ΠΕΙΡΑΜΑ 1.2 Μελέτη φυσιολογικών και βιοχημικών παραμέτρων δύο κλώνων πικροδάφνης με διαφορετική συμπεριφορά στην έλλειψη νερού

Transcript

1 ΠΕΙΡΑΜΑ 1.2 Μελέτη φυσιολογικών και βιοχημικών παραμέτρων δύο κλώνων πικροδάφνης με διαφορετική συμπεριφορά στην έλλειψη νερού

2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Φυτικό υλικό Χρησιμοποιήθηκαν νεαρά φυτά πικροδάφνης ηλικίας 8 εβδομάδων των κλώνων NO8 και NO9 από τη συλλογή του Εργαστηρίου Ανθοκομίας. Οι δύο κλώνοι διέφεραν τόσο ως προς τα μακροσκοπικά τους χαρακτηριστικά (σελ. 27) όσο και ως προς την ευαισθησία τους στην έλλειψη νερού. Σε καλλιέργεια σε φυτοδοχεία, ο κλώνος ΝΟ8 είχε εμφανή σημάδια ευαισθησίας (μάρανσης φύλλων) στην περιορισμένη άρδευση σε αντίθεση με τον κλώνο ΝΟ9. Ως εδαφικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε έδαφος:τύρφη:περλίτης σε αναλογία 5:3:2. Τα φυτά αναπτύσσονταν στο θερμοκήπιο του Εργαστηρίου Ανθοκομίας σε θερμοκρασία ημέρας 23 ο C και νυχτερινή θερμοκρασία 18 ο C σε φυσική φωτοπερίοδο Μαΐου-Ιουνίου Μεταχειρίσεις έλλειψης νερού Η υδατική καταπόνηση εφαρμόστηκε με διακοπή της παροχής νερού. Τα φυτά δέχτηκαν τις εξής τρεις μεταχειρίσεις: α. κανονική άρδευση καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος (μάρτυρας), β. διακοπή της παροχής νερού την ημέρα έναρξης του πειράματος για 18 και 24 ημέρες για τα φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9 αντίστοιχα (υδατική καταπόνηση) και γ. διακοπή της παροχής νερού την ημέρα έναρξης του πειράματος, με επανάρδευση όταν η διαπνοή προσέγγισε μηδενικές τιμές (ανάνηψη) Δειγματοληψίες Οι δειγματοληψίες έγιναν την ημέρα που η διαπνοή προσέγγισε μηδενικές τιμές (υδατική καταπόνηση) και 24 ώρες μετά την επανάρδευση (ανάνηψη). Ως φυτικό υλικό για τις βιοχημικές αναλύσεις συλλέχθηκαν νεαρά, ώριμα φύλλα, βλαστοί και ρίζες. Δείγματα του μάρτυρα πάρθηκαν στην έναρξη και στο τέλος του πειράματος για να διαπιστωθούν τυχόν διαφορές στην πορεία του χρόνου. Λόγω μη διαφοράς στα αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν οι μετρήσεις που έγιναν στο τέλος του πειράματος. 88

3 Παράμετροι αξιολόγησης Οι μορφολογικές, φυσιολογικές και βιοχημικές παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν το χλωρό και ξηρό βάρος των φύλλων, η φωτοσύνθεση, η διαπνοή, η στοματική αγωγιμότητα, η συγκέντρωση των χλωροφυλλών a και b, η περιεκτικότητα σε ολικές πρωτεΐνες και η ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών. Επίσης, μελετήθηκε η ενζυμική ανταπόκριση των ανιονικών και κατιονικών υπεροξειδασών, εστερασών, όξινων φωσφατασών, DNασών, RNασών και της υπεροξειδικής δισμουτάσης καθώς και τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα των πρωτεϊνών. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε περιγράφεται στο Κεφάλαιο ΙΙΙ. 89

4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Με βάση μακροσκοπικές παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια του πειράματος, διαπιστώθηκε ότι τα συμπτώματα έλλειψης νερού εμφανίστηκαν πιο έντονα και νωρίτερα στα φυτά του κλώνου ΝΟ8 σε σχέση με τον κλώνο ΝΟ9 (Εικόνες και ). Οι παρατηρήσεις αυτές σε συνδυασμό με την καθημερινή μέτρηση της διαπνοής, καθόρισαν την ημέρα δειγματοληψίας στη διάρκεια του πειράματος. Ως εκ τούτου δείγματα από φυτά του κλώνου ΝΟ8 ελήφθησαν 18 ημέρες μετά τη διακοπή της άρδευσης, οπότε η διαπνοή προσέγγισε μηδενικές τιμές, γεγονός που συνέβη την 24 η ημέρα του πειράματος για τον κλώνο ΝΟ9, δηλαδή 6 ημέρες αργότερα. Εικόνα Επίδραση της υδατικής καταπόνησης μετά από 18 ημέρες και μία ημέρα μετά από επανάρδευση στα μακροσκοπικά χαρακτηριστικά φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ8. Εικόνα Επίδραση της υδατικής καταπόνησης μετά από 24 ημέρες και μία ημέρα μετά από επανάρδευση στα μακροσκοπικά χαρακτηριστικά φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ Επίδραση της έλλειψης νερού στο νωπό και ξηρό βάρος Διακοπή της άρδευσης είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του νωπού βάρους και της περιεκτικότητας σε νερό των φύλλων στα φυτά του κλώνου ΝΟ8 (Πίνακας ). Μία ημέρα μετά την επανάρδευση οι τιμές αυξήθηκαν σημαντικά και επανήλθαν στο 85% των τιμών του μάρτυρα. Αντίθετα το ξηρό βάρος δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μεταξύ των μεταχειρίσεων. 90

5 Πίνακας Μεταβολή του νωπού, ξηρού βάρους και της περιεκτικότητας σε νερό φύλλων πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ8, μετά από 18 ημέρες έλλειψης νερού και μία ημέρα μετά από επανάρδευση. Μεταχείριση Νωπό βάρος (g) Ξηρό βάρος (g) H 2 O (g) Μάρτυρας 0,1185 a 0,0203 a 0,0982 a Υδατική καταπόνηση 0,0270 c 0,0214 a 0,0056 c Επανάρδευση 0,1001 b 0,0184 a 0,0817 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. Όπως φαίνεται στον Πίνακα το νωπό βάρος και η περιεκτικότητα σε νερό των φύλλων πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ9, μειώθηκαν λόγω της υδατικής καταπόνησης, ενώ το ξηρό βάρος δεν μεταβλήθηκε σημαντικά. Μία ημέρα μετά την επανάρδευση το νωπό βάρος και το περιεχόμενο νερό των φύλλων αυξήθηκαν φτάνοντας στο 80% του μάρτυρα, ενώ το ξηρό βάρος ήταν μειωμένο σε σχέση με τα φυτά του μάρτυρα. Πίνακας Επίδραση της έλλειψης νερού για 24 ημέρες σε φύλλα φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ9 στο νωπό, ξηρό βάρος και στην περιεκτικότητα σε νερό Μεταχείριση Νωπό βάρος (g) Ξηρό βάρος (g) H 2 O (g) Μάρτυρας 0,1288 a 0,0272 a 0,1016 a Υδατική καταπόνηση 0,0285 c 0,0243 ab 0,0041 c Επανάρδευση 0,1046 b 0,0235 b 0,0811 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan Επίδραση της έλλειψης νερού στη φωτοσύνθεση, διαπνοή και στοματική αγωγιμότητα Στα φυτά και των δύο κλώνων που μελετήθηκαν, η υδατική καταπόνηση προκάλεσε κλείσιμο των στομάτων, μηδενίζοντας τη στοματική αγωγιμότητα, με αποτέλεσμα τη στατιστικώς σημαντική μείωση της φωτοσύνθεσης, της διαπνοής αλλά και της συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου CO 2 (Ci) (Πίνακες και ). Μία ημέρα μετά την επανάρδευση των φυτών του κλώνου ΝΟ8 παρά τη σημαντική αύξηση της στοματικής αγωγιμότητας, της διαπνοής και της Ci, η φωτοσύνθεση δεν μεταβλήθηκε σε σχέση με τα καταπονημένα φυτά, ενώ αντίθετα αυξήθηκε στα φυτά του κλώνου ΝΟ9. Η έλλειψη νερού δεν προκάλεσε μεταβολή του λόγου Α/Ε στα φυτά του κλώνου ΝΟ8, ενώ αντίθετα ο λόγος αυξήθηκε σημαντικά στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 στη μεταχείριση της καταπόνησης και επανήλθε στα επίπεδα του μάρτυρα μετά την επανάρδευση. 91

