ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA replication) Καθηγητής Δρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς

Transcript

1 ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (DNA replication) 1

2 Τι σηµαίνει αντιγραφή του γενετικού υλικού Το γενετικό υλικό πρέπει να έχει τη δυνατότητα να περάσει από µια γενιά στην επόµενη, άρα πρέπει να αντιγραφεί Η µεταβίβαση του γενετικού υλικού ήταν γνωστή από πειράµατα γενετιστών Η διαδικασία αυτή οφείλει να έχει υψηλή πιστότητα για την διατήρηση του είδους και να είναι χρονικά συµβατή µε τον κυτταρικό κύκλο 2

3 Τι σηµαίνει αντιγραφή του γενετικού υλικού Μετά την διαλεύκανση της ελικοειδούς δοµής του DNA αρχίσαµε να µελετάµε την διαδικασία διπλασιασµού του DNA και µέχρι στιγµής είναι αρκετά πράγµατα γνωστά. Είναι µια διαδικασία εξαιρετικά πολύπλοκη και περιλαµβάνει πολλά ειδικά ένζυµα και πρωτεϊνικούς παράγοντες. H διαδικασία είναι ηµισυντηρητική όπως θα δούµε παρακάτω. 3

4 H σύνθεση των δύο νέων αλυσίδων DNA επιτυγχάνεται µε την ηµισυντηρητική αντιγραφή, που σηµαίνει ότι: 4

5 Ηµισυντηρητική φύση της αντιγραφής του γενετικού υλικού Εννοια του ηµισυντηρητικού µηχανισµού: Σηµαίνει ότι µετά την αντιγραφή, στην επόµενη γενιά µεταφέρεται, µισό γενετικό υλικό από την προηγούµενη που χρησιµοποιήθηκε σαν καλούπι, ενω το άλλο µισό είναι το νέοαντεγραµµένο DNA. Στην αντίθετη περίπτωση (συντηρητικός µηχανισµός) η προηγούµενη γενιά θα διατηρούσε το DNA της και η επόµενη το νέοαντεγραµµένο DNA. 5

6 Θα µελετήσουµε την διαδικασία της αντιγραφή του DNA στα προκαρυωτικά και θα εντοπίσουµε τις διαφορές µε τα ευκαρυωτικά Οι περισσότερες µελέτες έχουν γίνει στα προκαρυωτικά και ιούς διότι είναι πιο «απλά» συστήµατα αλλά και για πειραµατικούς λόγους. Το E.coli έχει ένα κυκλικό χρωµόσωµα 4,6 εκατ bp και µέσα σε λεπτά µπορεί να διπλασιασθεί. Τα ανθρώπινα ευκαρυωτικά έχουν στον πυρήνα τους 46 µόρια DNA, περίπου 6 δις bp και χρειάζονται µάλλον ώρες παρά λεπτά για να αντιγράψουν το DNA τους. Και στις δυο περιπτώσεις η διαδικασία παρουσιάζει αξιοσηµείωτη ταχύτητα και πιστότητα. 6

7 Ποιά είναι τα πρώτα προβλήµατα που πρέπει να λύσει το κύτταρο για να αντιγράψει το γενετικό του υλικό; Να το ξετυλίξει και να κάνει διαθέσιµη την διπλή έλικα στο ενζυµικό του σύστηµα: Στα προκαρυωτικά κύτταρα και ιούς η διαδικασία αυτή είναι πιο εύκολη λόγω του µικρού µεγέθους και της οργάνωσης της προκαρυωτικής χρωµατίνης. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι πιο πολύπλοκη διότι πρέπει πρώτα να απελευθερώσει τις ιστόνες και να «διαλύσει» το νουκλεόσωµα και µετά να διευθετήσει το θέµα της υπερελίκωσης. Να έχει τα υλικά που χρειάζεται: dntps, υπόστρωµα=µήτρα=dna, εκκινητές, ένζυµα (DNA πολυµεράσες) 7

