ΙΙΙ. ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Transcript

1 ΙΙΙ. ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 27

2 1. Φυτικό υλικό Τα φυτά των κλώνων πικροδάφνης που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, προήλθαν από τη ριζοβολία φυλλοφόρων μοσχευμάτων κορυφής από μητρικά φυτά της συλλογής του Εργαστηρίου Ανθοκομίας και των φυτώριων «Κωστελένος». Τα έρριζα μοσχεύματα φυτεύονταν σε φυτοδοχεία χωρητικότητας 1lt. Το εδαφικό υπόστρωμα περιείχε 50% έδαφος, 30% τύρφη και 20% περλίτη. Τα φυτά μεταφέρονταν σε χώρο του θερμοκηπίου, όπου δέχονταν τις απαραίτητες φροντίδες άρδευσης, λίπανσης και φυτοπροστασίας έως και την έναρξη των πειραμάτων. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν εννέα κλώνοι πικροδάφνης (Εικόνα 1.1) με τα εξής χαρακτηριστικά: ΝΟ1: κλώνος με βραδεία αύξηση και συμπαγές χαμηλό σχήμα. Φέρει στενά φύλλα με σκούρο πράσινο χρώμα και παχιά επιδερμίδα, με μονά άνθη κόκκινου χρώματος ΝΟ2: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, έχει φύλλα φαρδιά και λεπτά, με ζωηρό πράσινο χρώμα και διπλά άνθη λευκού χρώματος ΝΟ3: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, τα φύλλα είναι φαρδιά και λεπτά, με ζωηρό πράσινο χρώμα και τριπλά άνθη ρόδινου χρώματος ΝΟ4: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, έχει φύλλα φαρδιά και λεπτά, με ζωηρό πράσινο χρώμα και μονά άνθη ρόδινου χρώματος ΝΟ5: κλώνος με αργή βλαστική αύξηση, φύλλα στενά και λεπτά με σκούρο πράσινο χρώμα και δίνει διπλά άνθη με κίτρινο χρώμα ΝΟ6: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, φύλλα στενά και λεπτά με σκούρο πράσινο χρώμα και δίνει μονά άνθη κίτρινου χρώματος ΝΟ7: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, έχει φύλλα στενά και λεπτά, με σκούρο πράσινο χρώμα και δίνει μονά πορτοκαλορόδινα άνθη ΝΟ8: κλώνος με γρήγορη βλαστική αύξηση, τα φύλλα είναι φαρδιά και λεπτά με ζωηρό πράσινο χρώμα και δίνει μονά άνθη με έντονο ιώδες χρώμα. ΝΟ9: κλώνος με βραδεία αύξηση και συμπαγές χαμηλό σχήμα. Φέρει στενά φύλλα με σκούρο πράσινο χρώμα και παχιά επιδερμίδα, με μονά άνθη ρόδινου χρώματος 28

3 Εικόνα 1.1. Οι εννέα κλώνοι πικροδάφνης που χρησιμοποιήθηκαν, σε στάδιο ανθοφορίας. 2. Θρεπτικό διάλυμα καλλιέργειας Στα πειράματα όπου η υδατική καταπόνηση προκλήθηκε με τη χρήση ωσμωτικών μέσων (μαννιτόλη και PEG) τα φυτά αναπτύσσονταν σε θρεπτικό διάλυμα με την εξής σύσταση: Πίνακας 1.1. Σύσταση θρεπτικού διαλύματος Μακροστοιχεία (mmol/l) Ιχνοστοιχεία (μmol/l) 11,5 Fe 25 0,5 Mn 5 K + 11,5 B 20 - H 2 PO 4 1,5 Zn 35 Ca 2+ 3,3 Cu 0,75 Mg 2+ 1,0 Mo 0,5 - SO 4 1,0 - NO 3 + NH 4 3. Μέτρηση φωτοσύνθεσης, διαπνοής και στοματικής αγωγιμότητας Για τη μέτρηση της φωτοσύνθεσης (Α: μmol CO 2 m -2 s -1 ), της διαπνοής (Ε: mmol m -2 s -1 ), της στοματικής αγωγιμότητας (g s : mol m -2 s -1 ) και της συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου CO 2 (Ci: vpm), χρησιμοποιήθηκε φορητό σύστημα μέτρησης της φωτοσύνθεσης (LCi, Leaf Chamber Analysis System, ADC, Bioscientific LTD). Οι μετρήσεις γίνονταν πρωινές ώρες σε 5 νεαρά και πλήρως ανεπτυγμένα φύλλα ανά μεταχείριση. 29

