ΓOΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓIΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΠΙ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΑΠΟΑ ΕΝΥΛΑΣΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΠΑΘΟΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΓOΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓIΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΠΙ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΑΠΟΑ ΕΝΥΛΑΣΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΑΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2011

2 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Bασικές Ιατρικές Επιστήμες του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Αναπληρωτής Καθηγητής Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής ιονύσιος ραΐνας (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Ντίνος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2

3 Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους των οποίων οι υποδείξεις, η βοήθεια και η υποστήριξη υπήρξαν πολύτιμες για την διεκπεραίωση αυτής της εργασίας. Κατ αρχάς, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή, Κωνσταντίνο Σταθόπουλο για την άρτια καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της συγκεκριμένης διατριβής αλλά και για την καθοδήγηση του κατά τα χρόνια της προπτυχιακής μου φοίτησης. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τον Καθηγητή Βιοχημείας ιονύσιο ραΐνα και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχημείας Γεώργιο Ντίνο, για τη φιλική υποστήριξη στο εργαστήριο και την προθυμία τους να με συμβουλεύσουν για οποιοδήποτε πειραματικό ζήτημα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την συμφοιτήτρια και συνεργάτρια Μαρία Αποστολίδη και τους συνεργάτες μου Κατερίνα Γραφανάκη και Στέφανο Φακιολά για την άψογη συνεργασία. Οφείλω ενα μεγαλο ευχαριστώ στους υποψήφιους διδάκτορες Χρυσαυγή Τουμπέκη, και Μάριο Κροκίδη και τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες Χρύσα Κοντοπούλου, Μαρία Μπίκου και Αναστασία Ζούδιαρη για την βοήθεια και την ευχάριστη συνεργασία. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, Καθηγητές και μεταπτυχιακούς φοιτητές για το ευχάριστο κλίμα. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου και τα αδέλφια μου για την υποστήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια.. 3

4 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 ABSTRACT... 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παραγωγή και τροποποίηση του mrna Το 5 άκρο του ευκαρυωτικού mrna φέρει καλύπτρα Το 3 άκρο πολυαδενυλιώνεται Αποικοδόμηση του mrna Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna Αποαδενυλίωση Ποικιλότητα και βιοχημική δράση αποαδενυλασών Σύμπλοκα αποαδενυλασών Βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης Επαγωγή της αποαδενυλίωσης από ρυθμιστικές πρωτεΐνες Παράγοντες που διεγείρουν ή αναστέλλουν την αποαδενυλίωση Αντισταθμιστική πολυαδενυλίωση Έλεγχος πολλαπλής λειτουργίας Τα mirnas επιδρούν στις poly(a) ουρές Αποαδενυλίωση και καρκίνος ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΥΛΙΚΑ Χημικά Ένζυμα: Κιτ: Βακτηριακά στελέχη: Πλασμιδιακοί φορείς

5 7.Εκκινητές (primers) Θρεπτικά μέσα ιαλύματα ΜΕΘΟ ΟΙ Ανάλυση in silico του γονιδίου pnldc Κλωνοποίηση του γονιδίου pnldc Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Απομόνωση τμημάτων DNA Σύνδεση τμημάτων DNA Mεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα E. coli με ηλεκτροδιάτρηση Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Υποκλωνοποίηση σε φορέα έκφρασης και μετασχηματισμός δεκτικών ΒL21(DE3) Codon plus, BL21(DE3) και BL21(DE3)Rosetta Έκφραση ανασυνδυασμένης PNLDC1_ οκιμή έκφρασης Ανίχνευση των ανασυνδυασμένωνπολυπεπτιδίων με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου και ανάλυση κατά western Καθαρισμός διαλυτής PNLDC1_1 με χρωματογραφία συγγενείας Μέτρηση της δραστικότητας αποαδενυλίωσης με κυανό του μεθυλενίου Αρχή της μεθόδου Κατασκευή πρότυπης καμπύλης poly(a) Χρονοκαμπύλη ενζυμικής δράσης ιατήρηση και καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Απόψυξη κυττάρων Ανακαλλιέργεια Πάγωμα κυττάρων Αποσιώπηση Pan2 με shrna Χορήγηση 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης σε κυτταρικές σειρές