8 Γενικά περί αντιγραφής του γενετικού υλικού Η αντιγραφή του DNA συντελείται µε τεράστια πιστότητα (1/10 6 γονίδια) και ταχύτητα (E. coli *10 6 bp/ min) Στα ευκαρυωτικά (π.χ Δροσόφιλα 6.5*10 7 bp/λίγα min) η ταχύτητα είναι χαµηλή σε σύγκριση µε τα βακτήρια αλλά έχουµε ταυτόχρονη αντιγραφή σε 3000 µονάδες αντιγραφής 8

9 Ποιά είναι τα πρώτα προβλήµατα που πρέπει να λύσει το κύτταρο για να αντιγράψει το γενετικό του υλικό; Να το ξετυλίξει και να κάνει διαθέσιµη την διπλή έλικα στο ενζυµικό του σύστηµα Μηχανισµός «θ» αντιγραφής Η επιµήκυνση συνεπάγεται ξετύλιγµα της διπλής έλικας του µητρικού DNA. Η διαδικασία αυτή είναι εφικτή µόνο στα γραµµικά µόρια. Στην κλειστή κυκλική δοµή δηµιουργείται θετική υπερελίκωση όσο αυξάνεται η αντιγραφή έτσι ώστε να την εµποδίζει. Η δράση της Topo I χαλαρώνει τις θετικές υπερέλικες µέσω διαδοχικών ρηγµάτων, επιτρέποντας την εκτόνωση της τάσης και την ελεύθερη περιστροφή. 9

10 H αντιγραφή του γενετικού υλικού γίνεται σε 3 στάδια: 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής: η έναρξη της αντιγραφής γίνεται σε ειδικές θέσεις µε κοινά χαρακτηριστικά. 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής: ένζυµα και πρωτεϊνες σε µια δυναµική-αρµονική συνεργασία (τοπικά και χρονικά). 3 ο στάδιο: τερµατισµός της αντιγραφής: τα σηµεία λήξης είναι ειδικά. 10

11 Εναρξη της αντιγραφής Εντοπισµό της θέσης έναρξης της αντιγραφής Πρωτείνες εναρξης (initiator proteins) Πριµόσωµα (primosome) Ξετυλίγοντας το DNA αρχίζει η διαδικασία αντιγραφής, δηλαδή η επιµήκυνση που κλείνει µε την λήξη. 11

12 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Η διαδικασία της αντιγραφής του DNA ξεκινά σε συγκεκριµένα σηµεία της αλληλουχίας του γονιδιώµατος γνωστά ως σηµεία έναρξης. Οι αλληλουχίες αυτές είναι εµπλουτισµένες σε ΑΤ (χαµηλό T m ) οπότε είναι πιο εύκολo να ξετυλιχθούν τοπικά οι δυο αλυσίδες του dsdna. Τα σηµεία έναρξης είναι: Ένα στα προκαρυωτικά (OriC, 240 bp), στο κυκλικό χρωµόσωµα στο E. coli και αναγνωρίζεται από την πρωτεϊνη DΝaA που καταναλώνει ATP. Στα ανώτερα ευκαρυωτικά οι θέσεις αυτές είναι πολλαπλές. 12

13 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Στο Ε. coli, το µήκος της ελάχιστης θέσης έναρξης της αντιγραφής ορίζεται από το µήκος DNA που δηµιουργείται από τις 13 bp και 9 bp επαναλαµβανόµενες µονάδες. 13

14 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Το σύµπλοκο προεκκίνησης στη θέση οric είναι ορατό µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Τα δύο σύµπλοκα ταυτοποιούνται µε τη χρήση αντισωµάτων που αναγνωρίζουν την πρωτεΐνη DnaB. 14

15 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Στα βακτηριακά χρωµοσώµατα στη µοναδική θέση έναρξης οι γονικές αλυσίδες διαχωρίζονται σχηµατίζοντας µια αντιγραφική θηλιά µε δύο διχάλες που συναντούνται αντιδιαµετρικά ολοκληρώνοντας την αντιγραφή παράγοντας ενα νεο κυκλικό χρωµόσωµα. 15

16 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Και στις δυο περιπτώσεις η αντιγραφή ξεκινά από µια θέση έναρξης και προχωρά και προς τις δυο κατευθύνσεις Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Στα ευκαρυωτικά χρωµοσώµατα οι πολλαπλές θέσεις έναρξης στις γονικές αλυσίδες, κατα µήκος του γραµµικού DNA, προεκτείνονται και προς τις δυο κατευθύνσεις και τελικά συναντούνται ολοκληρώνοντας την αντιγραφή και παράγοντας γραµµικές θυγατρικές αλυσίδες. 16