4 4. Προσδιορισμός νωπού και ξηρού βάρους Για τον υπολογισμό του νωπού και ξηρού βάρους χρησιμοποιήθηκαν 5 δίσκοι πλήρως ανεπτυγμένων φύλλων ανά επανάληψη, διαμέτρου 7mm. Το ξηρό βάρος μετρήθηκε μετά από ξήρανση σε φούρνο στους 70 ο C για 24 h. 5. Υπολογισμός διαρροής ηλεκτρολυτών Η διαρροή των ηλεκτρολυτών μετρήθηκε ως δείκτης της ικανότητας της κυτταρικής μεμβράνης να διατηρεί ή να ανακτά τη σταθερότητά της κατά τη διάρκεια της υδατικής καταπόνησης ή της επανάρδευσης. Τα δείγματα, που αποτελούνταν από 5 δίσκους νεαρών και πλήρως ανεπτυγμένων φύλλων (διαμέτρου 7mm) τοποθετούνταν σε 1 ml διαλύματος μαννιτόλης 0,3Μ (Varith κ.ά., 2001). Μετά από επώαση στη μαννιτόλη για 2 h στους 25 ο C, μετριόταν η αγωγιμότητα του διαλύματος. Στη συνέχεια τα δείγματα τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο στους 100 ο C για 10 min και η αγωγιμότητα μετριόταν ξανά. Το ποσοστό της διαρροής των ηλεκτρολυτών υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο : % διαρροή ηλεκτρολυτών = (C 1 -C man )*100/(C 2 -C man ), όπου C 1 = η πρώτη μέτρηση της αγωγιμότητας πριν από βρασμό C 2 = η δεύτερη μέτρηση της αγωγιμότητας μετά από βρασμό και C man = η αγωγιμότητα του διαλύματος της μαννιτόλης 6. Προσδιορισμός χλωροφύλλης και καροτινοειδών Η περιεκτικότητα των χλωροφυλλών (chl α, chl b και chl α+b) και των καροτινοειδών καθορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Lichtenthaler (1987). Τα δείγματα, που αποτελούνταν από 5 δίσκους νεαρών και πλήρως ανεπτυγμένων φύλλων, εκχυλίζονταν με αιθανόλη 95% σε υδατόλουτρο στους 80 ο C για μια ώρα. Η απορρόφηση των εκχυλισμάτων μετρήθηκε στα 648 και 663 nm για τις χλωροφύλλες και στα 470 nm για τα καροτινοειδή. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως mg g -1 ξηρού βάρους. 7. Προσδιορισμός προλίνης Η περιεκτικότητα των φύλλων και των ριζών σε προλίνη έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο του Bates (1973). Ποσότητα 0,5 g φυτικού υλικού ομογενοποιήθηκε σε 2 ml σουλφοσαλικυλικού οξέος 3%. Στη συνέχεια το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε και 1 ml από το υπερκείμενο προστέθηκε σε δοκιμαστικό σωλήνα μαζί με 1 ml όξινης νινυδρίνης και 1 ml οξικού οξέος και θερμάνθηκαν στους 100 ο C για 1 ώρα. Κατόπιν προστέθηκαν 2 ml τολουόλη και το μίγμα ανακατεύτηκε καλά σε 30

5 αναδευτή για 15 sec. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 520 nm, αφού τα δείγματα απέκτησαν θερμοκρασία δωματίου. Η περιεκτικότητα σε προλίνη προσδιορίστηκε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης απορροφήσεων διαλυμάτων γνωστής περιεκτικότητας σε καθαρή προλίνη. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μmoles g -1 ξηρού βάρους. 8. Προσδιορισμός σακχάρων Η μέτρηση της περιεκτικότητας των σακχάρων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο του Dubois (1956). Η εκχύλιση των δειγμάτων, που αποτελούνταν από 5 δίσκους νεαρών και πλήρως ανεπτυγμένων φύλλων, έγινε με 80% μεθανόλη. Σε 1 ml του εκχυλίσματος προστέθηκαν 1 ml διαλύματος φαινόλης 5% και 5 ml θεϊικού οξέος. Τα δείγματα ανακατεύτηκαν σε αναδευτή και αφέθηκαν να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου σε υδατόλουτρο στους ο C. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm για τις εξόζες και τις μεθυλιωμένες εξόζες και στα 480nm για τις πεντόζες, τα ουρονικά οξέα και τα μεθυλιωμένα παράγωγά τους. Η περιεκτικότητα σε σάκχαρα προσδιορίστηκε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης απορροφήσεων διαλυμάτων γνωστής περιεκτικότητας σε γλυκόζη και εκφράστηκε σε μονάδες γλυκόζης (mg g -1 ξηρού βάρους). 9. Ενζυμική εκχύλιση Κατά τη δειγματοληψία το φυτικό υλικό ζυγίστηκε και λυοτριβήθηκε σε παγόλουτρο με τη βοήθεια υγρού αζώτου. Η ομογενοποίηση (αναλογία βάρους δείγματος προς όγκο εκχυλιστικού 1:10) έγινε σε γουδί για 2 min, με 2 ml ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (Κ 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ) συγκέντρωσης 0.1Μ και ph 7, που περιείχε 1mM PMSF ως αναστολέα των πρωτεασών και 5% (w/v) PVPP ως αναστολέα των πολυφαινολοξειδασών (Syros κ.ά., 2001). Για την εκχύλιση της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος το διάλυμα περιείχε επιπλέον 5 mm ασκορβικού οξέος. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα x g για 20 min στους 4 o C και το υπερκείμενο τοποθετήθηκε στην κατάψυξη στους -24 o C για τις περαιτέρω μετρήσεις. 10. Εκχύλιση ολικών πρωτεϊνών Το φυτικό υλικό ζυγίστηκε και λυοτριβήθηκε σε παγόλουτρο με τη βοήθεια υγρού αζώτου. Τα δείγματα εκχυλίστηκαν παρουσία Tris-HCl 0,065 M, ph 6,8 που περιείχε 1% w/v SDS, 1mM PMSF ως αναστολέα των πρωτεασών και 2% (v/v) β-μερκαπτοαιθανόλη ως αναγωγικού παράγοντα. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα x g για 20 min στους 4 o C και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για την SDS ηλεκτροφόρηση. Η SDS ηλεκτροφόρηση έγινε κάτω από αναγωγικές συνθήκες (παρουσία 2% (v/v) β-μερκαπτοαιθανόλης στο ρυθμιστικό διάλυμα επιστοίβαξης) με ποσότητα 180μg πρωτεΐνης για κάθε δείγμα. 31