6 8.Απομόνωση ολικού RNA από κυτταρικές σειρές Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάλυση in silico του γονιδιου pnldc Κλωνοποίηση του γονιδιου pnldc1 και εισαγωγή του σε φορέα έκφρασης οκιμή έκφρασης ανασυνδιασμένης PNLDC1_ Καθαρισμός ανασυνδυασμένης PNLDC1_1 με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου Μέτρηση της δραστικότητας της PNLDC1_1 με κυανό του μεθυλενίου Επίδραση της αποσιώπησης της αποαδενυλάσης PAN2 στην έκφραση σημαντικών γονιδίων Επίδραση του απομεθυλίοτικού παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine στην έκφραση των γονιδίων pnldc1, parn, cnot ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αποαδενυλίωση είναι συνήθως στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και καταστολής της μετάφρασης του mrna. Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Οι αποαδενυλάσες είναι εξωριβονουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg 2+ που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3-5, παράγοντας 5 -AMP. Ο αριθμός των γνωστών αποαδενυλασών έχει επεκταθεί πρόσφατα, κυρίως μέσω βιοχημικών και γενετικών μελετών. Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) υπέρ-οικογένεια. εν είναι ακόμη πλήρες κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Υποψήφιες αποαδενυλάσες έχουν ταυτοποιηθεί με χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής, ωστόσο η δράση τους δεν έχει αποδειχθεί, όπως η PNLDC1. Αρχική βιοπληροφορική ανάλυση του γονιδίου pnldc1 έδειξε ότι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη η οποία παρουσιάζει ομολογία με την PARN με πετιδικό σήμα που σχετίζεται με μια διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα φαίνεται ότι ο υποκινητής του γονιδίου περιέχει νησίδες CpG. Με μοντελοποίηση με βάση την ομολογία με την ανθρώπινη PARN της περιοχής με δράση νουκλεάσης προβλέφθηκε μία δομή που περιέχει ενεργό κέντρο με τα χαρακτηριστικά κατάλοιπα DEDD να κατευθύνονται σωστά για να αλληλεπιδρούν με τα ιόντα Mg 2+ και να υποστηρίζουν ενζυμική δράση. Το γονίδιο pnldc1 κλωνοποίηθηκε και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη καθαρίσθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Πειράματα αποαδενυλίωσης έδειξαν ότι η PNLDC1_1 είναι μία αποαδενυλάση με υψηλή συγγένεια γα το υπόστρωμα poly(a) αλλά χαμηλή Vmax σε σχέση με την PARN. Η έκφραση του pnldc1 μπορεί να ρυθμιστεί μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή. Ύστερα από χορήγηση του απομεθυλιωτικού 5-Aza- Deoxycytidine, η έκφραση του pnldc1 αυξήθηκε 4 φορές στις κυτταρικές σειρές HaCaT και HEK 293 T ενώ τα επίπεδα των PARN και CNOT7 mrna παρέμειναν αμετάβλητα, υποδεικνύοντας πιθανόν έναν μοναδικό ρόλο της νέας αποαδενυλάσης στην γονιδιακή έκφραση κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης και διαφοροποίησης. Η αποαδενυλάση PAN2 είναι μέλος της οικογένειας των DEDD νουκλεασών και ξεκινάει την βράχυνση του poly(a) απομακρύνοντας σχεδόν την μισή ουρά μέχρι άλλες αποαδενυλάσες να αποικοδομούν την υπόλοιπη. Παρόλο που ο ρόλος της PAN2 στην αποικοδόμηση του mrna είναι διευκρινισμένος ο βιολογικός ρόλος του ενζύμου δεν έχει αποσαφηνισθεί. Μετά από αποσιώπηση της PΑΝ2 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης των mrna PARN, Papola, CBP20 και MYC ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα EIF4E και CNOT7. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η PAN2 εμπλέκεται στην γονιδιακή έκφραση πιθανόν με το να διεγείρει την αποικοδόμηση των ήδη υπαρχόντων μορίων mrna επιτρέποντας την παραγωγή νέων. 7

8 ABSTRACT Deadenylation is often a rate-limiting step for mrna decay and translational silencing, making it an ideal control point for both processes. Deadenylases are Mg 2+ -dependent exoribonucleases that hydrolyse RNA in the 3 5 direction, which results in release of 5 - AMP. The number of known deadenylases has recently expanded, mainly through biochemical and genetics studies. All known deadenylases belong to one of two groups, the DEDD or the exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) superfamilies. The advantage of having such a range of deadenylases is not yet completely understood. Putative deadenylases have been identified through bioinformatics, but their functions has not yet been established such as the mammalian PNLDC1 which is a Poly(A)-specific Ribonuclease homolog (termed PARN-like). Preliminary bioinformatic analysis of the pnldc1 gene revealed that it encodes a PARN-similar protein with a signal peptide which corresponds to a trans-membrane region. In addition several CpG islands within the gene s promoter were identified. Homology modeling of the nuclease domain with its human PARN homolog predicted a structure that forms an active site which contains the characteristic DEDD residues orientated correctly to interact with Mg 2+ ions to support enzymatic activity. Pnldc1 was cloned and the recombinant protein was purified via affinity chromatography. Deadenylation assays showed that PNLDC1_1 is a deadenylase with high affinity for poly(a) substrates but relatively low Vmax compared to PARN. Interestingly, pnldc1 expression can be regulated through promoter methylation. Following treatment with the demethylating agent, 5-Aza-Deoxycytidine, pnldc1 expression was increased 4-fold in both HaCaT and HEK 293 T cell lines, whereas PARN and CNOT7 mrna expression was unchanged, thus implying a possible unique role of this new deadenylase in gene expression during embryogenesis and differentiation. PAN2 deadenylase, a member of the DEDD nucleases initiates poly(a) degradation removing almost half of the tail when other nucleases degrade the rest of the tail. Although the role of PAN2 in mrna degradation has been revealed, its biologic function has not been studied. On knockdown of PAN2 a significant reduction was observed in the levels of PARN, Papola, CBP20 and MYC, but no significant change changes were observed in the levels of EIF4E and CNOT7 mrna expression. Our results indicate that PAN2 is involved in gene expression, this probably by triggering the degradation of the current messengers allowing production of new messengers. 8