6 Πίνακας Μεταβολή της φωτοσύνθεσης (A: μmol CO 2 m -2 s -1 ), διαπνοής (E: mmol m -2 s -1 ), στοματικής αγωγιμότητας (g s : mol m -2 s -1 ), συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου CO 2 (Ci: vpm) και του λόγου Α/Ε (μmol CO 2 mmol -1 H 2 O), μετά από 18 ημέρες έλλειψης νερού και 24 ώρες μετά από επανάρδευση σε φυτά του κλώνου ΝΟ8 Μεταχείριση A E g s Ci Α/Ε Μάρτυρας 3,29 a 1,080 a 0,059 a 345,4 a 3,22 ab Υδατική καταπόνηση 0,75 b 0,028 c 0,000 c 296,7 b 5,34 a Επανάρδευση 0,54 b 0,291 b 0,004 b 410,3 a 2,53 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=5), με το κριτήριο Duncan. Πίνακας Μεταβολή της φωτοσύνθεσης (A: μmol CO 2 m -2 s -1 ), διαπνοής (E: mmol m -2 s -1 ), στοματικής αγωγιμότητας (g s : mol m -2 s -1 ), συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου CO 2 (Ci: vpm) και του λόγου Α/Ε (μmol CO 2 mmol -1 H 2 O), μετά από 24 ημέρες έλλειψης νερού και 24 ώρες μετά από επανάρδευση σε φυτά του κλώνου ΝΟ9 Μεταχείριση A E g s Ci Α/Ε Μάρτυρας 2,44 a 0,350 a 0,024 a 339,0 a 8,48 b Υδατική καταπόνηση 0,39 b 0,027 b 0,000 c 275,1 b 14,62 a Επανάρδευση 0,71 ab 0,286 a 0,007 b 318,6 a 2,67 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=5), με το κριτήριο Duncan Επίδραση της έλλειψης νερού στην περιεκτικότητα των χλωροφυλλών Η περιεκτικότητα των φύλλων σε χλωροφύλλες a, b και a+b στα φυτά και των δυο κλώνων που αξιολογήθηκαν δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις μεταχειρίσεις του πειράματος (Πίνακες και ). Ο λόγος a/b επίσης δεν μεταβλήθηκε στον κλώνο ΝΟ9, ενώ αντίθετα αυξήθηκε σημαντικά λόγω της υδατικής καταπόνησης στα φυτά του κλώνου ΝΟ8 και μειώθηκε μετά την επανάρδευση σε τιμές παρόμοιες με εκείνες του μάρτυρα. Πίνακας Περιεκτικότητα χλωροφυλλών (chla, chlb, chl a+b: mg/g ξηρού βάρους) και ο λόγος chl a/b μετά από 18 ημέρες έλλειψης νερού σε φυτά του κλώνου ΝΟ8 Μεταχείριση chl a chl b chl a+b chl a/b Μάρτυρας 7,17 a 4,45 a 11,60 a 1,61 b Υδατική καταπόνηση 8,20 a 4,81 a 12,99 a 1,71 a Επανάρδευση 7,77 a 4,8 a 12,56 a 1,62 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. 92

7 Πίνακας Περιεκτικότητα χλωροφυλλών (chla, chlb, chl a+b: mg/g ξηρού βάρους) και ο λόγος chl a/b μετά από 24 ημέρες έλλειψης νερού σε φυτά του κλώνου ΝΟ9 Μεταχείριση chl a chl b chl a+b chl a/b Μάρτυρας 5,70 a 3,58 a 9,27 a 1,58 a Υδατική καταπόνηση 7,15 a 4,23 a 11,37 a 1,69 a Επανάρδευση 6,83 a 4,21 a 11,03 a 1,62 a Διαφορετικά γράμματα σε κάθε στήλη δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan Επίδραση της έλλειψης νερού στην περιεκτικότητα των ολικών πρωτεϊνών Η διακοπή της άρδευσης επέφερε σημαντική μείωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες των νεαρών και ώριμων φύλλων του κλώνου ΝΟ8 (Πίνακας ). Μετά την επανάρδευση οι πρωτεΐνες αυξήθηκαν σημαντικά στους παραπάνω δύο ιστούς συγκριτικά τόσο με τα καταπονημένα όσο και με τα φυτά μάρτυρα. Σε δείγματα βλαστών του κλώνου ΝΟ8 η συγκέντρωση των πρωτεϊνών αυξήθηκε σημαντικά στα καταπονημένα φυτά και αυξήθηκε περαιτέρω μετά την επανάρδευση. Αύξηση των πρωτεϊνών καταγράφηκε και στις ρίζες λόγω της υδατικής καταπόνησης. Μετά την επανάρδευση η περιεκτικότητα των ριζών σε πρωτεΐνες μειώθηκε, όχι όμως στα επίπεδα του μάρτυρα. Πίνακας Επίδραση της έλλειψης νερού για 18 ημέρες στην περιεκτικότητα των πρωτεϊνών στα νεαρά, ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ8 Ολικές πρωτεΐνες (mg g -1 ξηρού βάρους) Φυτικό υλικό Μάρτυρας Υδατική καταπόνηση Επανάρδευση Νεαρά φύλλα 195,13 b 40,88 c 295,84 a Ώριμα φύλλα 136,28 b 53,19 c 202,81 a Βλαστοί 5,59 c 10,48 b 18,19 a Ρίζες 1,72 c 10,30 a 5,51 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε γραμμή δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. Η υδατική καταπόνηση σε φυτά του κλώνου ΝΟ9 προκάλεσε σημαντική μείωση της περιεκτικότητας των φύλλων, νεαρών και ώριμων, σε ολικές πρωτεΐνες (Πίνακας ). Μία ημέρα μετά την επανάρδευση οι πρωτεΐνες στα νεαρά φύλλα αυξήθηκαν ξεπερνώντας τις τιμές του μάρτυρα. Στα ώριμα φύλλα μετά την επανάρδευση η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες αυξήθηκε, όχι όμως στα επίπεδα του μάρτυρα. Αντίθετα με τα φύλλα, η υδατική καταπόνηση προκάλεσε σημαντική αύξηση των πρωτεϊνών στους βλαστούς και τις ρίζες. Μετά την επανάρδευση η 93

8 περιεκτικότητα των βλαστών σε πρωτεΐνες συνέχισε να αυξάνεται, ενώ στις ρίζες η περιεκτικότητα μειώθηκε σε τιμές χαμηλότερες του μάρτυρα. Πίνακας Επίδραση της έλλειψης νερού για 24 ημέρες στην περιεκτικότητα των πρωτεϊνών στα νεαρά, ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ9 Ολικές πρωτεΐνες (mg g -1 ξηρού βάρους) Φυτικό υλικό Μάρτυρας Υδατική καταπόνηση Επανάρδευση Νεαρά φύλλα 83,12 b 43,95 c 96,50 a Ώριμα φύλλα 143,26 a 55,17 c 105,88 b Βλαστοί 5,93 c 13,29 b 16,40 a Ρίζες 2,66 b 10,04 a 0,60 c Διαφορετικά γράμματα σε κάθε γραμμή δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. Επομένως, και στους δύο κλώνους η υδατική καταπόνηση είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των ολικών πρωτεϊνών στα νεαρά και ώριμα φύλλα και την αύξηση τους στους βλαστούς και τις ρίζες Επίδραση της έλλειψης νερού στην ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών Όπως φαίνεται στον Πίνακα η ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών αυξήθηκε σημαντικά στη μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης στα νεαρά και ώριμα φύλλα φυτών του κλώνου ΝΟ8. Στα ώριμα φύλλα η αύξηση συνεχίστηκε και μετά την επανάρδευση καταλήγοντας σε διπλάσια τιμή σε σχέση με τον μάρτυρα. Αντίθετα, στα νεαρά φύλλα η ειδική ενζυμική δραστικότητα μειώθηκε σημαντικά μετά την επανάρδευση. Σε εκχυλίσματα βλαστών και ριζών καταγράφηκε σημαντική μείωση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας λόγω της έλλειψης νερού. Η μείωση συνεχίστηκε και μετά την επανάρδευση σε φυτικό υλικό βλαστών φτάνοντας στο 34% της αρχικής τιμής του μάρτυρα. Αντίθετα, η επανάρδευση είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση της δραστικότητας στις ρίζες. 94

