσι διακρίνεται σε δωδεκαδάκτυλο, νήστιδα και ειλεό, με τα πρώτα δύο τμήματα να εμφανίζουν παχύτερο και περισσότερο αγγειοβριθές τοίχωμα, σε σύγκριση με αυτό του τελευταίου τμήματος. Τα διάφορα στάδια της διάπλασης του εντερικού σωλήνα είναι παρόμοια με αυτά του ανθρώπου, με τη δημιουργία αρχικά της πρωτογενούς εντερικής έλικας και στη συνέχεια την εμφάνιση των δευτερογενών ελίκων, οι οποίες επιστρέφουν ενδοπεριτοναϊκά καταλαμβάνοντας την τελική τους θέση μετά από ανθωρολογιακή στροφή με άξονα περιστροφής την αρχέγονη άνω μεσεντέριο αρτηρία 52 30

31 ΜΗΚΟΣ(mm) ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ(mm) Δωδεκαδάκτυλο Νήστιδα Ειλεός Τυφλό Κόλον πρωκτικός σωλήνας (Μήκος παχέος εντέρου) ΣΥΝΟΛΟ Πίνακας 1: Μήκος και διάμετρος των επιμέρους τμημάτων του εντέρου στον επίμυ 18 Το τοίχωμα του λεπτού εντέρου στον επίμυ αποτελείται από τέσσερις χιτώνες, οι οποίοι από έξω προς τα μέσα είναι οι εξής: α) ο ορoγόνoς χιτώνας, β) ο μυϊκός χιτώνας, που αποτελείται από δύο στιβάδες λείων μυϊκών ινών, την έξω επιμήκη και την έσω κυκλοτερή, γ) ο υποβλεννογόνιος χιτώνας, που αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό και περιέχει αγγεία και λεμφαγγεία και δ) ο βλεννογόνος. Στον αυλό του λεπτού εντέρου παρατηρούνται πλήρεις και ατελείς κυκλοτερείς πτυχώσεις ολόκληρου του βλεννογόνου και της βλεννογόνιας μυϊκής στοιβάδας και τα αγελαία λεμφοζίδια, ή πλάκες του Payer. Τον βλεννογόνο του λεπτού εντέρου αποτελούν το επιθήλιο, το χόριο και η βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα. Η επιθηλιακή επιφάνεια εμφανίζει τις λάχνες και τις κρύπτες. Οι λάχνες επενδύονται από υψηλό κυλινδρικό επιθήλιο, το οποίο περιβάλλει έναν άξονα από συνδετικό ιστό, που αποτελεί τμήμα της βασικής στοιβάδας. Κάθε λάχνη περιέχει ένα κεντρικό λεμφαγγείο, ένα αρτηριόλιο, ένα φλεβίδιο και ένα τριχοειδικό δίκτυο. 52 Η αρτηριακή παροχή του λεπτού εντέρου επιτελείται κατά κύριο λόγο από την άνω μεσεντέριο αρτηρία, η οποία εκφύεται από την κατιούσα αορτή κάτωθεν του σημείου έκφυσης του κοιλιακού άξονα. Πρόκειται για ένα ευμέγεθες μονήρες αρτηριακό στέλεχος, που χορηγεί κλάδους προς το πάγκρεας, το λεπτό έντερο και προς τμήμα του παχέος εντέρου ως εξής: την κάτω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική αρτηρία, που φτάνει στο πάγκρεας και το δωδεκαδάκτυλο, την ειλεοκολική αρτηρία, που τροφοδοτεί τον τελικό ειλεό και το τυφλό, την δεξιά κολική αρτηρία, που τροφοδοτεί το ανιόν κόλον, 31

32 την μέση κολική αρτηρία, που τροφοδοτεί το εγκάρσιο κόλον και τους πολυάριθμους εντερικούς κλάδους για την άρδευση της νήστιδας και του ειλεού. Τα φλεβικά στελέχη του λεπτού εντέρου ακολουθούν τα αντίστοιχα αρτηριακά σχηματίζοντας την άνω μεσεντέρια φλέβα, η οποία εκβάλει στο σύστημα της πυλαίας κυκλοφορίας. Τα λεμφαγγεία εκβάλλουν στα μεσοκολικά λεμφογάγγλια. Η νεύρωση του λεπτού εντέρου στον επίμυ επιτυγχάνεται μέσω του μυεντερικού (μεταξύ επιμήκους και κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας) και υποβλεννογόνιου νευρικού πλέγματος. Το υποβλεννογόνιο νευρικό πλέγμα μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις επιμέρους στιβάδες, η βαθύτερη εκ των οποίων έρχεται σε άμεση ανατομική σχέση με την έσω επιφάνεια της κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας. Η λειτουργική σύνδεση μεταξύ μυϊκού και νευρικού ιστού επιτυγχάνεται μέσω ειδικών κυττάρων, που ονομάζονται διάμεσα και εντοπίζονται μεταξύ της βαθύτερης στιβάδας του υποβλεννογόνιου νευρικού πλέγματος και της κυκλοτερούς μυϊκής στιβάδας 52 Το λεπτό έντερο στον επίμυ, όπως και στον άνθρωπο, έχει ως κύρια λειτουργία την απορρόφηση του νερού και των θρεπτικών στοιχείων που περιέχει η τροφή, ενώ αντίστοιχη είναι και η κινητικότητά του, εκτελεί δηλαδή κινήσεις μίξεως, προωθήσεως και περισταλτικές. 52 (Α) (Β) Εικόνα 3: Ενδοκοιλιακά όργανα (Α) και μεσεντέριο (Β) σε επίμυ 32

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΑΣ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ 3.1.ΑΡΤΗΡΙΑΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ Η κοιλιακή αρτηρία εκφύεται σε γωνία 90 μοιρών από την αορτή στο ύψος του Θ 12 ή Ο 1 σπονδύλου. Η άνω μεσεντέριος αρτηρία (ΑΜΑ) εκφύεται 5 µε 15 mm κάτω από την κοιλιακή αρτηρία. Η κοιλιακή αρτηρία δίνει τους εξής κλάδους: την κοινή ηπατική αρτηρία, τη σπληνική και την αριστερή γαστρική. Η ηπατική αρτηρία δίνει τη γαστροδωδεκαδακτυλική αρτηρία, την κυρίως ηπατική, η οποία διακλαδίζεται στη δεξιά μέση και αριστερή ηπατική. Τούτη είναι η πιο συχνή ανατοµική εκδοχή και συναντάται στο 55% των ανθρώπων. Η δεξιά ηπατική είναι κλάδος της ΑΜΑ σε 11-16% των περιπτώσεων. Στο 25% των ανθρώπων η αριστερή ηπατική αρτηρία είναι κλάδος της αριστερής γαστρική ς αρτηρίας. 53 Η σπληνική αρτηρία έχει οφιοειδή πορεία και δίνει ως κλάδο τη ραχιαία παγκρεατική αρτηρία που αρδεύει το σώµα του παγκρέατος. Ένας κλάδος της ραχιαίας παγκρεατικής αρτηρίας ενώνεται µε το δίκτυο της ΑΜΑ και σχηματίζει το παγκρεατοδωδεκαδακτυλικό δίκτυο που αποτελεί σημαντικό σημείο επικοινωνίας μεταξύ του συστήματος της κοιλιακής αρτηρίας και της ΑΜΑ. Οι βραχείες γαστρικές αρτηρίες είναι κλάδοι της κύριας σπληνικής ή της άνω πολικής σπληνικής αρτηρίας. Η αριστερή γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία αποτελεί κλάδο της σπληνικής αρτηρίας πριν εισέλθει στην πύλη του σπλήνα. Στο 90% των ανθρώπων η αριστερή γαστροεπιπλοϊκή αναστομώνεται µε τη δεξιά η οποία αποτελεί κλάδο της γαστροδωδεκαδακτυλικής αρτηρίας. 53, Άνω Μεσεντέριος Αρτηρία (ΑΜΑ) Η ΑΜΑ εκφύεται σε γωνία μοιρών από την πρόσθια μοίρα της κοιλιακής αορτής στο ύψος του σώματος του Ο 1 σπονδύλου. Πορεύεται κάτω από την κάτω επιφάνεια του σώματος του παγκρέατος και μετά πάνω από την τρίτη μοίρα του δωδεκαδάκτυλου. Υπάρχουν σταθεροί και μεταβλητοί κλάδοι της ΑΜΑ. Σταθεροί κλάδοι είναι η κάτω παγρεατοδωδεκαδακτυλική, η μέση κολική, η δεξιά κολική, η ειλεοκολική και οι εντερικοί κλάδοι. Η κάτω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική είναι ο πρώτος κλάδος της ΑΜΑ. Επικοινωνεί µε την άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική, 33

34 κλάδο της γαστροδωδεκαδακτυλικής και σημαντικό σημείο επικοινωνίας μεταξύ συστήματος ΑΜΑ και κοιλιακής αρτηρίας. Η μέση κολική (ΜΚ) αποτελεί το δεύτερο κλάδο της ΑΜΑ. Ο δεξιός κλάδος της ΜΚ αναστομώνεται µε τον ανερχόμενο κλάδο της δεξιάς κολικής αρτηρίας και µε τον αριστερό κλάδο της ΜΚ ή οποία προέρχεται από την κάτω μεσεντέριο αρτηρία (ΚΜΑ). Η τελευταία αποτελεί σημαντική επικοινωνία μεταξύ των συστημάτων της ΑΜΑ και ΚΜΑ. 53, Κάτω Μεσεντέριος Αρτηρία (ΚΜΑ) Εκφύεται από την αορτή στο ύψος του O 3 σπονδύλου. Διακλαδίζεται στην κάτω κολική, τρεις ή τέσσερις σιγµοειδικούς κλάδους και στην άνω ορθική αρτηρία. Η αριστερή κολική αρτηρία δίνει ανιόντες και κατιόντες κλάδους ΠΑΡΑΠΛΕΥΡΗ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΟΥ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ Παράπλευρη κυκλοφορία στη μεσεντέριο κυκλοφορία γίνεται μεταξύ: 1. Κοιλιακής αρτηρίας και ΑΜΑ 2. Κλάδων της ΑΜΑ 3. ΑΜΑ και ΚΜΑ 4. Κλάδων της ΚΜΑ 5. ΚΜΑ και κλάδων της έσω λαγονίου αρτηρίας Επικοινωνία Κοιλιακής και ΑΜΑ Οι άνω και κάτω παγκρεατοδωδεκαδακτυλικές αποτελούν την πιο σημαντική επικοινωνία μεταξύ των δύο συστημάτων. Αυτή διατηρεί αιμάτωση προς το ήπαρ και το στόμαχο σε περιπτώσεις πλήρους απόφραξης της κοιλιακής αρτηρίας. Σε σπάνιες περιπτώσεις υπάρχει άμεση επικοινωνία μεταξύ ΑΜΑ και κοιλιακής αρτηρίας µέσω αγγείου του Buehler, που αποτελεί υπόλειμμα επικοινωνίας κατά την εμβρυϊκή ζωή Επικοινωνία ΑΜΑ-ΚΜΑ Η πιο σημαντική επικοινωνία μεταξύ ΑΜΑ και ΚΜΑ γίνεται µε την επιχείλιο αρτηρία. Αυτή έχει διάφορες ονομασίες: αρτηρία του Riolan, του Treves, κεντρική αναστομωτική αρτηρία του κόλου. Η επιχείλιος αρτηρία συνδέει τον ανιόντα κλάδο της αριστερής κολικής αρτηρίας µε κλάδο 34

35 της ΑΜΑ που εκφύεται αμέσως πριν τη μέση κολική αρτηρία. Βρίσκεται στα 2/3 των ανθρώπων. Άλλη επικοινωνία ΑΜΑ-ΚΜΑ γίνεται µε την αρτηρία του Drummond που περιέγραψε ο Von Haller το Αυτή συνδέει τον αριστερό κλάδο της μέσης κολικής µε τον ανιόντα κλάδο της αριστερής κολικής. Στη σπληνική καμπή η αρτηρία αυτή ονομάζεται σημείο του Griffiths'. Ο Griffiths' είχε επισημάνει ότι η αναστόμωση μεταξύ μέσης κολικής και αριστερού κλάδου της κάτω μεσεντερίου μπορεί να είναι ανεπαρκής ή απούσα στο 5% των ασθενών. Ο ίδιος ανακάλυψε ότι η μέση κολική αρτηρία απουσιάζει στο 20% των ασθενών, τονίζοντας τη σημασία της δεξιάς κολικής και των υπογαστρικών αρτηριών όταν διαιρείται η ΚΜΑ Επικοινωνία ΚΜΑ και έσω λαγονίου Η άνω ορθική αρτηρία (κλάδος της ΚΜΑ) επικοινωνεί µε τη μέση και κάτω ορθική (κλάδοι της έσω λαγονίου). Με αυτόν τον τρόπο υπάρχει επικοινωνία μεταξύ συστηματικής και πυλαίας κυκλοφορίας. 53 Εικόνα 4: Άνω και κάτω μεσεντέριος αρτηρίες και κλάδοι τους 35

36 3.3. ΦΛΕΒΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ Το φλεβικό αίμα από το μεγαλύτερο μέρος του γαστρεντερικού σωλήνα και των προσαρτημένων σ αυτόν οργάνων φέρεται προς το ήπαρ με το σύστημα της πυλαίας φλέβας (πυλαίο φλεβικό σύστημα). Το αίμα αυτό περιέχει τα προϊόντα της πέψης, την παγκρεατική και «άλλη» ενδοκρινική έκκριση, καθώς και τα κατεστραμμένα ερυθρά από τον σπλήνα. Οι φλέβες από τα αρχικά τμήματα του γαστρεντερικού σωλήνα εκβάλλουν απευθείας στην πυλαία φλέβα, αλλά οι φλέβες των κατώτερων τμημάτων του γαστρεντερικού σωλήνα αντιστοιχούν προς τους κλάδους της κοιλιακής αρτηρίας και της άνω και κάτω μεσεντέριας αρτηρίας Πυλαία φλέβα Η σημαντική αυτή φλέβα έχει μήκος περίπου 7 εκ. και σχηματίζεται πίσω από τον αυχένα του παγκρέατος από τη συνένωση της άνω μεσεντέριας και της σπληνικής φλέβας. Πορεύεται προς τα άνω και δεξιά, πίσω από την πρώτη μοίρα του δωδεκαδακτύλου και εισέρχεται στο έλασσον επίπλουν. Στη συνέχεια, περνώντας μπροστά από το επιπλοϊκό τρήμα, ανέρχεται προς τις πύλες του ήπατος όπου διαιρείται σε δεξιό και αριστερό τελικό κλάδο. Η πυλαία κυκλοφορία αρχίζει ως πλέγμα τριχοειδών αγγείων μέσα στα σπλάχνα, το αίμα των οποίων αποχετεύει και καταλήγει σε τριχοειδική κυκλοφορία μέσα στο ήπαρ. Η πυλαία φλέβα απάγει αίμα από το γαστρεντερικό σωλήνα, από το κατώτερο τμήμα του οισοφάγου ως το μέσο του πρωκτικού σωλήνα, καθώς επίσης από το πάγκρεας, τη χοληδόχο κύστη, τους χοληφόρους πόρους και το σπλήνα Αναστομώσεις της πυλαίας με τη συστηματική φλεβική κυκλοφορία (πυλαιοσυστηματικές αναστομώσεις) Υπό φυσιολογικές συνθήκες το αίμα της πυλαίας φλέβας περνά μέσα από το ήπαρ και φέρεται με τις ηπατικές φλέβες προς την κάτω κοίλη φλέβα της συστηματικής φλεβικής κυκλοφορίας. Αυτή είναι η άμεση οδός. Υπάρχουν όμως και άλλες μικρότερες επικοινωνίες ανάμεσα στην πυλαία και τη συστηματική κυκλοφορία, οι οποίες αποκτούν σημασία σε περιπτώσεις όπου η άμεση οδός επικοινωνίας έχει αποφραχθεί (πυλαία υπέρταση). Οι επικοινωνίες αυτές είναι οι παρακάτω: 1. Στο κατώτερο τριτημόριο του οισοφάγου οι οισοφαγικοί κλάδοι της αριστερής 36

37 γαστρικής ή στεφανιαίας φλέβας (η οποία ανήκει στο πυλαίο σύστημα) αναστομώνονται με τις οισοφαγικές φλέβες που αθροίζουν αίμα από το μεσαίο τριτημόριο του οισοφάγου και εκβάλλουν στις άζυγες φλέβες (οι οποίες ανήκουν στη συστηματική φλεβική κυκλοφορία της άνω κοίλης φλέβας). 2. Στο μέσο περίπου του πρωκτικού σωλήνα οι άνω αιμορροϊδικές φλέβες της πυλαίας κυκλοφορίας, οι οποίες αθροίζουν αίμα από το άνω ήμισυ του πρωκτικού σωλήνα, αναστομώνονται με τις μέσες και κάτω αιμορροϊδικές φλέβες, οι οποίες ανήκουν στη συστηματική κυκλοφορία της κάτω κοίλης φλέβας. 3. Οι παρομφάλιες φλέβες συνδέουν τον αριστερό τελικό κλάδο της πυλαίας με τις επιπολής φλέβες του πρόσθιου κοιλιακού τοιχώματος (οι οποίες ανήκουν στη συστηματική κυκλοφορία της άνω και κάτω κοίλης φλέβας). Οι παρομφάλιες φλέβες πορεύονται στο δρεπανοειδή σύνδεσμο του ήπατος κατά μήκος του στρόγγυλου συνδέσμου. 4. Οι φλέβες του ανιόντος κόλου, του κατιόντος κόλου, του δωδεκαδακτύλου, του παγκρέατος και του ήπατος (οι οποίες ανήκουν στο πυλαίο σύστημα) αναστομώνονται με τις νεφρικές, τις οσφυϊκές και τις φρενικές φλέβες (οι οποίες ανήκουν στη συστηματική φλεβική κυκλοφορία της κάτω κοίλης φλέβας) 55 Εικόνα 5: Πυλαίο φλεβικό σύστημα 37

38 3.4.ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΟΥ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ Ρύθμιση της ροής του αίματος στη μεσεντέριο κυκλοφορία Ο τόνος των λείων μυϊκών ινών των αρτηριολίων και φλεβολίων καθορίζει τη βασική ροή στη μεσεντέριο κυκλοφορία. Υπάρχει λεπτή ισορροπία ανάμεσα σε παράγοντες αγγειοσύσπασης και αγγειοδιαστολής στη ρύθμιση της ροής αυτής. Οι παράγοντες ρύθμισης της ροής χωρίζονται σε εξωγενείς και ενδογενείς Εξωγενείς Παράγοντες Οι πρωταρχικοί εξωγενείς παράγοντες είναι οι αιμοδυναµικοί, το αυτόνομο νευρικό σύστημα και οι νευροχυµικοί παράγοντες. Αιμοδυναµικοί παράγοντες είναι η αρτηριακή πίεση, η καρδιακή παροχή, ο όγκος αίματος. Η ελάττωση οποιουδήποτε από τους παραπάνω παράγοντες προκαλεί μείωση της αιματικής ροής. Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα ασκεί την κύρια επιρροή στη μεσεντέριο κυκλοφορία (ΜΚ). Οι περισσότεροι υποδοχείς στις λείες μυϊκές ίνες των αγγείων είναι α-υποδοχείς. Διέγερση του συμπαθητικού συστήματος προκαλεί αγγειοσύσπαση, αύξηση των αγγειακών αντιστάσεων και ελάττωση της ροής της ΜΚ. Αυτό παρατηρείται κατά τη σωματική άσκηση για τη μετατόπιση όγκου αίματος από τη μεσεντέριο στη συστηματική κυκλοφορία. Υπάρχει μεγάλη ποικιλία νευροχημικών παραγόντων που ασκούν επιρροή στη μεσεντέριο κυκλοφορία. Η νορεπινεφρίνη ενεργοποιεί τους α-υποδοχείς και προκαλεί αγγειοσύσπαση των μεσεντέριων αγγείων. Παρόµοια δράση ασκούν η μεθοξαµίνη, η μεταραµινόλη και η φαινυλεφρίνη (όλοι α-αδρενεργικοί ενεργοποιητές). Η ισοπροτερενόλη είναι β-αδρενεργικός διεγέρτης και προκαλεί αύξηση της ροής της ΜΚ. Η προπρανολόλη είναι β- αποκλειστής και ελαττώνει τη ροή της ΜΚ. Η επινεφρίνη σε χαμηλές δόσεις είναι β-διεγέρτης και προκαλεί αγγειοδιαστολή, ενώ σε υψηλότερες δόσεις η α-διεγερτική δράση υπερτερεί, προκαλώντας αγγειοσύσπαση και ελάττωση της ΜΚ ροής. Η ντοπαµίνη σε δόσεις κάτω από 10 µg/kg/mίn προκαλεί αγγειοδιαστολή, ενώ σε δόσεις μεγαλύτερες από 10 µg/kg/mίn προκαλεί αγγειοσύσπαση των μεσεντέριων αγγείων. Άλλες ουσίες που προκαλούν αγγειοδιαστολή είναι: η ισταμίνη, η σεροτονίνη (σε υψηλές δόσεις) και η βραδυκινίνη. Η βασοπρεσσίνη και η αγγειοτενσίνη ΙΙ είναι ουσίες που ασκούν 38

39 έντονη αγγειοσυσπαστική δράση. Η δράση της βασοπρεσσίνης είναι πιο έντονη στη ΜΚ παρά στη συστηματική κυκλοφορία. Τούτη η δράση είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην αντιμετώπιση αιμορραγίας του ανώτερου πεπτικού από πυλαία υπέρταση και κιρσούς οισοφάγου. Επίσης γαστρεντερικές και παγκρεατικές ορμόνες επηρεάζουν τη ροή της ΜΚ. Η πενταγαστρίνη, ανάλογο της γαστρίνης, προκαλεί αύξηση της ροής της ΜΚ. Η χολοκυστοκινίνη προκαλεί και σύσπαση και διαστολή σε διαφορετικές συνθήκες. Η σεκρετίνη προκαλεί αγγειοδιαστολή. Φάρμακα που προκαλούν αγγειοδιαστολή είναι η τολαζολίνη και η παπαβερίνη. Η παπαβερίνη είναι αναστολέας της φωφοδιεστεράσης, του ενζύμου που είναι υπεύθυνο για την κατάσπαση της camp, που ρυθμίζει τη χάλαση των λείων μυών των αγγείων και την αγγειοδιαστολή. Το νιτροπρωσσικό νάτριο προκαλεί αγγειοχάλαση. Άλλες ουσίες που προκαλούν αγγειοδιαστολή είναι η καφεΐνη, η αμινοφυλλίνη και η προσταγλανδίνη PGE 1. Η διγοξίνη προκαλεί σημαντικού βαθμού αγγειοσύσπαση και προδιάθεση για µη αποφρακτική μεσεντέριο ισχαιμία. Η εργοταμίνη, που χορηγείται για τη θεραπεία της ημικρανίας, μπορεί να προκαλέσει μεσεντέριο ισχαιμία (ΜΙ) Ενδογενής Ρύθμιση Οι κύριοι μηχανισμοί ενδογενούς ρύθμισης της ΜΚ είναι μεταβολικοί και μυογενείς. Οι μεταβολικοί μηχανισμοί οδηγούν σε αύξηση της ροής της ΜΚ όταν αυξάνουν οι μεταβολικές ανάγκες των ιστών. Συσσώρευση μεταβολιτών και ελάττωση στην τάση οξυγόνου προκαλούν αγγειοδιαστολή. Οι μυογενείς μηχανισμοί είναι εκείνοι που συμμετέχουν στην αυτορρύθμιση της ροής. Κατά αυτήν η ροή στη ΜΚ διατηρείται σταθερή όταν έχουμε μεγάλες μεταβολές της συστηματικής αρτηριακής πίεσης Ανταπόκριση στην Ισχαιμία Η διακοπή παροχής αίματος στη ΜΚ προκαλεί μεταβολικές και μορφολογικές αλλαγές στο έντερο. Μικροσκοπικές (ultrastructurall) αλλαγές παρατηρούνται στα κύτταρα του βλεννογόνου του εντέρου στα 10 λεπτά αποκλεισμού της ΑΜΑ. Στα 30 λεπτά παρατηρούνται εκτεταμένες βλάβες του επιθηλίου. Οι κύριες συνέπειες της μεσεντέριο ισχαιμίας ΜΙ είναι οίδημα του 39

40 διάμεσου ιστού του εντερικού τοιχώματος και μετακίνηση υγρού στον εντερικό αυλό. Τόσο η ισχαιμία όσο και η επαναιμάτωση (ΙΕ) προκαλούν αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδικών αγγείων του εντέρου. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που σχηματίζονται κατά την ΙΕ προκαλούν κυτταρικές βλάβες. Το ένζυμο ξανθίνη οξειδάση είναι πηγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου. Ουσίες που εξουδετερώνουν ελεύθερες ρίζες, όπως η υπεροξειδική δισµουτάση καθώς και ανταγωνιστές της ξανθίνης οξειδάσης (αλλοπουρινόλη) μπορούν να προστατεύσουν από τέτοιες βλάβες. 56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ Οι συνέπειες της στέρησης ενός οργάνου από την προσφορά αίματος έχουν αναγνωριστεί από καιρό ως κρίσιμος παράγοντας στην κλινική έκβαση καταστάσεων όπως του αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου, του εμφράγματος του μυοκαρδίου, της μεταμόσχευσης οργάνων καθώς και της ισχαιμίας των άκρων. Η έγκαιρη αποκατάσταση της ροής αίματος σε ένα ισχαιμικό ιστό ή όργανο είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μη-αναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Εντούτοις, όμως, η ίδια η επαναιμάτωση, αυτή καθ' εαυτή, μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών, συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Έτσι έχει παρατηρηθεί ότι οι ιστολογικές μεταβολές της βλάβης μετά από 3 ώρες ισχαιμίας του ήπατος ή του εντέρου που ακολουθείται από 1 ώρα επαναιμάτωσης, είναι πολύ χειρότερες από τις μεταβολές που παρατηρούνται μετά από 4 ώρες μόνο ισχαιμίας 57,58 Η κυτταρικές βλάβες καθώς και το σύνολο των αλλοιώσεων που παρατηρούνται μετά από επαναιμάτωση βιώσιμων ισχαιμικών ιστών ορίζονται ως σύνδρομο ισχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) 59. Το σύνδρομο ισχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) μπορεί να εμφανιστεί σε ποικίλες κλινικές καταστάσεις, όπως π.χ. μετά από θρομβολυτική θεραπεία, αγγειοπλαστική των στεφανιαίων, μεταμόσχευση οργάνων, καρδιοπνευμονική παράκαμψη καθώς και αρτηριακές επεμβάσεις. Η επαναιμάτωση των ισχαιμικών ιστών οδηγεί τόσο σε τοπική όσο και σε συστηματική φλεγμονώδη απάντηση η οποία, μπορεί στη συνέχεια, να οδηγήσει σε εκτεταμένη μικροαγγειακή δυσλειτουργία. Εάν μάλιστα είναι αρκετά σοβαρή, οι αλλοιώσεις μπορούν να επεκταθούν πέρα από την ισχαιμική περιοχή, με 40

41 κίνδυνο να προσβάλλουν και απομεμακρυσμένα μη-ισχαιμούντα όργανα, όπως πνεύμονες, μυοκάρδιο, ήπαρ ή νεφροί. Αποτέλεσμα είναι το Σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (systemic inflammatory response syndrome SIRS) ή ακόμη και το Σύνδρομο δυσλειτουργίας πολλών οργάνων (multiple organ dysfunction syndrome MODS), που ευθύνεται για το 30-40% της θνητότητας στις μονάδες εντατικής θεραπείας 60. Οι γνώσεις για την παθοφυσιολογία, τις κλινικές εκδηλώσεις και τις θεραπευτικές στρατηγικές για την πρόληψη ή τη θεραπεία του συνδρόμου ισχαιμίας επαναιμάτωσης (ΣΙΕ) συνεχώς εμπλουτίζονται από διάφορες πειραματικές αλλά και κλινικές μελέτες, ενώ συχνά αναθεωρούνται 61. Σίγουρα απαιτούνται αρκετές τυχαιοποιημένες μελέτες για να αποδειχθεί η ασφάλεια και αποτελεσματικότητα διαφόρων παραγόντων που χρησιμοποιούνται και εφαρμόζονται στη διαγνωστική και θεραπευτική παρέμβαση μας ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η περιγραφή της ισχαιμικής σύσπασης μετά από κάταγμα από τον Volkmann το 1881, ήταν πιθανότατα ο πρώτος προσδιορισμός μιας επιπλοκής σχετικής με τον ισχαιμικό μυ. Το 1926 ο Jepson κατέδειξε πειραματικά σε σκυλιά ότι η ίσχαιμη περίδεση του σκέλους ακολουθείται από οίδημα, και το 1945 ο Dennis αποσυμπίεσε τον οιδηματώδη μυ μετά από απολίνωση μηριαίας φλέβας με απονευροτομή. Η διάδοση, όμως, της απονευροτομής στην αντιμετώπιση του ισχαιμικού μυός με οίδημα ανήκει στους Patman, Poulos, και Shires που το 1964 περιέγραψαν 76 ασθενείς στους οποίους η απονευροτομή χρησιμοποιήθηκε για να αποσυμπιέσει τον οιδηματώδη μυ μετά από την αποκατάσταση των αρτηριακών τραυματισμών. Όσον αφορά τα συστηματικά αποτελέσματα της αποκατάστασης της αιμάτωσης στον ισχαιμικό ιστό, η εργασία του Cannon στη δεκαετία του 1920 για τους τοξικούς παράγοντες που σχετίζονται με την καταπληξία έθεσε τη βάση για την αναγνώριση των επιπλοκών της επαναιμάτωσης. Το 1937 οι Husveldt και Bjering περιέγραψαν τις νεφρικές βλάβες λόγω καταπληξίας. Εντούτοις, αυτές αποτελούσαν μεμονωμένες περιπτώσεις. Ο Bywaters επέστησε παγκοσμίως την προσοχή στο πρόβλημα της επαναιμάτωσης όταν δημοσίευσε μια μεγάλη κλινική εμπειρία με νεφρική ανεπάρκεια μετά από τραυματισμούς κατάχωσης των άκρων κατά τη διάρκεια των βομβαρδισμών του Λονδίνου στον 2 ο παγκόσμιο πόλεμο. Ο Bywaters επισήμανε ότι η καφέ χρωστική ουσία που εμφανίστηκε στα ούρα των ασθενών που πέθαναν με τη νεφρική ανεπάρκεια ήταν η μυοσφαιρίνη. 41

42 Το 1960, πρώτος ο Haimovici, τεκμηρίωσε τον κίνδυνο της αρτηριακής αποκατάστασης των ισχαιμικών άκρων και χρησιμοποίησε τότε τον όρο "μυονεφροπαθητικό-μεταβολικό σύνδρομο" για τη νεφρική ανεπάρκεια που ακολουθούσε την επαναιμάτωση των άκρων. Σχεδόν μία δεκαετία μετά παρατηρήθηκε ότι η θνητότητα άγγιζε το 85%, όταν γινόταν επαναιμάτωση σε ισχαιμικά άκρα με παράλυση. Η υψηλή αυτή θνητότητα αποδόθηκε σε καρδιοπνευμονικά αίτια ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Η ομοιόσταση του οξυγόνου αποτελεί θεμελιώδη παράγοντα στην ανθρώπινη φυσιολογία και τη διατήρηση της ζωής. Η ουσιαστική απαίτηση για την παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) μέσω οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ισορροπείται από τον κίνδυνο οξειδωτικής βλάβης στα κυτταρικά λιπίδια, τα νουκλεϊνικά οξέα και τις πρωτεΐνες. Κατά συνέπεια οι κυτταρικές και συστηματικές συγκεντρώσεις του οξυγόνου είναι στενά ρυθμισμένες μέσα από βραχείας και παρατεταμένης διάρκειας οδούς αντίδρασης, που έχουν επιπτώσεις στην κυτταρική πρωτεϊνική έκφραση και δραστικότητα. Η διακοπή της παροχής αίματος στους σκελετικούς μύες συνοδεύεται από μια σειρά μεταβολικών, βιοχημικών και ηλεκτρολυτικών διαταραχών, εξαρτώμενων άμεσα από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Οι διαταραχές αυτές, κατά κανόνα, επιτείνονται στη φάση αποκαταστάσεως της κυκλοφορίας. Ο βαθμός επιδεινώσεως είναι ανάλογος της βαρύτητας της ισχαιμικής βλάβης. Η παθογένεια των διαταραχών αυτών, παρά το πλήθος των κλινικών και πειραματικών ερευνών, δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Έτσι εξακολουθεί να αποτελεί πεδίο συνεχούς ενδιαφέροντος με αποτέλεσμα συχνά αλληλοσυγκρουόμενο, αναλόγως των συνθηκών εκτελέσεως κάθε μελέτης. Σ όλους τους αερόβιους οργανισμούς η παροχή οξυγόνου στο μυϊκό κύτταρο και η οξειδωτική φωσφορυλίωση αποτελούν ζωτικούς παράγοντες για την παραγωγή ενέργειας και τη διατήρηση ομοιοστάσεως. Η διακοπή της παροχής οξυγόνου που ακολουθεί την οξεία ισχαιμία οδηγεί σε στροφή του μεταβολισμού προς την αναερόβια οδό με παραγωγή πυρουβικού οξέος, το οποίο αδυνατεί να εισέλθει στον κύκλο του κιτρικού οξέος (αερόβιος γλυκόλυση) μετατρέπεται, όμως, σε γαλακτικό οξύ κατόπιν αναγωγής με τη δράση της γαλακτικής δεϋδρογενάσης: 42