9 9

10 Το RNA είναι ένα μόριο κεντρικής σημασίας για τη γονιδιακή έκφραση. Αρχικά χαρακτηρίστηκε ως ενδιάμεσο προϊόν της πρωτεϊνοσύνθεσης, όμως από τότε έχουν ανακαλυφθεί πολλά μόρια RNA με ποικίλους δομικούς και λειτουργικούς ρόλους σε όλα τα στάδια της γονιδιακής έκφρασης. Η εμπλοκή του RNA σε πολλές λειτουργίες που αφορούν την γονιδιακή έκφραση υποστηρίζει την γενική άποψη ότι ολόκληρη η διαδικασία μπορεί να έχει εξελιχθεί από έναν «κόσμο του RNA», στον οποίο αρχικά το RNA ήταν το ενεργό συστατικό του μηχανισμού διατήρησης και έκφρασης της γενετικής πληροφορίας. Αργότερα οι πρωτεΐνες υποβοήθησαν ή ανέλαβαν αποκλειστικά πολλές από αυτές τις λειτουργίες, γεγονός που είχε ως συνέπεια την αύξηση της προσαρμοστικότητας και πιθανόν της αποτελεσματικότητας. Τα κύτταρα περιέχουν διάφορα είδη RNA, τα κυριότερα εκ των οποίων παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην μετάφραση. Το αγγελιοφόρο RNA (mrna) είναι το εκμαγείο για την πρωτεϊνοσύνθεση. Για κάθε γονίδιο ή ομάδα γονιδίων που χρειάζεται να εκφραστεί παράγεται και ένα mrna. Επομένως το mrna είναι μία πολύ ετερογενής τάξη μορίων. Στο E. coli το μέσο μήκος του mrna είναι 1,2 kb. Το μεταφορικό RNA (trna) μεταφέρει ενεργοποιημένα αμινοξέα στο ριβόσωμα για τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού όπως καθορίζεται από το mrna. Υπάρχει ένα τουλάχιστον trna για κάθε ένα από τα 20 αμινοξέα. Το ριβοσωμικό RNA (rrna) είναι το κυριότερο συστατικό των ριβοσωμάτων όπου παίζει δομικό και καταλυτικό ρόλο. Άλλα μόρια RNA μπορούν και ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με το να προσδένονται σε συμπληρωματικές τους αλληλουχίες πάνω στο mrna. Τα mirna καταστέλλουν την μετάφραση και διεγείρουν την αποικοδόμηση του mrna στόχου ενώ τα sirna προσδένονται στο mrna και προκαλούν διάσπαση του μορίου. Άλλα μικρά μόρια RNA εμπλέκονται στις διαδικασίες ωρίμανσης των mrna και των ριβοσωμάτων (snrna και snorna αντίστοιχα). Ξεχωριστή κατηγορία αποτελούν τα καταλυτικά RNA, τα οποία ήρθαν στην επιφάνεια με την ανακάλυψη της RNase P και των ιντρονίων της ομάδας Ι. 1.Παραγωγή και τροποποίηση του mrna. To mrna χαρακτηρίσθηκε αρχικά ως ένα ασταθές μόριο που μεταφέρει την πληροφορία από των πυρήνα στα ριβοσωμάτια [1]. Κατά την μεταγραφή (transcription) παράγεται ένα μονόκλωνο μόριο RNA, όμοιο στην αλληλουχία με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA, ενώ η μετάφραση (translation) μετατρέπει τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του mrna στην αλληλουχία αμινοξέων που αποτελούν μια πρωτεΐνη. Ένα μόριο mrna δε μεταφράζεται σε ολόκληρο το μήκος του, αλλά κάθε mrna περιέχει τουλάχιστον μία κωδική περιοχή (coding region), η οποία σχετίζεται με μια πρωτεϊνική αλληλουχία μέσω 10