9 Πίνακας Επίδραση της έλλειψης νερού για 18 ημέρες στην ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών σε νεαρά, ώριμα φύλλα, βλαστού και ρίζες φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ8 Ειδική ενζυμική δραστικότητα (Δ 590 min -1 mg -1 πρωτεΐνης) Φυτικό υλικό Μάρτυρας Υδατική καταπόνηση Επανάρδευση Νεαρά φύλλα 0,65 c 1,17 a 0,95 b Ώριμα φύλλα 0,77 c 0,99 b 1,40 a Βλαστοί 8,00 a 6,33 b 2,72 c Ρίζες 122,42 a 31,25 c 89,62 b Διαφορετικά γράμματα σε κάθε γραμμή δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. Η ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών στα νεαρά φύλλα φυτών του κλώνου ΝΟ9 αυξήθηκε σημαντικά ως αποτέλεσμα της έλλειψης νερού και αυξήθηκε ακόμη περισσότερο μετά την επανάρδευση (Πίνακας ). Στα ώριμα φύλλα η ειδική ενζυμική δραστικότητα αυξήθηκε σημαντικά λόγω της υδατικής καταπόνησης και μειώθηκε μετά από επανάρδευση, παραμένοντας όμως αρκετά υψηλότερη από τα επίπεδα του μάρτυρα. Αύξηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας παρατηρήθηκε και στα δείγματα βλαστών, και μείωσή της μετά την επανάρδευση σε τιμές μικρότερες από του μάρτυρα. Σε αντίθεση με τα υπόλοιπα δείγματα στη μεταχείριση της έλλειψης νερού, η ειδική ενζυμική δραστικότητα στις ρίζες μειώθηκε σημαντικά. Ωστόσο, μια ημέρα μετά την επανάρδευση η δραστικότητα αυξήθηκε κατά 26 φορές σε σχέση με τα καταπονημένα και 7 φορές σε σχέση με τα φυτά του μάρτυρα. Πίνακας Επίδραση της έλλειψης νερού για 24 ημέρες στην ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών σε νεαρά, ώριμα φύλλα, βλαστού και ρίζες φυτών πικροδάφνης του κλώνου ΝΟ9 Ειδική ενζυμική δραστικότητα (Δ 590 min -1 mg -1 πρωτεΐνης) Φυτικό υλικό Μάρτυρας Υδατική καταπόνηση Επανάρδευση Νεαρά φύλλα 0,93 c 1,53 b 2,22 a Ώριμα φύλλα 1,02 c 2,27 a 1,84 b Βλαστοί 4,81 b 5,71 a 3,11 c Ρίζες 65,49 b 17,33 c 467 a Διαφορετικά γράμματα σε κάθε γραμμή δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P 0,05) μεταξύ των μέσων όρων (n=3), με το κριτήριο Duncan. 95

10 Ενζυμική ανταπόκριση των κλώνων πικροδάφνης ΝΟ8 και ΝΟ9 σε συνθήκες έλλειψης νερού Ενζυμική ανταπόκριση των ανιονικών υπεροξειδασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Όπως φαίνεται στο ηλεκτροφόρημα του Σχήματος α, στα φυτικά δείγματα των κλώνων πικροδάφνης ΝΟ9 και ΝΟ8 ανιχνεύθηκαν συνολικά δύο (ΑPOD2 και ΑPOD3) και τέσσερις ισομορφές ανιονικών υπεροξειδασών (ΑPOD1, ΑPOD2, ΑPOD3 και ΑPOD4), αντίστοιχα. Πιο αναλυτικά, στα φυτικά δείγματα του κλώνου ΝΟ9, σε όλες τις μεταχειρίσεις, καταγράφηκε η ισομορφή ΑPOD2 της οποίας η ένταση αυξήθηκε στις μεταχειρίσεις έλλειψης νερού και επανάρδευσης. Εκτός της ΑPOD2, στα νεαρά και τα ώριμα φύλλα του κλώνου ΝΟ9, καταγράφηκε με πολύ χαμηλή ένταση και η ταχέως κινούμενη ισομορφή ΑPOD3. Σε όλα τα φυτικά δείγματα του κλώνου ΝΟ8, καταγράφηκαν δύο ισομορφές ανιονικών υπεροξειδασών, οι ΑPOD1 και ΑPOD2 με αυξανόμενη ένταση στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά. Επιπλέον, στα εκχυλίσματα ώριμων φύλλων ανιχνεύθηκαν και οι ισομορφές ΑPOD3 και ΑPOD4 με πολύ χαμηλή ένταση σε όλες τις μεταχειρίσεις. Συνοψίζοντας τα παραπάνω, παρατηρήθηκαν διαφορές στον αριθμό των ισομορφών τόσο μεταξύ των δύο κλώνων όσο και μεταξύ των φυτικών ιστών. Επίσης, σημειώθηκε αύξηση της έντασης των ισομορφών στις μεταχειρίσεις καταπόνησης και επανάρδευσης, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, στα δείγματα και των δύο κλώνων. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός ανιονικών υπεροξειδασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. ΑPOD1 έως ΑPOD4 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ενζυμική ανταπόκριση των κατιονικών υπεροξειδασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Καταγράφηκε η εμφάνιση 5 νέων συνολικά κατιονικών ισομορφών των υπεροξειδασών σε φυτικό υλικό νεαρών και ώριμων φύλλων στις μεταχειρίσεις της υδατικής καταπόνησης και της επανάρδευσης (Σχήμα α). Από αυτές, τρεις εμφανίστηκαν στα φύλλα του κλώνου ΝΟ8 96

11 (CPOD1, CPOD2 και CPOD5) και τέσσερις στα φύλλα του κλώνου ΝΟ9 (CPOD1, CPOD2, CPOD3 και CPOD4). Συγκεκριμένα, στα νεαρά φύλλα του κλώνου ΝΟ8 στη μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης, εμφανίστηκαν με πολύ χαμηλή ένταση, οι ισομορφές CPOD1 και CPOD2 καθώς και η ταχέως κινούμενη ισομορφή CPOD5. Οι ισομορφές CPOD1 και CPOD2 εμφανίστηκαν επίσης και στα ώριμα φύλλα του κλώνου ΝΟ8 στη μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης αλλά και της επανάρδευσης. Στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 η έλλειψη νερού, προκάλεσε την εμφάνιση τεσσάρων ισομορφών κατιονικών υπεροξειδασών, CPOD1, CPOD2, CPOD3 και CPOD4, με μεγαλύτερη ένταση αυτή των CPOD2 και CPOD4, στα εκχυλίσματα ώριμων φύλλων. Ισομορφές κατιονικών υπεροξειδασών δεν καταγράφηκαν σε φυτικό υλικό βλαστού και ρίζας. Συμπερασματικά, κατιονικές υπεροξειδάσες στα φυτά και των δύο κλώνων καταγράφηκαν μόνο σε φυτικό υλικό φύλλων και μόνο μετά από καταπόνηση. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός κατιονικών υπεροξειδασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. CPOD1 έως CPOD5 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ενζυμική ανταπόκριση της υπεροξειδικής δισμουτάσης σε συνθήκες έλλειψης νερού Όπως φαίνεται στο ηλεκτροφόρημα του Σχήματος α, οι δύο κλώνοι διαφέρουν στον αριθμό των ισομορφών της υπεροξειδικής δισμουτάσης. Στον κλώνο ΝΟ9 καταγράφηκαν τέσσερις ισομορφές, οι SOD1, SOD2, SOD3 και SOD4, ενώ στον κλώνο ΝΟ8 οι εξής έξι ισομορφές: SOD1, SOD2, SOD4, SOD5, SOD6 και SOD7. Στον κλώνο ΝΟ9 στα νεαρά και ώριμα φύλλα καταγράφηκαν στον μάρτυρα οι ισομορφές SOD2 και SOD3, των οποίων η ένταση αυξήθηκε με την εφαρμογή της υδατικής καταπόνησης και την επανάρδευση των φυτών. Στον βλαστό του ίδιου κλώνου καταγράφηκαν εκτός των SOD2 και SOD3, οι ισομορφές SOD1 και SOD4 σε όλες τις μεταχειρίσεις με μεγαλύτερη όμως ένταση στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά. Οι ίδιες τέσσερις ισομορφές εντοπίστηκαν και στις ρίζες, 97