43 Σχήμα 1: Μετατροπή Πυρουβικού οξέος σε Γαλακτικό οξύ Το γαλακτικό οξύ εν συνεχεία αποβάλλεται από τα κύτταρα ταχέως, για να μεταφερθεί στο ήπαρ, όπου μέσω της οδού της γλυκονεογενέσεως (κύκλος του Cori) μετατρέπεται σε γλυκόζη 63,64. Το σύνολο σχεδόν των μελετών αναφέρει αύξηση του γαλακτικού οξέος του αίματος, με μικρές μεταβολές του πυρουβικού οξέος, κατάσταση που οδηγεί σε αύξηση του λόγου γαλακτικού/πυρουβικού οξέος. Οι μεταβολές αυτές εξαρτώνται άμεσα από το βαθμό ισχαιμίας. Σε ατελή ισχαιμία ή σε ύπαρξη ικανής παράπλευρης κυκλοφορίας η αύξηση του γαλακτικού οξέος είναι μικρή, το πυρουβικό οξύ παραμένει σχεδόν αμετάβλητο και η αύξηση του λόγου γαλακτικού/πυρουβικού επίσης είναι μικρή. Κατά την επαναιμάτωση οι μεταβολές εξαρτώνται και από το χρόνο ισχαιμίας. Έτσι το γαλακτικό οξύ συνεχίζει να είναι αυξημένο για χρονικό διάστημα αυξανόμενο ανάλογο της αυξήσεως του χρόνου ισχαιμίας. Το ενδοκυττάριο γαλακτικό οξύ κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας αυξάνεται σε υψηλότερα επίπεδα απ αυτά που ελέγχονται στο φλεβικό αίμα που προέρχεται από την πάσχουσα περιοχή, ενώ το ενδοκυττάριο πυρουβικό οξύ δεν παρουσιάζει σημαντικές μεταβολές. Έτσι ο λόγος ενδοκυττάριου γαλακτικού/ενδοκυττάριου πυρουβικού είναι σαφώς μεγαλύτερος του αντίστοιχου λόγου του φλεβικού αίματος του προερχόμενου από το πάσχον τμήμα. Κατά την επαναιμάτωση η αύξηση του γαλακτικού οξέος στο ενδοκυττάριο περιβάλλον συνεχίζεται. Ο χρόνος διατηρήσεως σε υψηλά επίπεδα εξαρτάται από το χρόνο και το βαθμό ισχαιμίας. Παράλληλα όμως παρατηρείται και αύξηση του ενδοκυττάριου πυρουβικού οξέος με αποτέλεσμα την ελάττωση του λόγου ενδοκυττάριου γαλακτικού/ενδοκυττάριου πυρουβικού. 65,66,67,68 Το ενεργειακό φορτίο των κυττάρων εκφράζεται από τις δύο δεξαμενές ενέργειας. Η μία είναι η δεξαμενή των αδενυλικών (ATP+ADP+AMP) και η δεύτερη η δεξαμενή της κρεατίνης (PC+Cr). Το ATP είναι το άμεσα χρησιμοποιούμενο υλικό από το μυϊκό κύτταρο για την παραγωγή ενέργειας 43

44 προς εκτέλεση οποιασδήποτε μυϊκής δραστηριότητας. Παράγεται στις μιτοχονδριακές μεμβράνες με τη βοήθεια οξειδωτικής φωσφορυλιώσεως και παρουσία οξυγόνου. Σε οξεία ισχαιμία παρατηρείται πτώση του ATP που προέρχεται πλέον μόνο από την αναερόβια γλυκόλυση και από την κατανάλωση του ενεργειακού φορτίου της φωσφοκρεατίνης (PCr) PCr + ADP ATP + Κρεατίνη Επί παρατεταμένης ισχαιμίας επέρχεται κατανάλωση και της δεξαμενής των αδενυλικών με διάσπαση του ATP μέχρι το επίπεδο της αδενοσίνης. ATP ADP AMP Αδενοσίνη Τα προϊόντα διασπάσεως του ATP μέχρι το επίπεδο του AMP είναι αδιαπέραστα για την κυτταρική μεμβράνη και μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν. Η αδενοσίνη διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη. Ως εκ τούτου, όταν η διάσπαση φθάσει στο επίπεδο της αδενοσίνης, αυτή διαχέεται στον εξωκυττάριο χώρο και στερεί το ενδοκυττάριο περιβάλλον από το κατάλληλο υπόστρωμα παραγωγής ενέργειας. Επιπλέον παραπέρα διάσπαση της αδενοσίνης οδηγεί σε υποξανθίνη, η οποία στη φάση της επαναιματώσεως οδηγεί με τη βοήθεια του Cα ++ και του ενζύμου οξειδάση της ξανθίνης στην παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου 68.(Σχήμα 2) Σχήμα 2 44

45 Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των σκελετικών μυών είναι η αδυναμία μετατροπής, σε συνθήκες ισχαιμίας, της αφυδρογονάσης της ξανθίνης σε οξειδάση της ξανθίνης. Αυτός είναι ίσως και ένας από τους λόγους της μεγαλύτερης αντοχής του σκελετικού μυϊκού ιστού σε συνθήκες ισχαιμίας σε σύγκριση με άλλους ιστούς και όργανα. 66,69,70,71 Μετά την αποκατάσταση της κυκλοφορίας το ATP παραμένει χαμηλό με τάση όμως αυξήσεως που εξαρτάται από το χρόνο ισχαιμίας. Οι τιμές του ενεργειακού φορτίου και των δεξαμενών των αδενυλικών και της PCr επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα σε χρόνο εξαρτώμενο από την ισχαιμική βλάβη. Η μη αποκατάσταση των επιπέδων του ATP, ή πολύ βραδεία επανάκαμψη στα φυσιολογικά επίπεδα, αντανακλά αφ ενός εκτεταμένη ισχαιμική βλάβη των κυτταρικών μεμβρανών, αφ ετέρου ιδιαίτερη βλάβη της δομής και της λειτουργίας των μιτοχονδρίων των μυϊκών κυττάρων. 66,69,70,71 Οι τρανσαμινάσες, (γλουταμινική-οξαλοξική τρανσαμινάση (SGOT) και γλουταμινική- πυροσταφυλική τρανσαμινάση (SGPT) διαδραματίζουν ιδιαίτερο ρόλο στο μεταβολισμό των αμινοξέων, όπως προαναφέρθηκε. Παρατηρείται αύξηση αυτών σχετικά ανάλογη του βαθμού ισχαιμίας και εκφράζουν μυïκή βλάβη. Σε ήπιες περιπτώσεις μυïκής ισχαιμίας επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα εντός ολίγων ημερών. Μη αναστρέψιμες νεκρωτικές βλάβες του μυïκού ιστού συνοδεύονται από σταθερά υψηλά επίπεδα τρανσαμινασών. Η ερμηνεία των μεταβολών αυτών των ενζύμων (SGOT, SGPT, CPK) κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της επαναιματώσεως, σαν απόλυτος εκφραστής του βαθμού της μυϊκής βλάβης κρύβει πολλές παγίδες, εφόσον μεγάλο φάσμα νοσημάτων επηρεάζει τις συγκεντρώσεις τους. Ως εκ τούτου οι ενζυμικές αυτές μεταβολές έχουν αξία, όταν συνδυάζονται κατάλληλα με την κλινική εικόνα και τα εγχειρητικά ευρήματα. 72,73,74,75 Η παρατεταμένη ισχαιμία οδηγεί σε πολλαπλές κυτταρικές, μεταβολικές και δομικές αλλαγές. Αν και η υποξική ανοχή μεταξύ των διαφόρων τύπων κυττάρων διαφέρει ανάλογα με το μεταβολικό ποσοστό και τους εγγενείς προσαρμοστικούς μηχανισμούς, η κυτταρική νέκρωση ακολουθεί αναπόφευκτα τις εκτεταμένες περιόδους ανοξίας (απουσία οξυγόνου) ή σοβαρής υποξίας (προσφορά οξυγόνου που μειώνεται σχετικά με τη μεταβολική απαίτηση). Σε γενικές γραμμές ο μυς ανέχεται την ισχαιμία για περίπου 4-6 ώρες, τα νεύρα περί τις 8, το λίπος για 13, το δέρμα για 24 ώρες, ενώ το οστό έως και 4 ημέρες. 76 Η προκληθείσα από την ισχαιμία μείωση στην κυτταρική οξειδωτική φωσφορυλίωση οδηγεί σε αποτυχία επανασύνθεσης πλούσιων σε ενέργεια φωσφορικών 45

46 αλάτων συμπεριλαμβανομένου του ATP και της φωσφοκρεατίνης. Κατά συνέπεια, η ATP-εξαρτώμενη λειτουργία των αντλίων ιόντων στις μεμβράνες μεταβάλλεται, ευνοώντας την είσοδο του ασβεστίου, του νατρίου και του ύδατος στο κύτταρο. Επιπλέον, ο καταβολισμός των αδενικών νουκλεοτιδίων κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας οδηγεί στην ενδοκυτταρική συσσώρευση της υποξανθίνης, που μετατρέπεται στη συνέχεια στις τοξικές δραστικές μορφές οξυγόνου(δμο) (reactive oxygen species ROS) όταν το μοριακό οξυγόνο επαναπροσφέρεται. 77 Στο ενδοθήλιο η ισχαιμία προωθεί την έκφραση ορισμένων προ-φλεγμονωδών προϊόντων (όπως π.χ. μόριο προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων, κυτοκίνες) και των βιοενεργών παραγόντων (π.χ. ενδοθηλίνη, θρομβοξάνη A2), ενώ καταστέλλει άλλα προστατευτικά προϊόντα [όπως π.χ. συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (NO), θρομβομοδουλίνη] και βιοενεργούς παράγοντες (όπως π.χ. προστακυκλίνη, μονοξείδιο του αζώτου (NO). 59,78 Έτσι η ισχαιμία προκαλεί μία προ-φλεγμονώδη κατάσταση που αυξάνει την ευπάθεια του ιστού στον περαιτέρω τραυματισμό από την επαναιμάτωση Ενδοθηλιακά κύτταρα Τα ενδοθηλιακά κύτταρα αποτελούν μια δυναμική και πολυσύνθετη δομή που ρυθμίζει τις αγγειακές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένης της ροής, της διαπερατότητας και της μετακίνησης κυττάρων. Έτσι κατέχουν σημαντική θέση στην παθοφυσιολογία του ΣΙΕ λόγω του κρίσιμου ρόλου τους στη ρύθμιση της αγγειακής λειτουργίας. Το ΣΙΕ προκαλεί πολλές αλλαγές στα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως αποπόλωση και αυξανόμενη ρευστότητα των μεμβρανών, διαταραχές στη κατανομή των ιόντων, κυτταρικό οίδημα, κυτοσκελετική αποδιοργάνωση, συγκέντρωση και ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων. Τα πρόσφατα πειραματικά ευρήματα έχουν παράσχει σημαντικές πληροφορίες για αυτές τις αλλαγές. Το κυτταρικό οίδημα είναι μια κλασική ιστολογική συνέπεια της κυτταρικής βλάβης και παρατηρείται ομοιόμορφα μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων στο ΣΙΕ. Διάφοροι μηχανισμοί είναι πιθανώς υπεύθυνοι για αυτές τις αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της οξειδωτικής βλάβης στις μεμβράνες, της απορρύθμισης της ομοιόστασης των ιόντων και της ωσμωτικής καταπόνησης. Μια πρόσφατη μελέτη έδωσε έμφαση στο ρόλο των όγκο-ρυθμιζόμενων καναλιών ανιόντων στη διατήρηση της ομοιόστασης του όγκου κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ. 79 Άλλοι ερευνητές, εντούτοις, θεωρούν ότι η κυτταρική διόγκωση στα τριχοειδή αγγεία στο ΣΙΕ είναι συνέπεια της αγγειοσυστολής και της συσσώρευσης των κυττάρων, παρά μια πραγματική αλλαγή 46

47 στον κυτταρικό όγκο 80. Η αποπόλωση των μεμβρανών είναι μεταξύ των πιο πρόωρων αλλαγών του ενδοθηλίου στο ΣΙΕ. Η αδυναμία της ενέργειο-εξαρτώμενης ανταλλαγής ιόντων, λόγω της μείωσης των τριφωσφορικών αλάτων αδενοσίνης (ATP) κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας, έχει θεωρηθεί από καιρό ως μεσολαβητικός παράγοντας στην αποπόλωση των μεμβρανών. Εντούτοις, μελέτες δείχνουν ότι η άμεση μεταβολή των ρόο-ρυθμιζόμενων καναλιών του καλίου (Κ+), είναι η πρωτογενώς υπεύθυνη βλάβη. Μελέτες πνευμόνων σε επίμυες έχουν δείξει ότι, παρά τον ικανοποιητικό εφοδιασμό με ATP, η αποπόλωση των μεμβρανών των ενδοθηλιακών κυττάρων εμφανίζεται σύντομα μετά από την επαναιμάτωση λόγω της αδρανοποίησης των ρόο-ρυθμιζόμενων καναλιών του καλίου (Κ+). 81 Μια άλλη λεπτομερής μελέτη των επιδράσεων των δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ) στο αγγειακό ενδοθήλιο έδειξε αντιδράσεις υπερπόλωσης και αποπόλωσης εξαρτημένες από τη συγκέντρωση του καλίου. 82 Οι μελέτες αυτές τονίζουν ότι το δυναμικό των μεμβρανών δεν είναι μόνο θέμα ενέργειας. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) φαίνεται να μεσολαβούν σε πολλά από τα επιβλαβή αποτελέσματα του ΣΙΕ. Σε ένα μοντέλο εντερικής ισχαιμίας και επαναιμάτωσης, οι μέτριες μειώσεις της περιεκτικότητας σε οξυγόνο κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης μετέβαλε σημαντικά τη βλάβη, υπογραμμίζοντας τη σημασία της δημιουργίας των ΔΜΟ 83. Διάφορες μελέτες έχουν καταδείξει, ότι οι αντιοξειδωτικοί παράγοντες προστατεύουν από τις χαρακτηριστικές ιστολογικές αλλαγές που συνδέονται με το ΣΙΕ. 84 Οι μελέτες του ΣΙΕ στο μυοκάρδιο έδειξαν ότι οι αλλαγές στα ενδοθηλιακά κύτταρα απετράπησαν κατά ένα μεγάλο μέρος κατά την επαναιμάτωση με δεσφεροξαμίνη, αλλά όχι με καταλάση ή υπεροξειδική δισμουτάση, αποδεικνύοντας ότι οι ρίζες υδροξυλίου είναι ιδιαίτερα σημαντικές στο ΣΙΕ του μυοκαρδίου. 85 Οι συγκεκριμένοι ρόλοι των διαφόρων δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ) φαίνεται να ποικίλλουν ανάλογα με τον ιστό, τη διαθεσιμότητα των αντιδραστηρίων όπως το μονοξείδιο του αζώτου (NO), καθώς και τη διάρκεια και έκταση του ΣΙΕ. Το εκτεταμένο οξειδωτικό στρες στο ΣΙΕ κινεί τη θανατηφόρα διαδικασία της απόπτωσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εκτός από τα οξέα αποτελέσματά τους, όπως η υπεροξείδωση λιπιδίων, οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) εμποδίζουν τις αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες μέσα στο κύτταρο, όπως την οικογένεια των πρωτεϊνών Bcl-2. Προϊόντα αυτών των πρωτεϊνών που διαπερνούν τη μεμβράνη αποκαθιστούν μερικές από τις αποπτωτικές καταστάσεις του κυττάρου και αποτρέπουν την απόπτωση. 86 Οι ανεξέλεγκτες εισροές του ασβεστίου λόγω της βλάβης των μεμβρανών και της διαταραγμένης ομοιόστασης των ιόντων, ενεργοποιεί ένα πλήθος 47

48 ενδοκυτταρικών ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων των λιπάσων, των πρωτεάσεων, και των ενδονουκλεάσεων που είναι σημαντικά στη σηματοδότηση της απόπτωσης. Τα πρόσφατα πειραματικά στοιχεία εκχωρούν έναν σημαντικό ρόλο στα μιτοχόνδρια για τη ρύθμιση της ανεξέλεγκτης εισροής ασβεστίου κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ. 87 Εντούτοις, η ικανότητα της μιτοχονδριακής ρύθμισης του ασβεστίου είναι περιορισμένη και μπορεί να ξεπεραστεί από την έντονη εισροή του Αρτηριόλια: ελαττωμένη ενδοθήλιο εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή Η αρχική εκδήλωση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας των αρτηριολίων στο ΣΙΕ είναι η ελαττωμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή. Η επαναιμάτωση μετά από ισχαιμία έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει σημαντικά την αντιδραστικότητα των αρτηριολίων. 88 Μία μελέτη σταθμός του Palmer το 1987 επιβεβαίωσε την ενδοθήλιοεξαρτώμενη αγγειοδιαστολή, και προσδιόρισε το μονοξείδιο του αζώτου (NO) ως τον ενδοθήλιο-εξαρτώμενο παράγοντα χάλασης. 89 Από την περίοδο της ανακάλυψής του, θεωρείται βασικός παθογενετικός μηχανισμός της αρτηριδιακής δυσλειτουργίας ως απάντηση σε μια ευρεία σειρά παραγόντων καταπόνησης. Βέβαια δεν αποτελεί το μοναδικό παράγοντα της επηρεασμένης αγγειοδιαστολής στο ΣΙΕ, όπου φαίνεται να συμμετέχουν πολλαπλάσιοι μηχανισμοί. Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) συντίθεται από μια οικογένεια ενζύμων, τις συνθάσες του ΝΟ (ΝΟS) που μετατρέπουν την L-αργινίνη σε ΝΟ και κιτρουλίνη με συμπαράγοντες την τετραϋδροβιοπτερίνη (BH4) και την αναχθείσα μορφή του φωσφορικού νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτιδίου (NADPH). Δύο μορφές του ενζύμου υπάρχουν στα ενδοθηλιακά κύτταρα: η ενδοθηλιακή NOS (enos), η οποία εκφράζεται συνεχώς, και μια επαγώγιμη μορφή (inducible inos). Στα ενδοθηλιακά κύτταρα οι ΝΟS ανταγωνίζονται με την αργινάση για την L-αργινίνη. Η δραστηριότητα της αργινάσης έχει αναφερθεί ότι αυξάνει μετά από ΣΙΕ, 40 με αποτέλεσμα να μειώνει την L- αργινίνη που είναι απαραίτητη για τη σύνθεση του ΝΟ. Η παρεμπόδιση της αργινάσης στο ΣΙΕ συντηρεί την ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή, αν και όχι πλήρως, αναδεικνύοντας ότι αποτελεί έναν από τους διάφορους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αρτηριδιακή δυσλειτουργία. Η έκταση της ενδοθηλιακής βλάβης και της δυσλειτουργίας στο ΣΙΕ εξαρτάται από τη διάρκεια και την ένταση της ισχαιμίας. Γενικά, η σοβαρότερη ενδοθηλιακή δυσλειτουργία εμφανίζεται νωρίς, μπορεί όμως να βελτιωθεί στην πορεία με την επαναιμάτωση. 91,92 Μελέτες σε πειραματόζωα με ισχαιμία των κάτω άκρων έχουν 48

49 αναδείξει πρώιμα την εξασθενημένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή στα αρτηριόλια και όψιμα τη λειτουργική διαταραχή των λείων μυϊκών ινών του τοιχώματος. Οι αλλαγές αυτές ενεργούν εις βάρος της ροής αίματος μέσω της σύσπασης των μυϊκών ινών και μπορούν τελικά να περιορίσουν την έκβαση της επαναιμάτωσης. 93 Επίσης υπάρχουν στοιχεία για διαφοροποιημένη απάντηση στην ισχαιμία εξαρτώμενη από το μέγεθος των αρτηριολίων, που δείχνουν εντονότερη εξασθένιση της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης αγγειοδιαστολής στα μικρότερα προβλεννογόνια αρτηριόλια. 93 Επηρεασμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή μετά από ΣΙΕ έχει περιγραφεί στους σκελετικούς μυς, στους πνεύμονες, το έντερο, και τον εγκέφαλο, 95,96,97,98,99 με ξεχωριστή κάθε φορά ένταση στην απάντηση. Έτσι, ακόμη και σύντομες περίοδοι υποξίας προκαλούν ενδοθηλιακή δυσλειτουργία στα εγκεφαλικά αρτηριόλια 98, ενώ οι μελέτες στο νεφρό, έχουν καταδείξει τη μοναδική ανθεκτικότητά του στην ισχαιμία. 99 Αν και είναι σαφές ότι το μονοξείδιο του αζώτου (NO) είναι ο μεσολαβητής της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης αγγειοδιαστολής, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο αυτή η απάντηση είναι εξασθενισμένη στο ΣΙΕ δεν είναι πλήρως σαφής. Το γεγονός όμως ότι η ελάττωση αυτή είναι πιο έντονη κατά την επαναιμάτωση, εμπλέκει τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) ως σημαντικούς μεσολαβητές στην ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. 100 Οι Flynn και συν 101 έχουν δώσει έμφαση στη σημασία της ξάνθινο-οξειδάσης (XO) ως μεσολαβητή της ελαττωμένης ροής αίματος στη μεσεντέριο μικροκυκλοφορία. Η εικόνα βελτιώθηκε με τη χορήγηση αλλοπουρινόλης, ενός ανασταλτικού παράγοντα της XO, που δείχνει ότι οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) που παράγονται από την XO είναι σημαντικοί μεσολαβητές στο ΣΙΕ του εντέρου και ότι η παραγωγή ΔΜΟ μπορεί να είναι ένας ελπιδοφόρος στόχος για θεραπεία. Η απομόνωση και η συγκέντρωση των λευκοκυττάρων διαδραματίζουν έναν προεξέχοντα ρόλο στην παθοφυσιολογία του ΣΙΕ στα τριχοειδή αγγεία και φλεβίδια, αλλά δεν έχουν θεωρηθεί ως σημαντικό συστατικό της δυσλειτουργίας. Η προς τα πάνω ρύθμιση των μορίων προσκόλλησης μετά από ΣΙΕ, έχει αποδειχθεί ότι προωθεί τη συγκέντρωση και ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων στα αρτηριόλια, που παρέχουν μια πρόσθετη, σημαντική πηγή ROS. Παρά την ύπαρξη στοιχείων που υποστηρίζουν τη δράση των ΔΜΟ ως μεσολαβητές της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας, φαίνεται ότι η απάντηση είναι σύνθετη, περιλαμβάνοντας και διάφορες άλλες οδούς. 49

50 Τριχοειδή: δυσλειτουργία ενδοθηλιακού φραγμού και φαινόμενο μηεπανακυκλοφορίας Οι μεταβολές στα τριχοειδή μετά από ΣΙΕ χαρακτηρίζονται από μείωση στον αριθμό των τριχοειδών αγγείων που αιματώνονται και αύξηση στη διήθηση των υγρών. Δεν έχει επιτευχθεί ακόμη συναίνεση για τους υπεύθυνους, για αυτές τις αλλαγές, μηχανισμούς. Οι πρόσφατες μελέτες εμπλέκουν πολλές διαφορετικές διαδικασίες. Ο μειωμένος αριθμός αιματούμενων τριχοειδών αγγείων μετά από το ΣΙΕ μπορεί να εξηγηθεί με την απόφραξη ή τη στένωση του αγγείου. Η προσκόλληση των αιμοπεταλίων και η επιστράτευση-συγκέντρωση των λευκοκυττάρων οδηγούν στη συμφορητική απόφραξη των τριχοειδών αγγείων, ενώ η διάσπαση του ενδοθηλιακού φραγμού και η αυξημένη υδραυλική αγωγιμότητα-διαπίδυση στη συμπίεση του αγγείου από το διάμεσο οίδημα. Η συμπίεση του αγγείου μαζί με την ενδοαυλική συμφόρηση δεν επιτρέπουν την αιμάτωση, ακόμα και όταν αποκαθίσταται η συστηματική πίεση. Οι πειραματικές μελέτες σε μεθαιμορραγική καταπληξία επιβεβαιώνουν αυτές τις αλλαγές, με την άμεση παρατήρηση της διόγκωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων, την αυξημένη τριχοειδική αντίσταση, και τον αυξημένο χρόνο διέλευσης των λευκοκυττάρων. Ενώ όμως η συσσώρευση των λευκοκυττάρων και η δυσλειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού παίζουν ένα σημαντικό ρόλο, η μεγαλομοριακή διαρροή και η συμπίεση των αγγείων είναι οι αρχικοί μεσολαβητές της μειωμένης τριχοειδικής αιμάτωσης. 102 Ακόμη και οι μικρές χρονικές περίοδοι ισχαιμίας στους πνεύμονες, χωρίς απόφραξη των αεροφόρων οδών, αυξάνουν την πνευμονική αγγειακή διαπερατότητα σε πειραματικό μοντέλο. 103 Διάφορες μελέτες έχουν επιδιώξει να διευκρινίσουν το μηχανισμό που ευθύνεται για τη διαταραχή της πνευμονικής μικροκυκλοφορίας κατά το ΣΙΕ. Σε μοριακό επίπεδο, η τριχοειδική βλάβη έχει αποδοθεί στη διάσπαση των πρωτεϊνών προσκόλλησης που συμβάλλουν στη συντήρηση της λειτουργίας φραγμού υπό κανονικές συνθήκες. Η μείωση των αποθεμάτων ATP και η παραγωγή ΔΜΟ, που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια του ΣΙΕ, έχουν αποδειχθεί ότι οδηγούν στη διάσπαση της κυτοσκελετικής οργάνωσης και ενδεχομένως, και των μεσοκυττάριων συνδέσεων. Οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές και οι ΔΜΟ έχουν αποδειχθεί ότι μειώνουν την έκφραση των μορίων καντχερίνης (cadherin) στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων με μια διαδικασία εσωτερικοποίησης και συνεπώς, ότι αυξάνουν τη διαπερατότητα του ενδοθηλιακού φραγμού. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των λευκοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλουν στη βλάβη στα τριχοειδή αγγεία στο ΣΙΕ με διάφορους τρόπους. Τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα γίνονται 50

51 άκαμπτα και έχουν έναν πιo αργό χρόνο διέλευσης στα τριχοειδή, που οδηγεί στην κυτταρική συμφόρηση και την απόφραξη των αγγείων. Τα λευκοκύτταρα εν συνεχεία διαπερνούν το ενδοθήλιο, διασπούν τις μεσοκυττάριες συνδέσεις, και διαταράσσουν την ακεραιότητα του ενδοθηλιακού φραγμού. 104 Επίσης τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα απελευθερώνουν αποθηκευμένες ΔΜΟ σε μια "οξειδωτική έκρηξη", συμβάλλοντας έτσι στη συσσωρευτική οξειδωτική καταπόνηση του ΣΙΕ και επιδεινώνοντας τη βλάβη στα αγγεία και τον περιβάλλοντα ιστό Μετα-τριχοειδή φλεβίδια: ο κεντρικός ρόλος για τα ουδετερόφιλα Οι αλλαγές στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια στο ΣΙΕ είναι, κατά ένα μεγάλο μέρος, συνέπεια της συσσώρευσης, της προσκόλλησης, και της μετακίνησης λευκοκυττάρων στον ενδοθηλιακό φραγμό και της απελευθέρωσης ΔΜΟ. Τα ουδετερόφιλα είναι η κυρίαρχη κατηγορία λευκοκυττάρων που συμμετέχει στη φλεβική απάντηση στην ισχαιμία, επάγοντας τη βλάβη, είτε μέσω των άμεσων επιδράσεων με τη διάσπαση των μεσοκυττάριων συνδέσεων κατά τη διάρκεια της μετακίνησης, είτε έμμεσα μέσω των αλληλεπιδράσεων με άλλα κύτταρα και ειδικά τα αιμοπετάλια. 105 Αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας είναι η αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα στα μακρομόρια. Το διάχυτο οίδημα του ιστού και η αιμοδυναμική αστάθεια που ακολουθούν συνεπεία της αυξημένης ενδοθηλιακής διαπερατότητας και μείωσης του ενδοαγγειακού όγκου, οδηγούν σε επιβλαβή τοπικά και συστηματικά αποτελέσματα. Λόγω της σημασίας τους, όχι μόνο στο ΣΙΕ αλλά, σχεδόν σε όλες τις φλεγμονώδεις διαδικασίες, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ουδετεροφίλων και ενδοθηλιακών κυττάρων, έχουν αποτελέσει και συνεχίζουν να είναι το αντικείμενο ευρείας έρευνας. Οι μελέτες σε ΣΙΕ στο ήπαρ έχουν δείξει έναν κεντρικό ρόλο για την Π-Σελεκτίνη (P- Selectin), το μόριο προσκόλλησης που είναι αρμόδιο για τον εντοπισμό των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο. Η Π-Σελεκτίνη εκφράζεται κατά τρόπο διφασικό στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων σε απάντηση σε ΣΙΕ. 106 Διάφορες μελέτες που χρησιμοποιούν μονοκλονικά αντισώματα έχουν εμπλέξει έναν πλήθος μορίων δεκτών στη διαδικασία προσκόλλησης των ουδετεροφίλων. Έτσι ο αποκλεισμός του ICAM- 1 (ενδοθηλιακό μεσοκυττάριο μόριο προσκόλλησης 1, intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1) 107 στην ενδοθηλιακή επιφάνεια και των CD11 και CD1852 στην επιφάνεια των ουδετεροφίλων, μείωσε εμφανώς την προσκόλληση και δεν επιδείνωσε σημαντικά την αγγειακή διαπερατότητα. 51

52 Τα λευκοκύτταρα διαδραματίζουν έναν προεξέχοντα ρόλο στη συγκέντρωση των αιμοπεταλίων στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια. Μελέτη έδειξε ότι μεγάλος αριθμός των προσκολλημένων αιμοπεταλίων δεσμεύθηκε επίσης και στα λευκοκύτταρα, δείχνοντας ότι τα λευκοκύτταρα ενισχύουν την προσκόλληση και τη συσσώρευση αιμοπεταλίων στο ΣΙΕ. 108 Η χαμηλή ροή που συνδέεται με το ΣΙΕ προωθεί επίσης τις αλληλεπιδράσεις λευκοκυττάρων-αιμοπεταλίων, που επιτρέπουν το σχηματισμό μιας πλατφόρμας λευκοκυττάρων επάνω στην οποία τα αιμοπετάλια μπορούν να δεσμευτούν στο φλεβικό τοίχωμα. Ενώ τα λευκοκύτταρα έχουν πάρα πολύ μεγάλη σημασία για τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, ο σχηματισμός θρόμβου μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας στον καθορισμό του ΣΙΕ. Η θρομβίνη έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την επαγόμενη από την ισχαιμία συσσώρευση και προσκόλληση λευκοκυττάρων, προτείνοντας ένα θεραπευτικό ρόλο για τους αντιθρομβωτικούς παράγοντες στο ΣΙΕ. 109 Η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας σε λευκοπενικά πειραματόζωα μειώθηκε με τη χορήγηση του ιστικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου, που προτείνει έναν ανεξάρτητο ρόλο για το σχηματισμό του θρόμβου στο ΣΙΕ. 110 Οι ΔΜΟ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο σε όλες τις αγγειακές απαντήσεις. Προωθούν το σχηματισμό του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων και της λευκοτριένης B4 από τα μαστικά και ενδοθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση και ενεργοποίηση των λευκοκυτάρρων στα φλεβίδια. Τα προσκολλημένα λευκοκύτταρα οδηγούν εν συνεχεία στην αυξημένη εξαγγείωση λευκωματίνης στα μετα-τριχοειδή φλεβίδια. 111 Η παραγωγή ΔΜΟ από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ειδικά κατά τη διάρκεια της περιόδου επαναιμάτωσης, είναι επίσης εμφανής στα φλεβίδια. Μερικές μελέτες αναφέρουν ότι οι πηγές όπως η XO (ξανθινο-οξειδάση), είναι πρώτιστα αρμόδιες για τη μετα-ισχαιμική βλάβη στο σκελετικό μυ, παρά τα τοξικά προϊόντα που παράγονται με τη σύνδεση και προσκόλληση των λευκοκύτταρων στα φλεβίδια Αγγειακά αποτελέσματα υποξίας Η παθογένεια του ΣΙΕ ξεκινάει με την προσβολή από την υποξία του αγγειακού ενδοθηλίου το οποίο όχι μόνο αποτελεί αγγειακό φραγμό, αλλά ρυθμίζει και τη μετακίνηση των πολυμορφοπύρηνων (ΠΜΠ) λευκών αιμοσφαιρίων (polymorphonuclear leukocyte PMN). 63 H υποξία ενεργοποιεί τόσο τις μεταγραφικές όσο και τις μη-μεταγραφικές οδούς, ενώ διάφοροι παράλληλοι μηχανισμοί υπάρχουν μεταξύ των απαντήσεων του ιστού στην υποξία και στην οξεία φλεγμονή. 64 Τα ΠΜΠ 52