17 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Με τον εντοπισµό της θέσης έναρξης της αντιγραφής οι πρωτείνες αυτές στρατολογούν και άλλες πρωτείνες που ονοµάζονται πρωτείνες εναρξης (initiator proteins) και προάγουν την προσέλευση και άλλων πρωτεϊνών που σχηµατίζουν το πριµόσωµα (primosome) Το πρωτεϊνικό αυτό σύµπλοκο στόχο έχει να ξετυλίξει το DNA στο σηµείο αυτό για να αρχίσει η διαδικασία αντιγραφής. 17

18 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Το προ-αντιγραφικό σύµπλοκο στόχο έχει να ξετυλίξει το DNA στο σηµείο αυτό για να αρχίσει η διαδικασία. Mία εξαµερής ελικάση διατρέχει τη µία αλυσίδα του DNA. Όταν η ελικάση προσδένεται στο δίκλωνο DNA, η διαµόρφωση της αλλάζει, και υδρολύει ΑΤΡ, για να διαχωρίσει τις δύο αλυσίδες. Μετά το διαχωρισµό, υιοθετεί πάλι τη διαµόρφωση που έχει όταν είναι προσδεδεµένη σε µονόκλωνο DNA. 18

19 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Στο άκρο κάθε αντιγραφικής θηλιάς βρίσκεται η διχάλα αντιγραφής, σχήµατος Υ, στην οποία επιτελείται το ξετύλιγµα των γονικών αλυσίδων του DNA µε τη δράση της ελικάσης. Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Το µονόκλωνο DNA είναι ευάλωτο σε ζηµιές και τείνει να επανέρχεται σε διπλή έλικα. Οι πρωτείνες δέσµευσης µονόκλωνου DNA (SSB) προσδένονται στις αποχωρισµένες αλυσίδες του DNA και τις σταθεροποιούν σε µονόκλωνη κατάσταση. 19

20 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Κατά το ξετύλιγµα της διπλής έλικας δηµιουργούνται εντονότερες περιελίξεις στο τµήµα του DNA που βρίσκεται µπροστά από την αντιγραφική θηλιά (Y). Η δράση της τοποϊσοµεράσης που τέµνει τις αλυσίδες, εκτονώνοντας και επανενώνοντας, λύνει το πρόβληµα. 20

21 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Το πρώτο τµήµα της νέας νουκλεοτιδικής αλυσίδας είναι µικρό τµήµα RNA και όχι DNA και ονοµάζεται εκκινητής και συντίθεται από το ένζυµο πριµάση (DnaG) µε εκµαγείο το γονικό DNA αρχίζοντας από ένα µόνο νουκλεοτίδιο RNA. Οι RNA εκκινητές έχουν µήκος 5-10 νουκλεοτίδια και η νέα αλυσίδα θα αρχίσει να συντίθεται από το 3 -ακρο του εκκινητή RNA. 21

22 1 ο στάδιο: εντοπισµός θέσης έναρξης της αντιγραφής (replication origin) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 1 ου σταδίου; Συνοπτικά: Στο άκρο κάθε αντιγραφικής θηλιάς βρίσκεται η διχάλα αντιγραφής (replication fork) σχήµατος Υ λόγω των ξετυλιγµένων γονικών αλυσίδων DNA. Για την εκκίνηση της αντιγραφής χρειάζονται αρκετές ενζυµικές ενεργότητες: 1. οι ελικάσες που ξετυλίγουν την διπλή έλικα 2. οι SSB που προσδένονται σε µονόκλωνη αλυσίδα και την σταθεροποιούν 3. οι τοποισοµεράσες, πρωτείνες που εκτονώνουν τάσεις περιέλιξης τέµνοντας-περιστρέφοντας και επανενώνοντας αλυσίδες 4. πρωτεΐνες, πριµάσες, που συνθέτουν τον RNA εκκινητή. 22