11 του γενετικού κώδικα: κάθε νουκλεοτιδική τριπλέτα (κωδικόνιο) της κωδικής περιοχής αντιστοιχεί σε ένα αμινοξύ. Μόνο η μία αλυσίδα του δίκλωνου DNA μεταγράφεται σε αγγελιαφόρο RNA. Η μία αλυσίδα του DNA η οποία κατευθύνει τη σύνθεση του mrna δημιουργώντας ζεύγη συμπληρωματικών βάσεων αποκαλείται αλυσίδα-μήτρα (template strand) ή μη- νοηματική αλυσίδα (antisense strand). Ο όρος «μη-νοηματική» χρησιμοποιείται γενικά για την περιγραφή μιας αλληλουχίας του DNA ή RNA που είναι συμπληρωματική με το mrna ενώ η αλυσίδα του DNA που φέρει την ίδια αλληλουχία με το mrna (με εξαίρεση ότι περιέχει Τ αντί για U) ονομάζεται κωδική αλυσίδα (coding strand). Η παραγωγή του ευκαρυωτικού mrna περιλαμβάνει επιπρόσθετα στάδια μετά τη μεταγραφή. Η μεταγραφή γίνεται με το συνήθη τρόπο, ξεκινώντας με τη δημιουργία ενός μεταγράφου με 5' τριφωσφορικό άκρο. Ωστόσο, το 3' άκρο δημιουργείται αποκόπτοντας ένα τμήμα του μεταγράφου και όχι τερματίζοντας τη μεταγραφή σε μια προκαθορισμένη θέση. Όσα RNA προέρχονται από γονίδια που περιέχουν ιντρόνια πρέπει να υποστούν μάτισμα, ώστε να αφαιρεθούν τα ιντρόνια και να παραχθεί ένα μικρότερο mrna που να περιέχει μια άθικτη κωδική αλληλουχία. Οι δύο άκρες του μεταγράφου τροποποιούνται με προσθήκη επιπλέον νουκλεοτιδίων εμπλέκοντας πρόσθετα ενζυμικά συστήματα (Εικόνα 1). Το 5' άκρο του RNA τροποποιείται αμέσως μετά την εμφάνιση του, εξαιτίας της προσθήκης μιας «καλύπτρας». Η τριφωσφορική ομάδα του αρχικού μεταγράφου αντικαθίσταται από ένα νουκλεοτίδιο που προστίθεται σε αντίθετο προσανατολισμό (3'> 5'), «σφραγίζοντας» με αυτόν τον τρόπο το άκρο. Το 3' άκρο τροποποιείται εξαιτίας της προσθήκης μιας σειράς νουκλεοτιδίων αδενυλικού οξέος [πολυαδενυλικό οξύ ή poly(α)] αμέσως μετά την αποκοπή του. Εικόνα 1: Τα βασικά στάδια ωρίµανσης του mrna περιλαµβάνουν την πρόσθεση της 5 καλύπτρας, το µάτισµα και πολυαδενυλίωση 11

12 Μόνο μετά την ολοκλήρωση όλων των τροποποιήσεων και της επεξεργασίας μπορεί το mrna να μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Κατά μέσο όρο, το mrna καθυστερεί περίπου 20 λεπτά για να εξέλθει από τον πυρήνα. Μόλις το mrna εισέλθει στο κυτταρόπλασμα, αναγνωρίζεται από τα ριβοσώματα και μεταφράζεται. O κύκλος ζωής του ευκαρυωτικού είναι πιο παρατεταμένος από αυτόν του βακτηριακού mrna. Η μεταγραφή στα ζωικά κύτταρα συμβαίνει με τη ίδια περίπου ταχύτητα που συμβαίνει και στα βακτήρια ( περίπου 40 νουκλεοτίδια ανά δευτερόλεπτο). Πολλά ευκαρυωτικά γονίδια είναι μεγάλα: ένα γονίδιο bp χρειάζεται περίπου 5 λεπτά για να μεταγραφεί. Η μεταγραφή του mrna δεν τερματίζεται με την αποδέσμευση του ενζύμου της RNA πολυμεράσης από το DNA. Αντίθετα, το ένζυμο συνεχίζει τη μεταγραφή και μετά το τέλος του γονιδίου. Μια συντονισμένη σειρά γεγονότων δημιουργεί το 3' άκρο του mrna με αποκοπή ενός τμήματος και προσθήκη μιας αλληλουχίας poly(α) στο πρόσφατα δημιουργημένο 3' άκρο. Το ευκαρυωτικό mrna αποτελεί μόνο ένα μικρό ποσοστό το συνολικού κυτταρικού RNA (-3% της μάζας του). Ο χρόνος ημιζωής των mrna στους ζυμομύκητες είναι σχετικά μικρός και κυμαίνεται από 1 έως 60 λεπτά. Υπάρχει μια αξιοσημείωτη αύξηση της σταθερότητας στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς: το mrna των ζωικών κυττάρων είναι σχετικά σταθερό, με χρόνο ημιζωής μεταξύ 1 και 24 ωρών. Τα ευκαρυωτικά πολυσώματα είναι σχετικά σταθερά. Οι τροποποιήσεις και στα δυο άκρα του mrna συνεισφέρουν σε αυτή τη σταθερότητα. 1.1.Το 5 άκρο του ευκαρυωτικού mrna φέρει καλύπτρα [2]. H 5' καλύπτρα σχηματίζεται με την προσθήκη μιας γουανοσίνης στην ακραία βάση του μεταγράφου μέσω ενός 5'-5' δεσμού. 1-3 μεθυλομάδες προστίθενται στη βάση ή στη ριβόζη της καινούριας ακραίας γουανοσίνης. Η μεταγραφή αρχίζει με ένα τριφωσφορικό νουκλεοσίδιο (συνήθως μια πουρίνη, Α ή G). Το πρώτο νουκλεοτίδιο διατηρεί την 5' τριφωσφορική ομάδα του και δημιουργεί το συνήθη φωσφοδιεστερικό δεσμό μεταξύ της 3' θέσης του και της 5' θέσης του επόμενου νουκλεοτιδίου. Η αρχική αλληλουχία του μεταγράφου μπορεί να αναπαρασταθεί ως: 5'ppp Α / G pνpνpνp... Ωστόσο, αν το ώριμο mrna επεξεργαστεί in vitro με ένζυμα τα οποία θα έπρεπε να το αποικοδομήσουν σε μεμονωμένα νουκλεοτίδια το 5' άκρο δεν παράγει το αναμενόμενο τριφωσφορικό νουκλεοτίδιο. Αντίθετα, περιλαμβάνει δύο νουκλεοτίδια συνδεδεμένα με 5'- 12