53 μετακινούνται κατά τη διάρκεια της υποξίας από τον ενδοαγγειακό προς το διάμεσο χώρο και συμβάλουν σημαντικά στη βλάβη του ιστού κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Η μετανάστευση των ΠΜΠ δια του ενδοθηλίου μπορεί να αποδιοργανώσει τους ιστικούς φραγμούς και να δημιουργήσει τις προϋποθέσεις για εξωαγγείωση και δημιουργία οιδήματος. Διάφοροι ενδογενείς μηχανισμοί υπάρχουν για να ενισχύσουν τον αγγειακό φραγμό κατά τη διάρκεια των ισχαιμικών προσβολών. Τα ενεργοποιημένα ΠΜΠ απελευθερώνουν ποικίλους διαλυτούς μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένων των νουκλεοτιδίων της αδενίνης [υπό μορφή ATP ή AMP που, μέσω της μεταβολικής μετατροπής, απελευθερώνουν αδενοσίνη στην αγγειακή επιφάνεια], που ρυθμίζουν την αγγειακή διαπερατότητα. Ειδικότερα, η αδενοσίνη προστατεύει τη λειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού αποκαθιστώντας την επαφή μεταξύ των κυττάρων μετά από τη μετανάστευση των ΠΜΠ. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υποξία επηρεάζει σε διάφορο βαθμό την αγγειακή διαπερατότητα σε απάντηση στα ενεργοποιημένα ΠΜΠ. Το υποξικό ενδοθήλιο εμφανίζει αυξημένη προστατευτική απάντηση στα ενεργοποιημένα ΠΜΠ που μεσολαβείται εν μέρει μέσω του ΠΜΠ-παραγόμενου ATP. Κατά συνέπεια, η υποξία αρχίζει μια συντονισμένη προστατευτική για τον ενδοθηλιακό φραγμό απάντηση, που συνδέεται με την ενισχυμένη εξωκυττάρια συγκέντρωση και σηματοδότηση της αδενοσίνης. Σε αντίθεση, τα ΠΜΠ απελευθερώνουν και παράγοντες που μπορούν να αποδιοργανώσουν τον ενδοθηλιακό φραγμό. Η ενεργοποίηση των ΠΜΠ μέσω της β2 integrins επάγει την απελευθέρωση διαλυτών παραγόντων που προκαλούν κυτοσκελετική αποδιοργάνωση και χάσματα, με αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η πρωτεΐνη που συνδέεται με την ηπαρίνη (heparin binding protein HBP) και η οποία προκαλεί Cα2+-εξαρτώμενες κυτοσκελετικές αλλαγές και μακρομοριακή διαρροή Ρόλος των λεύκων αιμοσφαιρίων Το ΣΙΕ χαρακτηρίζεται από την ενεργοποίηση, το χημειοτακτισμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. 81 Τα λευκά αιμοσφαίρια αλληλεπιδρούν με το αγγειακό ενδοθήλιο μέσω μιας σειράς διακριτών βημάτων που χαρακτηρίζονται από το λευκό αιμοσφαίριο που ολισθαίνει στο ενδοθήλιο, την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στο ενδοθήλιο και τη μετανάστευση. Το πρώτο βήμα γίνεται με την επαγόμενη από το ΣΙΕ αύξηση στην έκφραση της ενδοθηλιακής P- Selectin (CD62P), η οποία αλληλεπιδρά με τα 53

54 λευκά αιμοσφαίρια. Αυτή η αρχική αλληλεπίδραση χαμηλής συγγένειας οδηγεί στην ενδιάμεση σύνδεση μεταξύ λευκοκυττάρου και ενδοθηλίου ή του λευκού αιμοσφαιρίου που ολισθαίνει. Η σταθερή προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων προκύπτει από την αλληλεπίδραση των β2 integrins CD11a/CD18 και CD11b/CD18 του λευκού αιμοσφαιρίου με το ενδοθηλιακό μεσοκυττάριο μόριο προσκόλλησης 1 (intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1). Η μετανάστευση των λευκών αιμοσφαιρίων στο διάμεσο χώρο διευκολύνεται από το μόριο προσκόλλησης-1 αιμοπεταλίων - ενδοθηλιακών κυττάρων (platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 PECAM-1) που εκφράζεται κατά μήκος των συνδέσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με την άφιξή τους στον εξωαγγειακό χώρο, τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα απελευθερώνουν τοξικές δραστικές μορφές οξυγόνου(δμο), πρωτεάσες και ελαστάσες, με συνέπεια την αυξημένη μικροαγγειακή διαπερατότητα, το οίδημα, τη θρόμβωση και το θάνατο των κυττάρων. 81 Η συσσώρευση ΠΜΠ στον εξωαγγειακό χώρο διευκολύνεται επίσης από την ιντερλευκίνη - 8 (IL-8) που απελευθερώνεται από τους υποξικούς ιστούς, με συνέπεια μια χημειοτακτική κλίση που κατευθύνει τα ΠΜΠ από το ενδοαγγειακό διάστημα προς το διάμεσο χώρο Φαινόμενο μη-επανακυκλοφορίας Το φαινόμενο της μη-επανακυκλοφορίας αναφέρεται στην κλινική παρατήρηση σύμφωνα με την οποία η ροή αίματος σε ένα ισχαιμικό όργανο συχνά δεν αποκαθίσταται πλήρως μετά από την αποκατάσταση της αγγειακής βλάβης. Οι πιθανοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την αυξημένη συγκόλληση μεταξύ αιμοπεταλίων και λευκών αιμοσφαιρίων, την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, τη συσσώρευση διάμεσου υγρού και τη μειωμένη ενδοθήλιο-εξαρτώμενη αγγειοχάλαση. 85, 115 Το φαινόμενο αυτό μπορεί να εκδηλωθεί κλινικά ως συνεχιζόμενη οργανική δυσλειτουργία, αποτυχία ενός μεταμοσχευμένου οργάνου ή αυξημένο μέγεθος εμφράγματος στην περίοδο μετά την επαναιμάτωση. Οι πειραματικές μελέτες δείχνουν έναν κεντρικό ρόλο για την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων στο φαινόμενο μη-επανακυκλοφορίας, δεδομένου ότι η μείωση λευκών αιμοσφαιρίων σε αυτά τα πρότυπα βελτιώνει τη στεφανιαία ροή αίματος, μειώνει το μέγεθος του μυοκαρδιακού εμφράγματος και βελτιώνει τις κοιλιακές αρρυθμίες. 54

55 Δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) Ένας άλλος παράγοντας που προκαλεί ιστική βλάβη μετά από επαναιμάτωση είναι η παραγωγή ελεύθερων ριζών από μοριακό οξυγόνο, με τη μεταφορά των ηλεκτρονίων στη μιτοχονδριακή αναπνευστική άλυσσο, το μεταβολισμό της οξειδάσης της ξανθίνης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τις προσταγλανδίνες και την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων. 83 Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το μοριακό οξυγόνο (Ο2) υπόκειται σε μια αναγωγή ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια, παράγοντας H2O. Παρ όλα αυτά 1% με 2% του οξυγόνου ξεφεύγει από την καθορισμένη του πορεία και υπόκειται σε αναγωγή ενός ηλεκτρονίου, παράγοντας ελεύθερες ρίζες οξυγόνου O2. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι ελεύθερες ρίζες αδρανοποιούνται από ενδογενή αντιοξειδωτικά ένζυμα, αλλά κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης εμφανίζεται μια υπερβολική συγκέντρωση ελεύθερων ριζών. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται οξειδωτικό stress με επακόλουθα τοξικά αποτελέσματα. 84 Υπάρχει μια πληθώρα ελευθέρων ριζών, όμως, εκείνες που παρουσιάζουν περισσότερο ενδιαφέρον στα βιολογικά συστήματα είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (oxygen free radicals, OFRs) ή γενικότερα οι δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS). Οι ελεύθερες ρίζες είναι μια κατηγορία χημικών ουσιών που έχουν ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στην εξωτερική τους στιβάδα. 85 Σε αυτή την κατάσταση, οι ελεύθερες ρίζες είναι εξαιρετικά δραστικές, ασταθείς και έχουν ισχυρή τάση να ζευγαρώσουν το ασύζευκτο ηλεκτρόνιό τους, μετέχοντας σε αντιδράσεις με οργανικές και ανόργανες χημικές ενώσεις, πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες και κυρίως κυτταρικές μεμβράνες και νουκλεϊκά οξέα. 76 Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας το ATP καταβολίζεται, παράγοντας υποξανθίνη. Σε φυσιολογικές συνθήκες η υποξανθίνη οξειδώνεται σε ξανθίνη με την δεϋδρογονάση της ξανθίνης (XDH) (Σχήμα 1). Σχήμα 3: Ο ρόλος της δεϋδρογονάσης της ξανθίνης ως καταλύτη διαφόρων αντιδράσεων. 55

56 Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας αναστέλλεται η λειτουργία της αντλίας Ca++ που οδηγεί σε αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου με συνέπεια τη μετατροπή της XDH σε οξειδάση της ξανθίνης, όπου ο αριθμός μετατροπής είναι ανάλογος του χρόνου ισχαιμίας. Η αντίδραση αυτή είναι ταχύτερη στο εντερικό τοίχωμα από ότι στους άλλους ιστούς, με αποτέλεσμα η μέτρηση της οξειδάσης της ξανθίνης (ΧΟ) να αποτελεί έναν ασφαλή δείκτη εντερικής ισχαιμίας (Σχήμα 2). 86 Σχήμα 4: Ο ρόλος της οξειδάσης της ξανθίνης ως καταλύτη διαφόρων αντιδράσεων. Κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης το Ο2 που προσφέρεται εκ νέου στους ιστούς αντιδρά με την υποξανθίνη και την ΧΟ παράγοντας σουπεροξείδιο (O2 ) το οποίο μετατρέπεται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) με την ενζυμική δράση της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD). Βέβαια με την καταλάση ή την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, το υπεροξείδιο του υδρογόνου μετατρέπεται σε H2O 83. Όμως παρουσία σιδήρου, το υπεροξείδιο του υδρογόνου με την αντίδραση γνωστή ως Fenton, μπορεί να μετατραπεί σε υδροξυλικές ρίζες (OH ), που είναι πολύ δραστικές και τοξικές 87 : H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH + OH Οι υδροξυλικές ρίζες έχουν την ικανότητα να αφαιρούν υδρογόνο από οργανικές ενώσεις, παράγοντας έτσι μια ποικιλία από νέες ρίζες. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η αφαίρεση υδρογόνου από τα λιπίδια των μεμβρανών (RH), με αποτέλεσμα το σχηματισμό ριζών με κέντρο τον άνθρακα (R ) και την έναρξη της λιπιδικής υπεροξείδωσης 88 : RH + OH R + H 2 O Αυτή η διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση ουσιών που ελκύουν και προάγουν την προσκόλληση των πολυμορφοπύρηνων στα ενδοθηλιακά κύτταρα της αγγειακής μικροκυκλοφορίας. Τα προσκολλημένα πολυμορφοπύρηνα προκαλούν επιπλέον βλάβη στα ενδοθηλιακά κύτταρα με την απελευθέρωση υπεροξειδάσης και διαφόρων προτεασών

57 Tα ανιόντα σουπεροξειδίου αντιδρούν με το μονοξείδιο του αζώτου (NO ) και παράγουν υπεροξυνιτρώδες οξύ (ONOOH, pka = 6,8), το οποίο αποσυντίθεται γρήγορα ( t½ ~ 1s σε ph 7,4 και 37 o C) και σχηματίζει ενδιάμεσα προϊόντα που έχουν κυτταροτοξική δράση παρόμοια με την υδροξυλική ρίζα (OH ) 89,90 : ONOOH [ OH + ΝΟ 2 ] Η+ + ΝΟ 3 Αυτά τα προϊόντα επιτείνουν τη λιπιδική υπεροξείδωση και επιπλέον προκαλούν μεταβολές στις πρωτεΐνες με πρωτεϊνικές μεταβολές καθώς και στο DNA, οδηγώντας στον κυτταρικό θάνατο. Όλες οι κυτταρικές δομές είναι ευαίσθητες στη δράση των ROS και πιο πολύ η κυτταρική μεμβράνη, που ως αποτέλεσμα της λιπιδικής υπεροξείδωσης, προκαλεί αλλαγές στη δομή της και στη διαπερατότητά της. Οι αντιδράσεις μεταξύ ελεύθερων ριζών και λιπιδίων απελευθερώνουν λιπιδικά υπεροξείδια, τα οποία είναι από μόνα τους ελεύθερες ρίζες, ξεκινώντας μια εκ νέου με τη σειρά τους οξειδωτική μετατροπή των λιπαρών οξέων. Το αποτέλεσμα είναι η βλάβη των πρωτεϊνών των κυτταρικών μεμβρανών, με απώλεια της ειδικότητας στην ανταλλαγή των ιόντων και την απελευθέρωση του περιεχομένου των οργανιδίων. Έτσι, όπως στην περίπτωση της λύσης της μεμβράνης των λυσοσωματίων, απελευθερώνονται υδρολάσες, που οδηγούν στην αυτοπεψία και στον κυτταρικό θάνατο. 76 Εκτός από την έναρξη της λιπιδικής υπεροξείδωσης, οι ROS έχουν την ιδιότητα να προκαλούν την ενεργοποίηση και προσκόλληση των ουδετερόφιλων. Η χρησιμοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων ρυθμίζεται από χημειοκίνες (C5a, IL-8, LTB4, PAF), που παράγονται κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και επίσης από τη διέγερση διαφόρων μορίων προσκόλλησης στην επιφάνεια τόσο των φλεγμονωδών κυττάρων όσο και των φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα μόρια προσκόλλησης που ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των λευκοκυττάρων και του ενδοθηλίου είναι οι σελεκτίνες, οι ιντεγκρίνες b2 (CD11/CD18) και οι ανοσοσφαιρίνες (ICAM-1, VCAM- 1, PECAM-1) 91. Η διαδικασία της μετανάστευσης των λευκοκυττάρων περιλαμβάνει την πλεύριση του κυτταρικού τοιχώματος, το κύλισμα (rolling) κατά μήκος του ενδοθηλίου και τελικά τη συγκόλληση πριν τη μετανάστευσή τους διαμέσου του ενδοθηλίου. 76, 91 Τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα, αυτά που εμφανίζουν μόρια προσκόλλησης, μετά από την προσκόλληση και μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου, προκαλούν τοπική καταστροφή με την απελευθέρωση και άλλων ελεύθερων ριζών, πρωτεολυτικών ενζύμων (κολλαγενάση, ελαστάση, κατεψίνη G) και υπεροξειδάση. Ένα σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη του συνδρόμου πολλαπλών οργάνων είναι η παγίδευση των 57

58 ενεργοποιημένων ουδετερόφιλων στους πνεύμονες και σε άλλα όργανα. 83 Σε φυσιολογικούς επίμυες, τα μόρια προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1 εκφράζονται κανονικά στο αγγειακό ενδοθήλιο. Σε απάντηση στην ισχαιμία-επαναιμάτωση, αυτά τα μόρια υπερεκφράζονται στα κύτταρα του αγγειακού ενδοθηλίου, στο συνδετικό ιστό και στα φλεγμονώδη κύτταρα. Αυτή η υπερέκφραση των ICAM-1 και VCAM-1 μεγεθύνει την προσκόλληση των λευκοκυττάρων και προάγει τη μετανάστευσή τους στο σημείο της ιστικής βλάβης του λεπτού εντέρου. Η απόφραξη της μικροκυκλοφορίας που αποδίδεται κυρίως στη μαζική προσκόλληση των ουδετεροφίλων στα τριχοειδή ονομάζεται φαινόμενο μη επαναφοράς της ροής (no reflow phenomenon). 89 Μία σημαντική ελεύθερη ρίζα που παράγεται κατά τη διάρκεια της ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης είναι το μονοξείδιο του αζώτου (NO ). Φυσιολογικά συντίθεται με τη μετατροπή της L-αργινίνης σε L-κιτρουλλίνης. Τα ένζυμα που καταλύουν αυτή την αντίδραση είναι οι συνθάσες του οξειδίου του αζώτου (NOS), που αποτελούνται από ισοένζυμα που χαρακτηρίζονται από συνεχή βιοσύνθεση (c NOS μορφή) και επαγόμενη (i NOS μορφή). 92,93 Η υπερβολική παραγωγή του ΝΟ διαμέσου της inos μορφής συμβάλλει στην παθοφυσιολογία της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του εντέρου. 94 Αντίθετα, η παραγωγή ΝΟ διαμέσου της c NOS μορφής μπορεί να αποτελέσει ένα σημαντικό μόριο προστασίας του εντέρου κατά την έναρξη της ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης. 95 Το μονοξείδιο του αζώτου παρουσιάζει ευεργετικά αγγειοδιασταλτικά αποτελέσματα στο σύστημα της μικροκυκλοφορίας, προκαλώντας χάλαση στα λεία μυϊκά κύτταρα, αλλά παραδόξως μπορεί να συμμετέχει στην παραγωγή κυτταροτοξικών ριζών. 96 Σύμφωνα με τους Sekhon και συν. 97 το ΝΟ είναι ευεργετικό ως ρυθμιστής ή αγγελιοφόρος, αλλά κατά τη διάρκεια οξειδωτικού στρες είναι δυνητικά τοξικό. Οι Naito και συν. 98 παρατήρησαν ότι η φλεγμονή που προκαλείται σε επίμυες από την επαναιμάτωση της μεσεντερίας αρτηρίας οδηγούσε σε οξειδωτικό και νιτρικό stress, που χαρακτηρίζεται από υψηλή παραγωγή ΝΟ, από την αυξημένη παραγωγή της i NOS μορφής και από την υπερβολική έκφραση λιπιδικών υπεροξειδίων. Η ιστική ισχαιμία και επαναιμάτωση ενεργοποιούν μια οικογένεια κινασών πρωτεϊνών οι οποίες μετατρέπονται σε ειδικούς μεταφραστικούς παράγοντες [πρωτεΐνηενεργοποιητής-1 (PA-1) και πυρηνικός παράγοντας-κb (NF-κB)], που ρυθμίζουν την έκφραση προφλεγμονωδών γονιδίων. Τα τελικά προϊόντα περιλαμβάνουν ένζυμα (inos, φωσφολιπάση Α2, κυκλοοξυγενάση), κυτοκίνες (TNF-a, IL-1, IL-6) και μόρια 58

59 προσκόλλησης (ICAM-1). 99 Ο παράγοντας NF-κB διατηρείται σε μια λανθάνουσα μορφή στο κυτταρόπλασμα και κάτω από ορισμένες συνθήκες μεταφέρεται στον πυρήνα όπου ρυθμίζει τη μεταγραφή. 94 Σύμφωνα με τους Zou και συν. 100 ο παράγοντας NF-κB φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παραγωγή και επιδιόρθωση των εντερικών βλαβών ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Ο παράγοντας NF-κB ενεργοποιείται από το έντερο από προφλεγμονώδη ερεθίσματα, που περιλαμβάνουν τη σήψη, τις κυτοκίνες και το οξειδωτικό στρες. Η ενεργοποίηση του παράγοντα NF-κB οδηγεί σε συντονισμένη έκφραση πολλών γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση του διαβιβαστή και στη μεγιστοποίηση και διατήρηση της φλεγμονώδους απάντησης. Παρ όλα αυτά, ο παράγοντας NF-κB λειτουργεί και σαν μόριο αντιφλεγμονώδους θεραπείας. Η ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος μπορεί να οδηγήσει σε μεταφορά του παράγοντα NF-κB και σε αύξηση στη μεταγραφή της i NOS μορφής. 100 Το σύστημα του συμπληρώματος ασκεί μια σημαντική λειτουργία στην παθογένεση των βλαβών που ξεκινάει από ισχαιμίαεπαναιμάτωση και την ενεργοποίησή της. Επίσης, μπορεί ακόμη να συμβάλλει στην αύξηση της παραγωγής του ανιόντος του σουπεροξειδίου, όχι μόνο διαμέσου της χρησιμοποίησης και ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων, αλλά και διαμέσου της μείωσης των επιπέδων του SOD μετά από επαναιμάτωση. 94 Η μεγάλη απώλεια και αναστολή του συμπληρώματος θα μπορούσε να μειώσει πολλούς από τους διαβιβαστές των βλαβών ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Ο παράγοντας 5 του συμπληρώματος (C5) μετριάζει τις εντερικές βλάβες διαμέσου της ρύθμισης των μορίων ICAM-1, TNF-a και IL-1a. 47 Παρ όλο ότι είναι φανερό πως σταματώντας το συμπλήρωμα υπάρχει η δυνατότητα προστασίας των ιστών από τις βλάβες επαναιμάτωσης, οι υπεύθυνοι ειδικοί μοριακοί μηχανισμοί των βλαβών σε κυτταρικό επίπεδο είναι ακόμη σε στάδιο έρευνας. Στην εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση, το συμπλήρωμα προκαλεί την έκφραση της i NOS μορφής στο εντερικό επιθήλιο των επίμυων. 94 Η ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων ήταν επίσης εξαρτώμενη από το συμπλήρωμα κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. 101 Από την άλλη πλευρά οι Fleming και συν. 102 έδειξαν ότι το C5a προκαλεί μειωμένη βλάβη, μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση σε επίμυες, ανεξάρτητα από τα πολυμορφοπύρηνα. Επιπλέον, τα μαστοκύτταρα μπορεί να συμμετέχουν στη μεγιστοποίηση των βλαβών μετά την ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Τα μαστοκύτταρα και οι αντιδράσεις που αυτά προκαλούν, φαίνεται να συμβάλλουν στην αύξηση της 59

60 διαπερατότητας του βλεννογόνου κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης, αλλά η λειτουργία τους σε παθολογικές βλάβες παραμένει άγνωστη. 101 Διάφορα στοιχεία υποδηλώνουν ότι εκτός από τα πολυμορφοπύρηνα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα και άλλα κύτταρα ασκούν σημαντικές λειτουργίες στην παθογέννηση των βλαβών επαναιμάτωσης. Τα αιμοπετάλια χρησιμοποιούνται από το μετισχαιμικό μικροαγγειακό δίκτυο αμέσως μετά την επαναιμάτωση και παρ όλο που είναι χωρίς πυρήνα, παράγουν ακόμη ελεύθερες ρίζες, απελευθερώνουν προφλεγμονώδεις μεσολαβητές, όπως TXA2, λευκοτριένια, σεροτονίνη, τον παράγοντα 4 των αιμοπεταλίων, το PDGF και ρυθμίζουν τη λειτουργία των λευκοκυττάρων. Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων του μετισχαιμικού μικροαγγειακού δικτύου συμβάλλει σημαντικά στην εμφάνιση των βλαβών ισχαιμίας-επαναιμάτωσης 103 (Σχήμα 3). Καταπληξία-Υποξία (shock-hypoxia slow flow) απόκρισης Ενεργοποίηση μονοκυττάρων Οξεία φάση ηπατικής κυττάρων IL-8 Ενεργοποίηση ουδετερόφιλων IL-6 IL-1, TNF IL-6 Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών Ελεύθερες Πρωτεάσες Απώλεια ενδοθηλιακής ρίζες ακεραιότητας Προπηκτική επιφάνεια Νεφρική Ενεργοποίηση Συγκέντρωση Θρομβωτικός ανεπάρκεια συμπληρώματος αιμοπεταλίων καταρράκτης ARDS Ενδοτοξιναιμία Τοπική Επίκτητη Ανεπάρκεια καταστροφή διαταραχή πολλών ιστών πήξης οργάνων Θάνατος 60

61 Σχήμα 5: Σχηματική παρουσίαση του καταρράκτη της φλεγμονώδους αντίδρασης που εξηγεί τις βλάβες ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Τα αιμοπετάλια, όπως και τα λευκοκυττάρα, κυλούν και προσκολλώνται στενά στο αγγειακό ενδοθήλιο κατά τη διάρκεια της μετισχαιμικής επαναιμάτωσης. Οι κυτταρικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και των αιμοπεταλίων που προκαλούνται από την ισχαιμία-επαναιμάτωση, ρυθμίζονται από ενδοθηλιακή P σελεκτίνη, ενώ η αιμοπεταλιακή P σελεκτίνη προάγει την αλληλεπίδραση μεταξύ αιμοπεταλίων και λευκοκυττάρων. 103 Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των δύο τύπων κυττάρων μπορούν να προκαλέσουν αμοιβαία ενεργοποίηση, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση των μορίων προσκόλλησης, στην παραγωγή του ανιόντος σουπεροξειδίου και στη φαγοκυτταρική δραστηριότητα των λευκοκυττάρων. 104 Ένας άλλος παράγοντας που συμμετέχει στις εντερικές βλάβες της ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης είναι η σεροτονίνη (5-HT). Η σεροτονίνη είναι μία βιοενεργός αμίνη, η οποία συμμετέχει σε διάφορα φυσιολογικά φαινόμενα όπως νευροδιαβίβαση, εντερική κινητικότητα, ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και αγγειοσύσπαση. 105 Μία μελέτη των Teramoto και συν. 105 έδειξε αύξηση των επιπέδων της 5-HT στο πλάσμα μετά από μεσεντέρια ισχαιμία-επαναιμάτωση σε αυτό, πιθανότατα εξαιτίας μιας αύξησης στην απελευθέρωση της σεροτονίνης από το ισχαιμικό έντερο. Σύμφωνα με τους μελετητές, η 5-HT μαζί με άλλες βιοενεργές ουσίες μπορούν να επιτελέσουν μια σημαντική λειτουργία στην παθογέννηση της εντερικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Τελευταία έχει αποδειχθεί ότι οι παγκρεατικές πρωτεάσες συμμετέχουν στην παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών μετά από εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση, όπως η τρυψίνη και η μεταλλοπρωτεϊνάση 9 (MMP 9). Η MMP 9 είναι μια ενδοπρωτεάση που περιέχει ψευδάργυρο στον ενεργό πυρήνα του και συμμετέχει σε αυτοάνοσες και φλεγμονώδεις απαντήσεις, που περιλαμβάνουν την ισχαιμία-επαναιμάτωση του μυοκαρδίου, του ήπατος και του παγκρέατος. 106 Οι Rosario και συν. παρατήρησαν ότι η ενδοαυλική τρυψίνη αύξανε τη φλεγμονώδη απάντηση με μια αύξηση της πολυμορφικής διήθησης στο εντερικό τοίχωμα. Η παγκρεατική τρυψίνη προάγει μια ταχεία πρωτεολυτική ενεργοποίηση της MMP-9, που ενεργεί σαν δυνητικός μηχανισμός της βλάβης. Νέα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας συσσώρευσης των αιμοπεταλίων (PAF) ασκεί μια σημαντική λειτουργία στην έναρξη και μεγιστοποίηση των βλαβών ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης. 107 Ο παράγοντας συσσώρευσης των αιμοπεταλίων (PAF) είναι ένας λιπιδικός μεσολαβητής της φλεγμονώδους απάντησης και οδηγεί στην κυτταρική 61

62 απόπτωση, που ενεργοποιείται από την εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση. Η ισχαιμίαεπαναιμάτωση αναστέλλει τη δραστηριότητα της PAF ακετυλυδρολάσης (PAF-AH), οδηγώντας σε αύξηση της δραστηριότητας του παράγοντα PAF. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας PAF διεγείρει την έκφραση του PECAM-1 και την έκκριση της IL-6 και αναστέλλει τη σύνθεση της IL-10, που ασκεί αντιφλεγμονώδεις λειτουργίες κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης του εντέρου. 107 Η απελευθέρωση του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος στο κυτόπλασμα είναι ικανή να ενεργοποιήσει την κασπάση-9, που με τη σειρά της αυξάνει την απόπτωση του εντερικού βλεννογόνου. Στο παρελθόν η νέκρωση θεωρούνταν το κύριο αποτέλεσμα της ισχαιμίας στα επιθηλιακά κύτταρα. Τελευταία, πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η απόπτωση είναι καθαρά ένας σημαντικός και πιθανόν ο κυριότερος συντελεστής του κυτταρικού θανάτου μετά από βλάβη ισχαιμίας- επαναιμάτωσης. 108 Αντίθετα με την κυτταρική νέκρωση, η απόπτωση είναι μια ενεργός διαδικασία γενετικά καθορισμένων κυττάρων για αυτοκαταστροφή και χαρακτηρίζεται από μορφολογικές αλλαγές. Τέτοιες αλλαγές είναι η κυτταρική συρρίκνωση, ενώ διατηρούνται άθικτα τα οργανίδια, η συμπύκνωση της χρωματίνης και πιθανή διάσπαση του πυρήνα με δημιουργία αποπτωτικών σωματιδίων στο κυτταρόπλασμα. 109 Οι κυριότεροι εκτελεστές του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου είναι οι κυστεϊκές ενδοπρωτεάσες που ονομάζονται κασπάσες. 110 Διάφορες μελέτες ασχολήθηκαν με την απόπτωση στην εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση. Οι Noda και συν. 109 αναφέρουν απόπτωση στη νήστιδα και τον ειλεό, μετά από αποκλεισμό και επαναιμάτωση της άνω μεσεντέριας αρτηρίας (ΑΜΑ) σε επίμυες. Το ποσοστό της διάσπασης του DNA αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και έφτασε στο μέγιστο βαθμό μία ώρα μετά την επαναιμάτωση. Σύμφωνα με τους Wu και συν. 111 η i NOS μορφή σχετίζεται με αυξημένη απόπτωση στο βλεννογόνο του λεπτού εντέρου των επίμυων μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση. Οι αναστολείς της απόπτωσης σε ιστό με βλάβη μπορούν να διατηρήσουν τη λειτουργική και μορφολογική ακεραιότητα σε όργανα που έχουν υποβληθεί σε ισχαιμία-επαναιμάτωση. 112 Οι Jakob και συν. 111 αναφέρουν ότι η γλυκίνη προστάτευε από την έναρξη της απόπτωσης σε μοντέλα μεσεντέριας ισχαιμίας-επαναιμάτωσης σε επίμυες. Η ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων είναι μια συνηθισμένη επιπλοκή μετά από εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση και περιλαμβάνει όργανα όπως ήπαρ 113, καρδιά 114, νεφρούς 115 και πνεύμονες 116. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου ξεκινούν μια ακολουθία γεγονότων που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και την απελευθέρωση βλαπτικών ουσιών, όπως PAF και ισταμίνη. Τα ενεργοποιημένα 62

63 ουδετερόφιλα διεισδύουν διαμέσου του εντερικού βλεννογόνου και των επιθηλιακών κυττάρων, προκαλώντας βλάβη του βλεννογόνου και του υποβλεννογόνιου με επακόλουθο την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Αυτή η αύξηση στη διαπερατότητα έχει ως αποτέλεσμα τη βακτηριακή αλλόθεση. Εκτός όμως από αυτό, η απελευθέρωση των ουδετερόφιλων, των προϊόντων των βακτηριδίων, καθώς και του παράγοντα PAF οδηγεί σε απομακρυσμένα παθοφυσιολογικά αποτελέσματα όπως τη συστηματική υπέρταση. 117 Σύμφωνα με τους Iglesias και συν. 118, το οξύ πνευμονικό οίδημα μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση είναι αποτέλεσμα της αύξησης της πνευμονικής μικροαγγειακής διαπερατότητας σε υγρά και πρωτεΐνες, όπως και σε αύξηση της υδροστατικής μικροαγγειακής πίεσης. Οι Horton και White 114 απέδειξαν ότι ένας από τους μηχανισμούς που προάγει την καρδιακή δυσλειτουργία μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση σε επίμυες είναι η παραγωγή των δραστικών ριζών οξυγόνου και της λιπιδικής υπεροξείδωσης στις μεμβράνες των καρδιακών κυττάρων. Η ηπατική βλάβη που προκαλείται από τη μεσεντέρια ισχαιμία-επαναιμάτωση μειώθηκε με τη χορήγηση αιθανόλης, που ανέστειλε την απόπτωση των ηπατοκυττάρων Ο ρόλος του συμπληρώματος Το ΣΙΕ οδηγεί στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος και το σχηματισμό διαφόρων μεσολαβητών της φλεγμονής που μπορούν να μεταβάλλουν την αγγειακή ομοιόσταση, όπως οι αναφυλατοξίνες C3a και C5a, και τα τμήματα συμπληρώματος ic3b και C5b-9. Το C5a που είναι περίπου 20 φορές πιο ισχυρό από το C3a, μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω τη φλεγμονώδη απάντηση επάγοντας την παραγωγή και απελευθέρωση διάφορων προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, όπως IL-1, IL-6, της χημειοτακτικής πρωτεΐνης -1 των μονοκυττάρων (MCP-1) και του παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (tumor nekrosis factor α TNF-α). 118 Η αγγειακή ενδοθηλιακή λειτουργία μπορεί επίσης να τροποποιηθεί από τα C5b-9 και ic3b. Το ic3b αποτελεί συνδετικό κρίκο για την προσκόλληση λευκών αιμοσφαιρίων στο αγγειακό ενδοθήλιο μέσω του β2 integrin CD11b/CD18. Το C5b-9 ενεργοποιεί τον πυρηνικό παράγοντα κβ (NF-kB) ώστε να αυξηθεί η μεταγραφή και η έκφραση των μορίων προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων, ενώ αυξάνει την ενεργοποίηση και το χημειοτακτισμό των λευκών αιμοσφαιρίων επάγοντας την έκκριση ενδοθηλιακής IL-8 και MCP Τέλος, το C5b-9 μπορεί άμεσα να αλλάξει τον αγγειακό τόνο με την αναστολή της ενδοθήλιο-εξαρτώμενης χάλασης και την ελάττωση του ενδοθηλιακού κυκλικόυ γουανόσινο-5 - φωσφορικού οξέος (cgmp). Με την 63