23 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Lagging strand: υστερούσα αλυσίδα Leading strand: ηγούµενη αλυσίδα RNA primers: RNA εκκινητές 5-10 βάσεων (5 ->3 ) DNA polymerases E.coli DNApol I και DNApol III Ευκαρυωτικά >11 DNA pols Απαιτούν εκκινητή 500 nt/sec E. coli 50 nt/sec άνθρωπο Ενσωµατώνουν τον τριφωσφορικό νουκλεοζίτη στο 3 -άκρο (-ΟΗ) ελευθερώνοντας πυροσφωσφορικό το οποίο ακολούθως υδρολύεται και παρέχει ενέργεια, ωθόντας την αντίδραση πολυµερισµού. 23

24 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Αντιπαράλληλη επιµήκυνση Τα δύο άκρα µιας αλυσίδας είναι διαφορετικά, γιατί έχουν διαφορετική φορά στις δυο αλυσίδες του. Είναι ένα είδος µονόδροµου. Οι γονικές αλυσίδες είναι αντιπαράλληλες οπότε και οι θυγατρικές αλυσίδες που σχηµατίζονται κατά την αντιγραφή του DNA πρέπει να είναι αντιπαράλληλες προς τις γονικές αλυσίδες. Η αντιπαράλληλη διάταξη επηρεάζει σηµαντικά την αντιγραφή διότι από τη φύση τους οι DNA πολυµεράσες µπορούν να προσθέσουν νουκλεοτίδια µόνο στο ελεύθερο άκρο 3 ενός εκκινητή ή µιας αυξανόµενης αλυσίδας DNA και ποτέ στο 5 -άκρο. 24

25 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Η επιµήκυνση είναι αντιπαράλληλη εποµένως µια νέα αλυσίδα µπορεί να να επιµηκυνθεί µόνο προς την 5 ->3 κατεύθυνση. Η DNApol III µπορεί να χρησιµοποιήσει µόνο τη µια γονική αλυσίδα χωρίς διακοπές και να επιµηκύνει την νεα αλυσίδα προς την υποχρεωτική κατεύθυνση 5 ->3 που ονοµάζεται ηγούµενη ή προπορευόµενη αλυσίδα. 25

26 Καθώς η διχάλα αντιγραφής της γονικής αλυσίδας προχωρά, παράγεται η υστερούσα αλυσίδα (lagging strand). Για την σύνθεση της υστερούσας αλυσίδας απαιτέιται ένας εκκινητής που είναι ένα µικρό RNA 5-10 βάσεων που ονοµάζετα εκκινητής RNA και συντίθεται από το ένζυµο πριµάση (DNaG). Από τα σηµεία αυτά ξεκινά η DNApolIII και συνθέτει τα θραύσµατα Okazaki. Η DNA πολυµεράση ΙΙΙ µπορεί χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο τη µια γονική αλυσίδα να συνθέσει µια συµπληρωµατικά αλυσίδα χωρίς διακοπές και να επιµηκύνει το νέο DNA προς την υποχρεωτική κατεύθυνση 5 ->3. Η δεύτερη αλυσίδα του νέου DNA υποχρεωτικά επιµηκύνεται πρός την κατεύθυνση 5 ->3 από τη δράση της DNA pol III. Το νεοσυντιθέµενο DNA επιµηκύνεται προς τη διχάλα αντιγραφής και ονοµάζεται ηγούµενη αλυσίδα (leading strand). 26

27 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Η υστερούσα αλυσίδα σε αντίθεση µε την ηγούµενη αλυσίδα, συντίθεται ασυνεχώς υπο τη µορφή σειράς µικροτέρων τµηµάτων που ονοµάζονται τεµάχια ή θραύσµατα Okazaki, µήκους νουκλεοτιδίων στα προκαρυωτικά και νουκλεοτιδίων στα ευκαρυωτικά. Το κάθε θραύσµα Okazaki χρειάζεται το δικό του εκκινητή. Μετά το σχηµατισµό του θραύσµατος Okazaki, οι RNA εκκινητές αποικοδοµούνται και στη θέση τους συντίθενται DNA από τη DNA pol I στο 3 -άκρο µέχρι να συναντήση το πρώτο νουκλεοτίδιο του επόµενου θραύσµατος Okazaki. Η ένωση δύο γειτονικών θραυσµάτων Okazaki γίνεται µε τη δράση της DNA λιγάσης σχηµατίζοντας µια ενιαία και συνεχή αλυσίδα DNA. 27