13 5' τριφωσφορικό δεσμό, ενώ φέρει και μεθυλομάδες. Η ακραία βάση είναι πάντα μια γουανίνης, η οποία προστίθεται στο αρχικό μόριο RNA μετά τη μεταγραφή. Η προσθήκη της G στο 5' άκρο καταλύεται από ένα πυρηνικό ένζυμο, τη γουανιδυλο-τρανσφεράση. Η αντίδραση αυτή συμβαίνει τόσο σύντομα μετά την έναρξη της μεταγραφής, που δεν είναι δυνατόν να ανιχνευθούν παρά μόνο ίχνη του αρχικού 5' τριφωσφορικό άκρου στο πυρηνικό RNA. Η συνολική αντίδραση μπορεί να αναπαρασταθεί ως μία συμπύκνωση μεταξύ του GTP και του αρχικού 5' τριφωσφορικού άκρου του RNA. Συνεπώς: 5' 5' Gppp + pppαpνpνp... = 5' 5' GpppΑpΝpΝp...+pp+p Το νέο κατάλοιπο G, που προστίθεται στο άκρο του RΝΑ, έχει το αντίστροφο προσανατολισμό από όλα τα άλλα νουκλεοτίδια. Αυτή η δομή ονομάζεται καλύπτρα (cap) και αποτελεί υπόστρωμα για αρκετές αντιδράσεις μεθυλίωσης. Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται η πλήρης δομή μιας καλύπτρας μετά την προσθήκη όλων των δυνατών μεθυλομάδων. Οι τύποι των καλυπτρών διακρίνονται από το πλήθος των μεθυλιώσεων Εικόνα 2: Πλήρης δοµή µιας καλύπτρας µετά την προσθήκη όλων των δυνατών µεθυλοµάδων. Η καλύπτρα ασφαλίζει το 5 άκρο του mrna και µπορεί να µεθυλιωθεί σε αρκετές θέσεις [ 13

14 που έχουν συμβεί. Η πρώτη μεθυλίωση γίνεται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αποτελείται από την προσθήκη μιας μεθυλομάδας στη θέση 7 της ακραίας γουανίνης. Μια καλύπτρα που έχει μόνο αυτή τη μεθυλομάδα ονομάζεται καλύπτρα 0 (cap 0). Στους μονοκύτταρους ευκαρυώτες, η αντίδραση σταματά σε αυτό το σημείο. Το ένζυμο που ευθύνεται για την τροποποίηση αυτή λέγεται 7-μεθυλο-τρανσφεράση της γουανίνης Το 3 άκρο πολυαδενυλιώνεται H 3' τερματική αλληλουχία από κατάλοιπα αδενοσίνης συχνά περιγράφεται ως ουρά poly(α), ενώ το mrna που έχει αυτό το χαρακτηριστικό δηλώνεται ως poly(α) + [poly(α)+]. Η αλληλουχία poly(α) δεν κωδικοποιείται στο DNA, αλλά προστίθεται στο RNA, μέσα στον πυρήνα, μετά τη μεταγραφή. Η προσθήκη της poly(α) καταλύεται από το ένζυμο poly(α) πολυμεράση, η οποία προσθέτει περίπου 200 κατάλοιπα αδενοσίνης στο ελεύθερο 3'-ΟΗ άκρο του mrna [3]. Η αλληλουχία poly(α), τόσο του πυρηνικού RNA όσο και του mrna, είναι συνδεδεμένη με μια πρωτεΐνη που ονομάζεται poly(α)-συνδεόμενη πρωτεΐνη (ΡΑΒΡ, Poly(Α) binding protein). Συγγενικές μορφές αυτής της πρωτεΐνης απαντώνται σε πολλούς ευκαρυώτες. Ένα μονομερές ΡΑΒΡ των -70 Κd συνδέεται σε κάθε βάσεις της ουράς poly(α). Έτσι, ένα κοινό χαρακτηριστικό σε πολλούς ή στους περισσότερους ευκαρυώτες είναι ότι το 3' άκρο του mrna αποτελείται από μία αλληλουχία poly(α), η οποία είναι προσδεμένη σε μία μεγάλη πρωτεϊνική μάζα. Η προσθήκη της poly(α) πραγματοποιείται ως μέρος μιας αντίδρασης στην οποία το 3' άκρο του mrna δημιουργείται και τροποποιείται από ένα σύμπλοκο ενζύμων. Η πρόσδεση της ΡΑΒΡ στον παράγοντα έναρξης elf4g δημιουργεί έναν κλειστό βρόχο, στον οποίο τα 5' και 3' άκρα του mrna συγκρατούνται στο ίδιο πρωτεϊνικό σύμπλοκο (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Η πρόσδεση της ΡΑΒΡ στον παράγοντα έναρξης elf4g δηµιουργεί έναν κλειστό βρόχο [ 14