64 αλλαγή της αγγειακής ομοιόστασης και την προώθηση της προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων στο αγγειακό ενδοθήλιο, το συμπλήρωμα μπορεί περαιτέρω να περιορίσει τη ροή αίματος στους ισχαιμικούς ιστούς Απομακρυσμένα αποτελέσματα: SIRS ΚΑΙ MODS (σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης και σύνδρομο δυσλειτουργίας πολλών οργάνων) Τα τοπικά αποτελέσματα του ΣΙΕ μπορούν να προκαλέσουν εκσεσημασμένη βλάβη στη θέση της ισχαιμίας, αλλά τα πιο καταστρεπτικά αποτελέσματα δημιουργούνται συχνά μέσω MODS, την κύρια αιτία θανάτου στους ασθενείς των Μονάδων Εντατικής Θεραπείας. Η αναπνευστική ανεπάρκεια, με την αυξημένη διαπερατότητα των αγγείων και τη συσσώρευση υγρού πλούσιου σε ουδετερόφιλα στο κυψελιδικό χώρο, είναι συχνά το πρώτο κλινικό σημάδι MODS. MODS αναπτύσσεται ως αποτέλεσμα του ΣΙΕ σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των σκελετικών μυών, 119,120 του εντέρου 121 και του ήπατος 122,124. Αν και η βλάβη των πνευμόνων είναι αυτή που έχει μελετηθεί περισσότερο από το σύνολο των απομεμακρυσμένων συνεπειών του ΣΙΕ, MODS μπορεί να περιλάβει τη δυσλειτουργία των νεφρών, του γαστρεντερικού συστήματος, του ήπατος, του μυοκαρδίου και του κεντρικού νευρικού συστήματος. Τα ουδετερόφιλα έχουν χαρακτηριστεί ως οι αρχικοί μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων. Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικών παραγόντων φαίνεται να βελτιώνει τη βλάβη των πνευμόνων μετά από ισχαιμία του εντέρου, στοιχείο που στηρίζει την υπόθεση του κεντρικού ρόλου σε ένα συντονισμένο ανοσομεσολαβητικό μοντέλο 124,125. Εντούτοις, η ενεργοποίηση και η συσσώρευση των ουδετεροφίλων εξαρτώνται από άλλους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης του συμπληρώματος, την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και την παραγωγή κυτοκινών και ΔΜΟ 126,127. Ουσιαστικά πειραματικά στοιχεία στηρίζουν την ύπαρξη κεντρικού ρόλου για τους κλασικούς και εναλλακτικούς καταρράκτες του συμπληρώματος ως μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων μετά από ΣΙΕ 128. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι ο αποκλεισμός διαφορετικών σημείων στον καταρράκτη του συμπληρώματος αποτρέπει την απομεμακρυσμένη βλάβη 129. Το συμπλήρωμα αυξάνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης στα ουδετερόφιλα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα 130, προωθώντας τη συσσώρευση και τη μετανάστευση των φλεγμονωδών κυττάρων που μεσολαβούν τη βλάβη στο μακρινό ιστό. Η έκφραση των μορίων προσκόλλησης είναι αρμόδια για τη συσσώρευση και την προσκόλληση των ουδετεροφίλων στην ενδοθηλιακή επιφάνεια, ένα βασικό στοιχείο στη μετανάστευση 64

65 των φλεγμονωδών κυττάρων στον περιβάλλοντα ιστό. Με τη χρήση των μονοκλονικών αντισωμάτων έχει δειχθεί ότι, ποικίλα μόρια προσκόλλησης (συμπεριλαμβανομένου του L -, E - και του P- Selectin) είναι σημαντικοί μεσολαβητές της απομεμακρυσμένης βλάβης οργάνων στο ΣΙΕ, με ποικίλους ρόλους σε διαφορετικά αγγειακά πεδία 131. Εκτός από την παρεμπόδιση της απομάκρυνσης των λευκοκυττάρων, ο εκλεκτικός αποκλεισμός του P- Selectin δείχθηκε ότι μειώνει την εναπόθεση συμπληρώματος, προσδίνοντας ένα πιο εκτενή ρόλο στα μόρια προσκόλλησης στη μεσολάβηση της απομεμακρυσμένης βλάβης. Η διακυττάρια σηματοδότηση με τις κυτοκίνες θεωρείται επίσης ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο βλάβη αυτή. Ίσως η καλύτερα μελετημένη κυτοκίνη είναι ο παράγοντας νέκρωσης όγκων-άλφα (TNFa). Ο TNFa έχει αποδειχθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη μεσολάβηση της συστηματικής βλάβης μετά από ισχαιμία εντέρου ή σκέλους. Στα πλαίσια της μεσεντερίου ισχαιμίας, η αλλόθεση των εντερικών βακτηριδίων υποκινεί την απελευθέρωση TNFa από τα εντερικά μακρόφαγα. Φαίνεται όμως ότι ο καταρράκτης σηματοδότησης της απομεμακρυσμένης βλάβης περιλαμβάνει περισσότερες κυτοκίνες, ενώ πειράματα δείχνουν ότι οι ΔΜΟ που παράγονται στο ΣΙΕ πιθανότατα επάγουν την έκφραση των κυτοκινών. 132 Η ξανθινο-οξειδάση (XO) θεωρείται σημαντική πηγή οξειδωτικών στην περίοδο επαναιμάτωσης και απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος μετά από την ισχαιμική βλάβη, επεκτείνοντας συστηματικά το πεδίο της παραγωγής οξειδωτικών με επιπτώσεις στο μακρινό ιστό 133. Στο ΣΙΕ κάτω άκρων, η XO που απελευθερώνεται δεσμεύεται στο ήπαρ, όπου ενεργοποιεί τα κύτταρα Kupffer και τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα (ΠΜΠ), τα οποία συμβάλλουν στη δυσλειτουργία πολλών οργάνων 134. Η αναστολή της XO έχει αποδειχθεί να μειώνει την ενεργοποίηση των ΠΜΠ και την οξειδωτική καταπόνηση μετά από την ισχαιμία του εντέρου, προτείνοντας έναν θεραπευτικό ρόλο για την παρεμπόδιση της XO ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΒΛΑΒΩΝ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ Η μεσεντέρια ισχαιμία-επαναιμάτωση μπορεί να εκτιμηθεί από τα διάφορα προϊόντα των βλαβών της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης χρησιμοποιώντας ιστομορφολογικές και παθολογοανατομικές μεθόδους. Η μέση αρτηριακή πίεση σε επίμυες εκτιμήθηκε με τη χρησιμοποίηση καθετήρων στη μηριαία αρτηρία ή στην καρωτίδα αρτηρία. Η εντερική μικροαγγειακή και κεφαλική μεσεντέρια κυκλοφορία της αρτηριακής ροής, όπως και η καρδιακή συχνότητα είναι παράμετροι που επίσης 65

66 μετρήθηκαν σε πειραματικά μοντέλα μεσεντέριας 136,137,138,139 ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Εκτίμηση των αερίων αίματος πραγματοποιήθηκε σε μερικές έρευνες που μελέτησαν το ph, την po2, την pco2, τα HCO3, καθώς και το έλλειμμα βάσης μετά από εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση σε επίμυες. 140 Η λιπιδική υπεροξείδωση χρησιμοποιείται συχνά, ώστε να αποδείξει τη συσχέτιση των ελεύθερων ριζών στην κυτταρική βλάβη με την ανίχνευση των λιπιδικών υπεροξειδίων και των διενίων που βρίσκονται μαζί. 141 Εκτός από τη λιπιδική υπεροξείδωση έχει πραγματοποιηθεί και η μέτρηση των βλαβών των πρωτεϊνών και του DNA και των αντιοξειδωτικών, ώστε να προσδιοριστούν in vivo οι δραστικές ρίζες οξυγόνου. Η ανίχνευση ελεύθερων ριζών σε βιολογικά συστήματα είναι δύσκολη λόγω της εξαιρετικά χαμηλής τους συγκέντρωσης (της τάξης του Μ) και της υψηλής ταχύτητας αντίδρασης. Άμεση ανίχνευση των ελεύθερων ριζών κατά τη διάρκεια της ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο του παραμαγνητικού συντονισμού των ηλεκτρονίων, της σαλυκυλικής υδροξυλίωσης και του χημειοφθορισμoύ. Οι μέθοδοι που κυρίως χρησιμοποιούνται για την έμμεση ανίχνευση των ελεύθερων ριζών και κατά συνέπεια των οξειδωτικών βλαβών είναι φασματοφωτομετρικές και χρωματομετρικές, που μετρούν την ενζυμική δραστηριότητα (καταλάση SOD, GSHPx και GSΗ-Rd) και/ή τη συγκέντρωση των τριπεπτιδίων (GSH, GSSG) και αλδεϋδών. 142,143,144 Αυτές οι μετρήσεις μπορούν να πραγματοποιηθούν σε ιστούς, αίμα και άλλα βιολογικά υγρά. Έμμεση ανίχνευση του ΝΟ μπορεί να πραγματοποιηθεί με χημειοφθορισμό, μετατροπή της οξυαιμοσφαιρίνης σε μεθαιμοσφαιρίνη ή ποσοτικό προσδιορισμό των σταθερών μεταβολιτών του ΝΟ, όπως το νιτρικό και το νιτρώδες οξύ. Επίσης και άλλες μέθοδοι έχουν αναφερθεί. Οι Hedge και συν. 145 μελέτησαν τη βιωσιμότητα του εντέρου και παρατήρησαν ότι η συχνότητα και το μέγεθος της εντερικής ηλεκτρικής δραστηριότητας (βασικός ηλεκτρικός ρυθμός) ήταν ευαίσθητα στην ισχαιμία και κατέγραψαν διαφορές πριν να εμφανιστούν οι ιστολογικές αλλαγές. Μεταβολές στην ηλεκτρική δραστηριότητα του λεπτού εντέρου κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης είναι μια δυναμική διαδικασία, που αντικατοπτρίζει τη μεταβολική κατάσταση των λείων μυϊκών ινών. Οι Sun και συν. 146 παρατήρησαν ότι η μέτρηση του γαλακτικού οξέος στο πλάσμα μπορεί να αποτελέσει ένα δείκτη εντερικής βλάβης, παρακολουθώντας την αύξηση στην ενδοτοξιναιμία μετά από 66

67 μεσεντέριο ισχαιμία-επαναιμάτωση στα επίμυες. Οι Günel και συν. 147 πιστεύουν ότι ένα αυξημένο επίπεδο γαλακτικού οξέος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν μια παράμετρος, ώστε να ανακαλυφθούν ασθενείς με ισχαιμία πριν την ερευνητική λαπαροτομία. Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν τα εντερικά λιπαρά οξέα (I-FABP) είναι μικρές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που υπάρχουν στον βλεννογόνο του εντερικού επιθηλίου πολλών θηλαστικών και μπορούν να προσδιοριστούν στο πλάσμα και τα ούρα μετά από κυτταρική βλάβη. 148 Οι παθολογοανατομικές βλάβες του εντέρου μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση στηρίζονται στη διαβάθμιση των βλαβών του εντερικού βλεννογόνου κατά Chiu και συνεργάτες. 148 Βαθμός 0 Τα παρασκευάσματα αυτής της κατηγορίας παρουσιάζουν φυσιολογικές εντερικές λάχνες. Βαθμός 1 Εδώ κατατάσσονται τα παρασκευάσματα που έχουν στην κορυφή των λαχνών μικρή ανόρθωση του επιθηλίου από τη βασική μεμβράνη. Βαθμός 2 Τα παρασκευάσματα παρουσιάζουν απόπτωση του επιθηλίου στην κορυφή των λαχνών. Βαθμός 3 Τα παρασκευάσματα αυτής της κατηγορίας παρουσιάζουν απόπτωση του επιθηλίου από την επιφάνεια των λαχνών σε ποσοστό 50-70%. Βαθμός 4 Στα παρασκευάσματα αυτής της κατηγορίας παρατηρείται απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων από τις λάχνες. Επίσης, υπάρχει μερική νέκρωση του βλεννογόνου. Αυτές οι βλάβες είναι απίθανο να χαρακτηριστούν αναστρέψιμες. Βαθμός 5 Αυτή την κατηγορία αποτελούν παρασκευάσματα που παρουσιάζουν βλάβες ολικής νέκρωσης του βλεννογόνου και επέκτασή της στους υπόλοιπους χιτώνες. 4.4.ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ Οι κλινικές εκδηλώσεις του ΣΙΕ περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα, κυμαινόμενο από τις παροδικές αρρυθμίες έως την ανάπτυξη μοιραίου MODS. Ενώ η απάντηση στο ΣΙΕ μπορεί να ποικίλει μεταξύ των ατόμων, παράγοντες κινδύνου όπως ο διαβήτης, η υπέρταση ή η υπερχοληστεριναιμία αυξάνουν την ευπάθεια στις βλάβες. 1 ΜΥΟΚΑΡΔΙΟ Το μυοκάρδιο μπορεί να παρουσιάσει κάποιο βαθμό δυσλειτουργίας μετά από την επαναιμάτωση. Η συσταλτική δυσλειτουργία είναι παροδική και πλήρως 67

68 αντιστρέψιμη με το χρόνο, αν και μπορεί να απαιτηθεί η προσωρινή ινότροπη ή μηχανική υποστήριξη. Η μυοκαρδιακή αυτή δυσλειτουργία πρέπει να διαφοροποιείται από την επίμονη ισχαιμία. Οι μηχανισμοί που πιθανώς εμπλέκονται, περιλαμβάνουν τη μειωμένη επανασύνθεση ATP, το μικροαγγειακό σπασμό, την κυτταροτοξική βλάβη από τις ΔΜΟ και τη διαταραγμένη διακίνηση του ενδοκυτταρίου ασβεστίου. 149,150 2 ΑΡΡΥΘΜΙΕΣ Οι αρρυθμίες είναι συχνές στους ασθενείς που υποβάλλονται σε θρομβολυτική θεραπεία ή χειρουργική επαναιμάτωση του μυοκαρδίου, και μπορεί να αποτελούν αιτία αιφνίδιου θανάτου μετά από την αποκατάσταση της στεφανιαίας ισχαιμίας. Αρρυθμίες όπως, κοιλιακή ταχυκαρδία, κοιλιακός πτερυγισμός ή ιδιοκοιλιακός ρυθμός, έχουν παρατηρηθεί και μετά από μυοκαρδιακή ΙΕ σε πειραματόζωα με κανονικές στεφανιαίες αρτηρίες, ιδιαίτερα εάν η επαναιμάτωση εγκατασταθεί απότομα. Οι αρρυθμίες μπορεί εν μέρει να οφείλονται στις γρήγορες και ξαφνικές αλλαγές συγκέντρωσης των ιόντων μέσα στους ισχαιμικούς ιστούς μετά την επαναιμάτωση. Η βαθμιαία επαναιμάτωση μπορεί να μειώσει την επίπτωση κακοήθων αρρυθμιών ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΚΝΣ) Η βλάβη επαναιμάτωσης στο κεντρικό νευρικό σύστημα μπορεί να συμβάλει στη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα που παρατηρείται μετά από αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, τραύμα κεφαλής, ή αποκατάσταση καρωτιδικής στένωσης. Το ΣΙΕ στο ΚΝΣ χαρακτηρίζεται από τη διάσπαση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, με συνέπεια το εγκεφαλικό οίδημα, την αυξημένη ενδοκρανιακή πίεση και τη μετακίνηση λευκών αιμοσφαιρίων στον περιβάλλοντα εγκεφαλικό ιστό. 151 Τα λευκά αιμοσφαίρια μπορεί εν συνεχεία να απελευθερώσουν διάφορες πρωτεάσες, μεσολαβητές και ΔΜΟ που μπορούν να οδηγήσουν στην αμετάκλητη βλάβη του ιστού, ιδιαίτερα στη μεταβατική ζώνη. Επιπλέον, λόγω απώλειας της εγκεφαλικής αγγειοδραστικότητας, η αντιδραστική υπεραιμία που μπορεί να εμφανιστεί δύναται να επιδεινώσει το εγκεφαλικό οίδημα. Κατά συνέπεια το ΣΙΕ στο ΚΝΣ μπορεί να εκδηλωθεί κλινικά ως επιδείνωση της αισθητικής, μηχανικής ή γνωστικής λειτουργίας ή ακόμη να οδηγήσει και στο θάνατο. 4 ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ΣΙΕ στο γαστροεντερικό σύστημα εμφανίζεται μετά από διάφορες καταστάσεις όπως αιμορραγική καταπληξία, στραγγαλισμός του εντέρου καθώς και 68

69 μετά από αγγειοχειρουργικές επεμβάσεις. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο εντερικός φραγμός προστατεύει τον οργανισμό από το εχθρικό περιβάλλον του εντερικού αυλού. Στο ΣΙΕ διασπάται ο φραγμός, διαταράσσεται η προστασία, με αποτέλεσμα την αύξηση της εντερικής διαπερατότητας και τη μικροβιακή μετακίνηση αλλόθεση στην πυλαία και συστηματική κυκλοφορία 58. Επίσης μπορεί να οδηγήσει σε εξασθένηση της κινητικότητας και της απορροφητικότητας του εντέρου. Φαίνεται επίσης ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων Kupffer του ήπατος σε ισχαιμία και επαναιμάτωση σκέλους έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της οξειδωτικής καταπόνησης 153. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος και των λευκών αιμοσφαιρίων από τα βακτηρίδια μπορεί τελικά να οδηγήσει στην ανάπτυξη του MODS. 5 ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ (MODS) Η καταστρεπτική συνέπεια του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης είναι η ανάπτυξη βλαβών σε απομεμακρυσμένα όργανα και η πολυοργανική ανεπάρκεια, που μπορεί να οδηγήσει σε θάνατο. Η πολυοργανική ανεπάρκεια είναι η κύρια αιτία θανάτου στις μονάδες εντατικής θεραπείας, με θνησιμότητα που σχετίζεται άμεσα με τον αριθμό των ανεπαρκούντων οργάνων. Οι πνεύμονες ανήκουν στα πιο συχνά προσβεβλημένα όργανα στους ασθενείς που πάσχουν από MODS 153. Η αναπνευστική ανεπάρκεια ακολουθείται συχνά από ηπατική, νεφρική, γαστροεντερική, μυοκαρδιακή και δυσλειτουργία του ΚΝΣ. Εκτός από την αυξημένη μικροαγγειακή διαπερατότητα, το MODS χαρακτηρίζεται και από δυσλειτουργία της πήξης και του ανοσοποιητικού συστήματος, που οδηγεί στη θρόμβωση, τη διάχυτη ενδοαγγειακή πήξη και την ανοσοκαταστολή. Λόγω των καταστρεπτικών αποτελεσμάτων του ΣΙΕ σε απομακρυσμένα όργανα που οδηγεί σε MODS, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη των στρατηγικών για να αποτρέψει ή να μειώσει τα αποτελέσματά του ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ Τα τελευταία χρόνια καταβάλλονται σημαντικές προσπάθειες ώστε να προληφθεί ή να περιοριστεί η έκταση του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Αν και πολλές θεραπευτικές στρατηγικές έχουν αποδειχθεί να είναι αποτελεσματικές στα ελεγχόμενα πειραματικά πρότυπα, εντούτοις δεν κατάφεραν να αναπαραγάγουν αποτελέσματα στην κλινική πρακτική ή δεν έχουν φθάσει ακόμα στις ανθρώπινες κλινικές δοκιμές. Επομένως η έγκαιρη επαναιμάτωση της ισχαιμικής περιοχής παραμένει ο ακρογωνιαίος λίθος της κλινικής αντιμετώπισης. 69

70 1 ΛΕΥΚΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΑ Οι θεραπευτικές στρατηγικές που στρέφονται στα λευκά αιμοσφαίρια περιλαμβάνουν την αναστολή της σύνθεσης μορίων προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων και της απελευθέρωσης φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως ο παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (platelet activation factor PAF), η ισταμίνη, η λευκοτριένη B4 (LTB4), και o TNF-α που προάγουν την ενεργοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων. Μια πειραματική προσέγγιση ήταν να ανασταλεί η απελευθέρωση ή οι υποδοχείς αυτών των μεσολαβητών χρησιμοποιώντας αντισώματα, ή ανταγωνιστές. 151 Μια δεύτερη θεραπευτική προσέγγιση είναι να μειωθεί η σύνθεση μορίων προσκόλλησης λευκών αιμοσφαιρίων. Πολλά αντιφλεγμονώδη φάρμακα, όπως η ασπιρίνη και τα γλυκοκορτικοειδή μειώνουν την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής (π.χ. NF-κΒ, AP-1) που ρυθμίζουν τη σύνθεση των μορίων προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων ή την έκφραση των κυτοκινών. 152 Η βλάβη από το σύνδρομο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης μπορεί επίσης να μειωθεί με την παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ λευκών αιμοσφαιρίων και ενδοθηλίου. Τα μονοκλονικά αντισώματα που κατευθύνονται ενάντια στα μόρια προσκόλλησης των λευκών αιμοσφαιρίων ή τις διαλυτές μορφές τους έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς σε διάφορα πειραματικά πρότυπα για να αποτρέψουν τη σύνδεση. Αν και αυτές οι στρατηγικές έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά αποτελεσματικές στα πειραματόζωα, τα ανθρώπινα κλινικά στοιχεία είναι περιορισμένα ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι παράγοντες σε πειραματικά μοντέλα, όπως Ν- ακετυλοκυστεΐνη, μαννιτόλη, καταλάση, δισμουτάση υπεροξιδίου, αλλοπουρινόλη και βιταμίνη Ε, που δείχνουν ότι η αντιοξειδωτική θεραπεία μπορεί να προλάβει ή να βελτιώσει τις εκδηλώσεις του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. 154 Εντούτοις, σε πολλές ανθρώπινες μελέτες τα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής θεραπείας ήταν διφορούμενα. Κατά συνέπεια, ενώ τα πειραματικά στοιχεία υποστηρίζουν έντονα το ρόλο της οξειδωτικής καταπόνησης στο σύνδρομο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και υποστηρίζουν έναν προστατευτικό ρόλο για την αντιοξειδωτική θεραπεία, περαιτέρω τυχαιοποιημένες μελέτες σε ανθρώπους είναι απαραίτητες. 3 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Η αναστολή της ενεργοποίησης του συμπληρώματος σε πειραματικά μοντέλα έχει δείξει να μειώνει τις βλάβες από ισχαιμία-επαναιμάτωση. Έτσι η χορήγηση ενός 70

71 αναστολέα της μετατροπής του παράγοντα C3, βελτίωσε σημαντικά το μέγεθος του μυοκαρδιακού εμφράγματος (κατά 44%) σε πειραματικό μοντέλο. Και σε αυτό το πεδίο χρειάζονται περαιτέρω μελέτες ώστε να κριθεί η αποτελεσματικότητα στον άνθρωπο. 155 Πρόσφατα, ένα ανασυνδυασμένο, «εξανθρωποποιημένο», αντίσωμα απλής αλύσου, ειδικό για το ανθρώπινο C5 στοιχείο του συμπληρώματος, αποδείχτηκε ότι μειώνει σημαντικά την ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος, την ενεργοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων, τη βλάβη του μυοκαρδίου και τις γνωστικές διαταραχές σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αορτοστεφανιαία παράκαμψη με εξωσωματική κυκλοφορία. 156 Η αναστολή του στοιχείου C5 του συμπληρώματος έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί σημαντική μείωση του μεγέθους ενός μυοκαρδιακού εμφράκτου, της απόπτωσης και της λευκοκυτταρικής διήθησης σε πειραματικό μοντέλο επίμυος ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Η επαναλαμβανόμενη έκθεση των ιστών σε περιοδικές μικρής διάρκειας ισχαιμίας ή υποξίας μπορεί να προστατεύσει από τα επιβλαβή αποτελέσματα της παρατεταμένης ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Αυτό το φαινόμενο αναφέρεται ως ισχαιμική προετοιμασία. 140 Η αδενοσίνη ή η ενεργοποίηση των a1-αδρενεργικών υποδοχέων, φαίνεται να αποτελούν σημαντικό παράγοντα έναρξης της προσαρμογής μετά από πρόκληση προπαρασκευαστικής ισχαιμίας, μέσω της ενεργοποίησης των φωσφολιπασών C ή D, οι οποίες αντιστρόφως ενεργοποιούν την C πρωτεϊνική κινάση. Τα οφέλη από την προπαρασκευαστική ισχαιμία μπορεί να σχετίζονται με την εξαρτώμενη από την C πρωτεϊνική κινάση, φωσφορυλίωση των ευαίσθητων στο ATP διαύλων καλίου. 158 Η ισχαιμική προετοιμασία προάγει, επίσης, την εξαρτώμενη από την πρωτεϊνική κινάση C μετακίνηση της 5'-νουκλεοτιδάσης στην κυτταρική επιφάνεια, γεγονός που αυξάνει την παραγωγή της κυτταρικής αδενοσίνης, που ίσως συνεισφέρει στην προστασία κατά την ισχαιμία-επαναιμάτωση, αυξάνοντας τα κυτταρικά ενεργειακά αποθέματα, και/ή αναστέλλοντας την προσκόλληση των λευκών αιμοσφαιρίων ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΙΙΙ Η Αντιθρομβίνη ΙΙΙ, είναι ένας φυσιολογικός αναστολέας της θρομβίνης και κάποιων ακόμη πρωτεασών της σερίνης 159 και προάγει την απελευθέρωση προστακυκλίνης (PGI2 ) από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. 160,161 Η χορήγησή της έχει προταθεί ως μία από τις εναλλακτικές θεραπευτικές προσεγγίσεις για την μείωση των 71

72 συνεπειών του συνδρόμου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, διότι, εμποδίζει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων, αναστέλλει την ενεργοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων και προάγει την αγγειοδιαστολή, συμβάλλοντας έτσι θετικά στην διατήρηση της άρδευσης στο επίπεδο της μικροκυκλοφορίας. 159,160,162,163,164,165,166 Επίσης, έχει βρεθεί ότι καταστέλλει την οξεία φλεγμονώδη αντίδραση και προφυλάσσει από την διάχυτη ενδαγγειακή πήξη, μετά από σήψη, τραύμα, ή έκλυση ενδοτοξινών. 167, 168,169,170 Η μείωση των επιπέδων της Αντιθρομβίνης ΙΙΙ, σε αυτές τις περιπτώσεις, συνδέθηκε με αυξημένα ποσοστά εκδήλωσης διάχυτης ενδαγγειακής πήξης και πολυοργανικής ανεπάρκειας και κατά συνέπεια, η συμπληρωματική χορήγησή της οδηγεί σε μείωση των ποσοστών θνητότητας. Έχει αποδειχθεί ότι σε σηπτικούς ασθενείς, αυτή η θεραπευτική τακτική, όχι μόνο βοηθά στον έλεγχο της πηκτικότητας, αλλά βελτιώνει και την οργανική δυσλειτουργία και έτσι αυξάνει την 160,162,163, 171 επιβίωση. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ- ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΤΟ ΝΕΦΡΟ Η ισχαιμία-επαναιμάτωση του εντέρου οδηγεί σε τοπική βλάβη αλλά και βλάβες σε άλλα όργανα. Μετά από την ισχαιμία- επαναιμάτωση του εντέρου είναι δυνατό να εγκατασταθεί σύνδρομο ανεπάρκειας πολλαπλών οργάνων. Η επίδραση της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του εντέρου στο νεφρό δεν έχει μελετηθεί ιδιαίτερα. Ακολουθεί μια λεπτομερής αναφορά στη σύγχρονη έρευνα στο συγκεκριμένο αντικείμενο. 5.1.ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΣΧΑΙΜΙΑ- ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ Από διάφορες πειραματικές μελέτες 172, βρέθηκε ότι η βλάβη στο νεφρικό ιστό οφείλεται σε υπεροξείδωση των λιπιδίων, η οποία συμβαίνει μετά την ισχαιμίαεπαναιμάτωση. Τα επίπεδα μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) που αποτελούν δείκτη υπεροξείδωσης των λιπιδίων, η οποία οδηγεί σε καταστροφή των βιομεμβρανών, αυξήθηκαν σημαντικά καθώς και τα επίπεδα της ουρίας του αίματος. Βέβαια, πρέπει 72

73 να σημειωθεί ότι το εύρημα αυτό δεν υπήρχε σε επαναιμάτωση 24 ωρών και 1 βδομάδας, γεγονός που σημαίνει ότι οι αλλοιώσεις των νεφρών είναι αναστρέψιμες. Ιστολογικά, οι αλλοιώσεις αφορούσαν κυρίως τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών των σπειραμάτων και τα μιτοχόνδρια των επιθηλιακών κυττάρων των σωληναρίων. Παρατηρήθηκε οίδημα των ενδοθηλιακών κυττάρων και καταστροφή των ακρολοφιών των μιτοχονδρίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών των σπειραμάτων και στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων. Επίσης παρατηρήθηκε διήθηση των τριχοειδών των σπειραμάτων και του διάμεσου χώρου από πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. Στα πειραματόζωα με επαναιμάτωση μεγάλης διάρκειας (24 ώρες) παρατηρήθηκε καταστροφή των ακρολοφιών των μιτοχονδρίων και επιπέδωση των μικρολαχνών του επιθηλίου των σωληναρίων. Στην ομάδα με 1 εβδομάδα επαναιμάτωση παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των επιθηλιακών κυττάρων και των κυττάρων του έσω πετάλου του ελύτρου του Bowman και καταστροφή των ποδοκυττάρων. Οι βλάβες από επαναιμάτωση μικρής διάρκειας βρέθηκε ότι ήταν εντονότερες στα μιτοχόνδρια και στα επιθηλιακά κύτταρα των μικρολαχνών των νεφρικών σωληναρίων. Όταν η χρονική διάρκεια της επαναιμάτωσης ήταν μεγάλη, οι αλλοιώσεις του νεφρικού ιστού ήταν εμφανείς και σε άμεση σχέση με τις χρόνιες μεταβολές, όπως την αύξηση του μεσαγγειακού χώρου. Συμπερασματικά: 1) το μοντέλο εντερικής ισχαιμίας επαναιμάτωσης προκαλεί βλάβη στο νεφρό μέσω υπεροξείδωσης των λιπιδίων του νεφρικού ιστού, 2) η νεφρική βλάβη είναι έντονη τις 2 πρώτες ώρες και υποχωρεί σε 24 ώρες, 3) οι μορφολογικές αλλοιώσεις είναι εμφανείς με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και εντοπίζονται ιδιαίτερα στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών των σπειραμάτων και στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων και 4) με την πάροδο του χρόνου, παρά το γεγονός ότι η ουρία και η υπεροξείδωση των λιπιδίων του νεφρικού ιστού επανέρχονται σε φυσιολογικά επίπεδα, παρατηρούνται χρόνιες μη αναστρέψιμες μορφολογικές αλλοιώσεις στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. 73