28 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Η σύνθεση των τµηµάτων Okazaki απαιτεί την εκκίνηση, την επιµήκυνση, την αποµάκρυνση του RNA και το γέµισµα του κενού απο την DNApolI. H ένωση των δύο θραυσµάτων Okazaki γίνεται µε τη δράση µιας DNA λιγάσης. 28

29 2 ο στάδιο: επιµήκυνση της αντιγραφής (elongation) Ποιά είναι τα χαρακτηριστικά του 2 ου σταδίου; Πειραµατικά δεδοµένα υποστηρίζουν ότι η ηγούµενη και υστερούσα αλυσίδα αναδιπλώνονται και διέρχονται µέσα από το σύµπλοκο της DNA poliii. Oταν η σύνθεση ενός τεµαχίου Okazaki αποµακρυνθεί από την DNApolIII, η DNApol I άµµεσα βρίσκει τον εκκινητή του επόµενου τεµαχίου κοντά στη διχάλα αντιγραφής. Ετσι αυξάνεται η ταχύτητα αντιγραφής. 29

30 Σύνοψη της αντιγραφής του DNA 30

31 Η ενζυµολογία της αντιγραφής γενικά Οι γνώσεις µας για τις πρωτείνες που παίρνουν µέρος στην αντιγραφή του DNA είναι αρκετά λεπτοµερείς και υπάρχει σηµαντική πρόοδος στην διαλεύκανση του µηχανισµών αντιγραφής λόγω εκτεταµένων δοµικών πληροφοριών. Στις πρώτες φάσεις µελέτης της αντιγραφής χρησιµοποίησαν in vitro συστήµατα αντιγραφής µε εκχυλίσµατα πρωτεϊνών. Πιο πρόσφατα τα συστήµατα αυτά χρησιµοποίησαν καθαρές πρωτείνες οπότε τα δεδοµένα είναι πιο κατανοητά. Κεντρικό ρόλο στην αντιγραφή παίζουν οι πολυµεράσες τις οποίες αναφέραµε στη διαδικασία αντιγραφής, αλλά τώρα θα τις αναλύσουµε περιατέρω. 31

32 Γενικά χαρακτηριστικά των DNA πολυµερασών σε προ- και ευκαρυωτικούς οργανισµούς H οργάνωση των DNA πολυµερασών εµφανίζει κοινά χαρακτηριστικά. Στη δοµή διακρίνονται µία παλάµη, που περιλαµβάνει: το ενεργό κέντρο τα δάκτυλα που τοποθετούν τη µήτρα και ο αντίχειρας, στον οποίο προσδένεται το DNA και είναι σηµαντικός για τη συνεχή δράση του ενζύµου. Ακόµα, υπάρχει µία επικράτεια µε ενεργότητα εξωνουκλεάσης, που διαθέτει το δικό της ενεργό κέντρο, και, τέλος, η Ν-τελική επικράτεια. 32

33 Η ενζυµολογία της αντιγραφής στο E. coli E. coli DNA pol I Αποµακρύνει RNA από υστερούσα αλυσίδα και συνθέτει τα Okazaki τµήµατα Πολυµερισµός 5 ->3 DNA pol II Συµµετέχει στην επισκευή µικρών σπασιµατων του DNA (επιδιόρθωση) DNA pol III Πολυµερίζει το νέο DNA στην ηγούσα και υστερούσα αλυσίδα Εξωνουκλεολυτικ ή δράση 3 -> Εξωνουκλεολυτικ ή δράση 5 ->3 + + _ 33

34 Η ενζυµολογία της αντιγραφής στα ευκαρυωτικά Ευκαρυωτικά α β γ δ ε Πολυµερισµός 5 -> Εξωνουκλεολυτική δράση 3 -> Δράση πριµάσης Πυρήνας Μιτοχόνδρια

35 Η ενζυµολογία της αντιγραφής έχει πολλά κοινά σηµεία σε όλους τους οργανισµούς και στους φάγους Σε όλες τις αντιγραφικές διχάλες απαιτούνται παρόµοιες ενεργότητες. 35