12 όπου σε αντίθεση με τους υπόλοιπους φυτικούς ιστούς, η ένταση στα φυτά του μάρτυρα ήταν μεγαλύτερη και εξασθένισε στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά. Σε ότι αφορά τον κλώνο ΝΟ8, στα νεαρά φύλλα από φυτά του μάρτυρα καταγράφηκε αμυδρά μόνο η ισομορφή SOD4, ενώ στη μεταχείριση έλλειψης νερού εμφανίστηκαν επιπλέον οι SOD2 και SOD6 των οποίων η ένταση αυξήθηκε ακόμη παραπάνω στο χειρισμό της επανάρδευσης. Στα ώριμα φύλλα παρατηρήθηκαν οι ισομορφές SOD4 και οι ταχέως κινούμενες SOD6 και SOD7 μόνο στην μεταχείριση της επανάρδευσης. Σε εκχυλίσματα βλαστού στον μάρτυρα εντοπίστηκε μόνο η ισομορφή SOD4 της οποίας η ένταση αυξήθηκε στις δύο άλλες μεταχειρίσεις, όπου καταγράφηκαν επιπλέον οι ισομορφές SOD1, SOD2, SOD5 και SOD6. Οι ισομορφές SOD1, SOD2, SOD4 και SOD6 εμφανίστηκαν και στα δείγματα ρίζας προερχόμενα από καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω, στο ηλεκτροφορητικό πρότυπο της SOD καταγράφηκαν διαφορές τόσο στον αριθμό των ισομορφών μεταξύ των δύο κλώνων και των φυτικών ιστών, όσο και στην έκφραση τους μεταξύ των μεταχειρίσεων του πειράματος. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός της υπεροξειδικής δισμουτάσης σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. SOD1 έως SOD7 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ενζυμική ανταπόκριση των όξινων φωσφατασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Κατά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό των όξινων φωσφατασών οι δύο κλώνοι που μελετήθηκαν εμφάνισαν διαφορετική ενζυμική ανταπόκριση δίνοντας 9 συνολικά ισομορφές (Σχήμα α). Στον κλώνο ΝΟ9 καταγράφηκαν οι πέντε από αυτές (ACP2, ACΡ3, ACΡ5, ACΡ6 και ACΡ9), ενώ στον κλώνο ΝΟ8 καταγράφηκαν και οι εννέα ισομορφές (ACΡ1 έως ACΡ9). Στον κλώνο ΝΟ9 σε φυτικό υλικό νεαρών και ώριμων φύλλων καταγράφηκαν οι δύο ισομορφές ACP5 και ACΡ6 σε όλες τις μεταχειρίσεις με πιο μεγάλη ένταση σ αυτή της υδατικής καταπόνησης. Επιπλέον, στη μεταχείριση της έλλειψης νερού στα ώριμα φύλλα, εμφανίστηκαν οι βραδέως κινούμενες και χαμηλής έντασης ισομορφές ACΡ2 και ACΡ3. Στον βλαστό σε φυτά μάρτυρα εντοπίστηκε η ισομορφή ACΡ9 με πολύ χαμηλή ένταση, η οποία δεν εμφανίστηκε στα 98

13 καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά. Στις ρίζες του κλώνου ΝΟ9 δεν καταγράφηκαν ισομορφές όξινων φωσφατασών. Σε ότι αφορά τον κλώνο ΝΟ8 στα φύλλα, νεαρά και ώριμα, καθώς και στις ρίζες καταγράφηκαν οι υψηλής έντασης ισομορφές ACΡ7, ACΡ8 και ACΡ9 σε όλες τις μεταχειρίσεις. Στα νεαρά φύλλα στις μεταχειρίσεις του μάρτυρα και της υδατικής καταπόνησης καταγράφηκαν και οι ισομορφές ACΡ5 και ACΡ6 με πολύ χαμηλή ένταση, οι οποίες δεν εμφανίστηκαν μετά την επανάρδευση. Επίσης, στη μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης εμφανίστηκαν και οι ACΡ1, ACΡ2, ACΡ3 και ACΡ4 με πολύ χαμηλή ένταση. Στα ώριμα φύλλα η ένταση των ισομορφών ACΡ5, ACΡ6, ACΡ7, ACΡ8 και ACΡ9 αυξήθηκε με την έλλειψη νερού και την επανάρδευση, ενώ σ αυτές τις μεταχειρίσεις εμφανίστηκαν και οι χαμηλής έντασης ACΡ1, ACΡ2, ACΡ3 και ACΡ4. Σε φυτικό υλικό βλαστού, εκτός από τα φυτά του μάρτυρα, καταγράφηκαν οι ACΡ1, ACΡ2, ACΡ3, ACΡ4, ACΡ6 καθώς και η ACΡ9, με πολύ χαμηλή ένταση. Στα εκχυλίσματα ριζών καταγράφηκαν οι ισομορφές ACΡ7, ACΡ8 και ACΡ9 με μεγάλη ένταση σε όλες τις μεταχειρίσεις. Συμπερασματικά, οι δύο κλώνοι διαφέρουν στο ηλεκτροφορητικό πρότυπο των όξινων φωσφατασών, με τον κλώνο ΝΟ8 να εμφανίζει τρεις βασικές ισομορφές με πολύ μεγάλη ένταση, στο σύνολο των φυτικών ιστών εκτός από τον βλαστό. Επίσης, στη μεταχείριση της έλλειψης νερού, και στους δύο κλώνους ανιχνεύθηκαν ορισμένες χαμηλής έντασης βραδέως κινούμενες ισομορφές. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός όξινων φωσφατασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. ACΡ1 έως ACΡ9 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ενζυμική ανταπόκριση των εστερασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Όπως φαίνεται στο ηλεκτροφόρημα του Σχήματος α, στα φυτικά δείγματα των κλώνων ΝΟ9 και ΝΟ8 ανιχνεύθηκαν συνολικά τρεις (ΕST1, ΕST2 και ΕST3) και πέντε ισομορφές εστερασών (ΕST1, ΕST2, ΕST3, ΕST4 και ΕST5), αντίστοιχα. Στα νεαρά φύλλα του κλώνου ΝΟ9 στον μάρτυρα καταγράφηκαν οι ισομορφές ΕST1 και ΕST3 των οποίων η ένταση μειώθηκε στις μεταχειρίσεις της έλλειψης νερού και επανάρδευσης. Αντίθετα, στα εκχυλίσματα των ώριμων φύλλων και βλαστού η ΕST1 εμφανίστηκε μόνο στη μεταχείριση της έλλειψης νερού, ενώ στις ρίζες εκτός της ΕST1 εμφανίστηκε επιπλέον και η ΕST2. 99