74 5.2. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ/ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΛΕΠΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ ΣΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Είναι γνωστό ότι η ισχαιμία/ επαναιμάτωση προκαλεί συστηματική αντίδραση στη βλάβη με την ενεργοποίηση μεσολαβητών φλεγμονής όπως τα ουδετερόφιλα και το συμπλήρωμα και την απελευθέρωση ουσιών που δρουν τοπικά όπως τα εικοσανοειδή, το μονοξείδιο του αζώτου και οι κυτοκίνες. Οι μεσολαβητές αυτοί προκαλούν μια γενικευμένη μικροαγγειοπάθεια και κυτταρική βλάβη του παρεγχύματος που προκαλεί ηπατική και αναπνευστική δυσλειτουργία. Το φαινόμενο της επαναιμάτωσης του εντέρου φαίνεται ότι προκαλεί μεταβολές στην αιματική ροή, είτε της συστηματικής κυκλοφορίας είτε τοπικά, ώστε να προκαλούνται αλλοιώσεις του νεφρικού παρεγχύματος. Σε πειραματικά μοντέλα βρέθηκε ότι προκλήθηκε 80% μείωση της ροής του αίματος στο νεφρό των πειραματόζωων που είχαν υποβληθεί σε επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου. Η σχέση μεταξύ της μείωσης της νεφρικής αιμάτωσης και της διαταραχής της νεφρικής λειτουργίας εξαιτίας κάποιας βλάβης έχει μελετηθεί σε μοντέλα ενδοτοξιναιμίας, 173 μικροβιαιμίας, 174 αιμορραγίας 175 και συστηματικής ενεργοποίησης του συμπληρώματος 177. Στην περίπτωση της διαταραχής της νεφρικής λειτουργίας μετά από εντερική ισχαιμία-επαναιμάτωση, φαίνεται ότι συμμετέχουν πολλοί παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί. Υπεύθυνοι είναι διάφοροι εξωγενείς και ενδογενείς παράγοντες. Οι εξωγενείς παράγοντες που επηρεάζουν τη νεφρική λειτουργία είναι η διαταραχή της καρδιακής λειτουργίας και η μείωση του ενδοαγγειακού όγκου. Επίσης, στη ρύθμιση της αιματικής ροής στους νεφρούς κατά τη διάρκεια της συστηματικής αντίδρασης στη βλάβη συμμετέχουν, όπως προαναφέρθηκε, διάφοροι μεσολαβητές φλεγμονής (όπως τα ουδετερόφιλα και το συμπλήρωμα) καθώς και αγγειοδραστικοί μεσολαβητές (όπως οι κατεχολαμίνες και το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης). 176 Τέλος, ο νεφρός παράγει ενδογενείς παράγοντες οι οποίοι δρουν τοπικά και μεταβάλουν την μικροαγγειακή κυκλοφορία. Τέτοιοι παράγοντες είναι τα αγγειοδιασταλτικά και αγγειοσυσταλτικά εικοσανοειδή, το μονοξείδιο του αζώτου, ο παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων και πιθανόν η ενδοθηλίνη. 176 Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου ενεργοποιούνται διάφοροι παράγοντες. Η δραστικότητα του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, η ενεργοποίηση του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης και τα αυξημένα επίπεδα κατεχολαμινών στην κυκλοφορία μπορεί να οδηγήσουν σε 74

75 αγγειοσύσπαση των νεφρικών αγγείων. Στη νεφρική αιματική ροή επίσης συμβάλλουν ενεργοποιημένοι φλεγμονώδεις παράγοντες όπως το συμπλήρωμα και τα ουδετερόφιλα. 178 Και οι δύο παράγοντες βρέθηκε ότι ενεργοποιούνται κατά την ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου και σχετίζονται με τη μεταβολή της αιμάτωσης διαφόρων ιστών. Έχει αποδειχθεί από τους Schirmer και συν. 177 η διαταραχή της αιμάτωσης του ήπατος και των νεφρών εξαιτίας ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Άλλοι ερευνητές παρατήρησαν διαταραχές της μικροκυκλοφορίας του πνεύμονα εξαιτίας του συμπληρώματος. 179 Τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα βρέθηκε ότι συμμετέχουν στη διαταραχή της μικροκυκλοφορίας που παρατηρείται μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση του μυοκαρδίου και αιμορραγία. 180 Ο νεφρός αποτελεί ένα όργανο που ανταποκρίνεται στις καταστάσεις αυτές με παραγωγή αγγειοσυσπαστικών ουσιών όπως η θρομβοξάνη Α2, η λευκοτριένη C4 και η ενδοθηλίνη. Οι Rothenbach και συν. 181 παρατήρησαν αύξηση της παραγωγής θρομβοξάνης Α2 από το νεφρό, μετά από 60 λεπτά ισχαιμία και 60 λεπτά επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου, η οποία θεώρησαν ότι σχετίζεται με τη μείωση της νεφρικής αιματικής ροής μετά ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου. Μικρότερη σημασία φαίνεται να έχει η επίδραση της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στην παραγωγή αγγειοδιασταλτικών ουσιών από το νεφρό, όπως η PGE2, η PGI2 και το μονοξείδιο του αζώτου. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι ο νεφρός απαντάει στη βλάβη από ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου με την αυξημένη παραγωγή θρομβοξάνης Α2 (που προκαλεί αγγειοσύσπαση) και τον περιορισμό της σύνθεσης των αγγειοδιασταλτικών PGE2 και PGI2 180, 182. Επίσης, πρόσφατα βρέθηκε ότι σημαντικό ρόλο στην αντίδραση του νεφρού στη βλάβη παίζουν τα παράγωγα της κυκλοοξυγενάσης και το μονοξείδιο του αζώτου. Στα συμπεράσματα αυτά κατέληξαν ερευνητές μετά από μελέτη στην οποία βρέθηκε ότι η χορήγηση ινδομεθακίνης ή αναστολέα της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου μείωνε σημαντικά τη νεφρική αιμάτωση μετά από αποκλεισμό της αορτής. 183 Στη μελέτη των LaNoue και συν. 184 βρέθηκε επίσης ότι η εντερική ισχαιμίαεπαναιμάτωση προκαλούσε κατά 25% μείωση των επιπέδων του ΑΤΡ στο νεφρικό ιστό, εύρημα που συνηγορεί υπέρ δυσλειτουργίας του νεφρού εξαιτίας ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου. Μείωση των επιπέδων ΑΤΡ του νεφρού έχει βρεθεί σε καταστάσεις αιμορραγικού shock και ενδοτοξιναιμίας. 185,186 Φαίνεται ότι η μείωση του ΑΤΡ στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων επηρεάζει την ικανότητα των κυττάρων να προστατευτούν από υπερφόρτωση με Ca2+, η οποία μπορεί να 75

76 οδηγήσει σε δυσλειτουργία των σωληναρίων. Η αύξηση του ενδοκυττάριου Ca2+, έχει σχετιστεί με αγγειοσύσπαση και μείωση της σπειραματικής διήθησης του νεφρού. 187 Στη μελέτη αυτή η επίδραση της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου στη νεφρική λειτουργία έγινε in vitro, κάτω από σταθερή θερμοκρασία, με σταθερή αιμάτωση και απουσία αγγειοδραστικών ουσιών, όπως κατεχολαμινών. Επίσης, στους νεφρούς των ποντικών που υποβλήθηκαν σε ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου, παρατηρήθηκε 25% μεγαλύτερη απώλεια νατρίου στα ούρα από την ομάδα ελέγχου, αποτέλεσμα που σήμαινε πρώιμα οξεία σωληναριακή δυσλειτουργία. Παρόμοια σωληναριακή δυσλειτουργία παρατήρησαν και οι Rothenbach και συν. 181 και Beecherl και συν. 188 οι οποίοι διαπίστωσαν διαταραχή του επιθηλίου των σωληναρίων και εξαφάνιση των μικρολαχνών από το 1 min μετά την ισχαιμία. Αντίστοιχη σωληναριακή δυσλειτουργία παρατηρήθηκε σε ασθενείς μετά από αποκλεισμό της αορτής άνωθεν των νεφρικών αρτηριών κατά τη διάρκεια επέμβασης για ανεύρυσμα και σε διάφορα πειραματικά μοντέλα οξείας νεφρικής βλάβης. 185,186,188 Οι Aldemir και συν. 189,190 μελέτησαν επίσης την επίδραση 60 λεπτών ισχαιμίας και 240 λεπτών επαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου στο νεφρό ποντικών και κατέληξαν στα εξής σημαντικά συμπεράσματα: 1) η ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου προκαλεί διαταραχή της νεφρικής λειτουργίας και 2) ένας από τους βασικούς παράγοντες αυτής της διαταραχής είναι η καταστροφή του επιθηλίου των νεφρικών σωληναρίων που οδηγεί σε οξεία νεφρική ανεπάρκεια. Όπως είναι γνωστό, ο κυτταρικός πληθυσμός του νεφρού είναι ανομοιογενής αλλά βρέθηκε ότι το εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο και η αγκύλη του Henle είναι πιο ευαίσθητα στην παρατεταμένη ισχαιμία. 191,192,193 Η κυτταρική βλάβη που παρατηρείται στα νεφρικά αγγεία οφείλεται σε λιπιδική υπεροξείδωση των κυτταρικών μεμβρανών. Κύριος δείκτης αυτής της βλάβης είναι η μαλονδιαλδεΰδη (MDA). Βρέθηκε στις μελέτες των Aldemir και συν. 189,190 ότι τα επίπεδα MDA των νεφρών ήταν αυξημένα στην ομάδα εντερικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης εξαιτίας λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η αντίδραση του οργάνου στις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που απελευθερώνονται εξαιτίας του οξειδωτικού stress, γίνεται με διάφορα ένζυμα (δισμουτάση του σουπεροξειδίου, καταλάση, υπεροξειδάση της γλουταθειόνης) και με αντιοξειδωτικές ουσίες (γλουταθειόνη, βιταμίνη Ε). Στη μελέτη των Aldemir και συν. 189 παρατηρήθηκε επίσης μείωση των επιπέδων γλουταθειόνης των νεφρών, στην ομάδα ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης του λεπτού εντέρου, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι το 76

77 οξειδωτικό stress που προκαλείται από την ισχαιμία-επαναιμάτωση του λεπτού εντέρου συμβάλλει στην παθογένεση της νεφρικής ανεπάρκειας που παρατηρείται. Έχει μελετηθεί επίσης η συμμετοχή του μονοξειδίου του αζώτου στην παθογένεση της οξείας νεφρικής ανεπάρκειας. 194,195,196 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ Η ανίχνευση της αντιθρομβίνης στο ανθρώπινο πλάσμα και η περιγραφή του ρόλου της έγινε το 1938 από τον Quick 197. Το 1993 η Διεθνής Ένωση Θρόμβωσης και Αιμόστασης (International Society of Thrombosis and Haemostasis) όρισε ότι το όνομα του μορίου απλοποιείται σε αντιθρομβίνη (AT), αλλά συχνά η πρωτεΐνη αυτή αναφέρεται με το παλαιό της όνομα, αντιθρομβίνη ΙΙΙ (ATIII) ΔΟΜΗ, ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ Η ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Η AT είναι χαρακτηριστικός αντιπρόσωπος της οικογένειας των σερινών. Η δραστική περιοχή σύνδεσης με τη θρομβίνη βρίσκεται στη θέση Arg393-Ser394 της COOH-περιοχής, ενώ η περιοχή σύνδεσης με την ηπαρίνη είναι μέρος της NH2- τελικής περιοχής 198. Είναι πολυπεπτιδική γλυκοπρωτεΐνη η οποία παράγεται στο ήπαρ και έχει μοριακή μάζα 58 kda. Παράγεται και ελέγχεται από το γενετικό υλικό που βρίσκεται στον μακρύ βραχίονα του ανθρώπινου χρωμοσώματος 1. Δύο μοριακά είδη βρίσκονται στο πλάσμα: η α-ατ σε ποσοστό 90%, και η β-ατ σε ποσοστό 10%. Η α- ΑΤ, έχει χαμηλότερη δεσμευτική συγγένεια με την ηπαρίνη συγκριτικά με τη β-ατ. Η ΑΤ συντίθεται κυρίως στο ήπαρ. Το φυσιολογικό εύρος της δραστικότητας της ΑΤ στο πλάσμα κυμαίνεται μεταξύ % και ο χρόνος ημίσειας ζωής της είναι 2,3-4,8 ημέρες. Εντούτοις, ο χρόνος αυτός μπορεί να μειωθεί σε λίγες ώρες υπό συνθήκες οξείας κατανάλωσης (σήψη, τραύμα, έγκαυμα) 199. Είναι ένας ανασταλτικός παράγοντας πρωτεασών πλάσματος ο οποίος δρα στην εξωγενή, ενδογενή και κοινή οδό πήξης. Εκτός από τη λειτουργία της ως ανασταλτικός παράγοντας της θρομβίνης, η ΑΤ έχει την ικανότητα να εμποδίζει τους παράγοντες Xα και XIIα 200. Εμποδίζει, επίσης, τη δραστηριότητα του παράγοντα IXa 200. Η ΑΤ δημιουργεί στοιχειομετρική σύνδεση με τη θρομβίνη και άλλες πρωτεάσεις πλάσματος 201. Τα αποτελέσματα ερευνών επιβεβαιώνουν ότι η ΑΤ δρα 77

78 μαζί με την ηπαρίνη για να αδρανοποιήσει το σύμπλεγμα ιστικού παράγοντα παράγοντα VIIα του πηκτικού συστήματος 202. Κυκλοφορεί πρωτίστως ως μονομερές μόριο στο πλάσμα, αλλά βρίσκεται, επίσης και στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων και των ενδοθηλιακών κυττάρων ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΗ Η αντιθρομβίνη, πέρα από την αντιπηκτική, εμφανίζει και ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση. Η αντιφλεγμονώδης δράση της ΑΤ οφείλεται στη μείωση της απελευθέρωσης λυσοσωμικών πρωτεασών και κυτοκινών 202,203. Ελλείψει των θεραπευτικών δόσεων της ηπαρίνης, η ΑΤ δεσμεύεται πρωτίστως με τις γλυκοσαμινογλυκάνες στην επιφάνεια κυττάρων του ενδοθηλίου. Σ αυτήν τη θέση η ΑΤ όχι μόνο ασκεί τις τοπικές αντιπηκτικές ιδιότητες της, αλλά παρουσιάζει και την τοπική αντιφλεγμονώδη δραστηριότητα 204. Η ΑΤ προκαλεί την επαγωγή της σύνθεσης της προστακυκλίνης από τα κύτταρα του ενδοθηλίου. Μπορεί, επίσης, να προκαλέσει την αντιφλεγμονώδη δράση μέσω δράσης στους υποδοχείς ενεργοποίησης των πρωτεασών των μεμβρανών (PARS, Protease Activating Receptors), όπως syndecan-4. Οι υποδοχείς syndecan-4 έχει αποδειχθεί ότι υπάρχουν στα λεμφοκύτταρα, σε ώριμα μακροφάγα και πρόσφατα ανιχνεύτηκαν σε ουδετερόφιλα 205. Ο Kaneider και συν. παρατήρησαν ότι η μετανάστευση των κυττάρων εμποδίζεται από τα αντι-syndecan-4 αντισώματα, γεγονός το οποίο επιβεβαιώνει τη λειτουργική συμμετοχή των syndecan-4 υποδοχέων στην αποτελεσματικότητα της AT. Τα syndecans-4 ανήκουν στην ομάδα πρωτεογλυκανών και αποτελούνται από μια πρωτεΐνη πυρήνα με την οποία είναι ομοιοπολικά συνδεμένα τα πολυμερή μόρια υδατανθράκων (glucosaminoglycans) 198. Βιοχημικές μελέτες προσδιορίζουν τους υποδοχείς syndecan-4 ως λειτουργικούς μεσολαβητές για τη δράση της ΑΤ, η οποία συνδέεται με τους υποδοχείς syndecan-4 στην περιοχή σύνδεσής με την ηπαρίνη. Οι υποδοχείς syndecan-4 συμμετέχουν στη μεταφορά σήματος στην επιφάνεια κυττάρων και παίζουν κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο της λειτουργίας τους. Επιταχύνουν τον σχηματισμό των συμπλεγμάτων πρωτεασών-ανασταλτικών παραγόντων πρωτεασών και των ενδιάμεσων αλληλεπιδράσεων της επιφάνειας κυττάρων με διάφορα ένζυμα και δομικές πρωτεΐνες. 78

79 Η χορήγηση της ΑΤ σε πειραματόζωα, τα οποία είχαν υποστεί τη δράση της ενδοτοξίνης, μείωσε σημαντικά την έκφραση της IL-6, την προσκόλληση των ουδετερόφυλων, των μονοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων, την αλληλεπίδραση των κυττάρων με το ενδοθήλιο των αγγείων, με αποτέλεσμα τη μείωση της διαπερατότητας των τριχοειδών και τον περιορισμό της βλάβης των ιστών και των οργάνων 206,207. Η ΑΤ προάγει τη σύνθεση της προστακυκλίνης: αντιπηκτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Εκτός από τις αντιπηκτικές της ιδιότητες η ΑΤ συνδέεται με την επιφάνεια του ενδοθηλίου και υποκινεί την αύξηση της σύνθεσης της προστακυκλίνης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η προσκόλληση της ΑΤΙΙΙ στις GAGs του ενδοθηλίου προκαλεί την απελευθέρωση προστακυκλίνης (PGI2), η οποία με τη σειρά της καταστέλλει την ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων, την παραγωγή των TNF-α από τα μονοκύτταρα, την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και την προσκόλλησή τους στα κύτταρα του ενδοθηλίου. Η προστακυκλίνη είναι ένας ισχυρός ανασταλτικός παράγοντας της συνάθροισης των αιμοπεταλίων. Εμποδίζει, επίσης, τη σύνθεση των προφλεγμονωδών κυτοκινών με τη μεσολάβηση της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (c-amp). Η διαδικασία αυτή μειώνει την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων, εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την απελευθέρωση της ελαστάσης και των ελευθέρων ριζών οξυγόνου 208,209,210. Πρέπει να σημειωθεί ότι αυτές οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες παρατηρούνται μόνον ελλείψει της ηπαρίνης (που παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση της ΑΤ με το θειικό άλας ηπαράνης στο ενδοθήλιο) 211. Αναφέρεται ότι η αντιφλεγμονώδης δράση της ΑΤ εκδηλώνεται σε πολύ υψηλά επίπεδα πλάσματος (>200%) H ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ ΣΤΗ ΔΙΑΧΥΤΗ ΕΝΔΑΓΓΕΙΑΚΗ ΠΗΞΗ ΕΞ ΑΙΤΙΑΣ ΣΗΠΤΙΚΗΣ ΣΥΝΔΡΟΜΗΣ Σε σηπτικές καταστάσεις παρατηρείται μία γρήγορη μείωση των επιπέδων της ΑΤ ως συνέπεια υπερκατανάλωσης και σχηματισμού συμπλεγμάτων με τους ενεργοποιημένους παράγοντες πήξης 213. Η ΑΤ, επιπλέον, είναι μια αρνητική πρωτεΐνη οξείας φάσης η οποία είναι ευαίσθητη στην ενζυματική καταστροφή από τις πρωτεάσες των ουδετερόφιλων, όπως η ελαστάση που απελευθερώνεται κατά τη φάση ενεργοποίησης της φλεγμονής. Η γρήγορη μείωση των επιπέδων της ΑΤ έχει προγνωστική αξία ως προς την έκβαση των ασθενών με βαριά σηψαιμία

80 6.4. ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ-ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ Η βλάβη εξαιτίας ισχαιμίας επαναιμάτωσης παρατηρείται συχνά κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μεταμόσχευσης οργάνων ή κατά την προσωρινή διακοπή της αιματικής ροής διεγχειρητικά ή εξαιτίας άλλης αιτιολογίας. Η αλληλεπίδραση των ουδετερόφιλων με το ενδοθήλιο μετά από ισχαιμία μειώνει τη ροή αίματος στη μικροκυκλοφορία και, με αυτόν τον τρόπο, προκαλεί τη δυσλειτουργία οργάνων. Σε πειραματική μελέτη σε επίμυες αναφέρεται ότι η αντιθρομβίνη βελτιώνει την ηπατική αιματική ροή και μειώνει την απελευθέρωση των ηπατικών ενζύμων σε ένα μοντέλο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του ήπατος. Η μέτρηση των επιπέδων της μυελουπεροξειδάσης έδειξαν σαφώς τη μειωμένη διήθηση του ηπατικού ιστού από τα λευκοκύτταρα, όπως και την αύξηση των επιπέδων της προστακυκλίνης στο ήπαρ μετά τη χορήγηση της ΑΤ. 215,216 Η προκληθείσα από την ΑΤ απελευθέρωση της προστακυκλίνης από τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό μηχανισμό της δράσης της κατά τη διάρκεια ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Η προστακυκλίνη όχι μόνο ελαττώνει την προσκόλληση των λευκοκυττάρων και τη συνάθροιση των αιμοπεταλίων, αλλά είναι επίσης γνωστό ότι είναι ένας ισχυρός αγγειοδιασταλτικός παράγοντας 198. Η άμεση επίδραση της ΑΤ στη μικροκυκλοφορία ανεξάρτητα από την αντιπηκτική της δράση έχει περιγραφεί σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του ήπατος και του μεσεντερίου 199,215. Έτσι φάνηκε ότι η προφυλακτική χρήση της αντιθρομβίνης όταν χορηγείται πριν από το κλείσιμο της μεσεντέριας αρτηρίας, προκαλεί μειωμένη υπεροξείδωση λιπιδίων μέσω εξαρτώμενου από την προστακυκλίνη μηχανισμού. Η πρώτη ομάδα που ερεύνησε την επίδραση της αντιθρομβίνης στη βλάβη από ισχαιμία-επαναιμάτωση έδειξε σημαντική μείωση της προσκόλλησης των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο μετά τη χορήγηση της αντιθρομβίνης. Η μειωμένη προσκόλληση των λευκοκυττάρων συνδέεται με τη μείωση της διαπερατότητας των αγγείων σε πειραματικό μοντέλο της μεσεντέριας ισχαιμίας 217. Επιπλέον, η αντιθρομβίνη έχει χρησιμοποιηθεί σε πειραματικές εργασίες που αφορούν στην οξεία απόρριψη του μοσχέυματος 218. Σε ένα πρότυπο μοντέλο αλλομεταμόσχευσης σε επίμυες, η επιβίωση του μοσχεύματος παρατάθηκε σημαντικά από μία συνδυασμένη χορήγηση ενός διαλυτού υποδοχέα τύπου-1 και της 80

81 αντιθρομβίνης. Επιπλέον, η αντιθρομβίνη προκάλεσε την αύξηση της επιβίωσης μεταμοσχευθείσας καρδιάς σε πειραματόζωα 219. Η εγγενής θρομβωτική δραστηριότητα του ενδοθηλίου θεωρείται ότι συμβάλλει στην απόφραξη των στεφανιαίων αρτηριών που παρατηρείται σε ασθενείς με μεταμόσχευση καρδιάς. Η σχετική έλλειψη της ΑΤ στα στεφανιαία αγγεία μπορεί να προκαλέσει μία κατάσταση αυξημένης πηκτικότητας και η αναστολή της θρομβογένεσης στα αγγεία της καρδιάς μετά από τη μεταμόσχευση αποτελεί τον κύριο λόγω της χρήσης της ΑΤ στους ασθενείς αυτούς. Τα αποτελέσματα της χορήγησης αντιθρομβίνης κατά τη διάρκεια της μεταμόσχευσης νεφρών σε κλινικές μελέτες δείχνουν μια σαφή μείωση της μεταισχαιμικής βλάβης ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΕ ΕΝΔΟΤΟΞΙΝΑΙΜΙΑ Από διάφορες μελέτες διαπιστώθηκε ιδιαίτερα σημαντική μείωση προσκόλλησης των λευκοκυττάρων στα μετατριχοειδικά αγγεία μετά από χορήγηση ενδοτοξίνης και, ακολούθως, ενδοφλέβια χορήγηση αντιθρομβίνης. Παρατηρήθηκε ότι η αντιθρομβίνη μειώνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης του ενδοθηλίου, όπως αυτών της οικογένειας IgG (ICAM-1, VCAM-1, Ιntercellular Αdhesion Μolecule) και των λευκοκυτταρικών β ιντεγρινών (CD11/CD18) 221. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό να επισημανθεί ότι η δράση της αντιθρομβίνης εξαρτάται από μια ανεμπόδιστη αλληλεπίδραση με τα κύτταρα του ενδοθηλίου. Σε άλλη μελέτη οι Hoffmann και συν. 222 προσπάθησαν να ερευνήσουν τον μηχανισμό με τον οποίον επιτυγχάνεται η βελτίωση της μικροκυκλοφορίας κατά τη διάρκεια της ενδοτοξιναιμίας αναλύοντας την αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων και της AT. Για να εξεταστεί αυτός ο μηχανισμός, χρησιμοποίησαν ΑΤ η οποία τροποποιήθηκε χημικά, διατήρησε την αντιπηκτική και την ανασταλτική των προτεασών δράση, αλλά είχε αποκλεισμένη την περιοχή συνδέσεων με τη γλυκοσαμινογλυκάνη. Αυτή η μορφή της ΑΤ, αναφέρεται ως triptophan (Trp)- δεσμευμένη και δεν είναι ικανή να συνδέεται με την επιφάνεια του ενδοθηλίου, αλλά διατηρεί τη δράση της στον «καταρράκτη» πήξης. Η άθικτη ΑΤ μείωσε σημαντικά την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, η οποία προκλήθηκε από τη χορήγηση του LPS (λιποπολυσακχαρίτη). Η Trp-δεσμευμένη αντιθρομβίνη διατήρησε την αντιπηκτική της δράση, αλλά απώλεσε τη δράση της στα λευκοκύτταρα λόγω της αδυναμίας της τροποποιημένης ΑΤ να συνδεθεί με τις γλυκοσαμινογλυκάνες της κυτταρικής μεμβράνης του ενδοθηλίου. Επιπλέον, η 81

82 άθικτη ΑΤ και όχι η δεσμευμένη με τριπτοφάνη (Trp), απέτρεψε την προκληθείσα από ενδοτοξίνη μείωση της λειτουργικής τριχοειδικής πυκνότητας, η οποία απεικονίζει την ανεπάρκεια της τριχοειδικής αιματικής ροής. Σε μία άλλη πειραματική μελέτη η δεσμευμένη ΑΤ με Trp απέτυχε να εμποδίσει την απελευθέρωση του ιστικού παράγοντα και της ιντερλευκίνης-6 από τη δράση του LPS, ενώ η άθικτη μορφή παρεμπόδισε αποτελεσματικά την απελευθέρωση και των δύο ουσιών 223. Η ΑΤ προκαλεί την απελευθέρωση της προστακυκλίνης σε καλλιέργειες κυττάρων, αλλά και την αύξηση της συγκέντρωσης της προστακυκλίνης πλάσματος σε πειραματικές και κλινικές μελέτες 224,225. Οι Uchiba και συν.93 έδειξαν ότι κατά τη διάρκεια της ενδοτοξιναιμίας η χορήγηση της ΑΤ αύξησε τη συγκέντρωση στο πλάσμα της κετοπροσταγλανδίνης (6- ketoprostaglandin-f1α), μιας ουσίας η οποία αποτελεί το τελικό προϊόν της προστακυκλίνης. Η χορήγηση της προστακυκλίνης προκαλεί τα ίδια προστατευτικά αποτελέσματα με την ΑΤ στην ενδοτοξιναιμία και στη βλάβη του ήπατος εξαιτίας ισχαιμίαςεπαναιμάτωσης. Επειδή η παρεμπόδιση της προστακυκλίνης από ινδομετακίνη καταργεί εντελώς το θετικό αποτέλεσμα της δράσης της ΑΤ στη μικροκυκλοφορία, είναι πιθανό ότι η ΑΤ αποτρέπει την ισχαιμία των ιστών αλληλεπιδρώντας με το ενδοθήλιο των αγγείων και προκαλώντας απελευθέρωση προστακυκλίνης 226. Η χορήγηση υψηλών δόσεων ηπαρίνης αποτρέπει τη σύνδεση αντιθρομβίνηςενδοθηλιακών κυττάρων και την εξαρτώμενη από αυτήν κλινική δράση της αντιθρομβίνης 227. Η ηπαρίνη αποτρέπει τη δέσμευση των γλυκοσαμινογλυκανών στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων με την αντιθρομβίνη. Δεδομένου ότι η περιοχή σύνδεσης με την ηπαρίνη είναι η ίδια με αυτήν που συμμετέχει στην παρεμπόδιση του χημειοτακτισμού και απενεργοποίηση των ουδετερόφιλων, είναι πιθανό ότι η εξωγενώς χορηγούμενη ηπαρίνη αποτρέπει αυτήν τη δραστηριότητα και παρεμποδίζει τη σύνδεση της ΑΤ με θεϊκή ηπαράνη των ουδετερόφιλων. Κλασική ηπαρίνη και η ηπαρίνη χαμηλού μοριακού βάρους (LMWH) εμφανίζουν δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στην αντιφλεγμονώδη δράση της ΑΤ και, με τον τρόπο αυτόν, εξηγείται η έλλειψη αποτελεσματικότητας της ΑΤ παρουσία της ηπαρίνης κατά τη σήψη 228. Έχει καταδειχθεί ότι η αλληλεπίδραση αντιθρομβίνης με τους υποδοχείς sundecan-4 εμποδίζεται, επίσης, από την ηπαρίνη. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η 82

83 χορήγηση ηπαρίνης πρέπει να αποφεύγεται εάν είναι επιθυμητή η αντιφλεγμονώδης δράση της ΑΤ 197,229,230. Σε μια πρόσφατη μεγάλη πολυκεντρική διπλή-τυφλή μελέτη (KyberSept), που εξέτασε την επίδραση της θεραπείας με υψηλές δόσεις αντιθρομβίνης σε περισσότερους από 2300 ασθενείς με βαριά σηψαιμία, η αντιθρομβίνη μείωσε τη θνησιμότητα 90 ημερών μόνο στην υποομάδα ασθενών που δεν έλαβαν ταυτοχρόνως την ηπαρίνη κατά τη διάρκεια της τετραήμερης θεραπείας 228. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ (PRECONDITIONING) ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ Τη δεκαετία του 80 παρατηρήθηκε, ότι μικρής διάρκειας κυκλικά επαναλαμβανόμενα επεισόδια ισχαιμίας, ακολουθούμενα από περιόδους επαναιμάτωσης, καθιστούν τους ιστούς περισσότερο ανθεκτικούς σε μελλοντική παρατεταμένη ισχαιμική βλάβη. Το φαινόμενο αυτό ονομάστηκε ischaemic preconditioning (IP), δηλαδή Ισχαιμική Προετοιμασία (Ι.Π.), και περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1986 από τον Murray et al Η Ι.Π. είναι ένας ισχυρότατος προστατευτικός μηχανισμός, που περιορίζει την έκταση της ισχαιμικής βλάβης (και φλεγμονής) και φαίνεται πως συμβαίνει σε διάφορα όργανα. Παρότι οι θετικές επιδράσεις της Ι.Π., έχουν αποδειχθεί σε πολλές μελέτες σε πειραματόζωα 232,233,234 στον άνθρωπο δεν έχουμε αρκετά κλινικά δεδομένα 235. Οι περισσότερες μελέτες αφορούν καρδιοχειρουργικά περιστατικά και η Ι.Π, αν και ποικίλει ανάμεσα στα είδη, διακρίνεται σε πρώιμη και όψιμη 236,237,238. Γενικά: 1. Η πρώιμη Ι.Π. χαρακτηρίζεται από: α) ισχυρή προστασία, β) έναρξη αμέσως μετά το ερέθισμα και γ) διάρκεια 2-3ώρες. Ο μηχανισμός δράσης στη πρώιμη Ι.Π. συσχετίζεται με τη διάνοιξη των Κ + -ATP-channels 239,240,241 τόσο αυτών που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα, όσο και αυτών που βρίσκονται στα μιτοχόνδρια. Η διάνοιξη αυτών των διαύλων καλίου διεγείρεται από ουσίες όπως αδενοσίνη 240, βραδυκινίνη 242, κατεχολαμίνες 243 και ενδιάμεσο ενισχυτή του φαινομένου καταρράκτη της πρωτεϊνικής κινάσης C 244,245, Η όψιμη Ι.Π. χαρακτηρίζεται από: α) επανεμφάνιση ώρες μετά το αρχικό ερέθισμα που πυροδοτεί η πρώιμη Ι.Π., β) η προστασία δεν είναι τόσο 83