6 11. Προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης καθορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Bradford όπως τροποποιήθηκε από τον Bearden (1978). Η μέθοδος στηρίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliand Blue G 250 σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, να απορροφά στα 465 nm και να δίνει καστανό χρώμα. Η χρωστική έχει την ικανότητα να δεσμεύεται με πρωτεΐνες σε αραιά όξινα διαλύματα και να αλλάζει το χρώμα του διαλύματος σε βαθύ κυανό. Το σύμπλοκο δείκτη-πρωτεΐνης απορροφά μέγιστα στα 595 nm. Για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ενός διαλύματος αναμιγνύoνται 2 ml του διαλύματος Bradford με ίσο όγκο νερού και του εκχυλίσματος του οποίου την πρωτεΐνη θέλουμε να μετρήσουμε. Η μέτρηση της απορρόφησης γίνεται στα 595 nm χρησιμοποιώντας ως μάρτυρα (blanc) το ίδιο διάλυμα χωρίς την προσθήκη του εκχυλίσματος μας. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη βρέθηκε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης απορροφήσεων διαλυμάτων γνωστής περιεκτικότητας σε κρυσταλλική αλβουμίνη βοδιού (BSA). Η πρότυπη αυτή καμπύλη ξαναγινόταν από την αρχή σε κάθε νέα παρασκευή του αντιδραστηρίου. Με τη μέθοδο αυτή η πρωτεΐνη του δείγματος προσδιορίζεται με ακρίβεια 1 μg πρωτεΐνη/ml δείγματος. 12. Προσδιορισμός πρωτεϊνών παρουσία αναγωγικών παραγόντων Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την μέθοδο των Minamide και Bamburg (1990). Με τη μέθοδο αυτή, μπορεί να προσδιοριστεί η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ακόμα και παρουσία αναγωγικών παραγόντων, απορρυπαντικών και άλλων ουσιών που υπάρχουν στα δείγματα των πρωτεϊνών. Επειδή η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη η χρήση γαντιών ήταν απαραίτητη κατά το χειρισμό των φίλτρων. Τα δείγματα επιστάζονται σε φίλτρα από χαρτί Whatman Νο 1, στεγνώνονται στον αέρα, ξεπλένονται με απόλυτη μεθανόλη και πάλι αφήνονται στον αέρα να στεγνώσουν. Αυτό το πλύσιμο απομακρύνει τις ουσίες που πιθανώς να παρεμποδίζουν στην αντίδραση της βαφής. Κατόπιν τα φίλτρα τοποθετούνται σε διάλυμα που περιέχει 0,5% w/ν Coomassίe brίlliant blue G, 7% v/v οξικό οξύ, και αναδεύονται ήπια σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως ξεβάφονται με διάλυμα 7% ν/ν οξικού οξέος, ξηραίνονται στον αέρα, και τοποθετούνται σε πλαστικούς σωλήνες (eppendorf). Σε κάθε eppendorf προστίθεται 1 ml διάλυμα εκχύλισης, (66% v/v μεθανόλη, 33 /ο v/v νερό, 1% v/v ΝH 4 ΟΗ) και γίνεται ανάδευση. Η ανάδευση επαναλήφθηκε μετά από 5min. Στο εκχύλισμα μετριέται η απορρόφηση στα 610 nm. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη βρίσκεται με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης απορροφήσεων διαλυμάτων γνωστής περιεκτικότητας σε κρυσταλλική αλβουμίνη βοδιού (BSA). Ο προσδιορισμός με τα φίλτρα μπορεί να προσδιορίσει πρωτεΐνη 100 ng έως 20 μg, παρουσία θειϊκού αμμωνίου, ουρίας, αναγωγικών παραγόντων θειόλης, αμινοξέων, DNA, ιοντικών και μη ιοντικών απορρυπαντικών, οξέων και βάσεων. 32