14 Σε ότι αφορά τον κλώνο ΝΟ8, στα νεαρά φύλλα φυτών μάρτυρα, καταγράφηκε η ΕST3 της οποίας η ένταση μειώθηκε στη μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης, εμφανίστηκαν όμως επιπλέον οι ΕST1 και ΕST4. Στα ώριμα φύλλα, στη μεταχείριση της έλλειψης νερού, εμφανίστηκε η ισομορφή ΕST1 και η ταχέως κινούμενη ΕST5 με πολύ χαμηλή ένταση. Μετά την επανάρδευση των φυτών, στα ώριμα φύλλα, η ένταση της ΕST1 μειώθηκε, ενώ δεν ανιχνεύθηκε η ΕST5. Η ΕST1 καταγράφηκε και στον βλαστό των φυτών του κλώνου ΝΟ8 με αυξημένη ένταση στη μεταχείριση της επανάρδευσης, οπότε εμφανίστηκε και η ΕST2. Στις ρίζες καταγράφηκαν οι ισομορφές ΕST1 και ΕST2 σε όλες τις μεταχειρίσεις του πειράματος. Επομένως, τόσο ο αριθμός όσο και η έκφραση των ισομορφών των εστερασών διέφερε ανάλογα με τον κλώνο πικροδάφνης, το φυτικό δείγμα και τη μεταχείριση του πειράματος. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των εστερασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. ΕST1 έως ΕST3 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ενζυμική ανταπόκριση των DNασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Όπως φαίνεται στο Σχήμα α, καταγράφηκε μια ισομορφή DNάσης, η DNase1, ενδιάμεσης κινητικότητας και πολύ υψηλής έντασης σε όλα τα φυτικά δείγματα και των δύο κλώνων χωρίς μεταβολή μεταξύ των μεταχειρίσεων. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός DNασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. DNase1 είναι η ισομορφή που καταγράφηκε. 100

15 Ενζυμική ανταπόκριση των RNασών σε συνθήκες έλλειψης νερού Κατά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων ανιχνεύθηκαν συνολικά έξι ισομορφές RNασών στον κλώνο ΝΟ9 (RNase3, RNase5, RNase6, RNase7, RNase8 και RNase9) και έξι στον κλώνο ΝΟ8 (RNase1, RNase2, RNase3, RNase4, RNase8 και RNase9), (Σχήμα α). Σε ότι αφορά τον κλώνο ΝΟ9, σε όλα τα φυτικά δείγματα και σε όλες τις μεταχειρίσεις, καταγράφηκε με υψηλή ένταση η ισομορφή RNase3. Στα νεαρά φύλλα του κλώνου ΝΟ9, εκτός της RNase3, καταγράφηκαν και οι ισομορφές RNase5 και RNase8 σε όλες τις μεταχειρίσεις. Επίσης, στα νεαρά φύλλα εμφανίστηκε με αυξημένη ένταση στις μεταχειρίσεις της υδατικής καταπόνησης και της επανάρδευσης, σε σχέση με τον μάρτυρα και η ισομορφή RNase6. Στα ώριμα φύλλα του κλώνου ΝΟ9, όπως και στα νεαρά, επίσης καταγράφηκε η ισομορφή RNase5 με αυξημένη ένταση στις μεταχειρίσεις της υδατικής καταπόνησης και της επανάρδευσης, σε σχέση με τον μάρτυρα. Επιπλέον, στα ώριμα φύλλα εμφανίστηκε η ισομορφή RNase8 μόνο στη μεταχείριση της επανάρδευσης. Στα εκχυλίσματα βλαστού καταγράφηκαν, εκτός της RNase3, οι ισομορφές RNase7 και RNase8 με πολύ χαμηλή ένταση. Στις ρίζες, η ένταση των RNase7, RNase8 και RNase9 μειώθηκε στη μεταχείριση της έλλειψης νερού συγκριτικά με τον μάρτυρα, ενώ δεν ανιχνεύθηκε η ισομορφή RNase6 που καταγράφηκε μόνο στον μάρτυρα. Στο στάδιο της επανάρδευσης, στις ρίζες, εκτός της RNase6 δεν ανιχνεύθηκε και η RNase7 σε σχέση τόσο με τον μάρτυρα όσο και με τα καταπονημένα φυτά. Σε όλες τις μεταχειρίσεις και όλα τα φυτικά δείγματα του κλώνου ΝΟ8, καταγράφηκαν οι υψηλής έντασης ισομορφές RNase3 και RNase4. Εκτός από αυτές, στα νεαρά και ώριμα φύλλα του κλώνου ΝΟ8 καταγράφηκε η χαμηλής έντασης RNase1 σε όλες τις μεταχειρίσεις, ενώ στα ώριμα φύλλα καταγράφηκε και η επίσης χαμηλής έντασης ισομορφή RNase2. Σε όλες τις μεταχειρίσεις στα νεαρά φύλλα εμφανίστηκαν και οι ισομορφές RNase8 και RNase9, η ένταση των οποίων ήταν μειωμένη στις μεταχειρίσεις έλλειψης νερού και επανάρδευσης συγκριτικά με τον μάρτυρα. Στο φυτικό υλικό ώριμων φύλλων και βλαστών του κλώνου ΝΟ8, εκτός των RNase3 και RNase4, καταγράφηκε και η RNase8. Στα ώριμα φύλλα η RNase8 εμφανίστηκε στον μάρτυρα και στα επαναρδευμένα φυτά με πολύ χαμηλή ένταση, δεν ανιχνεύθηκε όμως στα καταπονημένα φυτά. Στον βλαστό η RNase8 καταγράφηκε σε όλες τις μεταχειρίσεις με χαμηλή ένταση. Τέλος, στις ρίζες του κλώνου ΝΟ8, εκτός των RNase3 και RNase4, καταγράφηκαν οι ισομορφές RNase8 και RNase9 με υψηλή ένταση σε όλες τις μεταχειρίσεις. Και στους δύο κλώνους ανεξαρτήτως χειρισμού καταγράφηκε η ενδιάμεσης κινητικότητας ισομορφή RNase3 με πολύ υψηλή ένταση, ωστόσο στον κλώνο ΝΟ8 καταγράφηκε επιπλέον η επίσης πολύ έντονη ισομορφή RNase4. Όσον αφορά το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των υπολοίπων 101

16 ισομορφών των RNασών, σημειώθηκαν διαφορές μεταξύ των κλώνων και των φυτικών ιστών ανάλογα με τη μεταχείριση. Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός RNασών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. RNase1 έως RNase9 είναι οι ισομορφές που καταγράφηκαν Ηλεκτροφορητικά πρότυπα πρωτεϊνών μετά από SDS ηλεκτροφόρηση Συνολικά και στους δύο κλώνους που μελετήθηκαν σε όλους τους φυτικούς ιστούς καταγράφηκαν 17 πρωτεϊνικές ζώνες με ισχυρότερη ένταση αυτή των ζωνών με ΜΒ: 50, 15, και 11kD (5, 12 και 16) (Σχήμα α). Από αυτές, η πρωτεϊνική ζώνη 5 (ΜΒ: 50kD) καταγράφηκε σε όλες τις μεταχειρίσεις στα νεαρά και τα ώριμα φύλλα και των δύο κλώνων. Στα δείγματα βλαστού και των δύο κλώνων, η ζώνη 5 εμφανίστηκε αμυδρά μόνο στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά, ενώ δεν καταγράφηκε στα εκχυλίσματα ριζών. Στα δείγματα φύλλων και των δύο κλώνων η πρωτεϊνική ζώνη 12 (ΜΒ: 15kD) καταγράφηκε σε όλες τις μεταχειρίσεις του πειράματος, η ένταση της όμως αυξήθηκε λόγω της έλλειψης νερού και παρέμεινε αυξημένη και μετά την επανάρδευση σε σχέση με τον μάρτυρα. Στις ρίζες και τους βλαστούς η ζώνη 12 εμφανίστηκε μόνο στις μεταχειρίσεις της υδατικής καταπόνησης και ανάνηψης. Η έλλειψη νερού προκάλεσε την εμφάνιση της πρωτεϊνικής ζώνης 16 (ΜΒ: 11kD) στα ώριμα φύλλα και τους βλαστούς και των δύο κλώνων πικροδάφνης που καταγράφηκε και στη μεταχείριση της επανάρδευσης. Επομένως, σύμφωνα με το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των πρωτεϊνών, παρατηρήθηκαν διαφορές ανάλογα με το φυτικό υλικό, με τα φύλλα να εμφανίζουν τις περισσότερες και με μεγαλύτερη ένταση πρωτεϊνικές ζώνες και τις ρίζες τις λιγότερες και με χαμηλότερη ένταση ζώνες. Όσον αφορά τις μεταχειρίσεις του πειράματος καταγράφηκε αύξηση της έντασης των περισσοτέρων ζωνών στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά σε σύγκριση με τον μάρτυρα και εμφάνιση νέων ζωνών λόγω της έλλειψης νερού. 102