36 Επιδιόρθωση της αντιγραφής του DNA Ο όρος επιδιόρθωση χρησιµοποιείται στον τοµέα της µοριακής βιολογιάς αναφερόµενοι στις διόρθωσης σφαλµάτων διαδικασιών. Προτάθηκε για πρώτη φορά από τον John Hopfield και Jacques Ninio, που µελέτησαν την αντιγραφή του DNA, µεταξύ άλλων. Οι µηχανισµοί διόρθωση της Hopfield και Ninio είναι ενεργές διεργασίες που καταναλώνουν ΑΤΡ για την ενίσχυση της ειδικότητας των διαφόρων βιοχηµικών αντιδράσεων. 36

37 Η πιστότητα του µηχανισµού της αντιγραφής του γενετικού υλικού διασφαλίζεται από σύστηµα διόρθωσης Στα βακτήρια, οι τρεις DNA πολυµεράσες (I, II, και III) έχουν την ικανότητα να διορθώνουν, µε τη χρήση εξωνουκλεολυτικής ενεργότητας 3'-> 5 '. Όταν ένα λανθασµένο ζεύγος βάσεων αναγνωρίζεται, η DNA πολυµεράση αντιστρέφει την κατεύθυνση της κατά ένα ζεύγος βάσεων του DNA και αποµακρύνει την αταίριαστη βάση. Μετά την εκτοµή της βάσης, η πολυµεράση µπορεί να τοποθετήσει ξανά τη σωστή βάση και η αντιγραφή συνεχίζεται. Σε ευκαρυωτικά κύτταρα µόνο οι πολυµεράσες που ασχολούνται µε την επιµήκυνση (γ, δ και ε) έχουν διορθωτική ικανότητα (ενεργότητα εξωνουκλεάσης 3'-> 5 '). 37

38 Μηχανισµός επιδιόρθωσης της αντιγραφής (proofreading) Η αντιγραφή σταµατά είτε σε θέσεις βλάβης είτε σε εγκοπές του DNA. 38

39 Μηχανισµός επιδιόρθωσης της αντιγραφής (proofreading) Mετά την ενσωµάτωση ενός νουκλεοτιδίου στη νεοσυντιθέµενη αλυσίδα, το ζευγάρωµα µεταξύ των βάσεων του τελευταίου ζεύγους εξετάζεται από τη βακτηριακή DNA πολυµεράση. Σε περίπτωση λάθους, το νουκλεοτίδιο αφαιρείται από τη νεοσυντιθέµενη αλυσίδα. 39

40 3 ο στάδιο: τερµατισµός της αντιγραφής Η λήξη της αντιγραφής διαφέρει ανάλογα έαν το µόριο που αντιγράφεται είναι γραµµικό ή κυκλικό. Στο γραµµικό DNA η λήξη συµβαίνει όταν οι διχάλες αύξησης φθάσουν στα άκρα του γραµµικού υποστρώµατος. Επειδή το σηµείο έναρξης δεν είναι στο κέντρο του γραµµικού DNA, τότε η λήξη στα δύο άκρα δεν είναι ταυτόχρονη. Με τη λήξη της αντιγραφής αποχωρίζονται αυτόµατα τα θυγατρικά µόρια. 40

41 3 ο στάδιο: τερµατισµός της αντιγραφής Σε κυκλικό µόριο DNA η λήξη συµβαίνει σε θέση που είναι αντιδιαµετρική από το σηµείο έναρξης. Στο σηµείο λήξης (TER) της αντιγραφής προσδένεται µια ειδική πρωτείνη (Tus) η οποία προκαλέι τη λήξη της αντιγραφής επειδή εµποδίζει τη δράση της ελικάσης DnaB. Με τη λήξη της αντιγραφής τα θυγατρικά µόρια δεν αποχωρίζονται αυτόµατα διότι είναι σαν δυο δεµένοι κρίκοι και πρέπει να δηµιουργηθεί ρήγµα. 41