15 Ο σχηματισμός αυτού του συμπλόκου μπορεί να ευθύνεται για κάποιες από τις επιδράσεις της poly(α) στις ιδιότητες του mrna. Η poly(α) συνήθως σταθεροποιεί το mrna. Η ικανότητα της poly(α) να προστατεύει το mrna από την αποικοδόμηση απαιτεί τη σύνδεση της με την ΡΑΒΡ. Η αφαίρεση της Poly(Α) αναστέλλει την έναρξη της μετάφρασης in vitro και η μείωση της ΡΑΒΡ έχει το ίδιο αποτέλεσμα στο ζυμομύκητα in vivo. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να εξαρτώνται από την πρόσδεση της ΡΑΒΡ στο σύμπλοκο έναρξης, στο 5' άκρο του mrna. Σε μερικές περιπτώσεις, τα mrna αποθηκεύονται σε μη πολυαδενυλιωμένη μορφή και η poly(α) προστίθεται όταν είναι απαραίτητη η μετάφραση τους. Σε άλλες περιπτώσεις, τα poly(α)+ mrna αποαδενυλιώνονται, με συνέπεια τη μείωση της μετάφρασης τους. 2. Αποικοδόμηση του mrna Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης είναι μια σύνθετη διαδικασία που περιλαμβάνει τον έλεγχο του ρυθμού μεταγραφής, την επεξεργασία και σταθερότητα του mrna, τον ρυθμό της μετάφρασης και την σταθερότητα της παραγόμενης πρωτεΐνης. Στο επίπεδο του mrna το σημαντικότερο σημείο ελέγχου αφορά την σταθερότητα του μορίου. Ανάλυση μικροσυστοιχίων έχει αποκαλύψει ότι το 40 50% των αλλαγών γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση σε διάφορα κυτταρικά σήματα συμβαίνει σε επίπεδο σταθερότητας του mrna [4, 5]. Αυτές οι αλλαγές προκαλούνται συνήθως από μεταβολές στην σύσταση των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων με αποτέλεσμα είτε να αναστέλλεται είτε να διευκολύνεται η αποικοδόμηση. Πολλοί κυτταρικοί παράγοντες και μηχανισμοί είναι αφιερωμένα στον συντονισμό του ρυθμού της αποικοδόμησης του mrna. Κατά την διάρκεια των τελευταίων πέντε ετών, τα περισσότερα από τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του mrna έχουν ταυτοποιηθεί και ξεκινάει η διαλεύκανση της σύνθετης ρύθμισης που καθορίζει την πορεία και τον ρυθμό της αποικοδόμησης του mrna. Μονοπάτια αποικοδόμησης του mrna Α.Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως τα ευκαρυωτικά mrna ωριμάζουν με την πρόσθεση δύο χαρακτηριστικών που προσδίδουν δομική ακεραιότητα. Στο 5 άκρο προστίθεται μία μεθυλιωμένη γουανίνη με τριφωσφορικό δεσμό 5-5 ενώ στο 3 άκρο προστίθεται η πολύ(α) ουρά. Αυτοί οι δύο παράγοντες αλληλεπιδρούν με τους κυτταροπλασματικούς παράγοντες eif4e και poly(a)-binding protein (PABP), αντίστοιχα για να προστατεύουν το μετάγραφο από τις εξωνουκλεάσες και να προαγάγουν την έναρξη της μετάφρασης. 15

16 Για να ξεκινήσει η αποικοδόμηση πρέπει είτε ένας από τους δύο παράγοντες να αποδεσμευτεί είτε να κοπεί ενδονουκλεοτιδικά το mrna. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η πλειοψηφία των mrna αποικοδομείται με ένα μονοπάτι που ξεκινάει από την βράχυνση της poly(a) ουράς. Το πρώτο βήμα στην μονοπάτι της αποικοδόμησης είναι μοναδικό από την άποψη ότι είναι αντιστρεπτό. Μετάγραφα που δέχονται ένα ειδικό σήμα μπορεί να επαναδενυλιωθούν και να επιστρέψουν στα πολυσώματα. Από την άλλη εάν ένα μετάγραφο πρέπει να καταστραφεί, μία από τις δύο παρακάτω πορείες θα ακολουθήσει (Εικόνα 4). Είτε αφαιρείται η 5 καλύπτρα, γεγονός που επιτρέπει την εξωνουκλεοτιδική διάσπαση από την XRN1 εξωριβονουκλεάση, είτε το 3 άκρο δέχεται επίθεση από το εξώσωμα. Αυτές οι δύο πορείες δεν είναι όμως απαραίτητα ανεξάρτητες. Στο Saccharomyces cerevisiae αποσιωπώντας συστατικά του 3 ή 5 μονοπατιού το μεταγραφόσωμα επηρεάζεται ελάχιστα, γεγονός που υποδηλώνει πλεονασμό των μηχανισμών αποικοδόμησης [6, 7]. Τα ένζυμα και ο έλεγχος της αποαδενυλίωσης θα συζητηθούν παρακάτω. Παρόλο που τα περισσότερα μετάγραφα αποικοδομούνται με μία πορεία που ξεκινάει με την αποαδενυλίωση υπάρχουν μερικές εξαιρέσεις. Ειδικά mrna φαίνεται να παρακάμπτουν την συνήθη πορεία για να επιτρέπουν ιδιαίτερο έλεγχο της αποικοδόμησης τους. Β.Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας ύο μετάγραφα άσχετα μεταξύ τους RPS28B και EDC1 παρακάμπτουν το στάδιο της αποαδενυλίωσης, και αφαιρείται η καλύπτρα με έναν αυτορυθμιστικό μηχανισμό (Εικόνα 4). Η πρωτεΐνη Rps28B προσδένεται σε μία δομή θηλιάς στην 3 αμετάφραστη περιοχή του δικού της μεταγράφου και στρατολογεί την Edc3, έναν προαγογέα της αφαίρεσης της. Αυτό επιφέρει σύνδεση και άλλων παραγόντων αφαίρεσης της καλύπτρας και επιτρέπει την αποικοδόμηση που είναι ανεξάρτητη από την αποαδενυλίωση [5].Το EDC1 mrna του S. cerevisiae, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Edc1 που ρυθμίζει την αφαίρεση της καλύπτρας, επίσης αποικοδομείται με πορείες ανεξάρτητες της αποαδενυλίωσης. Στην περίπτωση αυτή η αποαδενυλίωση φαίνεται να προλαμβάνεται από την αλληλεπίδραση της poly(a) ουράς και μία περιοχή poly(u) που βρίσκεται στο 3 UTR. Αυτό το ενδομοριακό ζευγάρωμα βάσεων εμποδίζει την πρόσβαση των αποαδενυλασών. Ο μηχανισμός αυτός είναι ένας μηχανισμός ανατροφοδοτικής ρύθμισης όπου το προϊόν της μετάφρασης αποικοδομεί το μετάγραφο του. Η αφαίρεση του EDC1 mrna απαιτεί την παρουσία υπομονάδων του συμπλόκου CCR4 NOT γεγονός που υποδηλώνει συσχέτιση μεταξύ αφαίρεσης της καλύπτρας και αποαδενυλίωσης. 16