7 13. Φωτομετρικός προσδιορισμός υπεροξειδασών Ο προσδιορισμός της ενζυμικής δράσης έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Ngo και Lenhoff (1980). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στο γεγονός ότι παρουσία των υπεροξειδασών το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) αντιδρά με το MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone hydrochloride monohydrate) και DMAB [3-(dimethylamino) benzoic acid] και δίνει ένα έγχρωμο προϊόν που απορροφά μέγιστα στα 590 nm. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη (πιθανώς η πιο ευαίσθητη για υπεροξειδάσες) και η μεταβολή της απορρόφησης στα 590 nm είναι γραμμική μέχρι και τιμές απορρόφησης 0.8 περίπου. Το μίγμα επώασης είχε όγκο 3 ml και αποτελούνταν από 0.1 Μ διάλυμα φωσφορικών K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ph 6.5, 1μmol H 2 Ο 2, 30 μmol DMAB και 0,6 μmol ΜΒΤΗ. Για τις ανάγκες των πειραμάτων η μέτρηση γινόταν στους 25 ο C και η τιμή της απορρόφησης στα 590 nm καταγράφονταν ανά 30 sec. Η ενζυμική δράση εκφράστηκε ως μεταβολή της απορρόφησης σε 1 min/mg πρωτεΐνης (ειδική ενζυμική δραστικότητα). 14. Φωτομετρικός προσδιορισμός όξινων φωσφατασών Ο προσδιορισμός της ενζυμικής δράσης έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο που προτάθηκε από τον Bessey (1946) και βασίζεται στην αποφωσφορυλίωση του π-νιτρο-φαινυλο-φωσφορικού νατρίου από τη φωσφατάση. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στο γεγονός ότι η π-νιτροφαινόλη, η οποία απελευθερώνεται από το υπόστρωμα, έχει κίτρινο χρώμα σε αλκαλικό περιβάλλον. Το χρώμα αυτό οφείλεται στο ανιόν της το οποίο υφίσταται βαθυχρωμική μετατόπιση. Η αποφωσφορυλίωση έγινε παρουσία Mn 2+ με το μίγμα επώασης να έχει όγκο 750 μl και να περιέχει 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος οξικού αμμωνίου-οξικού οξέος για ph 5-6,5 και Τριςοξικό για ph 7-8,1 mm κατιόντα Mn 2+ (ως οξικό μαγνήσιο) και 0,166 mm π-νιτροφαινυλοφωσφορικό νάτριο, το ενζυμικό παρασκεύασμα (20 μl) και νερό έως όγκου 750 μl. H επώαση έγινε στους 37 ο C για 45 min και η διακοπή της έγινε με προσθήκη 750 μl ψυχρού διαλύματος (4 o C) 0,25 Μ ΝαΟΗ. Η ανάπτυξη του κίτρινου χρώματος μετρήθηκε στα 410 nm χρησιμοποιώντας ως μάρτυρα λευκό μίγμα στο οποίο δεν περιεχόταν ενζυμικό παρασκεύασμα. 15. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός υπεροξειδασών Για την ηλεκτροφόρηση των υπεροξειδασών η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε βασίστηκε στο σύστημα του Laemmli (discontinuous buffer system for non denatured PAGE, 1970). Χρησιμοποιήθηκε η συσκευή ηλεκτροφόρησης V10-WDC, Dual Cooled mini vertical Gel Unit (Scie-PLAS). H πηκτή επιστοίβαξης ήταν 5% ενώ ο διαχωρισμός των υπεροξειδασών και φωσφατασών έγινε σε πηκτή 10% μήκους 5.0 cm και πάχους 1,5 mm. Η πηκτή επιστοίβαξης είχε την παρακάτω σύσταση: 5 ml Tris-HCl 0,5 M ph 6,8 για τις ανιονικές υπεροξειδάσες ή 33

8 5 ml οξικό-koh 1 M ph 6,8 για τις κατιονικές υπεροξειδάσες ή 5 ml Tris-γλυκίνη Μ ph για τις εστεράσες ml H 2 O δις απεσταγμένο 3.32 ml ακρυλαμίδιο 30% + 1% bis-ακρυλαμίδιο 1 ml APS 1.5 % 40 μl TEMED Η πηκτή διαχωρισμού είχε την εξής σύσταση: 5 ml Tris-HCl 3 M ph 8,8 5 ml οξικό-koh 1 M ph 4,3 για τις βασικές υπεροξειδάσες ml H 2 O δίς ml ακρυλαμίδιο 30 % + 1 % bis-ακρυλαμίδιο 2 ml APS 1.5 % 40 μl TEMED για τις όξινες υπεροξειδάσες ή 5 ml οξικό-koh 1 M ph 4, ml H 2 O δίς ml ακρυλαμίδιο 30 % + 1 % bis-ακρυλαμίδιο 2 ml APS 1.5 % 40 μl TEMED για τις βασικές υπεροξειδάσες. Η παρασκευή της πηκτής έγινε με πολυμερισμό μίγματος ακρυλαμιδίου και ΝΝ -μεθυλενο-διςακρυλαμιδίου (bis-ακρυλαμίδιο). Η αντίδραση γίνεται με τον μηχανισμό των ελεύθερων ριζών. Για την έναρξη της χρησιμοποιείται καταλύτης TEMED (NNN N -τετραμεθυλο-αιθυλενοδιαμίνη) και ενισχυτής του καταλύτη (NH 4 ) 2 S 2 O 8. Αντί του (NH 4 ) 2 S 2 O 8 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ριβοφλαβίνη παρουσία φωτός αν πρόκειται να γίνει μη μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση ενζύμου ευαίσθητου στο (NH 4 ) 2 S 2 O 8. Ο ενισχυτής του καταλύτη προκαλεί τις πρώτες ελεύθερες ρίζες στο TEMED το οποίο με τη σειρά του δημιουργεί ελεύθερες ρίζες στο ακρυλαμίδιο. Το ακρυλαμίδιο πολυμερίζεται σε γραμμικά πολυμερή ενώ το TEMED δημιουργεί νέες ελεύθερες ρίζες σε άλλα άθικτα μόρια ακρυλαμιδίου. Τα γραμμικά πολυμερή ενώνονται μεταξύ τους με bis-ακρυλαμίδιο και σχηματίζουν τρισδιάστατο πλέγμα. Τα δείγματα φορτώθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα επιστοίβαξης (loading buffer) με την εξής σύσταση: 7.5 ml H 2 O 1.0 ml 10 % γλυκερόλη 34