42 3 ο στάδιο: τερµατισµός της αντιγραφής H Τοποϊσοµεράσης II (Topo II) αλληλεπιδρά και µε δύο αλυσίδες του DNA για να τις διαχωρίσει. Το ένζυµο εισάγει ένα διπλό σπάσιµο κλώνου σε ένα DNA που λέγεται G ή τµήµα της πύλης. Από το σηµείο αυτό θα περάσει το άλλο κλειστό DNA. Με τη χρήση ΑΤΡ η Topo II ενανασυνδέει το ανοικτό DNA. 42

43 Τελοµερή και τελοµεράση Σε αντίθεση µε τα βακτηριακά χρωµοσώµατα που είναι κυκλικά, τα ευκαρυωτικά χρωµοσώµατα είναι γραµµικά και έχουν ειδικά άκρα που ονοµάζονται τελοµερή. Τα τελοµερή αποτελούνται απο µικρές επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες (2000 περίπου). Η ανάγκη για την ύπαρξη των ειδικών αυτών αλληλουχιών στα άκρα των χρωµοσωµάτων είναι προφανής διότι οι DNA πολυµεράσες απαιτούν πρωταρχικό τµήµα και κάνουν 5-3 επιµήκυνση. Στα γραµµικά µόρια DNA στο 5 άκρο και των δυο νέων αλυσίδων παραµένει ένα έλλειµµα που προέρχεται από την αφαίρεση του πρωταρχικού τµήµατος µε την δράση της DNA pol I. Στο τέλος της αντιγραφής υπάρχουν εποµένως µικρές µονόκλωνες ουρές και στις δύο αλυσίδες του καλουπιού. 43

44 Αντιγραφή και τελοµερή 44

45 Τελοµερή και τελοµεράση Η σύνθεση και διατήρηση του µήκους των τελοµερών του DNA γίνεται µε την προσθήκη TTAGGG επαναλαµβανόµενων µονάδων DNA στα 3 -άκρα των υφιστάµενων µονόκλωνων τελοµερικών DNA. Η τελοµεράση ("πορτοκαλί" κουτί) περιέχει πολλά συστατικά των πρωτεϊνών (TERT, τελοµεράση σχετίζεται µε τις πρωτεΐνες) και µία υποµονάδα RNA (TR). 45

46 Τελοµερή και τελοµεράση Το ένζυµο τελοµεράση παρέχει λύση στο πρόβληµα. Η Τελοµεράση επιµηκύνει τα 3 -άκρα των προγονικών αλυσίδων DNA που χρησιµοποιούνται σαν καλούπι για τα καινούργια 5 -άκρα. Οι απλές επαναλαµβανόµενες αλυσίδες που προσθέτει η τελοµεράση καθορίζονται όχι από το DNA αλλά από ένα RNA που αποτελεί τµήµα της τελοµεράσης. Η τελοµεράση είναι µια ριβονουκλεοπρωτείνη και η δράση της είναι: εξειδικευµένη αντίστροφη µεταγραφάση. 46

47 Τελοµερή vs γήρανση, στρες 47

48 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Τα περισσότερα βακτήρια δεν περνούν από ένα καλά καθορισµένο κυτταρικό κύκλο αλλά αντιγράφουν συνεχώς το DNA τους κάτω από συνθήκες ταχείας ανάπτυξης. Υπό τις συνθήκες αυτές το κύτταρο µπορεί να οδηγηθεί σε ταυτόχρονους και πολλαπλούς γύρους αντιγραφής. Στο Ε. coli η αντιγραφή του DNA ρυθµίζεται µέσω διαφόρων µηχανισµών, που κοινό έχουν τον έλεγχο της δέσµευσης πρωτεϊνών εκκίνησης µε τις αλληλουχίες έναρξης. Η αναλογία του ΑΤΡ/ ADP σηµατοδοτεί ότι το κύτταρο έχει φτάσει σε ένα συγκεκριµένο µέγεθος και είναι έτοιµο να διπλασιαστεί. Αυτό το "σήµα" σχετίζεται µε πλούσιες θρεπτικές συνθήκες όπου το κύτταρο θα αυξηθεί γρήγορα και απαιτεί αντιγραφή του γονιδιώµατός του. 48