17 Σχήμα α. Ηλεκτροφορητικά πρότυπα πρωτεϊνών σε νεαρά και ώριμα φύλλα, βλαστούς και ρίζες από φυτά των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ9. Μάρτυρας (C), υδατική καταπόνηση (S) και επανάρδευση (R) είναι οι μεταχειρίσεις του πειράματος. 1 έως 17 είναι οι αριθμητικές ενδείξεις των πρωτεϊνικών ζωνών που καταγράφηκαν. 103

18 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα φυτά και των δύο κλώνων πικροδάφνης που υποβλήθηκαν σε υδατική καταπόνηση σημειώθηκε μείωση του νωπού βάρους και της περιεκτικότητας σε νερό (Πίνακες και ), όπως συμβαίνει στα περισσότερα φυτικά είδη (Egert και Tevini, 2002; Xiao κ.ά., 2005; Herralde κ.ά., 1998). Και στους δύο κλώνους το ξηρό βάρος δεν μεταβλήθηκε υποδηλώνοντας πως η μείωση του νωπού βάρους οφείλεται πρωτίστως στην απώλεια νερού μέσω της διαπνοής. Μια ημέρα μετά την επανάρδευση ήταν αρκετή ώστε η περιεκτικότητα σε νερό να επανέλθει στο 80% του μάρτυρα και στους δύο κλώνους. Παρόμοια αύξηση μετά από επανάρδευση αναφέρουν και οι Baczek κ.ά. (2006), Mohsenzadeh κ.ά. (2006) και Loggini κ.ά. (1999). Σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης η φωτοσύνθεση, που υπολογίζεται ως ο ρυθμός αφομοίωσης του CO 2, συνήθως μειώνεται ανάλογα με την ένταση και τη διάρκεια της καταπόνησης, το είδος και το στάδιο ανάπτυξης του φυτού (Torrecillas κ.ά., 1996; Chaves κ.ά., 2002, Cechin κ.ά., 2006). Η μείωση της φωτοσύνθεσης σχετίζεται με το κλείσιμο των στομάτων και κατά συνέπεια τη χαμηλή συγκέντρωση ενδοκυττάριου CO 2 (Ci) (Cornic, 2000). Στα φυτά και των δύο κλώνων πικροδάφνης η υδατική καταπόνηση προκάλεσε κλείσιμο των στομάτων, που ακολουθήθηκε από σημαντική μείωση της Ci, της φωτοσύνθεσης και της διαπνοής (Πίνακες και ). Ενώ όμως μία ημέρα μετά την επανάρδευση, η στοματική αγωγιμότητα αυξήθηκε επιτρέποντας την είσοδο CO 2 στα φύλλα και των δύο κλώνων, η φωτοσύνθεση παρέμεινε το ίδιο χαμηλή στα φυτά του κλώνου ΝΟ8, υποδεικνύοντας πως μία ημέρα μόνο, δεν ήταν αρκετή για να ανακάμψει ο φωτοσυνθετικός μηχανισμός, ενώ αντίθετα στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 η φωτοσύνθεση επανήλθε στα επίπεδα του μάρτυρα. Επομένως, ενδέχεται η μείωση της φωτοσύνθεσης στον κλώνο ΝΟ8 να μην οφείλεται μόνο στο κλείσιμο των στομάτων αλλά και σε άλλους ενδογενείς παράγοντες, όπως μεταβολή της ποσότητας και της δραστικότητας της RubisCO καθώς και της σύνθεσης της RuBP (Ramachandra-Reddy, 1996; Ramachandra-Reddy κ.ά., 2004; Yordanov κ.ά., 2000). Παρόμοια με τα φυτά του κλώνου ΝΟ9, η φωτοσύνθεση σε φυτά ηλίανθου ανέκαμψε πλήρως 24 ώρες μετά από επανάρδευση (Cechin κ.ά., 2006). Στη βιβλιογραφία αναφέρονται διάφορες ανταποκρίσεις του λόγου Α/Ε σε συνθήκες έλλειψης νερού. Οι Ashraf κ.ά. (2002) αναφέρουν μείωση του λόγου σε φυτά μπάμιας, ενώ οι Smit κ.ά. (1992) αύξησή του σε φυτά πεύκης και Pseudotsuga. Σύμφωνα με τους Jones (1993) και Heilmeier κ.ά (2002) αύξηση του λόγου Α/Ε υποδεικνύει σωστή χρήση του διαθέσιμου νερού από τα φυτά σε συνθήκες έλλειψης νερού. Στα καταπονημένα φυτά πικροδάφνης o λόγος Α/Ε σχεδόν διπλασιάστηκε στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 και μειώθηκε στις αρχικές τιμές του μάρτυρα μετά την επανάρδευση, ενώ δεν μεταβλήθηκε στον κλώνο ΝΟ8 πιθανώς λόγω ανάλογης μείωσης της φωτοσύνθεσης και της διαπνοής (Πίνακες και ). 104

19 Οι David κ.ά. (1998) κατέγραψαν μείωση της περιεκτικότητας των φύλλων σε χλωροφύλλες λόγω έλλειψης νερού σε φυτά Lupinus albus και αναφέρουν πως η διαταραχή του φωτοσυνθετικού μηχανισμού ακόμα και μετά από άρση της καταπόνησης σχετίζεται με τη μείωση σε χλωροφύλλες. Μείωση της συγκέντρωσης των χλωροφυλλών αναφέρει και πλήθος άλλων ερευνητών (Ashraf, 2003; Gong κ.ά., 2005; Pieters και El Souki, 2005; Upadhyaya και Panda, 2004). Αντιθέτως, στην περίπτωση των δύο κλώνων πικροδάφνης που μελετήθηκαν η συγκέντρωση των χλωροφυλλών δεν επηρεάστηκε στη διάρκεια του πειράματος (Πίνακες και ) δείχνοντας πως η μείωση της φωτοσύνθεσης δεν οφείλεται σε καταστροφή των χλωροφυλλών. Ωστόσο, στα φυτά του κλώνου ΝΟ8 ο λόγος a/b αυξήθηκε σημαντικά λόγω της καταπόνησης δείχνοντας πως η αναλογία των χλωροφυλλών a και b στους χλωροπλάστες μεταβλήθηκε. Οι Alscher κ.ά. (1997) και Sircelj κ.ά (2005) αποδίδουν τη σταθερή συγκέντρωση χλωροφυλλών σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης στον αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό μηχανισμό των υπό μελέτη φυτών. Μεταξύ των μηχανισμών αποκατάστασης του μεταβολισμού κάτω από αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες συμπεριλαμβάνεται η μεταβολή στη σύνθεση και τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών (Ramagopal, 1987). Οι Bertamini κ.ά. (2006) και οι Quartacci και Navari-Izzo (1992) κατέγραψαν μείωση των ολικών πρωτεϊνών σε συνθήκες έλλειψης νερού σε φυτά αμπέλου και ηλίανθου, αντίστοιχα. Ομοίως, στην πικροδάφνη παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των ολικών πρωτεϊνών στα νεαρά και ώριμα φύλλα και των δύο κλώνων (Πίνακες και ). Αντίθετα, στους βλαστούς και τις ρίζες καταγράφηκε σημαντική αύξηση των πρωτεϊνών και στους δύο κλώνους που μελετήθηκαν. Αύξηση των πρωτεϊνών σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης αναφέρουν οι Gamble και Burke (1984) και Mohsenzadeh κ.ά. (2006) σε φυτά σίτου και Aeluropus lagopoides, αντίστοιχα. Μία ημέρα μετά την επανάρδευση οι πρωτεΐνες αυξήθηκαν στα φύλλα και τους βλαστούς και μειώθηκαν στις ρίζες και των δύο κλώνων. Σύμφωνα με το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των πρωτεϊνών η ένταση των περισσοτέρων πρωτεϊνικών ζωνών αυξήθηκε σε όλους τους φυτικούς ιστούς και των δύο κλώνων πικροδάφνης, ενώ εμφανίστηκαν και νέες ζώνες στις μεταχειρίσεις της έλλειψης νερού και της επανάρδευσης (Σχήμα α). Στα νεαρά και ώριμα φύλλα παρατηρήθηκε τόσο μεγαλύτερη περιεκτικότητα όσο και μεγαλύτερος αριθμός πρωτεϊνικών ζωνών και με μεγαλύτερη ένταση, σε σύγκριση με τους βλαστούς και τις ρίζες, σε όλες τις μεταχειρίσεις του πειράματος. Επίσης, αξίζει να σημειωθεί πως η ένταση των πρωτεϊνικών ζωνών σε όλους τους ιστούς ήταν μεγαλύτερη στα φυτά του κλώνου ΝΟ9. Οι Veljovic-Jovanovic κ.ά. (2006) επίσης κατέγραψαν αύξηση της περιεκτικότητας αλλά και της έντασης των πρωτεϊνικών ζωνών, καθώς και εμφάνιση νέων πολυπεπτιδίων, σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης φυτών Ramonda serbica. Σύμφωνα με τους Sgherri κ.ά. (1994) η αντοχή των φυτών σε συνθήκες έλλειψης νερού ενδεχομένως εξαρτάται από την αλλαγή στη σύνθεση των πρωτεϊνών και κυρίως από τη συσσώρευση πρωτεϊνών με προστατευτικό ρόλο. 105