84 έντονη όσο η αρχική αλλά γ) διαρκεί 2-3 μέρες. Ο μηχανισμός είναι διαφορετικός από της πρώιμης Ι.Π. και σχετίζεται με διαφοροποίηση στην «έκφραση» κάποιων γονιδίων μέσω της παραγωγής προστατευτικών ενδοκυττάριων πρωτεϊνών (αντιοξειδωτικά ένζυμα, συνθετάση ΝΟ, πρωτεΐνες θερμικού shock) 247. Τελευταία χρόνια, έχουν δημοσιευθεί αρκετές πειραματικές μελέτες για την πιθανή ευεργετική επίδραση της απομακρυσμένης ισχαιμικής προετοιμασίας (remote ischemic preconditioning: RIPC). Πρόκειται για ένα δυναμικό μέσο για τη μείωση της βλάβης από ισχαιμία-επαναιμάτωση σε διάφορους ιστούς, Η καρδιά, το ήπαρ, ο πνεύμονας, το έντερο, ο εγκέφαλος, το νεφρό και τα άκρα, είναι ικανά να παράγουν απομακρυσμένη προετοιμασία όταν υποβάλλονται σε σύντομη ισχαιμίαεπαναιμάτωση ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΚΛΑΣΙΚΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ Στους μηχανισμούς και το σηματοδοτικό καταρράκτη της ισχαιμικής προετοιμασίας, υπάρχουν ουσίες που πυροδοτούν, ουσίες που διαμεσολαβούν και οι τελικοί εκτελεστές της ισχαιμικής προετοιμασίας. Γνωρίζουμε σήμερα ότι οι διάφορες σηματοδοτικές οδοί μεταφέρουν το μήνυμα της προστασίας και πιθανώς τερματίζουν σε ένα ή περισσότερους τελικούς εκτελεστές. Οι ουσίες που πυροδοτούν την προστασία απελευθερώνονται κατά την πρώιμη Ι.Π και ασκούν τη δράση τους μόνο κατά την περίοδο αυτή. Ενεργοποιούν τους διαμεσολαβητές, που τελικά συγκλίνουν στους τελικούς εκτελεστές, οι οποίοι δρουν αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της όψιμης Ι.Π. ή/και της περιόδου επαναιμάτωσης Ουσίες που πυροδοτούν την ισχαιμική προετοιμασία Όπως είναι γνωστό, οποιοσδήποτε υποδοχέας συζευγμένος με την πρωτεΐνη Gi, μπορεί να πυροδοτήσει την ισχαιμική προετοιμασία. Κατά την πρώιμη Ι.Π. απελευθερώνονται αδενοσίνη, βραδυκινίνη, νορεπινεφρίνη, οπιοειδή και η κατάληψη των αντίστοιχων υποδοχέων τους διεγείρει την ισχαιμική προετοιμασία, μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης Gi. Πολλαπλοί υποδοχείς δε, ενεργούν παράλληλα, για να παρέχουν ικανή προστασία στο ερέθισμα της Ι.Π. 84

85 1.ΑΔΕΝΟΣΙΝΗ Η πρώτη αναγνωρισμένη, και πιθανώς πιο σημαντική ουσία, που πυροδοτεί την Ι.Π., είναι το ενδογενές νουκλεοτίδιο, αδενοσίνη. Μετά την έναρξη της ισχαιμίας, η αδενοσίνη απελευθερώνεται τάχιστα στον ενδιάμεσο χώρο από την διάσπαση του ATP (τριφωσφορική αδενοσίνη) και δρα στους υποδοχείς της στα καρδιακά μυοκύτταρα, κύτταρα του εγκεφάλου και του νεφρού, των οποίων η πυκνότητα αυξάνει κατά την ισχαιμία. Κατά τη διάρκεια της υποαιμάτωσης, η αδενοσίνη αυξάνει την μεταφορά οξυγόνου, μέσω της διάτασης των αγγείων αντιστάσεως και μειώνει τις ανάγκες σε οξυγόνο. Οι Downey et al 248, ανακάλυψαν ότι οι Α 1 υποδοχείς της αδενοσίνης είναι αυτοί που έχουν σημασία για την ισχαιμική προετοιμασία και κατέδειξαν ότι η ενδοφλέβια χορήγηση ενός εκλεκτικού αγωνιστή των Α 1 υποδοχέων προσφέρει παρόμοια προστασία με αυτή της ισχαιμικής προετοιμασίας. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και στο ανθρώπινο μυοκάρδιο, in vitro και in vivo, ενώ αποδείχτηκε ότι η διέγερση των Α 3 υποδοχέων της αδενοσίνης συμμετέχει στην ισχαιμική προετοιμασία 249. Ως ουσία που πυροδοτεί την ισχαιμική προετοιμασία, η χορήγηση εξωγενούς αδενοσίνης θα πρέπει να γίνεται πριν από το επεισόδιο της ισχαιμίας, καθώς όταν χορηγείται κατά τη διάρκεια του, φαίνεται ότι είναι μερικώς προστατευτική. 2.ΒΡΑΔΥΚΙΝΙΝΗ Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι κατά τη διάρκεια βραχέων επεισοδίων ισχαιμίας, τα επίπεδα της βραδυκινίνης αυξάνουν σημαντικά 250. Τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα αποτελούν την πρωταρχική πηγή της βραδυκινίνης, αλλά έχει προταθεί ότι και τα ισχαιμικά μυοκύτταρα μπορούν να συνθέτουν κινίνες 251. Η ενζυματική διάσπαση της προκαλλικρεΐνης, μέσω της ενεργοποίησης της από τον παράγοντα ΧΙΙ, δημιουργεί την καλλικρεΐνη στην επιφάνεια του ενδοθηλιακού κυττάρου. Στη συνέχεια, τα κυκλοφορόντα κινιγόνα διασπώνται από την καλλικρεΐνη με αποτέλεσμα την παραγωγή της βραδυκινίνης. Οι κινινάσες είναι τα ένζυμα που διασπούν τη βραδυκινίνη. Η δράση των κινινών διαμεσολαβείται μέσω δύο υποτύπων υποδοχέων, αλλά σημαντικότεροι είναι συνήθως οι Β 2 υποδοχείς, που ανήκουν στους, με τη πρωτεΐνη Gi, συζευγμένους υποδοχείς

86 Οι Schoelkens et al 253 ήταν οι πρώτοι που ανακοίνωσαν τις καρδιοπροστατευτικές δράσεις της βραδυκινίνης, καταδεικνύοντας σε πειραματική τους μελέτη, ελάττωση της απελευθέρωσης των δεικτών της μυοκαρδιακής βλάβης και καλύτερη ανάνηψη της μετισχαιμικής λειτουργικότητας της καρδιάς μετά από ενδοστεφανιαία χορήγηση της βραδυκινίνης. Ένας αριθμός μελετών κατέδειξε τον σημαντικό ρόλο της ενδογενούς βραδυκινίνης στην ισχαιμική προετοιμασία. Έτσι, οι Shoemaker et al 254 στο πειραματικό τους μοντέλο έδειξαν πρώτοι ότι, η ισχαιμική προετοιμασία της μεσεντέριας κυκλοφορίας συνεπάγεται την αύξηση της ενδογενούς βραδυκινίνης, που έχει ως αποτέλεσμα την απομακρυσμένη προστατευτική δράση στο μυοκάρδιο. 3.ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου μπορεί να πυροδοτήσουν την Ι.Π. καθώς δείχτηκε ότι η χορήγηση εκκαθαριστών των ελευθέρων ριζών αυξάνει τον ουδό πρόκλησης της, ενώ η χορήγηση ουσιών που απελευθερώνουν ελεύθερες ρίζες μπορεί να την πυροδοτήσει αν και το τελευταίο φαίνεται παράδοξο, καθώς οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου θεωρούνται ότι συμμετέχουν στη βλάβη ισχαιμίας/επαναιμάτωσης («παράδοξο των ελεύθερων ριζών») 255. Θεωρείται ότι οι ελεύθερες ρίζες δρουν σαν ουσίες που πυροδοτούν την προστασία κατά την περίοδο της ισχαιμικής προετοιμασίας ενώ κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης ισχαιμίας και της μετέπειτα επαναιμάτωσης συμμετέχουν στη βλάβη. Ο μηχανισμός με τον οποίο συμμετέχουν στην προστασία δεν είναι απόλυτα ξεκαθαρισμένος, αλλά φαίνεται ότι μπορούν να ενεργοποιούν το σύστημα των πρωτεϊνών G 256. Από τη μελέτη των Yue et al 257 φαίνεται ότι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου ενεργοποιούν άμεσα τις κινάσες που οδηγούν σε μεταγραφή των προστατευτικών πρωτεϊνών. Οι Weinbrenner et al 258 ήταν οι πρώτοι που ανακοίνωσαν ότι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου αποτελούν βασικά μόρια της απομακρυσμένης ισχαιμικής προετοιμασίας. Έδειξαν ότι ένας κύκλος απόφραξης 15 λεπτών της υπονεφρικής κοιλιακής αορτής που ακολουθήθηκε από επαναιμάτωση 10 λεπτών μείωσε το μέγεθος του εμφράγματος σημαντικά. Πρόσφατα οι Patwell et al 259 έδειξαν την εμφάνιση υδροξυλικών ριζών στην κυκλοφορία μετά από ισχαιμία/επαναιμάτωση των άκρων και το επιχείρημα ότι οι ελεύθερες ρίζες μπορεί να παράγονται από ισχαιμικό άκρο σε απομακρυσμένη ισχαιμική προετοιμασία υποστηρίχθηκε από τους Chen et al. 260 που έδειξαν ότι το μέγεθος εμφράγματος μυοκαρδίου μειώθηκε μετά 86

87 από 4 κύκλους των 10 λεπτών της ισχαιμίας/επαναιμάτωσης της μηριαίας αρτηρίας. Αυτό συσχετίστηκε με την αύξηση στο ολικό αίμα ελεύθερων ριζών. 4. ΟΠΙΟΕΙΔΗ Για το ρόλο των ενδογενών οπιοειδών στην ισχαιμική προετοιμασία, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν το σημαντικό ρόλο των εγκεφαλινών και πιθανώς των δυνορφινών στην καρδιοπροστασία, καθώς η μυοκαρδιακή ισχαιμία έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση τόσο μετ- και λευ-εγκεφαλίνης, όσο και δυνορφινών. Οι Zang et al 261 βρήκαν ότι η ισχαιμική προετοιμασία πριν από την ισχαιμία και επαναιμάτωση του εντέρου είχε ως αποτέλεσμα μικρή εντερική βλάβη, οίδημα, καθώς και μειωμένα επίπεδα LDH και μαλονδιαλδεϋδης (δείκτες του οξειδωτικού stress). Η χορήγηση της μορφίνης πριν την επαναιμάτωση μιμούταν τις επιπτώσεις της Ι.Π. και η ναλοξόνη ανέστειλε τις δράσεις τόσο της Ι.Π. όσο και της μορφίνης. Έδειξαν, επίσης, ότι στο έντερο και το κόλον υπάρχουν πολλοί υποδοχείς οπιοειδών και περιέχουν οπιοειδή πεπτίδια. Τρεις τύποι υποδοχέων των οπιοειδών έχουν κλωνοποιηθεί, οι μ-, κ- και δ-, αλλά τα έως τώρα δεδομένα υποστηρίζουν την σημασία των υποδοχέων τύπου δ- για την ισχαιμική προετοιμασία. Έτσι καταδείχτηκε, ότι η χορήγηση των αγωνιστών των δ- υποδοχέων προ και μετά την επαναιμάτωση, υπήρξε προστατευτική, μειώνοντας το μέγεθος της βλάβης. Πέντε μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο των οπιοειδών στην απομακρυσμένη ισχαιμική προετοιμασία εντέρου, σκελετικών μυών και του μυοκαρδίου Διαμεσολαβητές - σηματοδοτικά συστήματα ισχαιμικής προετοιμασίας 1.ΠΡΩΤΕΊΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ C (PKC) Ένας σημαντικός αριθμός μελετών έχουν καταδείξει το σημαντικό ρόλο της PKC στην ισχαιμική προετοιμασία 262. Η PKC είναι με σερίνη/θρεονίνη κινάση που ενεργοποιείται από λιπιδικούς συμπαράγοντες, που παράγονται μέσω της διάσπασης λιπιδίων της μεμβράνης από την φωσφολιπάση C (PLC). Υπάρχουν διάφορες ισομορφές της PKC που συνδέονται με ειδικούς υποδοχείς για την ενεργοποιημένη PKC (RACK, receptor for activated C kinase) και οι οποίοι βρίσκονται τοποθετημένοι σε ειδικά οργανίλλια μέσα στο κύτταρο. Η δέσμευση της PKC με τους υποδοχείς RACK ολοκληρώνει την ενεργοποίηση της και μπορεί να φωσφορυλιώσει κάθε γειτονικό της πρωτεϊνικό υπόστρωμα. Από όλες τις ισομορφές 87

88 της PKC που έχουν μελετηθεί, φαίνεται ότι οι ε-, δ- και α- ισομορφές 263 μπορούν να συμμετέχουν στην προετοιμασία, αλλά τα έως τώρα δεδομένα υποστηρίζουν μόνο το ρόλο της ε PKC στην ισχαιμική προετοιμασία. 264 Οι Wolfrum et al 265 έδειξαν ότι η PKC ήταν υπεύθυνη για την μείωση του μεγέθους του εμφράγματος μετά από την ισχαιμία/επαναιμάτωση του μεσεντερίου και η χορήγηση ενός ειδικού αναστολέα της PKC, της σταυροσπορίνης κατήργησε πλήρως την ισχαιμική προετοιμασία. Παρατήρησαν αύξηση της PKC στο μυοκάρδιο μετά από απομακρυσμένη Ι.Π. και ότι η αναστολή της PKC καταργεί την προστατευτική δράση της. Οι Weinbrenner et al 258 βρήκαν ότι η απομακρυσμένη Ι.Π. από υπονεφρική απόφραξη αορτής για 15 λεπτά που ακολουθήθηκε από επαναιμάτωση μείωσε το μέγεθος της βλάβης του μυοκαρδίου κάτι που αναστάλθηκε με τη χορήγηση της σταυροπορίνης ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΑΣΗ Μια ελκυστική θεωρία για το μηχανισμό της ισχαιμικής προετοιμασίας βασίζεται στην ενεργοποίηση της 5-νουκλεοτιδάσης. Το ένζυμο αυτό καταλύει την αποφωσφορυλίωση της ΑMP (5-μονοφωσφορική αδενοσίνη) σε αδενοσίνη. Κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας, όταν στα κύτταρα εξαντληθούν τα αποθέματα υψηλής ενέργειας, το ATP μεταβολίζεται σε AMP και κατόπιν το ποσό της παραγόμενης αδενοσίνης ελέγχεται από την 5-νουκλεοτιδάση. Αρκετές μελέτες δείξανε ότι η πρωτεϊνική κινάση C αυξάνει τη δραστηριότητα της 5-νουκλεοτιδάσης, η οποία με τη σειρά της δρα μέσω μηχανισμού θετικής ανατροφοδότησης, παράγοντας περισσότερη αδενοσίνη, που ενισχύει το σήμα για την ισχαιμική προετοιμασία. 266, ΚΙΝΑΣΕΣ ΤΗΣ ΤΥΡΟΣΙΝΗΣ Οι κινάσες της τυροσίνης, που φωσφορυλιώνουν πρωτεΐνες στο τυροσινικό τους άκρο, αποτέλεσαν το αντικείμενο έρευνας, αναφορικά με το ρόλο τους στη σηματοδοτική οδό της ισχαιμικής προετοιμασίας μετά την ενεργοποίηση της PKC. Βέβαια πρέπει να σημειωθεί ότι, όπως φαίνεται από διάφορες μελέτες, οι κινάσες της τυροσίνης που εμπλέκονται στην ισχαιμική προετοιμασία, βρίσκονται ένα στάδιο μετά ή δρουν παράλληλα με την PKC. 88

89 Οι Maulik et al 268 έδειξαν ότι η χορήγηση της γενιστεΐνης, ενός αναστολέα των κινασών της τυροσίνης, απέκλεισε την ισχαιμική προετοιμασία και πρότειναν ότι τουλάχιστον μια τυροσινική κινάση εμπλέκεται στην όλη σηματοδοτική οδό Τελικοί εκτελεστές της ισχαιμικής προετοιμασίας 1. ΟΙ ΔΙΑΥΛΟΙ Κ + ΣΤΟ ΑΤΡ (Κ + ΑΤΡ) Οι Gross et al 267 ήταν οι πρώτοι που πρότειναν ότι οι δίαυλοι Κ + ΑΤΡ είναι υπεύθυνοι για την καρδιοπροστασία της ισχαιμικής προετοιμασίας. Τελευταία, πληθώρα δεδομένων υποστηρίζει τον κεντρικό ρόλο των διαύλων αυτών στην Ι.Π., είτε ως ουσίες που πυροδοτούν, είτε ως τελικοί εκτελεστές της. Οι δίαυλοι αυτοί του Κ + αναστέλλουν σε φυσιολογικά επίπεδα ΑΤΡ και διανοίγουν όταν τα επίπεδα του ΑΤΡ πέφτουν, ενώ η λειτουργία τους ρυθμίζεται από το ph, την οξειδοαναγωγική κατάσταση, τα λιπαρά οξέα, το ΝΟ, τις πρωτεΐνες G και ποικίλα νουκλεοτίδια και συνδέτες. 268 Για την εξήγηση της καρδιοπροστατευτικής δράσης των διαύλων Κ + ΑΤΡ, είχε αρχικά προταθεί ότι είναι οι δίαυλοι Κ + ΑΤΡ του σαρκειλήμματος 269. Οι δίαυλοι αυτοί έχουν μικρό ρόλο σε φυσιολογική καρδιακή λειτουργία, αλλά γίνονται ιδιαίτερα σημαντικοί στις διαταραχές της ενεργειακής ομοιόστασης κατά την ισχαιμία και την επαναιμάτωση. Αργότερα εκτιμήθηκε ότι τα καρδιομυοκύτταρα διαθέτουν πλην των διαύλων Κ + ΑΤΡ του σαρκειλήμματος και αυτούς των μιτοχονδρίων που έχουν διαφορετικό φαρμακολογικό προφίλ. Οι μιτοχονδριακοι δίαυλοι είναι εκείνοι τελικά που διαμεσολαβούν για την ισχαιμική προετοιμασία. 271,272 Διάφορες θεωρίες υποστηρίζουν την συμμετοχή των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ στην ισχαιμική προετοιμασία, αλλά αν και η διάνοιξη αυτών φαίνεται ότι είναι σημαντική για την προστασία, πιο πρόσφατες μελέτες επανεξέτασαν τον ρόλο τους ως τελικοί εκτελεστές, καθώς δεδομένα δείχνουν ότι μπορεί να δρουν και σε ένα άλλο στάδιο της σηματοδοτικής οδού, πυροδοτώντας ή διαμεσολαβώντας για την Ι.Π. 272,273 Οι Forbes et al 274 έδειξαν ότι η διάνοιξη των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ μπορεί να βρίσκεται ψηλά στη σηματοδοτική οδό που οδηγεί στην ενεργοποίηση των κινασών, δεικνύοντας ότι η Ι.Π. μπορούσε να ανασταλεί από ένα εκκαθαριστή ελεύθερων ριζών, την Ν-ακετυλοκυστεϊνη. Τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν και από άλλους ερευνητές 275,276, που πρότειναν νέο παράδειγμα που περιλάμβανε τους διαύλους Κ + ΑΤΡ και τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου στη σηματοδοτική οδό της Ι.Π. Στο 89

90 μοντέλο αυτό, η κατάληψη των υποδοχέων οδηγεί στη διάνοιξη των διαύλων Κ + ΑΤΡ, που προκαλεί τα μιτοχόνδρια να παράγουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Οι ελεύθερες ρίζες αυτές στη συνέχεια ενεργοποιούν τις κινάσες, που βρίσκονται πιο κάτω στο σηματοδοτικό καταρράκτη, που τελικά ρυθμίζουν τον τελικό εκτελεστή. Η παραπάνω υπόθεση, ότι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου συμμετέχουν στο πυροδοτικό σήμα της Ι.Π., μπορεί να εξηγήσει το γιατί η διέγερση των υποδοχέων κατά τη διάρκεια μιας μόνο απόφραξης, δεν δίνει καμία προστασία. Η πιθανότερη εξήγηση είναι, ότι κατά τη διάρκεια μιας απόφραξης απελευθερώνονται αγωνιστές των υποδοχέων που διανοίγουν τους μιτοχονδριακούς διαύλους Κ + ΑΤΡ. Παρόλα αυτά λείπει το απαραίτητο οξυγόνο, για τη δημιουργία των ελεύθερων ριζών και απαιτείται βραχεία επαναιμάτωση που το παρέχει, με αποτέλεσμα τη δημιουργία τους, που στη συνέχεια οδηγεί στην ενεργοποίηση της PKC. 277 Εξάλλου, οι Fryer et al 278 ανέστειλαν την προστασία της ισχαιμικής προετοιμασίας, χορηγώντας τη 5-HD τόσο κατά την περίοδο της ισχαιμικής προετοιμασίας, όσο και κατά τη διάρκεια του παρατεταμένου επεισοδίου ισχαιμίας, προτείνοντας ότι η διάνοιξη των διαύλων Κ + ΑΤΡ μπορεί τόσο να πυροδοτήσει την προστασία, όσο και να είναι ο «τελικός εκτελεστής» της. 2.Ο ΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ Να + /Η + Οι Xaio et al 279 είχαν προτείνει, ότι η αναστολή του ανταλλάκτη Να + /Η + μπορεί να αποτελεί τον «τελικό εκτελεστή» της Ι.Π., καθώς παρατήρησαν ότι ο ανταλλάκτης Να + /Η + φαίνεται να αποκλείεται κατά την επαναιμάτωση μετά από Ι.Π. Η προσθήκη του ΗΟΕ-642, ενός ιδιαίτερα εκλεκτικού αναστολέα του εναλλάκτη Να + /Η +, λίγο πριν την επαναιμάτωση, σε μυοκάρδιο που δεν είχε προετοιμαστεί ισχαιμικά, διατήρησε τη μετισχαιμική λειτουργικότητα σε ποσοστό παρόμοιο με αυτό που είχε επιτευχθεί με την Ι.Π. Το ΗΟΕ-642 δεν είχε καμία επιπρόσθετη επίδραση όταν συνδυάστηκε με Ι.Π., γεγονός που υπαινίσσεται κοινό μηχανισμό. Παρόμοια δράση έδειξε να έχει και η 5-αμιλορίδη, ένας άλλος αναστολέας του εναλλάκτη Να + /Η +. Ούτε οι αναστολείς των κινασών, ούτε το 5-ΗD μπορούσε να αναστείλει την προστασία από την αμιλορίδη, προτείνοντας ότι ο ανταλλάκτης Να + /Η + πρέπει να δρα ως τελικός εκτελεστής

91 3. ΩΣΜΩΤΙΚΟ ΟΙΔΗΜΑ Τα κύτταρα βρίσκονται σε ωσμωτικό ισοζύγιο και δεν υφίστανται μεταβολές της ωσμωτικής πίεσης υπό φυσιολογικές συνθήκες. Το ωσμωτικό ισοζύγιο διατηρείται από το συνδυασμό της ωσμωτικής έλξης των πρωτεϊνών και των νουκλεοτιδίων μέσα στο κύτταρο, με την έξοδο Νa + έξω απ αυτό. 281 Κατά την ισχαιμία, το ΑΤΡ διασπάται σε ΑΜΡ και δύο ανόργανα φωσφορικά, τριπλασιάζοντας έτσι την ωσμωτική έλξη των νουκλεοτιδίων. Παρομοίως κατά την ισχαιμία, η ανεπάρκεια των αντλιών Na + /Ca ++ οδηγεί στην συγκέντρωση Νa + μέσα στο κύτταρο, και έτσι σε κατάρρευση της ζωτικής σημασίας κλίσης του Νa +. Κάθε αύξηση της ωσμωτικής συγκέντρωσης 1 mm, ασκεί μια επιπρόσθετη διαμεμβρανική πίεση της τάξης των 19 mmhg. Οι Jennings et al 134 το 1974, είχαν προτείνει ότι το ωσμωτικό οίδημα αποτελεί την αιτία της ανεπάρκειας της μεμβράνης, της ρήξης της και του κυτταρικού θανάτου κατά την ισχαιμία και την επαναιμάτωση. 4.ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟΣ ΠΟΡΟΣ ΔΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑΣ (MPTP) Αν και η επαναιμάτωση θεωρείται σημαντική για την επιβίωση των κυττάρων μετά από μια περίοδο ισχαιμίας, είναι πλέον γνωστό ότι από μόνη της μπορεί να επισπεύσει τον κυτταρικό θάνατο, κατάσταση που είναι γνωστή ως βλάβη επαναιμάτωσης και αποδίδεται καλύτερα από το ρόλο της απόπτωσης. Η επαναιμάτωση συνοδεύεται από μια αύξηση της απελευθέρωσης των ελεύθερων ριζών που θεωρούνται σημαντικοί διαμεσολαβητές της βλάβης επαναιμάτωσης, καθώς έχει δειχτεί ότι τα αντιοξειδωτικά, όταν χορηγούνται κατά την περίοδο αυτή, περιορίζουν τον κυτταρικό θάνατο. 283 Τα μιτοχόνδρια παίζουν πρωταρχικό ρόλο στην επαναιμάτωση. Η πιο σημαντική λειτουργία τους είναι η παραγωγή του ΑΤΡ, που πραγματοποιείται με τη μεταφορά ηλεκτρονίων στο οξυγόνο. Η μεταφορά αυτή, όπως αναφέρθηκε, συνδέεται με τη μεταφορά ιόντων Η + από το εσωτερικό στο εξωτερικό της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων, εγκαθιστώντας έτσι το μιταχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό. Ακολούθως, η παθητική προς τα έσω ροή των ιόντων Η +, δημιουργεί την κατευθυντήρια δύναμη για την παραγωγή του ΑΤΡ. Κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων, 1-5% των ιόντων συμμετέχουν στο σχηματισμό των ελεύθερων ριζών. Ο μιτοχονδριακός πόρος διαβατότητας (ΜΡΤΡ) σχηματίζεται από πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα που δημιουργούν ένα μεγάλο, μη εκλεκτικό πόρο στην εξαιρετικά αδιαπέραστη εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Ο πόρος αυτός, που 91

92 είναι κλειστός κατά την ισχαιμία, διανοίγεται κατά την επαναιμάτωση από τις ελεύθερες ρίζες, τις υψηλές συγκεντρώσεις Ca ++, την εξάντληση των αποθεμάτων του ΑΤΡ 145. Η διάνοιξη του ΜΡΤΡ κατά την επαναιμάτωση οδηγεί στην αποσύζευξη της αναπνευστικής αλύσου των μιτοχονδρίων, που τελικά οδηγεί στην εξάντληση των αποθεμάτων του ΑΤΡ και σε νέκρωση από τη μια, άλλα και σε οίδημα των μιτοχονδρίων, σε ρήξη της μιτοχονδριακής μεμβράνης και στην απελευθέρωση προαπτωτικών παραγόντων από την άλλη. 284 Οι συνθήκες για τη διάνοιξη του πόρου είναι βέλτιστες κατά την επαναιμάτωση μετά από παρατεταμένη ισχαιμία, ενώ έχει καταδειχτεί ότι ο αποκλεισμός του πόρου με την κυκλοσπορίνη-α κατά την επαναιμάτωση μπορεί να μειώσει τη βλάβη της ισχαιμίας/επαναιμάτωσης. 285 Υπάρχει πληθώρα δεδομένων που υποστηρίζει τον κεντρικό ρόλο του ΜΡΤΡ στην ισχαιμική προετοιμασία, και τα τελευταία χρόνια σημαντικό έδαφος κερδίζει η υπόθεση ότι η αναστολή της διάνοιξης του, αποτελεί τον τελικό εκτελεστή της Ι.Π. Σε μια εκτενή μελέτη οι Juhaszova et al 286 έδειξαν ότι, τόσο η ισχαιμική, όσο και η φαρμακολογική προετοιμασία από μια μεγάλη ποικιλία φαρμάκων, δρα μέσω της αναστολής της διάνοιξης του ΜΡΤΡ από τις ελεύθερες ρίζες, και το εύρημα αυτό επιβεβαιώθηκε και από άλλους μελετητές 287. Κατέδειξαν ότι η Ι.Π. προκαλεί τη διάνοιξη των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ, η οποία οδηγεί σε οίδημα των μιτοχονδρίων, που αυξάνει τη μεταφορά των ηλεκτρονίων και δίνει γένεση σε μικρή ώση ελεύθερων ριζών, η οποία δρα σαν αγγελιοφόρος για την ενεργοποίηση της PKC, που καταλήγει στη φωσφορυλίωση της κινάσης-3b της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK-3b). Η φωσφορυλίωση της GSK-3b αναστέλλει τη δράση της, αυξάνει τον ουδό και αναστέλλει τη διάνοιξη του ΜΡΤΡ από τις ελεύθερες ρίζες κατά την επαναιμάτωση. 288,289 Οι Hausenloy et al 290 επιπρόσθετα, παρείχαν κάποια στοιχεία για το ότι ο ΜΡΤΡ μπορεί να διανοιχθεί παροδικά μετά τη φάση της ισχαιμικής προετοιμασίας και ότι το γεγονός αυτό μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην ενίσχυση της κυτταρικής επιβίωσης. Πιστεύεται ότι η αποσύζευξη των μιτοχονδρίων και μια αύξηση του ph, μπορεί να επάγει την παροδική διάνοιξη του πόρου, που στην συνέχεια προάγει την απελευθέρωση των ελεύθερων ριζών κατά τη φάση της επαναιμάτωσης, που οδηγούν στην ενεργοποίηση της PKC και πιθανώς άλλων κινασών. Η επακόλουθη προσαρμοστική απάντηση περιλαμβάνει τη διάνοιξη των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ που μπορεί να διαρκέσει 1 ώρα ή και περισσότερο. Η διάνοιξη των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ οδηγεί σε οίδημα των μιτοχονδρίων και πιθανώς σε 92

93 παροδική απελευθέρωση ελεύθερων ριζών, που αναστέλλουν τη διάνοιξη του ΜΡΤΡ κατά το παρατεταμένο επεισόδιο ισχαιμίας, ελαττώνοντας έτσι τη κυτταρική βλάβη και θάνατο ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΗ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Τελευταία χρόνια, έχουν δημοσιευθεί αρκετές πειραματικές μελέτες για την πιθανή ευεργετική επίδραση της απομακρυσμένης ισχαιμικής προετοιμασίας (remote ischemic preconditioning: RIPC). Πρόκειται για ένα δυναμικό μέσο που είτε με την απελευθέρωση διάφορων βιοχημικών ουσιών αγγελιοφόρων, είτε με ενεργοποίηση διάφορων νευρικών οδών και απελευθέρωση των αγγελιοφόρων, έχει στόχο τη μείωση της βλάβης από ισχαιμία-επαναιμάτωση σε διάφορους ιστούςστόχους, Η καρδιά, το ήπαρ, ο πνεύμονας, το έντερο, ο εγκέφαλος, το νεφρό και τα άκρα, είναι ικανά να παράγουν απομακρυσμένη προετοιμασία όταν υποβάλλονται σε σύντομη ισχαιμία-επαναιμάτωση. 292 Το φαινόμενο της απομακρυσμένης ισχαιμικής προετοιμασίας μελετήθηκε στο μυοκάρδιο από τους McClanahan et al. το Οι συγγραφείς βρήκαν ότι η ισχαιμία στο νεφρό που ακολούθησε μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση του μυοκαρδίου είχε αποτέλεσμα την μείωση του μεγέθους του εμφράγματος. Σε ζωικά μοντέλα, η σύντομη ισχαιμία-επαναιμάτωση των άκρων, του εντέρου και των νεφρών μειώνει σημαντικά το μέγεθος του εμφράγματος του μυοκαρδίου Ενδείξεις της Απομακρυσμένης Ισχαιμικής Προετοιμασίας 1.Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑ Αυθόρμητα ισχαιμικά επεισόδια του εγκεφάλου, φάνηκε να προκαλούν την προσαρμογή της καρδιάς σε ισχαιμία.. Οι Tokuno et al 293 ήταν πρώτοι που έδειξαν σε ένα πειραματικό μοντέλο τη μείωση του εμφράγματος του μυοκαρδίου σε ποντίκια με νευρολογική πάθηση. Η ισχαιμία του εγκεφάλου που προκλήθηκε με αμφοτερόπλευρο αποκλεισμό των έσω καρωτίδων αρτηριών, 24 ώρες πριν από την ολική ισχαιμία του μυοκαρδίου, μείωσε το μέγεθος του εμφράγματος και βελτίωσε την απόδοση του μυοκαρδίου. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη της εγκεφαλικής βλάβης, εκτός από την παροδική νευρολογική σημειολογία 293. Σημαντικό στη μελέτη αυτή είναι ότι η ισχαιμία και όχι η επαναιμάτωση προκάλεσε την έναρξη της σηματοδοτικής οδού, η οποία με τη σειρά της οδήγησε σε απομακρυσμένη προστασία. 93