17 Γ.Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση Ένας αποτελεσματικός τρόπος καταστροφής του mrna είναι μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης, όπου παράγονται δύο τμήματα που είναι ευάλωτα σε εξωνουκλεάσες (Εικόνα 4). ιάφορες ενδονουκλεάσες που στοχεύουν το mrna έχουν χαρακτηριστεί πρόσφατα συμπεριλαμβανομένου τις PMR1, IRE1 και το ένζυμο επεξεργασίας του ριβοσωμικού RNA (RNase MRP) το οποίο φαίνεται να επιτελεί επιπρόσθετο ρόλο αφού επιτίθεται και σε συγκεκριμένα μόρια mrna. Επιπλέον ενδονουκλεάσες φαίνεται να εμπλέκονται στην αποικοδόμηση ελαττωματικών mrnas [6, 7] ενώ τα sirnas ξεκινούν την αποικοδόμηση μέσο ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης όπου εμπλέκεται η Argonaute protein-2 (Ago2) [11, 12]. Εικόνα 4: Α. Αποικοδόµηση εξαρτώµενη από αποαδενυλίωση Β. Αποικοδόµηση εξαρτώµενη από την αφαίρεση της καλύπτρας Γ. Αποικοδόµηση εξαρτώµενη από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση[74] 3.Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna Κάθε βήμα στην παραγωγή ενός ώριμου μεταγράφου παρέχει δυνατότητες εισαγωγής λαθών. Για να εξασφαλίζεται η πιστότητα της μεταγραφής το κύτταρο έχει αναπτύξει την ικανότητα να εντοπίζει τα ελαττωματικά μετάγραφα και να τα αποικοδομεί, προφυλάσσοντας το κύτταρο από τοξικές πρωτεΐνες. Ο έλεγχος της ωρίμανσης του mrna συμβαίνει στον πυρήνα, ενώ οι πορείες ελέγχου που αναφέρονται παρακάτω σχετίζονται με την μετάφραση και ανιχνεύουν ελαττωματικά ριβονουκλεϊνικά σύμπλοκα στο κυτταρόπλασμα. Α.Nonsense-mediated decay: Στην διαδικασία αυτή (NMD) τα mrna που περιέχουν μια πρόωρη αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται (Εικόνα 5). Η 17

18 πρόωρη αλληλουχία τερματισμού μπορεί να προκύψει από σημειακές μεταλλάξεις, μετατοπίσεις αναγνωστικού πλαισίου, ελαττωματική ωρίμανση του μεταγράφου, προβληματική έναρξη [13] της μετάφρασης και εκτενή 3 αμετάφραστη περιοχή. Τα μετάγραφα αυτά θα οδηγούσαν στην παραγωγή ελαττωματικής πρωτεΐνης. Το μονοπάτι αυτό έχει βρεθεί σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ενώ τα κυριότερα συστατικά του NMD συμπλόκου UPF1, UPF2 και UPF3, είναι διατηρημένα. Εικόνα 5: A. Nonsense-mediated decay.στην διαδικασία αυτή τα mrna που περιέχουν µια πρόωρη αλληλουχία τερµατισµού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται. B. Non-stop decay. Τα mrna στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερµατισµού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται ταχύτατα µε κατεύθυνση 3 5 από το κυτταροπλασµατικό εξώσωµα. Γ. No-go decay Κατά την διαδικασία αυτή ανιχνεύονται ριβοσώµατα τα οποία έχουν κολλήσει πάνω σε ένα mrna µε αποτέλεσµα να διασπάται το mrna µόριο µε ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο σηµείο αυτό [74]. 18