20 Η ενζυμική δράση των υπεροξειδασών δύναται να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την ανταπόκριση των φυτών σε συνθήκες ξηρασίας (Dhanda κ.ά., 2004; Zhang κ.ά., 1994). Φυτά με υψηλή περιεκτικότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων αναφέρεται πως παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντοχή στην οξειδωτική ζημιά που προκαλείται σε συνθήκες έλλειψης νερού (Sudhakar κ.ά., 2001). Στην πικροδάφνη η διακοπή της άρδευσης προκάλεσε αύξηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών στα νεαρά και ώριμα φύλλα και των δύο κλώνων καθώς και στους βλαστούς του κλώνου ΝΟ9 (Πίνακες και ), όπως έχει παρατηρηθεί σε φυτά σίτου και ζέρμπερας (Gong κ.ά., 2005; Syros κ.ά., 2004). Αντίθετα, στις ρίζες και των δύο κλώνων παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας, που όμως ακολουθήθηκε από αύξηση μετά την επανάρδευση των φυτών. Μείωση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας η οποία συνεχίστηκε και μετά την επανάρδευση καταγράφηκε στους βλαστούς του κλώνου ΝΟ8. Εκτός από αλλαγές στην ενζυμική δράση των υπεροξειδασών σε αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες, αλλαγές συμβαίνουν και στην έκφραση των ισομορφών τους (Sheoran και Garg, 1979; Yoshimoura κ.ά., 2000). Στους κλώνους ΝΟ9 και ΝΟ8 καταγράφηκαν δύο και τέσσερις ισομορφές ανιονικών υπεροξειδασών, αντίστοιχα (Σχήμα α). Σε κάθε περίπτωση η ένταση των ισομορφών ήταν μεγαλύτερη στις μεταχειρίσεις της καταπόνησης και επανάρδευσης. Ισομορφές κατιονικών υπεροξειδασών (Σχήμα α) καταγράφηκαν μόνο στα φύλλα και μόνο μετά από καταπόνηση και επανάρδευση. Οι νέες αυτές ισομορφές κατιονικών υπεροξειδασών ίσως αποτελούν μέρος του αντιοξειδωτικού μηχανισμού των φυτών που ενεργοποιείται σε περιπτώσεις έλλειψης νερού. Η υπεροξειδική δισμουτάση παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία των φυτών από την οξειδωτική καταπόνηση (Santos κ.ά., 2000; Moran κ.ά., 2003) και η συνδυασμένη δράση της με τις υπεροξειδάσες συμβάλει στην αύξηση της αντοχής σε ξηρικές συνθήκες (Veljovic-Jovanovic κ.ά., 2006). Οι δύο κλώνοι πικροδάφνης διέφεραν στον αριθμό των ισομορφών της υπεροξειδικής δισμουτάσης (Σχήμα α) σε όλους τους φυτικούς ιστούς. Στον κλώνο ΝΟ9 η ένταση των ισομορφών που ανιχνεύθηκαν στον μάρτυρα αυξήθηκε στα καταπονημένα και επαναρδευμένα φυτά εκτός από την περίπτωση των ριζών όπου καταγράφηκε μείωση της έντασης. Αντίθετα, σε όλους τους φυτικούς ιστούς του κλώνου ΝΟ8 στον μάρτυρα ανιχνεύθηκαν λιγότερες έως και καθόλου ισομορφές με μικρότερη ένταση, η οποία αυξήθηκε κατά την εφαρμογή της υδατικής καταπόνησης και την επανάρδευση, με σύγχρονη εμφάνιση νέων ταχέως κινούμενων ισομορφών. Αύξηση της έντασης των ισομορφών της υπεροξειδικής δισμουτάσης κατέγραψαν και οι Veljovic-Jovanovic κ.ά. (2006) σε φύλλα φυτών Ramonda serbica. Οι Rubio κ.ά. (2002) επίσης αναφέρουν υπερέκφραση αλλά και εμφάνιση νέων ισομορφών υπεροξειδικής δισμουτάσης σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης σε διαγονιδιακά φυτά μηδικής. Επίσης, αύξηση της ενζυμικής δράσης σε συνθήκες 106