94 2.Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΣΕ ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι η σύντομη νεφρική ισχαιμία μείωσε το μέγεθος του εμφράγματος μυοκαρδίου 294,295,296,297,298. Τα πρώτα στοιχεία της απομακρυσμένης προετοιμασίας μεταξύ των οργάνων χρονολογείται από το 1993 όταν ο McClanahan και η ομάδα του πραγματοποίησε πειράματα σε ένα μοντέλο κουνελιών και έδειξε ότι ένας κύκλος 10 λεπτών της νεφρικής ισχαιμίας ήταν εξίσου αποτελεσματικός με ένα κύκλο 5 λεπτών αποκλεισμού της στεφανιαίας αρτηρίας στην προετοιμασία της καρδιάς 299. Οι Gho et al το έδειξαν ότι οι σύντομοι κύκλοι της απομακρυσμένης ισχαιμίας οργάνων (μεσεντερίου και των νεφρών) ήταν τόσο αποτελεσματικοί όσο και η άμεση καρδιακή προετοιμασία. 3.Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΜΕΣΕΝΤΕΡΙΟΥ Αρκετές μελέτες παρέχουν αποδείξεις της απομακρυσμένης ισχαιμικής προετοιμασίας από μεσεντέριο. Οι Shoemaker et al 300 σε ένα πειραματικό μοντέλο με αρουραίους έδειξαν ότι, ο σύντομος αποκλεισμός μεσεντερίου (15 λεπτά) με επακόλουθη (10 λεπτά) επαναιμάτωση, 60 λεπτά πριν από τον αποκλεισμό της στεφανιαίας αρτηρίας και 180 λεπτά επαναιμάτωσης, είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του εμφράγματος μυοκαρδίου σε μέγεθος. Σε ένα παρόμοιο μοντέλο, οι GHO et al 295 παρατήρησαν ότι 15 λεπτά αποκλεισμού μεσεντερίου αρτηρίας, ακολουθούμενη από 10 λεπτά επαναιμάτωσης, είχε το ίδιο αποτέλεσμα με 15 λεπτά του αποκλεισμού της στεφανιαίας αρτηρίας. Οι Wang et al 301 παρατήρησαν ότι με τον αποκλεισμό μεσεντερίου αρτηρίας (30 λεπτά) και την επαναιμάτωση μειώθηκε σημαντικά το μέγεθος του εμφράγματος μυοκαρδίου. Έδειξαν επίσης ότι η απομακρυσμένη ισχαιμική προετοιμασία μείωσε την μυελοϋπεροξειδάση του μυοκαρδίου (MPO), που είναι ένας δείκτης της συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης. 4. Η ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΑΚΡΩΝ ΣΕ ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ Αρκετές μελέτες έχουν δείξει τα ευεργετικά αποτελέσματα της σύντομης ισχαιμία άκρων σε προετοιμασία της καρδιάς. Οι Oxman et al. 302 παρατήρησαν πρώτοι ότι σε ένα μοντέλο αρουραίων, μια μικρή περίοδος ισχαιμίας άκρων (10 94

95 λεπτά) in vivo, που ακολουθούταν από επαναιμάτωση (10 λεπτά), οδήγησε σε καρδιοπροστασία. Από τη μελέτη αυτή φάνηκε ότι η συστηματική απάντηση στο stress συνδέεται με την απελευθέρωση των κατεχολαμινών μετά από την σύντομη ισχαιμία άκρων. Οι Kharbanda et al 303 πραγματοποίησαν μελέτες τόσο σε πειραματικό μοντέλο χοίρου όσο και σε κλινικό επίπεδο. Τέσσερις κύκλοι (5 λεπτά ο καθένας) ισχαιμίας-επαναιμάτωσης του άκρου έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους του εμφράγματος του μυοκαρδίου και τη βελτίωση της κοιλιακής λειτουργίας σε χοίρους. Η ισχαιμία άκρων έδειξε μια προστατευτική επίδραση στη μείωση της ενδοθηλιακής βλάβης και στον άνθρωπο. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η απομακρυσμένη προετοιμασία έχει μια προστατευτική επίδραση στους κρημνούς, κάτι που είναι ιδιαίτερα χρήσιμο σε ασθενείς που έχουν ακτινοβοληθεί, σε καπνιστές και σε παχύσαρκους. Η προστατευτική δράση αυτή είναι πιο έντονη προς το τέλος της φάσης της προετοιμασίας. Οι εργασίες αυτές απέδειξαν ότι η απομακρυσμένη ισχαιμική προετοιμασία σχετίζεται με την βελτίωση της μικροκυκλοφορίας. 5. Η ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΗΠΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΥΟΚΑΡΔΙΟΥ ΣΕ ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ. Αρκετές μελέτες ασχολήθηκαν με την προστατευτική επίδραση σε απομακρυσμένα όργανα μετά από μικρή ισχαιμία μυοκαρδίου και του ήπατος 304,305,306 Έτσι, μελετήθηκε σε ένα πειραματικό μοντέλο η προστατευτική δράση της ισχαιμίας του μυοκαρδίου σε στόμαχο. Οι Brzozowski et al 305 έδειξαν ότι οι δύο κύκλοι (5 λεπτά ο καθένας) της ανεπάρκειας / ισχαιμίας του μυοκαρδίου που ακολουθούταν από 10 λεπτά επαναιμάτωσης ο καθένας, είχε ως αποτέλεσμα την άμεση προετοιμασία του στομάχου, με αύξηση αιμάτωσης και μείωση διαβρώσεων γαστρικού βλεννογόνου. Οι Ates et al 304 απέδειξαν σε ένα πειραματικό μοντέλο ότι η ισχαιμία ήπατος (10 λεπτά) με προηγηθείσα ισχαιμία αριστερού νεφρού (45 λεπτά) είχε ως αποτέλεσμα καλύτερη κάθαρση κρεατινίνης καθώς και βελτιωμένη κλασματική απέκκριση νατρίου 24 ώρες μετά την προετοιμασία. Παρατήρησαν μειωμένη μιτοχονδριακή διόγκωση, αποκόλληση βασικής μεμβράνης με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, μειωμένο οίδημα νεφρικών σωληναρίων, νέκρωση, TNF-α επίπεδα και μια σχετικά γρήγορη ελάττωση επιπέδων LDH στην ομάδα με απομακρυσμένη προετοιμασία σε σύγκριση με τη ομάδα ελέγχου. 95

96 7.3. ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Έχει βρεθεί ότι διάφοροι φαρμακολογικοί παράγοντες, όπως τα πτητικά αναισθητικά, έχουν την ικανότητα να προκαλέσουν προετοιμασία των ιστών. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται φαρμακευτική προετοιμασία. Ο θετικός ρόλος των πτητικών αναισθητικών κατά τη διάρκεια ισχαιμίας του μυοκαρδίου περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1969, με την παρατήρηση ότι το αλοθάνιο σε σκύλους επιμηκύνει την ανοχή στην ισχαιμία και παρατείνει την διατήρηση στο κύτταρο υψηλών ενεργειακών υποστρωμάτων 307.Αλλά και τα νεότερα πτητικά αναισθητικά φαίνεται ότι έχουν αντιισχαιμικές ιδιότητες. Το ισοφλουράνιο σε μελέτες σε ανθρώπους απέδειξε αυτό που δείχνουν οι πειραματικές μελέτες για όλα σχεδόν τα πτητικά αναισθητικά (σεβοφλουράνιο, ισοφλουράνιο, αλοθάνιο, δεσφλουράνιο, ενφλουράνιο) 307 Στις κλινικά χρησιμοποιούμενες δόσεις τα βαρβιτουρικά (θειοπεντάλη) δεν προκαλούν πειραματικά φαρμακευτική προετοιμασία, αλλά παρόλο που αναστέλλουν το άνοιγμα των μιτοχονδριακών διαύλων Κ + ΑΤΡ, που είναι ένας κεντρικός μηχανισμός για την προετοιμασία δεν την εμποδίζουν 307. Το R-εναντιομερές της κεταμίνης μπλοκάρει την ευεργετική επίδραση της προετοιμασίας. Η προποφόλη παρότι έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες, η μιδαζολάμη, η δεξμετομιδίνη, η ετομιδάτη, δεν έχουν επίδραση στους διαύλους Κ + ΑΤΡ και άρα στερούνται ιδιοτήτων προετοιμασίας. 7.4.ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ (PRECONDITIONING) ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η Ι.Π. έχει προστατευτική δράση στο έντερο δεν είναι πλήρως γνωστός. Οι μελέτες του Aksoeyk 303 έδειξαν ότι η Ι.Π. του εντέρου μειώνει την βακτηριακή μετατόπιση σε ένα πειραματικό μοντέλο ισχαιμίας/επαναιμάτωσης σε επίμυες. Οι Davis et al. έδειξαν ότι η Ι.Π. εμποδίζει τη έκφραση της P σελεκτίνης σε ένα ισχαιμικό έντερο με αποτέλεσμα να επηρεάζονται η συσσώρευση των λευκοκυττάρων και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ και αιμοπεταλίων 309. Επίσης, η προστατευτική δράση της Ι.Π. συνδέθηκε με την μείωση της συγκέντρωσης της ξανθίνης και αναστέλλει τη μετατροπή της XDH σε οξειδάση της ξανθίνης 292 Από άλλες μελέτες φαίνεται ότι η Ι.Π. μειώνει την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων και αυτό οφείλεται στην αυξημένη έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεϊνης Bcl

97 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο Ο ΕΠΙΜΥΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ WISTAR Τα πρώτα στελέχη επίμυων για βιοϊατρική έρευνα αναπτύχθηκαν στο Ινστιτούτο Wistar στην Φιλαδέλφια το Ο επίμυς αποτελεί το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο σπονδυλωτό μετά τον ποντικό και χρησιμοποιείται κυρίως στην ιατρική έρευνα, στην έρευνα τροφίμων, συμπεριφοράς και τοξικότητας. Ο λευκός επίμυς του εργαστηρίου τύπου Wistar είναι ένα πειραματόζωο το οποίο αναπαράγεται σχετικά γρήγορα και είναι ανθεκτικό στις ασθένειες. Ο όρος ζωής του επίμυος είναι μεγαλύτερος από τα τρία χρόνια. Στα οργανωμένα εργαστήρια συνήθως θυσιάζονται πριν από τη συμπλήρωση του ενός έτους. Το πειραματόζωο αυτό εξοικειώνεται με τον τρόπο διαβίωσης του και με το κλουβί του. Ο νεογέννητος επίμυς ζυγίζει περίπου 5 gr και φτάνει περίπου στα gr την ημέρα απογαλακτισμού του δηλαδή την 21 η ημέρα. Οι ηλικιωμένοι αρσενικοί επίμυες μπορεί να φτάσουν τα gr, ενώ οι θηλυκοί σπάνια ξεπερνούν τα gr. Στον παρακάτω πίνακα ακολουθούν κάποιοι φυσιολογικοί παράμετροι καθώς και περιβαλλοντικές απαιτήσεις για την στέγασή τους. 310 Περιβαλλοντικές απαιτήσεις Θερμοκρασία ( 0 C) Σχετική υγρασία (%) 60 Αερισμός (αλλαγές/ ώρα) Φως/σκοτάδι (ώρες) 12-14/12-10 Ελάχιστο εμβαδόν δαπέδου κλουβιού(350cm 2 ) 350 Γενικές φυσιολογικές παράμετροι Βάρος ενηλίκου (gr) αρσενικό θηλυκό Βάρος κατά τη γέννηση (gr) 5 Διάρκεια ζωής (έτη) 2-3 Θερμοκρασία σώματος ( ο C) 35,9-37,5 Κατανάλωση τροφής (gr/gr BW/ημ.)

98 Κατανάλωση νερού (ml/gr BW/ημ.) Καρδιακή συχνότητα (/min) Αναπνευστική συχνότητα (/min) Αρτηριακή πίεση (mmhg) συστολική διαστολική (116) (90) Αιματολογικοί παράμετροι Ολικό αίμα (ml/kg) 60 RBC (/μl) 5-10Χ10 6 Αιμοσφαιρίνη (gr/100ml) Αιματοκρίτης (όγκος %) Λευκοκύτταρα (Χ1000/mm 3 ) 6-17 Αιμοπετάλια (/μl) Χ10 3 Βιοχημικοί δείκτες BUN (mg/dl) Γλυκόζη (mg/dl) Πρωτεΐνη (mg/dl) 4,5-8,4 Κρεατινίνη (mg/dl) 0,4-1,4 Ολική χολερυθρίνη (mg/dl) 0,0-0,64 Αλβουμίνη (mg/dl) 2,9-5,9 Ca +2 (mg/dl) 9,1-15,1 P (mg/dl) 4,7-16 Na + (meq/l) K + (meq/l) 3,6-9,2 Cl - (meq/l) Πίνακας 1: περιβαλλοντικές απαιτήσεις και φυσιολογικοί παράμετροι των επίμυων ΑΝΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥ Ένας επίμυς δεν είναι απαραίτητο να στερηθεί την τροφή του πριν από την αναισθησία. Μπορεί να πίνει ελεύθερα νερό, εκτός αν αντενδείκνυται για το συγκεκριμένο πείραμα που θα ακολουθήσει. Τα αναισθητικά που χρησιμοποιούνται στον επίμυ είναι πτητικά και μη πτητικά. Για μικρής διάρκειας επεμβάσεις προτιμάται ο αιθέρας. Ως μειονέκτημα στη χρήση του αιθέρα αναφέρεται ότι είναι εξαιρετικά αναφλέξιμος, αυξάνει σημαντικά τις 98

99 εκκρίσεις των βρόγχων και των σιελογόνων αδένων και μπορεί να αλλοιώσει το δείγμα της αιμοληψίας. Τα κυριότερα μη πτητικά αναισθητικά είναι η νατριούχος πεντοβαρβιτόλη και η κεταμίνη. Οι οδοί χορήγησης τους είναι τρεις: υποδόρια, που γίνεται στο ύψος του ώμου, είτε στην κοιλιά 2,5 cm περίπου πλάγια της μέσης γραμμής μεταξύ του ομφαλού και του προηβικού τένοντα. ενδοπεριτοναϊκά, που γίνεται στο αριστερό κάτω τεταρτημόριο του κοιλιακού τοιχώματος, δηλαδή στην περιοχή όπου δεν υπάρχουν ζωτικά όργανα εκτός από το λεπτό έντερο. Χρειάζεται προσοχή γιατί τυχόν έμπαρση της βελόνας και έγχυση του αναισθητικού στο ήπαρ, σπλήνα, έντερο προκαλεί ταχεία επέλευση της αναισθησίας και επιπλοκές κατά την αποδρομή της. Οι ουσίες της αναισθησίας με αυτήν την οδό πηγαίνουν κατευθείαν στην πυλαία κυκλοφορία. Ο μεταβολισμός αυτών των ουσιών μπορεί να πραγματοποιείται στο ήπαρ πριν αυτές εισέλθουν στη συστηματική κυκλοφορία. Συνεπώς η φαρμακοκινητική τους είναι διαφορετική από την ενδοφλέβια χορήγηση. ενδοφλέβια χορήγηση, για την οποία προτιμούνται οι μεγάλες φλέβες της ουράς, η γλωσσική και η φλέβα ταρσού. Η συχνότερη οδός χορήγησης είναι η ενδοπεριτοναϊκή έγχυση του φαρμάκου. Το ζώο με αυτήν τη μέθοδο αναισθητοποιείται μέσα σε 5-15 λεπτά και η διάρκεια αναισθησίας είναι περίπου 45 λεπτά. Αν η αρχική δόση είναι ανεπαρκής, μπορεί να χορηγηθεί επιπλέον το ¼ από την αρχική δόση, ύστερα από 45 λεπτά. Η πλήρης χειρουργική αναισθησία περιλαμβάνει αναισθητοποίηση με ελάττωση της πρόσληψης εξωτερικών ερεθισμάτων, αναλγησία και κατάργηση των αντανακλαστικών και του μυϊκού τόνου. Κατά τη διάρκεια της νάρκωσης πρέπει να γίνεται έλεγχος της αναπνοής. Κατά την πραγματοποίηση χειρουργικών επεμβάσεων έχει ιδιαίτερη σημασία η διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας του σώματος. 8.2 ΕΥΘΑΝΑΣΙΑ Η οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης ορίζει ότι ένα ζώο δε θα πρέπει να κρατείται στη ζωή ύστερα από ένα πείραμα εάν υπάρχει πιθανότητα να υποφέρει από πόνο εφόσον η διατήρησή του στη ζωή δεν είναι απαραίτητη για τους στόχους του πειράματος, καθώς επίσης για να αποκτηθούν όργανα ή ιστοί για περαιτέρω πειραματισμό και για την εξέταση των μορφολογικών επιδράσεων του πειράματος. 99

100 Υπάρχουν κάποιες συγκεκριμένες απαιτήσεις που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όταν τα ζώα υποβάλλονται σε ευθανασία. Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι με τις οποίες τα ζώα μπορούν να θανατωθούν και μπορούν να χωριστούν σε δυο κατηγορίες: φαρμακοχημικές και μηχανοφυσικές μέθοδοι. Φαρμακοχημικές μέθοδοι: Χορηγείται ένα φάρμακο ή άλλη ουσία που οδηγεί σε θάνατο του ζώου. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η χορήγηση υπερβολικής δόσης ενός γενικού αναισθητικού που οδηγεί σε καρδιακή και αναπνευστική ανακοπή του ζώου. Επίσης, η ευθανασία μπορεί να γίνει με τη χρήση εισπνεόμενων αναισθητικών, όπως για παράδειγμα του αιθέρα. Συχνά χρησιμοποιείται και το διοξείδιο του άνθρακα. Μηχανοφυσικές μέθοδοι: Επειδή οι περισσότερες φαρμακοχημικές μέθοδοι μπορούν να επηρεάσουν ορισμένα πειράματα όσον αφορά τη συλλογή οργάνων και ιστών για βιοχημική και ιστολογική εξέταση, προτιμούνται οι μηχανοφυσικές μέθοδοι. Οι φυσικές μέθοδοι περιλαμβάνουν εξάρθρωση του αυχενικού σπονδύλου καθώς και αποκεφαλισμό. Σε νεογνά και μικρά ζώα βάρους λιγότερο από 20gr η ευθανασία μπορεί να επιτευχθεί με στιγμιαία ψύξη σε υγρό άζωτο. Μια εναλλακτική τεχνική είναι η εφαρμογή μικροκυμάτων στο ΚΝΣ που προκαλεί στιγμιαίο θάνατο χωρίς καμιά μεταβολή στη βιοχημεία του ζώου

101 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 101

102 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΙ 9.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Για την εκπόνηση της πειραματικής μελέτης χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 80 άρρενες επίμυες της ποικιλίας Wistar ηλικίας 2-3 μηνών και σωματικού βάρους gr. Τα πειραματόζωα ανήκαν σε αποικία, που δημιουργήθηκε στο Πειραματικό Εργαστήριο του Θεαγενείου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Τα πειράματα διενεργήθηκαν στην Κτηνιατρική Σχολή του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης. Επιλέχτηκαν οι επίμυες Wistar λόγω της ευκολίας στην προμήθεια αυτών, της ανθεκτικότητάς τους στους χειρισμούς και της ύπαρξης σχετικής βιβλιογραφίας, με αριθμό εργασιών που πραγματεύεται την μελέτη της επούλωσης της αναστόμωσης παχέος εντέρου στα ζώα αυτά. Ο επίμυς αποτελεί σήμερα το σημαντικότερο πειραματικό μοντέλο μελέτης των θεραπευτικών και τοξικών επιδράσεων φαρμάκων και άλλων ουσιών. Οι συνθήκες διαβίωσης ήταν ιδανικές. Ειδικότερα υπήρχε περιβάλλον σταθερής θερμοκρασίας, υγρασίας, αερισμού και υγιεινής με 12ωρη φυσιολογική εναλλαγή φωτός/σκότους. Τα πειραματόζωα φυλάσσονταν ανά τετράδες σε κλωβούς ανάλογων διαστάσεων και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στους επίμυες χορηγούνταν τροφή συγκεκριμένης ποιότητας (pellets) της εταιρείας ΕΛΒΙZ.(πίνακας 2 ) Πρωτεΐνη 20,37% Λίπος 6,09% Κυτταρίνες 4,59% Τέφρα 7,84% Ασβέστιο 1,15% Φωσφόρος 0,86% Λυσίνη 1,11% Μεθειονίνη 0,38% Πίνακας 2: Σύνθεση PELLETS (από εργαστήρια ΕΛΒΙΖ). 102

103 Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις προβλεπόμενες διατάξεις της Ευρωπαϊκής Σύμβασης για την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς και ερευνητικούς σκοπούς (Ν. 1197/81 Αρθρ. 4, Ν. 2015/92, ΠΔ 160/91). Η μελέτη διενεργήθηκε υπό την επίβλεψη και τη συμβολή κτηνιάτρου, που ήταν υπεύθυνος σύμβουλος για την τήρηση των κανόνων υγιεινής των χώρων και των κανόνων εγκλιματισμού, προστασίας και διατροφής των πειραματόζωων. Πριν από την έναρξη της πειραματικής μελέτης εκδόθηκε η απαιτούμενη ειδική έγκριση από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής της Νομαρχίας Θεσσαλονίκης με Αριθμό Πρωτ.: /930 / ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΤΑΞΗ Οι 80 επίμυες χωρίστηκαν τυχαία σε οκτώ (8) ομάδες των 10 πειραματόζωων. Σε κάθε επίμυ δόθηκε ένας μοναδικός κωδικός αριθμός. Οι επίμυες είχαν ελεύθερη πρόσβαση προεγχειρητικά και μετεγχειρητικά σε νερό και τροφή. 1. ΟΜΑΔΑ 1 (ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΕΠΙΜΥΕΣ). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν μόνο σε αναισθησία. 2.ΟΜΑΔΑ 2 (ΕΛΕΓΧΟΥ-CONTROL). Αποτέλεσε την ομάδα των μαρτύρων. Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε αναισθησία και επίσης χορηγήθηκε 250 IU/Kgr αντιθρομβίνης. Οι επίμυες είχαν ελεύθερη πρόσβαση προεγχειρητικά σε νερό και τροφή. 3.ΟΜΑΔΑ 3 (ΕΙΚΟΝΙΚΗ ΕΓΧΕΙΡΗΣΗ - SHAM OPERATION). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε αναισθησία και λαπαροτομή και παρέμειναν με ανοιχτή την κοιλία για 110min. 4.ΟΜΑΔΑ 4 (ΙΣΧΑΙΜΙAΣ/ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ- I/R). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε αναισθησία, καθώς και σε ισχαιμία λεπτού εντέρου διάρκειας 30, επαναιμάτωση διάρκειας 60, και θυσιάστηκαν σε ΟΜΑΔΑ 5 (ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Λ.ΕΝΤΕΡΟΥ - IPC+I/R, I 10 ). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε αναισθησία, σε ισχαιμική προετοιμασία λεπτού εντέρου διάρκειας 10min, επαναιμάτωση 10min, και στην συνέχεια ακολούθησε η ίδια διαδικασία όπως περιγράφεται στην ομάδα 4. 6.ΟΜΑΔΑ 6 (ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ/ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν στην ίδια διαδικασία με την 103

104 ομάδα 4, αλλά επιπλέον χορηγήθηκε η αντιθρομβίνη 250ΙU/Kgr, ενδοφλεβίως, 5 πριν την επέμβαση. 7.ΟΜΑΔΑ 7 (ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Λ.ΕΝΤΕΡΟΥ ΚΑΙ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν στην ίδια διαδικασία με την ομάδα 5, αλλά επιπλέον χορηγήθηκε η αντιθρομβίνη 250ΙU/Kgr, ενδοφλεβίως, 5 πριν τον αποκλεισμό της άνω μεσεντέριας αρτηρίας. 8.ΟΜΑΔΑ 8 (ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΚΑΙ ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Λ.ΕΝΤΕΡΟΥ -IPC+I/R, I 10 ). Τα πειραματόζωα υποβλήθηκαν στην αναισθησία, χορηγήθηκε η αντιθρομβίνη 250ΙU/kgr, ενδοφλεβίως και μετά ακολούθησε η περιγραφόμενη στην ομάδα 5 διαδικασία. 0 :αρχή πειράματος 30 :τέλος ισχαιμίας για τις ομάδες 4 και :τέλος ισχαιμίας για τις ομάδες 5, 7 και :τέλος επαναιμάτωσης για τις ομάδες 4 και :τέλος επαναιμάτωσης για τις ομάδες 5, 7 και :τέλος εικονικής επέμβασης για την ομάδα 3. Πίνακας 3: Χρονοδιάγραμμα πειράματος 9.3 ΑΝΑΙΣΘΗΣΙΑ Η επέμβαση πραγματοποιούνταν υπό γενική αναισθησία. Αρχικά το πειραματόζωο τοποθετούνταν για λίγα δευτερόλεπτα σε κώδωνα, που περιέχει τολύπιο βάμβακος εμποτισμένο με το πτητικό αναισθητικό ισοφλουράνιο (εικόνα 10). Η αναισθητοποίηση επιτυγχανόταν σε λίγα (1-2 ) λεπτά και γινόταν αντιληπτή όταν το ζώο έπαυε να κινείται. Η επιλογή του ισοφλουράνιου έναντι του χαμηλότερου κόστους αιθέρα έγινε λόγω της πολύ μικρότερης καταπόνησης του επίμυος όσον αφορά στον ερεθισμό των βλεννογόνων. Κατά τη χορήγηση του πτητικού αναισθητικού αποφευγόταν η επαφή του πειραματόζωου με το εμποτισμένο με αιθέρα τολύπιο, διότι θα μπορούσε να προκαλέσει έντονο ερεθισμό στο δέρμα, στους βλεννογόνους και ιδίως στον επιπεφυκότα. Η αναισθητοποίηση με το ισοφλουράνιο διαρκούσε λίγα λεπτά (2-3 ), χρόνος αρκετός για τη ενδοπεριτοναϊκή έγχυση συνδυασμένης αναισθησίας. Χορηγείτο ενδοπεριτοναϊκά υδροχλωρική κεταμίνη (Ketalar 50mg/ml, Park Davis) σε δόση 104

105 100mg/kg και ξυλαζίνη (Rompun, Bayer AG) σε δόση 8mg/kg. Έτσι επιτυγχανόταν συνδυασμένη αναισθησία, καταστολή και αναλγησία, διάρκειας μιας περίπου ώρας. 9.4 ΕΓΧΕΙΡΗΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ Μετά την αναισθητοποίηση το πειραματόζωο τοποθετείτο επί της ειδικά διαμορφωμένης χειρουργικής τράπεζας και ακινητοποιείτο επ αυτής με την επίδεση άνω και κάτω άκρων με νήματα. Τα άνω άκρα δένονταν χαλαρά για να μην εμποδίζονται οι αναπνευστικές κινήσεις. Μετά την έναρξη της αναισθησίας πραγματοποιείτο ευπρεπισμός της κοιλιακής χώρας, ξύρισμα δηλαδή του τριχωτού και αντισηψία με χρήση διαλύματος ιωδιούχου ποβιδόνης 10% (Betadine). Ακολουθούσε η τοποθέτηση αποστειρωμένου χειρουργικού πεδίου (σχιστό οθόνιο) στο κοιλιακό τοίχωμα. Εικόνα 6: Τοποθέτηση επίμυος σε χειρουργική τράπεζα Μετά την προσπέλαση με μέση κοιλιακή τομή μήκους 3cm αναγνωριζόταν και παρασκευαζόταν η άνω μεσεντέριος αρτηρία. Σε επίμυες των ομάδων 1 (Ελέγχου-Control), 6 (I/R και χορήγηση ΑΤ), 7 (IPC και χορήγηση ΑΤ), 8 (IPC+I/R και χορήγηση ΑΤ) χορηγούταν Αντιθρομβίνη ΙΙΙ (ΑΤ) ενδοφλεβίως σε δόση 250 IU/kg Βάρους Σώματος. Σε επίμυες των ομάδων 4 (I/R), 5 (IPC+I/R), 6 (I/R και χορήγηση ΑΤ), 7 (IPC και χορήγηση ΑΤ) και 8 (IPC+I/R και χορήγηση ΑΤ) εφαρμοζόταν ένα ατραυματικό μικροαγγειακό clip, στο σημείο έκφυσης της άνω μεσεντερίου αρτηρίας. Το clip αφαιρούταν σε ανάλογο για κάθε ομάδα χρόνο από την έναρξη του αποκλεισμού της άνω μεσεντερίου αρτηρίας. (Σχήμα 6) 105

106 ΟΜΑΔΑ 4 (I/R) ΟΜΑΔΑ 5 (IPC+I/R) IPC I/R ΟΜΑΔΑ 6 (I/R + ΑΤ) ΑΤ I/R ΟΜΑΔΑ 7 ( ΑΤ+ IPC+I/R) ΑΤ IPC I/R ΟΜΑΔΑ 8 ( ΑΤ+ IPC+I/R) Προεγχειρητικά ΑΤ IPC I/R Αντιθρομβίνη ΙΙΙ Ισχαιμία Επαναιμάτωση Σχήμα 6.Σχηματική παράσταση πρωτοκόλλου Ι/R και IPC 106

107 Με το πέρας της περιόδου επαναιμάτωσης, τα πειραματόζωα αναισθητοποιούνταν και γινόταν λήψη του αριστερού νεφρού, καθώς και λήψη δειγμάτων αίματος (0,7ml). Καθ' όλη τη διάρκεια της χειρουργικής διαδικασίας τα πειραματόζωα βρίσκονταν υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας (37ºC) με τη χρήση λάμπας υπερύθρων και χορήγηση κατά διαστήματα ενδοπεριτοναϊκά προθερμασμένου (37ºC) διαλύματος Ringer's Lactate για αναπλήρωση των υγρών. 9.5.ΚΥΤΟΚΙΝΕΣ Οι κυτοκίνες αποτελούν ρυθμιστικές πρωτεΐνες που εκκρίνονται από λευκά αιμοσφαίρια και άλλα κύτταρα του οργανισμού. Έχουν δράση στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και τροποποιούν την αντίδραση φλεγμονής. Παρακάτω αναφέρονται τα κύρια χαρακτηριστικά των κυτοκινών: 1. Η πλειοψηφία των κυτοκινών είναι πολυπεπτίδια ή γλυκοπρωτεϊνες μικρότερες του μεγέθους των 30 kda. 2. Δεν γίνεται συνεχής παραγωγή των ουσιών. Η παραγωγή κυτοκινών γίνεται μετά από επίδραση κάποιου ερεθίσματος σε κυτταρικό επίπεδο μεταγραφής ή μετάφρασης. 3. Η παραγωγή κυτοκινών είναι παροδική και η ακτίνα δράσης τους είναι μικρή (αυτοκρινής ή παρακρινική). 4. Η δράση των κυτοκινών πραγματοποιείται μετά από σύνδεσή τους σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων-στόχων. 5. Η δράση των κυτοκινών είναι συνδεδεμένη με μεταβολή στην έκφραση γονιδίων στα κύτταρα-στόχους. 6. Οι κυτοκίνες επιδρούν σχεδόν πάντοτε σε κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος. Παρακάτω θα αναφερθούν οι κυτοκίνες που θα μελετηθούν στην παρούσα εργασία ΤΝFa Ο παράγων νέκρωσης όγκων (TNF) αποτελεί πλειοτροπική κυτοκίνη που προάγει τη φλεγμονώδη αντίδραση. Ουσία που είχε απομονωθεί σε πειραματόζωα στα οποία είχε χορηγηθεί λιποπολυσακχαρίδιο (LPS). Ο TNF προκαλεί νέκρωση καρκινικών κυττάρων in vitro. Μια άλλη πρωτεΐνη, η καχεκτίνη, βρέθηκε στο υπερκείμενο υγρό 107

108 από μακροφάγα που είχαν ενεργοποιηθεί από LPS. Η δράση της καχεκτίνης ήταν η αναστολή της έκφρασης της λιποπρωτεϊνικής λίπανσης και άλλων αναβολικών πρωτεϊνών στα λιπώδη κύτταρα. Αργότερα βρέθηκε ότι ο TNF και η καχεκτίνη ήταν ίδια ουσία. Η χορήγηση της ουσίας αυτής σε ποντίκια προκαλούσε φαινόμενο παρόμοιο με σηπτική καταπληξία και ήταν συνήθως θανατηφόρα. Τα κύτταρα που παράγουν τον TNF είναι τα μακροφάγα, τα σιτευτικά κύτταρα, κερατινοκύτταρα, τα Τ-κύτταρα και τα Β-κύτταρα. Η παραγωγή TNFα σε μικρές ποσότητες συμβάλλει στην ανανέωση και ανασύσταση ιστών που συμβάλλουν στην ανοσολογική άμυνα του οργανισμού. Η υπερπαραγωγή όμως TNFα μετά από τραύμα ή λοίμωξη ενεργοποιεί τη συστηματική φλεγμονώδη αντίδραση και παίζει βασικό ρόλο στη παθογένεση της MODS. Έχει βρεθεί ότι ο TNFα εκλύεται κατά την ΙΕ και προκαλεί βλάβες σε απομακρυσμένους ιστούς. Οι Nezu et al, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μεσεντερίου ΙΕ, μέτρησαν τη δραστηριότητα TNFα στην αρτηριακή και πυλαία κυκλοφορία. Βρέθηκε ότι η μέγιστη δραστηριότητα του TNFα στην πυλαία κυκλοφορία ήταν στα 60 λεπτά επαναιμάτωσης, και στην αρτηριακή κυκλοφορία στα 180 λεπτά. Ενδογενείς παράγοντες που Εξωγενείς παράγοντες που προκαλούν έκλυση TNFα προκαλούν έκλυση TNFα Κυτοκίνες (TNFa, IL-1, IFN-A, Λιποπολυσακχαρίδιο GM-CSF, IL-2) PAF Ζυμοσάνη HMGB1 Στρεπροκοκκική πυρογενική εξωτοξίνη Α HSP70 Στρεπτολυσίνη Ο HSP60 Σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β Σταφυλοκοκκική τοξίνη Ι Βακτηριακό DNA Πίνακας 4: Ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες που προκαλούν έκλυση TNFα Ιντερλευκίνες Οι ιντερλευκίνες αποτελούν οικογένεια μικρών πρωτεϊνικών μορίων που ανήκουν στην κατηγορία των κυτοκινών. Η δράση τους βασίζεται στην ενεργοποίηση γονιδίων με αποτέλεσμα την κυτταρική διαφοροποίηση, ανάπτυξη και έκφραση κυτταρικών υποδοχέων. Οι ιντερλευκίνες παίζουν βασικό ρόλο στην ρύθμιση ανοσολογικών 108