9 1.0 ml 500 mm Tris-HCl ph 6,8 0.5 ml 1 % κυανό της βρωμοφαινόλης για τις όξινες (ανιονικές) υπεροξειδάσες ή 7.5 ml H 2 O 1.0 ml 10 % γλυκερόλη 1.0 ml 500 mm Tris-HCl ph 6,8 0.5 ml 1 % κυανό του μεθυλενίου για τις βασικές (κατιονικές) υπεροξειδάσες. Η ηλεκτροφόρηση των όξινων υπεροξειδασών και φωσφατασών έγινε χρησιμοποιώντας ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (10x) διάλυμα με τη παρακάτω σύσταση: 144,0 g Γλυκίνη 30,3 g Tris-HCl, διαλυμένα σε 1000 ml H 2 O δίς απεσταγμένο. Για την ηλεκτροφόρηση των βασικών υπεροξειδασών χρησιμοποιήθηκε ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (1x) διάλυμα με τη παρακάτω σύσταση: 31,2 g β-αλανίνη ~ 8.0 ml οξικό οξύ (ρύθμιση του pη στο 4.5), διαλυμένα σε 1000 ml H 2 O δις απεσταγμένο. Οι συνθήκες της ηλεκτροφόρησης ήταν 1mA ανά θέση μέχρι να εισέλθουν τα δείγματα στην πηκτή διαχωρισμού και στη συνέχεια 3 ma μέχρι τέλους. Η ηλεκτροφόρηση γινόταν σε θερμοκρασία 4 ο C και διαρκούσε περίπου 4 h. Για τη βαφή των υπεροξειδασών στην πηκτή του πολυακριλαμιδίου χρησιμοποιήθηκε η χρωστική carbazole (3-methyl-9-ethyl-carbazole) σε διάλυμα που αποτελούνταν από 50 ml οξικό νάτριο 0,1 M ph 5.0 παρουσία 100 μl Η 2 Ο 2. Η χρωστική διαλύονταν αρχικά σε 3 ml Dimethyl Formamide (DMF). Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, οι πηκτές εξισορροπούνταν αρχικά για 15 min σε διάλυμα οξικού νατρίου και στη συνέχεια σε νέο διάλυμα γινόταν η βαφή που διαρκούσε ακριβώς 30 min για να είναι δυνατή η σύγκριση της έντασης των ζωνών στην πηκτή του πολυακρυλαμιδίου. Με την παραπάνω μέθοδο βαφής οι υπεροξειδάσες χρωματίζονται ερυθρές. Η στερέωση των υπεροξειδασών στην πηκτή έγινε με επαναλαμβανόμενες πλύσεις σε διάλυμα 20 % οξικό οξύ και 40% αιθυλικής αλκοόλης (περίπου 15 min). Στη συνέχεια οι πηκτές του πολυακρυλαμιδίου διατηρούνταν σε απεσταγμένο νερό για μελέτη, παρατήρηση και φωτογράφηση τους. 16. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός της υπεροξειδικής δισμουτάσης Η ανίχνευση των ισομορφών της υπεροξειδικής δισμουτάσης σε πηκτή πολυακρυλαμίδης έγινε με συνεχή ανακίνηση, σύμφωνα με τη μέθοδο των Beauchamp και Fridovich (1971). Η πηκτή επιστοίβαξης ήταν 6% ενώ ο διαχωρισμός των υπεροξειδασών έγινε σε πηκτή 10% μήκους 4.2 cm 35

10 και πάχους 1 mm. Η πηκτή επιστοίβαξης όσο και η πηκτή διαχωρισμού είχαν τη ίδια ακριβώς σύσταση με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των ανιονικών υπεροξειδασών. Μετά το τέλος του ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού οι πηκτές επωάσθηκαν για 20 min στο σκοτάδι σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7.8) που περιείχε 2.45 mm NBT (nitroblue tetrazolium). Στη συνέχεια, οι πηκτές επωάσθηκαν για άλλα 20 min, επίσης στο σκοτάδι, σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7.8) που περιείχε mm ριβοφλαβίνη και 28 mm τετρα-μεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη (TEMED). Ακολούθησε έκθεση των πηκτών σε τεχνητό φως (περίπου 10 min), έως ότου οι ισομορφές της υπεροξειδικής δισμουτάσης έγιναν ορατές. Η πηκτή χρωματιζόταν κυανή, ενώ αντίθετα οι ισομορφές της υπεροξειδικής δισμουτάσης εμφανίζονταν ως άχρωμες ζώνες. Κατόπιν οι πηκτές αποθηκεύονταν σε απεσταγμένο νερό και φωτογραφίζονταν αμέσως. 17. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός όξινων φωσφατασών Η σύσταση των πηκτών και οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης για των προσδιορισμό των φωσφατασών περιγράφονται στον ηλεκτροφορητικό προσδιορισμό των ανιονικών υπεροξειδασών. Η βαφή του ενζύμου έγινε με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Wendel και Weeden (1989). Τα συστατικά του διαλύματος της βαφής ήταν τα εξής : 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος εξισορρόπησης-επώασης Na-acetate 0,1 M ph mg a-napthyl acid phosphate monosodium salt 200 mg MgCl 2. 6 H 2 O 100 mg Fast Garnet GBC salt Η πηκτή τοποθετήθηκε σε 80 ml ρυθμιστικού διαλύματος Na-acetate για εξισορρόπηση για 15 min με συνεχή ανάδευση. Στα υπόλοιπα 20 ml διαλύθηκαν το MgCl 2.6 H 2 O και το Fast Garnet GBC salt. Το a-napthyl acid phosphate monosodium salt διαλύθηκε σε 5 ml DMSO. Μετά την εξισορρόπηση προστέθηκαν στην πηκτή τα υπόλοιπα 20 ml και έπειτα τα 5 ml του DMSO. Ακολούθησε επώαση από μια έως δώδεκα h στους 37 ο C. Με τη παραπάνω μέθοδο βαφής οι διαχωρισμένες φωσφατάσες έδιναν κυανώδη χρωματισμό. Στη συνέχεια οι πηκτές του πολυακρυλαμιδίου αποθηκεύονταν σε απεσταγμένο νερό για μελέτη, παρατήρηση και φωτογράφηση τους. 18. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός εστερασών Η σύσταση των πηκτών και οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης για τον προσδιορισμό των εστερασών περιγράφονται στον ηλεκτροφορητικό προσδιορισμό των ανιονικών υπεροξειδασών. Η βαφή του ενζύμου έγινε με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Wendel και Weeden (1989). Τα συστατικά του διαλύματος της βαφής ήταν τα εξής : 36