21 ξηρασίας αναφέρουν οι Duan κ.ά. (2005) και οι Upadhyaya και Panda (2004) σε φυτά Picea asperata και Camelia sinensis, αντίστοιχα. Σε συνθήκες αβιοτικών καταπονήσεων, όπως αλατότητα και ξηρασία, αναφέρεται αύξηση της δράσης των όξινων και αλκαλικών φωσφατασών (Olmos και Hellin, 1997). Οι Ehsanpour και Amini (2003) επίσης αναφέρουν αύξηση της ενζυμικής δράσης των όξινων φωσφατασών σε συνθήκες αλατότητας και ωσμωτικής καταπόνησης σε φυτά μηδικής. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των όξινων φωσφατασών (Σχήμα α) έδειξε σημαντικές διαφορές στον αριθμό και την ένταση των ισομορφών στα φυτικά δείγματα μεταξύ των δύο κλώνων πικροδάφνης. Στον κλώνο ΝΟ8 καταγράφηκαν τρεις επιπλέον ισομορφές με πολύ υψηλή ένταση. Όσον αφορά τη μεταβολή των ισομορφών κατά τη διάρκεια του πειράματος παρατηρήθηκε η εμφάνιση νέων ισομορφών καθώς και αύξηση της έντασης των ήδη υπαρχουσών ισομορφών με την εφαρμογή της υδατικής καταπόνησης. Στους βλαστούς και των δύο κλώνων σημειώθηκαν οι λιγότερες και ασθενέστερες ισομορφές, ενώ στις ρίζες φυτών του κλώνου ΝΟ9 δεν καταγράφηκαν ισομορφές όξινων φωσφατασών. Στα νεαρά φύλλα και των δύο κλώνων πικροδάφνης καταγράφηκε εξασθένιση των ισομορφών των εστερασών λόγω της διακοπής άρδευσης, ενώ στους υπόλοιπους ιστούς παρατηρήθηκε εμφάνιση νέων ισομορφών και αύξηση της έντασής τους στις μεταχειρίσεις της καταπόνησης και επανάρδευσης (Σχήμα α). Οι El-Sayed κ.ά. (2002), Abdel-Twab κ.ά. (2003) και Hassanein (1999) μελετώντας φυτά τομάτας, σακχαροκάλαμου και φιστικιάς, αντίστοιχα, αναφέρουν επίσης την εμφάνιση νέων ισομορφών σε συνθήκες αλατότητας και έλλειψης νερού και προτείνουν κάποιες από αυτές ως δείκτες για την αντοχή στις εν λόγω συνθήκες. Επίσης, οι Syros κ.ά. (2005) σε φυτά πικροδάφνης κατέγραψαν την εμφάνιση μίας ισομορφής εστερασών που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για τον εγκλιματισμό σε συνθήκες χαμηλών θερμοκρασιών. Τα νουκλεολυτικά ένζυμα (DNάσες και RNάσες) ανταποκρίνονται διαφορετικά σε συνθήκες βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων τόσο σε ότι αφορά τη δραστικότητα όσο και σε ότι αφορά την εμφάνιση και τον αριθμό των ισομορφών τους (Booker 2004; Abou Auda κ.ά., 2002; Yupsanis κ.ά., 2001). Στη μοναδική εργασία που μελετήθηκε η δράση και η έκφραση των νουκλεολυτικών ενζύμων σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, με χρήση μαννιτόλης, οι Yupsanis κ.ά. (2001) αναφέρουν αύξηση της δράσης τους χωρίς όμως την εμφάνιση νέων ισομορφών. Σε ότι αφορά τους δύο κλώνους πικροδάφνης, στο σύνολο του φυτικού υλικού καταγράφηκε μία μοναδική ισομορφή DNάσης με μεγάλη ένταση σε όλες τις μεταχειρίσεις (Σχήμα α). Αντίθετα, κατά την ηλεκτροφόρηση των RNασών διαχωρίστηκαν εννέα συνολικά ισομορφές, με τους δύο κλώνους να διαφέρουν ως προς τον αριθμό και την έντασή τους ανάλογα με το φυτικό υλικό και τη μεταχείριση (Σχήμα α). Στις μεταχειρίσεις της έλλειψης νερού και της επανάρδευσης καταγράφηκε αύξηση της έντασης ορισμένων ισομορφών στα νεαρά και ώριμα φύλλα του κλώνου ΝΟ9, ενώ 107

22 αντίθετα μείωση της έντασης ορισμένων ισομορφών παρατηρήθηκε στα νεαρά φύλλα του κλώνου ΝΟ8. Μείωση της έντασης τριών ισομορφών RNασών καταγράφηκε και στα εκχυλίσματα ριζών του κλώνου ΝΟ9. 108

23 ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 1. Η υδατική καταπόνηση προκάλεσε μείωση του νωπού βάρους και της περιεκτικότητας των φύλλων σε νερό, όχι όμως και του ξηρού βάρους, και των δύο κλώνων που επανήλθαν στο 80% του μάρτυρα μετά από επανάρδευση. 2. Η φωτοσύνθεση μειώθηκε λόγω της έλλειψης νερού στα φυτά και των δύο κλώνων, αλλά επανήλθε στα επίπεδα του μάρτυρα μόνο στα φυτά του κλώνου ΝΟ9. 3. Στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 ο λόγος Α/Ε αυξήθηκε λόγω της υδατικής καταπόνησης, πιθανώς λόγω καλύτερης αξιοποίησης του διαθέσιμου νερού. 4. Η περιεκτικότητα των φύλλων και των δύο κλώνων σε χλωροφύλλες δεν επηρεάστηκε από την έλλειψη νερού. 5. Μείωση των ολικών πρωτεϊνών παρατηρήθηκε στα νεαρά και ώριμα φύλλα και των δύο κλώνων, λόγω της έλλειψης νερού, ενώ αντίθετα αύξηση καταγράφηκε στους βλαστούς και τις ρίζες. Ωστόσο, σε όλους τους ιστούς παρατηρήθηκε αύξηση της έντασης των πρωτεϊνικών ζωνών και εμφάνιση νέων ζωνών στις μεταχειρίσεις της υδατικής καταπόνησης και επανάρδευσης. 6. Η υδατική καταπόνηση προκάλεσε αύξηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών στα φύλλα και μείωση στις ρίζες και των δύο κλώνων. Αύξηση της έντασης των ισομορφών των ανιονικών υπεροξειδασών παρατηρήθηκε σε όλα τα φυτικά δείγματα και των δύο κλώνων. Κατιονικές ισομορφές υπεροξειδασών εμφανίστηκαν μόνο στα φύλλα και των δύο κλώνων αποκλειστικά στις μεταχειρίσεις καταπόνησης και επανάρδευσης. 7. Διαφορετική έκφραση των ισομορφών της υπεροξειδικής δισμουτάσης καταγράφηκε μεταξύ των δύο κλώνων. Η έλλειψη νερού προκάλεσε αύξηση της έντασης των ισομορφών που καταγράφηκαν στον μάρτυρα στα φυτά του κλώνου ΝΟ9, εκτός από την περίπτωση των ριζών, ενώ στον κλώνο ΝΟ8 προκάλεσε την εμφάνιση νέων ισομορφών σε όλους τους ιστούς που δεν υπήρχαν στον μάρτυρα. 8. Μεγάλη διαφοροποίηση των ισομορφών των όξινων φωσφατασών καταγράφηκε μεταξύ των φυτικών ιστών αλλά και μεταξύ των κλώνων πικροδάφνης. Η υδατική καταπόνηση είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση νέων βραδέως κινούμενων ισομορφών, χαμηλής έντασης, και στους δύο κλώνους. 9. Όσον αφορά το ηλεκτροφορητικό πρότυπο των νουκλεολυτικών ενζύμων διαφορές μεταξύ των χειρισμών παρατηρήθηκαν μόνο στις RNάσες. Η υδατική καταπόνηση προκάλεσε άλλοτε αύξηση της έντασης και εμφάνιση νέων ισομορφών RNασών και άλλοτε μείωση της έντασης ανάλογα με τον κλώνο και τον φυτικό ιστό. 109

24 ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Λαμβάνοντας υπόψη τη γρηγορότερη και εντονότερη εμφάνιση των μακροσκοπικών συμπτωμάτων στα φυτά του κλώνου ΝΟ8, θα μπορούσε να ειπωθεί πως ο κλώνος αυτός είναι περισσότερο ευαίσθητος από τον ΝΟ9 σε συνθήκες έλλειψης νερού. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται τόσο από την αύξηση του λόγου Α/Ε λόγω της έλλειψης νερού, υποδηλώνοντας ορθότερη χρήση του διαθέσιμου νερού, όσο και από την επαναφορά της φωτοσύνθεσης στα επίπεδα του μάρτυρα μία ημέρα μετά την επανάρδευση στα φυτά του κλώνου ΝΟ9. Επίσης, η ύπαρξη ισομορφών υπεροξειδικής δισμουτάσης στα φυτά του κλώνου ΝΟ9 στον μάρτυρα καθώς και η εμφάνιση δύο επιπλέον ισομορφών κατιονικών υπεροξειδασών στα φύλλα στη μεταχείριση της έλλειψης νερού, πιθανώς να σημαίνει μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα. Επομένως, η διαφορετική αντίδραση των δύο κλώνων είναι ενδεχομένως αποτέλεσμα όχι μόνο των διαφορετικών μορφολογικών χαρακτηριστικών τους αλλά και του διαφορετικού αντιοξειδωτικού δυναμικού τους. Ωστόσο, τα φυτά και των δύο κλώνων ανέκαμψαν ικανοποιητικά, όσον αφορά την εξωτερική τους εμφάνιση, μια μόλις ημέρα μετά την επανάρδευση, δείχνοντας πως και οι δύο διαθέτουν μηχανισμούς αποφυγής και ανοχής στην αφυδάτωση. 110