109 φαινομένων και στην παθογένεση διαφόρων νοσημάτων. Οι ιντερλευκίνες παράγονται κυρίως από τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα, Τ-κύτταρα, σιτευτικά κύτταρα, και ηωσινόφιλα. Παράγονται όμως και από ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, λεία μυϊκά κύτταρα, νευρώνες. Η ταξινόμηση των ιντερλευκινών είναι δυνατό να γίνει αναφορικά με τη βιοχημική τους λειτουργία. Έτσι, οι ιντερλευκίνες χωρίζονται σε α) Προ-φλεγμονώδεις: IL-1, IL-6, IL-8. Εκκρίνονται από μονοπύρηνα φαγοκύτταρα τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί από λοιμογόνους παράγοντες. β) Ανοσορρυθμιστικές: IL-2, IL-4, IL-10. Συμμετέχουν στην ενεργοποίηση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση των λευκοκυττάρων και μονοκυττάρων. γ) Σχετικές με την ανάπτυξη λευκοκυττάρων: IL-3, IL-7. Ρυθμίζουν την ανάπτυξη και διαφοροποίηση ανώριμων λευκοκυττάρων IL-1 Η IL-1 αρχικά περιγράφτηκε ως ο παράγων ενεργοποίησης λεμφοκυττάρων. Αποτελεί οικογένεια τριών πρωτεϊνών, της IL-1α, της IL-1β και της IL-1 RA, οι οποίες είναι προϊόντα διαφορετικών γονιδίων που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 2. Το γονίδιο της σύνθεσης των υποδοχέων της IL-1 βρίσκεται και αυτό στο χρωμόσωμα 2. Η IL-1α και η IL-1β, έχουν διαφορετική βιοχημική σύνθεση, αλλά παρόμοια δράση. Η IL-1 RA είναι βιολογικά ανενεργός ουσία αλλά λειτουργεί ως συναγωνιστικός αναστολέας της IL-1. Τα κύτταρα που συνθέτουν την IL-1 είναι τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα Β- κύτταρα τα ΝΚ κύτταρα, κερατινοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, ινοβλάστες, ουδετερόφιλα, ενδοθηλιακά κύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου. Οι ουσίες που προκαλούν την παραγωγή της IL-1 είναι προϊόντα του τοιχώματος των μικροβίων. Παράλληλα, η IL-1 οδηγεί στη σύνθεση μορίων σύνδεσης που βρίσκονται στην επιφάνεια μεσεγχειματικών και ενδοθηλιακών κυττάρων (ICAM-1, VCAM-1). Αυτό συμβάλλει στη διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στο διάμεσο ιστό και έξω-αγγειακό χώρο. Η IL-1 αποτελεί παράγοντα αγγειογένεσης, καθώς αυξάνει τη σύνθεση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) IL-6 Η IL-6 είναι μια πολυδύναμη κυτοκίνη, όπως η IL-1. Σχετίζεται με τη φλεγμονώδη αντίδραση. Η IL-6 παράγεται από ανοσοκύτταρα (μονοκύτταρα, μακροφάγα, 109

110 λεμφοκύτταρα) καθώς και ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του εντερικού επιθηλίου. Οι παράγοντες που προκαλούν έκκριση της IL-6 είναι ο TNF, η IL-1, ο PAF, η LPS καθώς και ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Η IL-6 προκαλεί πυρετό, ωρίμανση και διαφοροποίηση των Β-κυττάρων, ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ- κυττάρων, ενεργοποίηση του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων και προαγωγή της σύνθεσης των πρωτεϊνών της οξείας φάσης από τα ηπατικά κύτταρα. Η συγκέντρωση της IL-6 αυξάνεται σημαντικά μετά από τραύμα, από χειρουργικές επεμβάσεις και εγκαύματα. Σε ασθενείς με σηπτικό shock η συγκέντρωση της IL 6 στο πλάσμα είναι πολύ αυξημένη. Ο βαθμός στον οποίο είναι αυξημένη η IL 6 στους ιστούς σχετίζεται με τον κίνδυνο εμφάνισης μετατραυματικών επιπλοκών Προσδιορισμός κυτοκινών Για τον προσδιορισμό των κυτοκινών λαμβανόταν περιφερικό αίμα καθώς και δείγμα από την πυλαία φλέβα σε ποσοστά 5 ml μέσα σε σωληνάριο βιοχημικού ελέγχου χωρίς προσθήκη αντιπηκτικού. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν άμεσα στα 5000g για 5 λεπτά. Μετά την φυγοκέντρηση το υπερκείμενο διήθημα λαμβανόταν προσεκτικά και τοποθετείτο σε αριθμημένα σωληνάρια τύπου Eppendorf χωρητικότητας 2ml. Το σωληνάριο φυλασσόταν σε θερμοκρασία -70 ο C έως ότου εξεταστούν για τον προσδιορισμό των κυτοκινών IL-1, IL-6 και TNF-α. TNF-α Η συγκέντρωση του παράγοντα νέκρωσης όγκου TNF-α στο πλάσμα μετρήθηκε με ένζυμο -συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) χρησιμοποιώντας ένα κιτ ΤΝF-α (KRC3011, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA). Σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το όριο ανίχνευσης αυτής της δοκιμασίας προσδιορίστηκε να είναι 4 pg /ml. Το κιτ ΤΝF-α επίμυος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας, είναι μια δοκιμασία σάντουιτς στερεάς φάσης με ένζυμο- συνδεδεμένη ανοσοπροσρόφηση (ELISA). Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για τον ΤΝF-a επίμυος είχε επιστρωθεί πάνω στις κοιλάνσεις των λωρίδων μικροτιτλισμού (panel). Τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των προτύπων ΤΝF-α επίμυος, τα δείγματα ελέγχου, και τα άγνωστα, τοποθετούνταν σε αυτές τις κοιλάνσεις. 110

111 Κατά την πρώτη επώαση, το αντιγόνο ΤΝF-α επίμυος προσδενόταν στο ακινητοποιημένο αντίσωμα (σύλληψη) στη μία πλευρά. Μετά από πλύση, προστίθετο ένα βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για ΤΝF-α επίμυος. Κατά τη δεύτερη επώαση, το αντίσωμα αυτό προσδένεται στο ακινητοποιημένο ΤΝF-α επίμυος που συνελήφθη κατά τη διάρκεια της πρώτης επώασης. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας του δεύτερου αντισώματος, προστίθετο στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (ένζυμο). Αυτό συνδέεται με το βιοτινυλιωμένο αντίσωμα για να ολοκληρωθεί το σάντουιτς των τεσσάρων μελών. Μετά από μία δεύτερη επώαση και πλύση για να απομακρυνθεί το σύνολο του μη δεσμευμένου ενζύμου, προστίθετο ένα διάλυμα υποστρώματος, το οποίο επενεργεί επί του δεσμευμένου ενζύμου για την παραγωγή χρώματος. Η ένταση αυτού του χρωματισμένου προϊόντος είναι ευθέως ανάλογη προς τη συγκέντρωση του ΤΝF-α επίμυος που υπάρχει στα αρχικό δείγμα. IL-1β Η συγκέντρωση της ιντερλευκίνης- 1 βήτα (IL-1β) στο πλάσμα μετρήθηκε με ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) χρησιμοποιώντας ένα κιτ IL-1β (KRC0011, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA). Σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το όριο ανίχνευσης αυτής της δοκιμασίας προσδιορίστηκε να είναι 3 pg/ml. Το κιτ IL-1β επίμυος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας, είναι μια δοκιμασία σάντουιτς στερεάς φάσης με ένζυμο- συνδεδεμένη ανασοπροσρόφηση (ELISA). Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για IL-1β επίμυος είχε επιστρωθεί πάνω στις κοιλάνσεις των λωρίδων μικροτιτλισμού. Τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των προτύπων IL- 1β επίμυος, τα δείγματα ελέγχου, και τα άγνωστα, τοποθετούνταν σε αυτές τις κοιλάνσεις. Κατά την πρώτη επώαση, το αντιγόνο IL-1β επίμυος προσδένεται στο ακινητοποιημένο αντίσωμα (σύλληψη) στη μία πλευρά. Μετά από πλύση, προστίθετο ένα βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για IL-1β επίμυος. Κατά τη δεύτερη επώαση, το αντίσωμα αυτό προσδένεται στο ακινητοποιημένο IL-1β επίμυος που συνελήφθη κατά τη διάρκεια της πρώτης επώασης. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας του δεύτερου αντισώματος, προστίθετο στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (ένζυμο). Αυτό συνδέεται με το βιοτινυλιωμένο αντίσωμα για να ολοκληρωθεί το σάντουιτς των τεσσάρων μελών. Μετά από μία δεύτερη επώαση και πλύση για να απομακρυνθεί το σύνολο του μη δεσμευμένου ενζύμου, προστίθετο 111

112 ένα διάλυμα υποστρώματος, το οποίο επενεργεί επί του δεσμευμένου ενζύμου για την παραγωγή χρώματος. Η ένταση αυτού του χρωματισμένου προϊόντος είναι ευθέως ανάλογη προς τη συγκέντρωση της IL-1β επίμυος που υπάρχει στα αρχικό δείγμα. IL-6 Η συγκέντρωση της ιντερλευκίνης-6 (IL-6) στο πλάσμα μετρήθηκε με ένζυμο - συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) χρησιμοποιώντας ένα κιτ IL-6 (KRC0061, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA). Σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το όριο ανίχνευσης αυτής της δοκιμασίας προσδιορίστηκε να είναι 5 pg /ml. Το κιτ IL-6 επίμυος που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας, είναι μια δοκιμασία σάντουιτς στερεάς φάσης με ένζυμο- συνδεδεμένη ανοσοπροσρόφηση (ELISA). Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για IL-6 επίμυος είχε επιστρωθεί πάνω στις κοιλάνσεις των λωρίδων μικροτιτλισμού. Τα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των προτύπων IL-6 επίμυος, τα δείγματα ελέγχου, και τα άγνωστα, τοποθετούνταν στις κοιλάνσεις. Κατά την πρώτη επώαση, το αντιγόνο IL-6 επίμυος προσδένεται στο ακινητοποιημένο αντίσωμα (σύλληψη) στη μία πλευρά. Μετά από πλύση, προστίθετο ένα βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για IL-6 επίμυος. Κατά τη δεύτερη επώαση, το αντίσωμα αυτό προσδένεται στο ακινητοποιημένο IL-6 επίμυος που συνελήφθη κατά τη διάρκεια της πρώτης επώασης. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας του δεύτερου αντισώματος, προστίθετο στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (ένζυμο). Αυτό συνδέεται με το βιοτινυλιωμένο αντίσωμα για να ολοκληρωθεί το σάντουιτς των τεσσάρων μελών. Μετά από μία δεύτερη επώαση και πλύση για να απομακρυνθεί το σύνολο του μη δεσμευμένου ενζύμου, προστίθετο ένα διάλυμα υποστρώματος, το οποίο επενεργεί επί του δεσμευμένου ενζύμου για την παραγωγή χρώματος. Η ένταση αυτού του χρωματισμένου προϊόντος είναι ευθέως ανάλογη προς τη συγκέντρωση της IL -6 επίμυος που υπάρχει στα αρχικό δείγμα. 112

113 Σχήμα 7. Σχηματική αναπαράσταση του πρωτοκόλλου μέτρησης TNF-α. (KRC3011, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA) 113

114 Σχήμα 8. Σχηματική αναπαράσταση του πρωτοκόλλου μέτρησης IL-1β (KRC0011, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA). 114

115 Σχήμα 9. Σχηματική αναπαράσταση του πρωτοκόλλου μέτρησης IL-6 (KRC0061, Invitrogen Corporation, Camarillo, CA 93012, USA). 115

116 9.6.ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΥΕΛΟΫΠΕΡΟΞΕΙΔΑΣΗΣ Η μυελοϋπεροξειδάση (myeloperoxidase - MPO) είναι ένα ένζυμο που βρίσκεται στα αζουροφιλικά κοκκία των ουδετερόφιλων. Είναι αποδεδειγμένο ότι η μέτρηση των επιπέδων της μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ευαίσθητη και ποσοτική παράμετρος για την εκτίμηση της πολυμορφοπυρηνικής διήθησης στον μεθισχαιμικό ιστό. Επομένως, η μέτρηση της MPO χρησιμοποιείται ως αξιόπιστη μέθοδος για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των ενεργοποιημένων ουδετερόφιλων στους ιστούς και στο αίμα. Ο έλεγχος της ενεργότητας του ενζύμου, βασίζεται στο γεγονός ότι, καταλύει την διάσπαση του Η 2 Ο 2, και ελευθερώνει Ο : Η 2 Ο 2 Η 2 Ο + Ο Το Ο που ελευθερώνεται αντιδρά με το αντιδραστήριο διυδροχλωρική ο- διανισιδίνη (o-dianisidinedihydrocloride, ή XΗ2), η οποία είναι δότης υδρογόνων και μετατρέπεται σε μια ένωση (Χ) με απορροφητική για το φως ικανότητα: Ο + XΗ 2 Η 2 Ο + Χ Για τη συλλογή των δειγμάτων γινόταν διάνοιξη της συρραφείσας κοιλιακής τομής η οποία επεκτεινόταν κεφαλικά με την εκτέλεση και μέσης θωρακοτομής και μετά από διατομή του περικαρδίου και τοποθέτηση καθετήρα ενδοφλεβίου έγχυσης 22G στην αριστερή κοιλία ακολουθούσε έγχυση φυσιολογικού ορού με πίεση που ισοδυναμούσε σε στήλη ύδατος 50cm. Ταυτόχρονα γινόταν μικρή τομή στον δεξιό καρδιακό κόλπο και η έγχυση συνεχιζόταν έως ότου να παρατηρηθεί εκροή καθαρού φυσιολογικού ορού από το άνοιγμα στη δεξιά καρδιακή κοιλότητα, καθώς και αλλαγή και σταθεροποίηση του χρώματος του νεφρού από ερυθρόφαιο σε κιτρινόμαυρο. Η ενέργεια αυτή αποσκοπούσε στην έκπλυση του τριχοειδικού δικτύου με πλήρωση του αγγειακού δικτύου του πειραματόζωου με το διάλυμα του φυσιολογικού ορού. Προκειμένου να αποφευχθούν αγγειοκινητικές αντιδράσεις λόγω μεταβολής στη θερμοκρασία, κατά την ανωτέρω διαδικασία, το υγρό της έκπλυσης διατηρείτο στους o C. Στη συνέχεια παραλαμβανόταν ο αριστερός νεφρός, και διαιρείτο κατά το οβελιαίο επίπεδο, σε δύο ίσα μέρη. Το ένα ήμισυ ψυχόταν στους -35 o C, για περαιτέρω βιοχημική ανάλυση. Από το άλλο λαμβάνονταν, από περιφερικά και κεντρικά σημεία ιστοτεμάχια μεγέθους περίπου 1 1 mm, και τοποθετούνταν εντός διαλύματος γλουταραλδεΰδης 3%, ώστε στη συνεχεία να γίνει μονιμοποίηση και εξέταση με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση των μετρήσεων ήταν: - διυδροχλωρική ο-διανισιδίνη. 116

117 - Η 2 Ο 2. - Hexadecyl-trimethylammoniumbromide (ΗΤΑΒ). - Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου 50 mm, ph 6. Η μέτρηση της ενεργότητας της μυελοϋπεροξειδάσης γινόταν με την παρακάτω τεχνική: Τα δείγματα ιστού αποψύχονται και αραιώνονται με 10 όγκους 0,5% βρωμιούχου δεκαέξυλο - τριμέθυλοαμμώνιο (ΗΤΑΒ), σε 50mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου. Στη συνέχεια ομογενοποιούνται με ομογενοποιητή Polytron. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρείται στα g για 30min. Στη συνέχεια, 50μl από το υπερκείμενο υγρό, αναμιγνύεται με 50μlO-dianisidinedihydrocloride (1,67 mg/ml) και 0,05% Η 2 Ο 2, σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Η απορροφητικότητα μετράται σε φασματοφωτόμετρο στα 460nm στα 30 και 90 sec. Η ενεργότητα της μυελοϋπεροξειδάσης στον ιστό, εκφράζεται σε μονάδες ανά γραμμάριο ιστού (U/g). Μία ενζυμική μονάδα ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 1mmolH 2 O 2 /min στους 25 ο C. 9.7.ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΑΛΟΝΙΚΗΣ ΔΙΑΛΔΕΫΔΗΣ Από διάφορες πειραματικές μελέτες, βρέθηκε ότι η βλάβη στο νεφρικό ιστό οφείλεται σε υπεροξείδωση των λιπιδίων, η οποία συμβαίνει μετά την ισχαιμίαεπαναιμάτωση. Τα επίπεδα μαλονικής διαλδεΰδης (MDA) αποτελούν δείκτη υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Περίπου 0,5 g νεφρικού ιστού ζυγίζονταν μετά το χειρουργείο, αναμιγνύονταν με παγωμένο διάλυμα 0,9% NaCI έως ότου ο τελικός όγκος φτάσει τα 5 ml και στη συνέχεια καταψύχονταν αμέσως στους -70 C μέχρις ότου προσδιοριστούν οι τιμές τους χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αντιδραστικών ουσιών θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS). Το κιτ TBARS στη μελέτη μας παρέχει ένα απλό, αναπαραγώγιμο και τυποποιημένο εργαλείο για την ανίχνευση της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε ομογενοποιήματα ιστού. 25 mg ιστού προσθέτονταν σε σωλήνα φυγοκέντρησης 1.5ml. Στη συνέχεια, προστίθετο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό θειοβαρβιτουρικό οξύ (EDTA) και τα δείγματα υποβάλλονταν σε επεξεργασία με υπερήχους επί 15 δευτερόλεπτα σε 40V επί πάγου. Οι σωλήνες φυγοκεντρούνταν στις 1600 x g για 10 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο χρησιμοποιούταν για ανάλυση. Το προϊόν προσθήκης ΤΒΑ- MDA που σχηματιζόταν από την αντίδραση MDA και ΤΒΑ 117

118 κάτω από υψηλή θερμοκρασία ( C) και όξινες συνθήκες μετρούνταν χρωματομετρικά στα nm 9.8. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Η υπερμικροσκοπική υφή των νεφρικών κυττάρων μελετήθηκε με τη χρήση Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Διέλευσης. Η λήψη των ιστοτεμαχίων για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο γινόταν άμεσα μετά την θανάτωση του ζώου για να αποφευχθούν μεταθανάτιες αλλοιώσεις. Λαμβάνονταν ιστοτεμάχια τα οποία στη συνέχεια τεμαχίζονταν σε μικρότερα, διαστάσεων 1cm 3 ενώ ήταν βυθισμένα σε διάλυμα γλουταραλδεϋδης 3% σε φωσφορικό διάλυμα ΡH 7,4 στο οποίο και παρέμειναν για 2 ώρες. Στη συνέχεια τα ιστοτεμάχια μετά από έκπλυση μεταφέρονταν σε διάλυμα τετροξειδίου του οσμίου για περαιτέρω μονιμοποίηση για μιάμιση ώρα και ακολουθούσε χρώση σε υδατικό διάλυμα οξικού ουρανυλίου 1% για 14 έως 16 ώρες. Στη συνέχεια ο ιστός υποβαλλόταν σε αφυδάτωση με αλκοολικά διαλύματα αυξανόμενης πυκνότητας (30%, 70%, 90%, και 6 φορές σε απόλυτη αλκοόλη 100%), ακολουθούσε διήθηση με διάλυμα ρητίνης-αιθανόλης ½ για 2 λεπτά και τελικά έγκλειση σε καθαρή ρητίνη ΕΡΟΝ 812 μετά από φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις 200 στροφές/λεπτό. Ο πολυμερισμός της ρητίνης έγινε σε ξηρό επωαστικό κλίβανο στους 65 0 C για 24 ώρες. Στη συνέχεια λαμβάνονταν ημίλεπτες τομές πάχους 1,5-3μ στις οποίες κάτω από οπτικό μικροσκόπιο γίνονταν εντοπισμός της περιοχής παρατήρησης στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Κάτω από στερεοσκόπιο αφαιρούνταν οι περιοχές άνευ ενδιαφέροντος και από το παραμένον υλικό λαμβάνονταν λεπτές τομές πάχους 80nm χρώματος γκρι έως ασημί. Οι λεπτές αυτές τομές βάφονταν με εμβάπτιση σε διάλυμα οξειδίου του μολύβδου (Reynold s) για 20 λεπτά και ακολουθούσε η παρατήρησή τους με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο JEOL TEM 2000 FX 11 σε 80ΚV. Λαμβάνονταν φωτογραφίες από τις περιοχές ενδιαφέροντος και ακολουθούσε μελέτη τους. 9.9.ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι παράμετροι συνοψίστηκαν χρησιμοποιώντας μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις (standarddeviation [SD]) και διαμέσους με εύρη (ελάχιστη τιμή, μέγιστη τιμή). Επίσης, για την γραφική παρουσίαση αυτών των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν ραβδογράμματα, με τη μέση τιμή και τα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης, ή θηκογράμματα (boxplots), για την κάθε ομάδα θεραπείας. Η διάμεσος πλεονεκτεί 118

119 έναντι του μέσου όρου διότι δεν επηρεάζεται από την παρουσία ακραίων τιμών που απέχουν πολύ από όλες τις άλλες τιμές. Επίσης, η διάμεσος προτιμάται όταν τα δεδομένα δεν ακολουθούν την κανονική κατανομή. Αρχικά, στις ποσοτικές μεταβλητές χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία κατά Shapiro-Wilk (Shapiro-Wilktest), για να διαπιστωθεί αν τα δεδομένα κατανέμονται κανονικά. Για την συνολική σύγκριση των υποομάδων χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), όταν τα δεδομένα κατανέμονταν κανονικά, αλλιώς χρησιμοποιήθηκε η μη-παραμετρική ανάλυση διακύμανσης Kruskall-Wallis (Kruskal-Wallistest). Στην περίπτωση που υπήρχε ένδειξη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς (p 0,05) ανάμεσα στις υποομάδες, ακολούθησε η διερεύνηση, για τον εντοπισμό των συγκεκριμένων υποομάδων που διέφεραν στατιστικώς σημαντικά μεταξύ τους. Αυτός ο εντοπισμός έγινε με την σύγκριση όλων των δυνατών συνδυασμών των κατηγοριών ανά δύο, εφαρμόζοντας τη δοκιμασία Student st (Student st-test), ή την αντίστοιχη μη-παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney (Mann- WhitneyUtest). Γι αυτές τις πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε η απλή ρύθμιση κατά Bonferroni. Η επιβίωση παρουσιάστηκε γραφικά με τις καμπύλες Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με μη παραμετρική ανάλυση (Kruskal-Wallistest και Student st-test), εφόσον δεν υπήρχαν αποκομμένα δεδομένα (nocensoring). Σ όλες τις στατιστικές αναλύσεις το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε ως 0,05 και αμφίπλευρο. Οι στατιστικές αναλύσεις εφαρμόστηκαν με το στατιστικό πακέτο SPSS 20.0._ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 10.1 IL-1β Η IL-1β ήταν σημαντικά χαμηλότερη στις ομάδες PC (5, 7 και 8), σε σύγκριση με τις IR ομάδες (4 και 6) (p<0,05). Η μέση τιμή της IL-1β ήταν χαμηλότερη στις ομάδες 7 και 8 (9,52 ± 0,67pg/ml και 9,53 ± 0,79pg/ml αντίστοιχα) σε σύγκριση με την ομάδα 5 (11,05 ± 1,9pg/ml), αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντικό (p>0,05). Υπήρχε, ωστόσο, σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων 4 και 6 (26,06 ± 5pg/ml και 21,79 ± 1,51pg/ml αντίστοιχα, p<0,05). Οι χαμηλότερες τιμές της IL-1β παρατηρήθηκαν στις ομάδες 1, 2 και 3 (5,22 ± 1,61pg/ml, 5,69 ± 6,13 και 1,36pg/ml ± 1,33pg/ml αντίστοιχα) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p<0,05). Η διαφορά μεταξύ των ομάδων 7 και 8 δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (p>0,05). 119

120 ΟΜΑΔΑ IL-1β (pg/ml) ± ± ± ± ± ± ± ±0.79 ΣΥΝΟΛΟ 11.87±7.64 Πίνακας 5. Μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για τις TNF-α για τις 8 ομάδες επιμύων. IL-1β Πίνακας 6. Συγκεντρωτικός πίνακας p test των μέσων τιμών IL-1β για τις διάφορες ομάδες επιμύων. 120

121 Σχήμα 10. Boxplot των τιμών IL-1β για τις 8 ομάδες επιμύων IL- 6 Η IL-6 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στις ομάδες PC (5, 7 και 8) σε σύγκριση με τις ομάδες IR (4 και 6) (p<0,05). Η μέση τιμή της IL-6 ήταν χαμηλότερη στις ομάδες 7 και 8 (17,13 ± 0,54pg/ml και 17,03 ± 0,85pg/ml, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την ομάδα 5 (23,82 ± 1pg/ml) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό (p<0,05). Υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων 4 και 6 (27,7 ± 1,24 pg/ml και 26,09 ± 1,15pg/ml, p<0,05). Οι χαμηλότερες τιμές IL-6 παρατηρήθηκαν στις ομάδες 1, 2 και 3 (6,59 ± 1,39pg/ml, 6,7 ± 0,77pg/ml και 6,95 ± 0,65pg/ml, αντίστοιχα) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p<0,05). Η διαφορά μεταξύ των ομάδων 7 και 8 δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (p>0,05). 121

122 ΟΜΑΔΑ IL-6 (pg/ml) ± ± ± ± ± ± ± ±0.85 ΣΥΝΟΛΟ 16.5±8.45 Πίνακας 7. Μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για τις IL-6 για τις 8 ομάδες επιμύων. IL Πίνακας 8. Συγκεντρωτικός πίνακας p test των μέσων τιμών IL-6 για τις διάφορες ομάδες επιμύων. 122

123 Σχήμα 11. Boxplot των τιμών IL-6 για τις 8 ομάδες επιμύων TNF-α Η ομάδα 4 είχε τα υψηλότερα επίπεδα TNF-α (17,05 ± 1pg/ml) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό (p<0,05) για όλες τις ομάδες. Η ομάδα 6 (15,78 ± 0,85 pg/ml) είχε υψηλότερα επίπεδα TNF-α σε σύγκριση με τις ομάδες 5, 7 και 8 (13,64 ± 0,78 pg/ml, 12,48 ± 0,67 pg/ml και 12,5 ± 0,71 pg/ml, αντίστοιχα) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό. Τα επίπεδα TNF -α στις ομάδες 7 και 8 ήταν χαμηλότερα σε σύγκριση με την ομάδα 5, αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντικό (p>0,05). Οι χαμηλότερες τιμές TNF-α παρατηρήθηκαν στις ομάδες 1, 2 και 3 (4.49 ± 1.39 pg/ml, 5,07 ± 0,58 pg/ml και 5,3 ± 0,3 pg/ml αντιστοίχως) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p<0,05). Η διαφορά μεταξύ των ομάδων 7 και 8 δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (p>0,05). 123

124 ΟΜΑΔΑ TNF-α (pg/ml) ± ± ± ± ± ± ± ±0.71 ΣΥΝΟΛΟ 10.79±4.85 Πίνακας 9. Μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για τις TNF-α για τις 8 ομάδες επιμύων. TNF-α Πίνακας 10. Συγκεντρωτικός πίνακας p test των μέσων τιμών TNF-α για τις διάφορες ομάδες επιμύων. 124

125 Σχήμα 12. Boxplot των τιμών TNF-α για τις 8 ομάδες επιμύων MDA Η ομάδα 4 είχε τα υψηλότερα επίπεδα MDA (6,84 ± 0,87 μmol) σε σύγκριση με όλες τις ομάδες (p<0,05). Δεν υπήρχε σημαντική βελτίωση στα επίπεδα MDA των ομάδων 7 και 8 (4,55 ± 0,46 μmol και 4,49 ± 0,16 μmol αντίστοιχα) σε σύγκριση με την ομάδα 5 (5,17 ± 0,61 μmol). Οι ομάδες 7 και 8 είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα MDA από την ομάδα 6 (5,57 ± 0,34 μmol). Αυτό δεν ισχύει για την ομάδα 5 σύγκριση με την ομάδα 6. Οι χαμηλότερες τιμές MDA παρατηρήθηκαν στις ομάδες 1, 2 και 3 (4.15 ± 0.44 pg/ml, 4,38 ± 0,47 pg/ml και 4.61 ± 0.6 pg/ml, αντίστοιχα) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p<0,05). Δεν υπήρχε καμία σημαντική διαφορά συγκρίνοντας τα επίπεδα MDA των ομάδων 7 και 8 με τις ομάδες ελέγχου (p>0,05). 125

126 ΟΜΑΔΑ MDA (μmol) ± ± ± ± ± ± ± ±0.16 ΣΥΝΟΛΟ 4.97±0.97 Πίνακας 11. Μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για τις MDA για τις 8 ομάδες επιμύων. MDA Πίνακας 12. Συγκεντρωτικός πίνακας p test των μέσων τιμών MDA για τις διάφορες ομάδες επιμύων. 126

127 Σχήμα 13. Boxplot των τιμών MDA για τις 8 ομάδες επιμύων MPO Η ομάδα 4 είχε τα υψηλότερα επίπεδα ΜΡΟ (24,82 ± 1,24 μονάδες/gr) σε σύγκριση με όλες τις ομάδες (p<0,05). Η ομάδα 5 (20.52 ± 2.26 μονάδες/gr) είχε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με την ομάδα 7 (18,59 ± 1,03 μονάδες/gr) τα οποία άγγιζαν στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με την ομάδα 8 (18.87 ± 0.88 μονάδες/gr, p=0.058). Η διαφορά τιμών μεταξύ των ομάδων 5 και 6 (22.12 ± 0.79 μονάδες/gr) δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p>0,05). Ωστόσο, οι ομάδες 7 και 8 είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ΜΡΟ σε σύγκριση με την ομάδα 6. Οι χαμηλότερες ΜΡΟ τιμές παρατηρήθηκαν στις ομάδες 1, 2 και 3 (16,95 ± 0,62 pg/ml, 17,22 ± 0,63 pg/ml και 17,41 ± 0,85 pg/ml, αντίστοιχα) και αυτό ήταν στατιστικά σημαντικό σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες (p<0,05). Η διαφορά μεταξύ των ομάδων 7 και 8 δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (p>0,05). 127

128 ΟΜΑΔΑ MPO (μονάδες/gr) ± ± ± ± ± ± ± ±0.88 ΣΥΝΟΛΟ 19.56±2.82 Πίνακας 13. Μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις για τις MΡΟ για τις 8 ομάδες επιμύων. MPO Πίνακας 14. Συγκεντρωτικός πίνακας p test των μέσων τιμών MPO για τις διάφορες ομάδες επιμύων. 128

129 Σχήμα 14. Boxplot των τιμών MPO για τις 8 ομάδες επιμύων ΔΟΜΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΝΕΦΡΟΥ ΥΠΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Από τη μελέτη στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο πολλαπλές παράμετροι της δομικής βλάβης νεφρού αξιολογήθηκαν μετά από ισχαιμία επαναιμάτωση. Οι αλλοιώσεις αφορούσαν κυρίως τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών των σπειραμάτων και τα μιτοχόνδρια των επιθηλιακών κυττάρων των σωληναρίων. Παρατηρήθηκε οίδημα των ενδοθηλιακών κυττάρων και καταστροφή των ακρολοφιών των μιτοχονδρίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών των σπειραμάτων και στα επιθηλιακά κύτταρα των σωληναρίων. Επίσης παρατηρήθηκε διήθηση των τριχοειδών των σπειραμάτων και του διάμεσου χώρου από πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. Οι ομάδες 1, 2 και 3 εμφάνισαν φυσιολογικές δομές χωρίς να παρατηρείται αιμορραγική διήθηση του διάμεσου ιστού και τα μιτοχόνδρια έχουν φυσιολογικό σχήμα και εμφάνιση. 129