11 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος εξισορρόπησης-επώασης Na-phosphate 0,1 M ph 6 50 mg a-napthyl acetate 50 mg β-napthyl acetate 100 mg Fast Blue RR Η πηκτή τοποθετήθηκε σε 70 ml ρυθμιστικού διαλύματος Na-phosphate για εξισορρόπηση για 15 min με συνεχή ανάδευση. Στα υπόλοιπα 30 ml διαλύθηκε το Fast Blue RR και στη συνέχεια διηθήθηκε. Το a-napthyl acetate και το β-napthyl acetate διαλύθηκαν σε 3 ml αιθανόλης. Μετά την εξισορρόπηση προστέθηκαν στην πηκτή τα υπόλοιπα 30 ml του ρυθμιστικού διαλύματος Naphosphate με το Fast Blue RR και τα 3 ml αιθανόλης. Ακολούθησε επώαση για μια ώρα στους 37 ο C. Με την παραπάνω μέθοδο βαφής οι διαχωρισμένες εστεράσες έδιναν κυανώδη χρωματισμό. Στη συνέχεια οι πηκτές του πολυακρυλαμιδίου αποθηκεύονταν σε απεσταγμένο νερό για μελέτη, παρατήρηση και φωτογράφηση τους. 19. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος Η ανίχνευση των ισομορφών της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος σε πηκτή πολυακρυλαμίδης έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Mittler και Zilinskas (1993). Η σύσταση των πηκτών και οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης για τον προσδιορισμό της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος περιγράφονται στον ηλεκτροφορητικό προσδιορισμό των ανιονικών υπεροξειδασών. Η μόνη διαφορά έγκειται στο ότι το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης περιείχε επιπλέον 2 mμ ασκορβικού οξέος και οι πηκτές έτρεξαν για 30 min με το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης προτού φορτωθούν τα δείγματα. Μετά το τέλος του ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού οι πηκτές επωάσθηκαν, σε θερμοκρασία δωματίου, για 30 min σε 50 mμ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7) που περιείχε 2 mm ασκορβικού οξέος, το οποίο ανανεώνονταν κάθε 10 min. Στη συνέχεια, οι πηκτές επωάσθηκαν για άλλα 20 min σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7) που περιείχε 4 mm ασκορβικό οξύ και 2 mm H 2 O 2. Ακολούθως οι πηκτές ξεπλύθηκαν με 50 mμ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7) για 1 min. Κατόπιν εμβαπτίστηκαν σε 50 mμ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph 7,8) που επιπλέον περιείχε 28 mm τετρα-μεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη (TEMED) και 2.45 mm NBT (nitroblue tetrazolium) υπό συνεχή ανακίνηση και εκτέθηκαν σε τεχνητό φως, έως ότου οι ισομορφές της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος έγιναν ορατές. Η πηκτή χρωματιζόταν κυανή, ενώ αντίθετα οι ισομορφές της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος εμφανίζονταν ως άχρωμες ζώνες σε περίπου 3-5 min. 37

12 20. Ηλεκτροφορητικός προσδιορισμός νουκλεασών Για την ηλεκτροφόρηση των DNAσών και των RNAσών χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυμερισμένη παρουσία υποστρώματος ssdna και RNA αντίστοιχα. Η πηκτή επιστοίβαξης ήταν 6% ενώ ο διαχωρισμός των νουκλεασών έγινε σε πηκτή 10% μήκους 4,3 cm και πάχους 1 mm. Η πηκτή επιστοίβαξης είχε την παρακάτω σύσταση: 5 ml Tris-HCl 0,5M ph 6,8 9,88 ml Η 2 Ο δις για υπόστρωμα ss DNA ή 10,18 ml Η 2 Ο δις για υπόστρωμα RNA 0,8 ml ssdna (2 mg/ml) ή 0,5 ml RNA (5 μονάδες Α 260 ) 3,32 ml ακρυλαμίδιο 30% + 1%bis- ακρυλαμίδιο 1ml APS 1,5% 40 μl TEMED Η πηκτή διαχωρισμού είχε την εξής σύσταση: 5 ml Tris-HCl 1,875 M ph 8,8 18,04 ml Η 2 Ο δις για υπόστρωμα ss DNA ή 18,64 ml Η 2 Ο δις για υπόστρωμα RNA 1,6 ml διαλύματος ss DNA ή 1 ml διαλύματος RNA 13,32 ml ακρυλαμίδιο 30% + 1%bis- ακρυλαμίδιο 2 ml APS 2,0% 40 μl TEMED Τα δείγματα φορτώθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιώντας ως διάλυμα επιστοίβαξης (loading buffer) κατάλληλο buffer με την εξής σύσταση: 5,5ml Η 2 Ο 3,0 ml 10% γλυκερόλη 1,0 ml 500 mm Tris HCl ph 6,8 0,5 ml 1% κυανό της βρωμοφαινόλης Η ηλεκτροφόρηση (τα δείγματα κινούνται προς την κάθοδο) έγινε χρησιμοποιώντας ως buffer ηλεκτροφόρησης (10Χ) διάλυμα με την παρακάτω σύσταση: 144,0 g Γλυκίνη 30,3 g Tris-HCl στα 1000 ml Η 2 Ο δις απεσταγμένο. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης και την αφαίρεση της πηκτής από τη συσκευή ακολουθούσε η εξής διαδικασία: 38