49 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Από την αντιγραφή του µεθυλιωµένου DNA προκύπτει ηµιµεθυλιωµένο DNA. Οι θέσεις GATC παραµένουν ηµιµεθυλιωµένες, έως ότου η µεθυλάση Dam να αποκαταστήσει πλήρως τη µεθυλίωση. 49

50 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Μόνο πλήρως µεθυλιωµένες θέσεις έναρξης της αντιγραφής µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την εκκίνηση. Οι ηµιµεθυλιωµένες θυγατρικές θέσεις έναρξης δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν, παρά µόνο αφού µεθυλιωθούν πλήρως. 50

51 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Ένα µοντέλο συνεπές µε τα αποτελέσµατα: Η αντιγραφή δηµιουργεί ηµιµεθυλιωµένο DNA. Οι αλληλουχίες ori και DnaA συγκρατούνται στην µεµβράνη και είναι ανενεργές στην αντιγραφή και µεταγραφή. Το επίπεδο της πρωτεΐνης DnaA µειώνεται γρήγορα µετά τη λήξη της αντιγραφής. Μετά ένα κύκλο αντιγραφής δεν υπάρχει αρκετή DnaA να ξεκινήσετε την επόµενη αντιγραφή. Η Dam µεθυλάσης µεθυλιώνει τελικά όλες τις θέσεις στο γονιδίωµα µε αποτελέσµα την απελευθέρωση των ori και DnaA από τη µεµβράνη. Το απελευθερωµένο DnaA γονίδιο µεταγράφεται και µεταφράζεται. Η πρωτεΐνη DnaA ξεκινά την αντιγραφή του DNA. 51

52 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Οι µηχανισµοί ρύθµισης της αντιγραφής του DNA είναι κατασταλτικού χαρακτήρα για να αποφευχθεί η αλόγιστη αντιγραφή του και να ακολουθεί τον κύκλο της ζωής του βακτηρίου. 52

53 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η αντιγραφή του DNA ελέγχεται στα πλαίσια του κυτταρικού κύκλου. 53

54 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η αντιγραφή του DNA ελέγχεται στα πλαίσια του κυτταρικού κύκλου. Καθώς το κύτταρο αναπτύσσεται και διαιρείται µέσα από τα στάδια του κυτταρικού κύκλου η αντιγραφή του DNA λαµβάνει χώρα κατά τη φάση S (φάση σύνθεσης). Η πρόοδος του κύκλου του ευκαρυωτικού κυττάρου ελέγχεται από σηµεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Η διάβαση µέσω των σηµείων ελέγχου, ελέγχεται µέσω πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων µεταξύ διαφόρων πρωτεϊνών, συµπεριλαµβανοµένων των κυκλινών και εξαρτώµενες από κυκλίνη κινασών. 54

55 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η αντιγραφή του DNA ελέγχεται στα πλαίσια του κυτταρικού κύκλου. Το G 1 / S σηµείο ελέγχου (ή το checkpoint περιορισµού) ρυθµίζει εαν τα ευκαρυωτικά κύτταρα θα εισέλθουν στην διαδικασία της αντιγραφής του DNA και ακολούθως θα διαιρεθούν. Τα κύτταρα που δεν θα περάσουν µέσα από αυτό το σηµείο ελέγχου παραµένουν στο στάδιο G 0 και δεν αντιγράψουν το DNA τους. Η αντιγραφή των γονιδιωµάτων του χλωροπλάστη και των µιτοχονδρίων λαµβάνει χώρα ανεξάρτητα από τον κυτταρικό κύκλο. 55

56 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ANTΙΓΡΑΦΗΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Στα ευκαρυωτικά υπάρχουν αρκετές χιλιάδες σηµεία έναρξης της αντιγραφής. Άρα ο έλεγχος πρέπει να γίνεται στη φάση S για να λειτουργήση κάθε σηµείο έναρξης ΜΙΑ ΦΟΡΑ και ως εκ τούτου απαιτείται η παρουσία παραγόντων = µοριακών διακοπτών = που να δίνουν αδεία συγκρότησης (licensing). Στα σηµεία έναρξης συγκροντούνται τα προεναρξιακά σύµπλοκα (pre-rc) στη φάση G1 και ενεργοποιούνται αφού τα κύτταρα περάσουν στη φάση S. 56