13 1. Εξισορρόπηση της πηκτής για 15 min υπό συνεχή ανατάραξη με 50ml διαλύματος της παρακάτω σύστασης: 6,6ml ρυθμιστικό διάλυμα tris-οξικό (ph 7,5) 0,5M 10ml διάλυμα Mg(CH 3 COO) M 83,4ml Η 2 Ο 2. Επώαση της πηκτής με άλλα 50 ml του παραπάνω διαλύματος για 20 min σε υδατόλουτρο 37 ο C υπό συνεχή ανατάραξη. 3. Εξισορρόπηση της πηκτής για 15 min υπό συνεχή ανατάραξη με 50 ml διαλύματος της παρακάτω σύστασης: 6,6ml ρυθμιστικό διάλυμα οξικό αμμώνιο-οξικό (ph 5,5) 0,5M 10ml διάλυμα Mg(CH 3 COO) M 83,4ml Η 2 Ο 4. Επώαση της πηκτής με άλλα 50 ml του παραπάνω διαλύματος για 20 min σε υδατόλουτρο 37 ο C υπό συνεχή ανατάραξη. 5. Προσθήκη 6 μl βρωμιούχου αιθιδίου στο δοχείο που περιέχει την πηκτή με τα 50 ml του buffer επώασης ph 5,5 και συνεχίζεται η επώαση για άλλα 5 min. Κατά τις επωάσεις στις οποίες υπόκειται η πηκτή, το υπόστρωμα στο σημείο της πηκτής όπου βρίσκεται το ένζυμο υδρολύεται. Το σημείο αυτό (ζώνη) γίνεται εμφανές με το διαποτισμό της πηκτής με το διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου το οποίο έχει την ιδιότητα να σχηματίζει σύμπλοκο μόνο με άθικτα μόρια του νουκλεϊνικού οξέος. Το σύμπλοκο αυτό κάτω από UV ακτινοβολία, εκπέμπει ρόδινο φθορισμό, χαρακτηριστικό του βρωμιούχου αιθιδίου. Η ζώνη όπου ήταν το ένζυμο και υδρολύθηκε το νουκλεϊνικό οξύ παραμένει σκοτεινή. Η φωτογράφηση των πηκτών γίνεται υπό φωτισμό με λάμπα UV με το κατάλληλο φιλμ. 21. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS- PAGE). Κατά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται από το απορρυπαντικό SDS και δημιουργούνται σύμπλοκα πρωτεΐνης- SDS. Το SDS έχει την ιδιότητα να ενώνεται με τις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνικών μορίων με αποτέλεσμα τη διάσπαση των μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών, το ξεδίπλωμα των πεπτιδικών αλυσίδων και τη δημιουργία επιμήκών συμπλόκων. Στο μίγμα προστίθεται επίσης και κάποια αναγωγική ουσία όπως η β-μερκαπτοαιθανόλη, η οποία ανάγει τις δισουλφιδικές γέφυρες ώστε να διαχωριστούν οι τυχόν υπομονάδες των πρωτεϊνών και να αποτελέσουν σύμπλοκα με το SDS. 39

14 Στα σύμπλοκα αυτά, τα ανιόντα του SDS συνδέονται με τις πεπτιδικές αλυσίδες με σταθερή αναλογία ενός μορίου SDS ανά δύο αμινοξέα ή ποσοτικά περίπου 1,4 g SDS ανά g πρωτεΐνης. Λόγω του πλήθους των μορίων SDS στο σύμπλοκο, αυτό έχει μεγάλο καθαρό αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο, συνήθως πολύ μεγαλύτερο από το φορτίο που είχε αρχικά η πρωτεΐνη, με αποτέλεσμα όταν βρεθεί σε ηλεκτρικό πεδίο να κινείται προς το θετικό ηλεκτρόδιο. Το φορτίο του συμπλόκου είναι περίπου ανάλογο προς τη μάζα της πρωτεΐνης λόγω της σταθερής αναλογίας των μορίων SDS προς τον αριθμό των αμινοξέων της. Σύμπλοκα που σχηματίζονται με πρωτεΐνες ιδίου μεγέθους έχουν το ίδιο σχήμα λόγω αποδιάταξης από το SDS των ανώτερων διαμορφώσεων τους. Έχουν επίσης το ίδιο ηλεκτρικό φορτίο, διότι έχουν το ίδιο πλήθος μορίων SDS. Λόγω του ίδιου σχήματος, του ίδιου μεγέθους και του ίδιου φορτίου τείνουν να συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο, όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο. Κατά την SDS-ηλεκτροφόρηση στην κίνηση των πρωτεϊνών παρεμβάλλεται η πηκτή του πολυακρυλαμιδίου η οποία συμπεριφέρεται ως μοριακό φίλτρο, επιτρέποντας τα μικρότερα μόρια να διέρχονται από τους πόρους της ευχερέστερα από τα μεγαλύτερα τα οποία και καθυστερούν να κινηθούν. Έχει βρεθεί εμπειρικά ότι η απόσταση που διανύει ένα τέτοιο σύμπλοκο είναι αντιστρόφως ανάλογη προς τον λογάριθμο του μοριακού του βάρους, εκτός από μερικές εξαιρέσεις που παρατηρήθηκαν σε πρωτεΐνες πλούσιες σε υδατάνθρακες και σε κάποιες πρωτεΐνες μεμβρανών. Συνεπώς κατά την SDS-PAGE ενός μίγματος πρωτεϊνών, αυτές κινούνται προς το θετικό ηλεκτρόδιο, το οποίο βρίσκεται στο κάτω άκρο της κατακόρυφα τοποθετημένης πηκτής, και διαχωρίζονται μέσα σε αυτή σε μια σειρά από ζώνες από τις οποίες κάθε μία περιέχει πρωτεΐνες του ίδιου μεγέθους και κατά συνέπεια του ίδιου μοριακού βάρους. Όσο μικρότερο είναι το μοριακό βάρος μίας πρωτεΐνης τόσο πλησιέστερα προς το κάτω άκρο της πηκτής βρίσκεται μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών ενός δείγματος, ηλεκτροφορείται παράλληλα με αυτό και ένα μίγμα μαρτύρων πρωτεϊνών γνωστών μοριακών βαρών και συγκρίνονται οι θέσεις των ζωνών του δείγματος με τις θέσεις των ζωνών των μαρτύρων. Η ηλεκτροφόρηση έγινε χρησιμοποιώντας τη συσκευή ηλεκτροφόρησης LKB 2001, Vertical Electrophoresis Unit (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden. Glass plates 16 x 18 cm, 1,5 mm comp). Χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% (1,2 mm) και ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών έγινε σε μήκος 12 cm. Η πηκτή διαχωρισμού (για δύο gel) είχε την εξής σύσταση: 15.8 ml Tris-HCl 1,875 M ph 8, ml H 2 O δίς 31.6 ml ακρυλαμίδιο 30 % + 1 % bis-ακρυλαμίδιο 790 μl SDS 10 % 395 μl APS 10 % 70 μl TEMED 40

15 Η πηκτή επιστοίβαξης ήταν 6% και είχε την παρακάτω σύσταση (για δύο gel): 3.24 ml Tris-HCl 0,625 M ph 6,8 9,40 ml H 2 O δίς 3,24 ml ακρυλαμίδιο 30% + 1% bis-ακρυλαμίδιο 162,2 μl SDS 10 % 129,8 μl APS 10 % 40 μl TEMED Τα δείγματα φορτώθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα επιστοίβαξης (5x) με την εξής σύσταση: 10 % SDS 50 % γλυκερόλη 312,5 mm Tris-HCl ph 6,8 0,1 % κυανό της βρωμοφαινόλης 2 % β-μερκαπτοαιθανόλη Η ηλεκτροφόρηση έγινε χρησιμοποιώντας ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (1x) με τη παρακάτω σύσταση: 75 g Γλυκίνη 15 g Tris-HCl 5 g SDS διαλυμένα σε 5 λίτρα H 2 O δίς απεσταγμένο. Οι συνθήκες της ηλεκτροφόρησης ήταν 75 V μέχρι να εισέλθουν τα δείγματα στην πηκτή διαχωρισμού και στη συνέχεια 125 V. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε θερμοκρασία δωματίου και διαρκούσε περίπου 9 h. Τα δείγματα πριν από την ηλεκτροφόρηση θερμαίνονταν για 3 min στους 100 ο C. Για τη βαφή των πρωτεϊνών στην πηκτή του πολυακριλαμιδίου χρησιμοποιήθηκε η χρωστική Commasie Brilliant Blue R-250 (BBR-250) που έχει ευαισθησία 1 μg πρωτεΐνης ανά ζώνη, σε διάλυμα που αποτελούνταν από: 0,1 % w/v BBR % τριχλωροξικό οξύ, TCA 40% v/v μεθανόλη και διαρκούσε 12 h. Ο αποχρωματισμός της πηκτής έγινε με διάλυμα 10 % τριχλωροξικού οξέος και συνεχή ανακίνηση για 12 h περίπου. Στη συνέχεια οι πηκτές του πολυακριλαμιδίου με τις πρωτεΐνες να 41

16 χρωματίζονται κυανές, διατηρούνταν σε διάλυμα οξικού οξέος 7 % για μελέτη, παρατήρηση και φωτογράφησή τους. 22. Στατιστική ανάλυση δεδομένων Η επεξεργασία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος MSTAT. Η στατιστική ανάλυση βασίστηκε στην ανάλυση της παραλλακτικότητας (ANOVA) σε επίπεδο σημαντικότητας 5% και η σύγκρισή των μέσων όρων έγινε με τη βοήθεια του κριτηρίου Duncan. 42