19 Β.Non-stop decay: Παρομοίως σε μια διαδικασία που αναφέρεται ως non-stop decay (NSD) τα mrna στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται ταχύτατα με κατεύθυνση 3-5 από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα [14, 15]. Τέτοια μετάγραφα μπορούν να προκύψουν από διάσπαση, από την απουσία αλληλουχίας τερματισμού μέσα στην κωδικοποιούμενη περιοχή καθώς επίσης και από πρόωρη πολυαδενυλίωση κατά την μεταγραφη (Εικόνα 5). Γ.No-go decay: Ένας τελευταίος μηχανισμός επιτήρησης είναι ο no-go decay [16] (NGD) (Εικόνα 5), ο οποίος ανακαλύφθηκε πρόσφατα στον ζυμομύκητα και δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Κατά την διαδικασία αυτή ανιχνεύονται ριβοσώματα τα οποία έχουν κολλήσει πάνω σε ένα mrna με αποτέλεσμα να διασπάται το mrna μόριο με ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο σημείο αυτό. Τα ριβοσώματα απελευθερώνονται και τα παραγόμενα τμήματα RNA αποικοδομούνται από το εξώσωμα και την Xrn1. 4.Αποαδενυλίωση Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αποικοδόμηση του mrna υπό φυσιολογικές συνθήκες συνήθως ξεκινάει από την βράχυνση της poly(a) ουράς. Η αποαδενυλίωση είναι το Εικόνα 6: Η αποαδενυλίωση είναι συνήθως το στάδιο που καθορίζει το ρυθµό της αποικοδόµησης και της αποσιώπησης του mrna [74]. 19

20 σημαντικότερο στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και της μεταφραστικής αποσιώπησης του mrna. Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Τα ένζυμα που καταλύουν την αποαδενυλίωση είναι εξωνουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg 2+ που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3-5, παράγοντας 5 -AMP. Οι poly(a) ουρές είναι το κυριότερο υπόστρωμα των ενζύμων αυτών, ωστόσο μερικές αποαδενυλάσες μπορούν να διασπούν και άλλα μόρια RNA in vitro [17, 18].Από την στιγμή που η poly(a) ουρά έχει αφαιρεθεί από το mrna, άλλα υδρολυτικά ένζυμα ξεκινούν την διάσπαση του (Εικόνα 6). 4.1.Ποικιλότητα και βιοχημική δράση αποαδενυλασών Ο αριθμός των γνωστών αποαδενυλασών έχει επεκταθεί πρόσφατα, κυρίως μέσω βιοχημικών και γενετικών μελετών. Υποψήφιες αποαδενυλάσες έχουν ταυτοποιηθεί με χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής, ωστόσο η δράση τους δεν έχει αποδειχθεί. Σύμφωνα με συγκριτικές μελέτες των περιοχών με δράση ριβονουκλεάσης των ενζύμων αυτών, όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) υπέρ-οικογένεια. Οι DEDD νουκλεάσες ονομάστηκαν έτσι εξαιτίας των συντηρημένων καταλυτικών αμινοξικών καταλοίπων Asp και Glu τα οποία είναι διάσπαρτα σε τρία μοτίβα εξωνουκλεάσης που δεσμεύουν ιόντα μαγνησίου [19]. Μέλη της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν τις οικογένειες της POP2 (γνωστή και ως CAF1), της poly(a) εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης (PARN), την CAF1Z, και την PAN2. Τα ένζυμα της ομάδας EEP περιλαμβάνουν την CCR4, την Nocturinin, την ANGEL και 2 phosphodiesterase (2 PDE) και έχουν συντηρημένα κατάλοιπα Asp και His στην περιοχή με δράση νουκλεάσης [20] (Πίνακας 1). Είναι πιθανό να υπάρχουν και άλλες νουκλεάσες εκτός των υπέρ-οικογενειών DEDD και EEP ωστόσο δεν έχει ταυτοποιηθεί καμία ακόμη. Με αποαδενυλίωση είναι δυνατό να αφαιρεθούν poly(a) που προστίθενται σε μη κωδικοποιούμενα μόρια. Το πυρηνικό σύμπλοκο εξωσώματος εμπλέκεται σε τέτοιες αποαδενυλιώσεις, με την RRP6 υπομονάδα η οποία είναι μια DEDD τύπου εξωνουκλεάση, να είναι πιθανόν το καταλυτικό ένζυμο του συμπλόκου [13,8]. Οι ποικιλία των αποαδενυλασών μεταβάλλεται μέσα στα είδη. Μέλη των POP2, CCR4, PAN2 και ANGEL οικογενειών εντοπίζονται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Πίνακας 1), ενώ άλλες αποαδενυλάσες είναι λιγότερο συντηρημένες. Για παράδειγμα από την Drosophila melanogaster λείπουν η PARN και CAF1Z (Πίνακας 1). Στο Arabidopsis thaliana υπάρχουν 26 αποαδενυλάσες, πιθανότατα λόγω γεγονότων γενωμικού 20

21 διπλασιασμού. Στα θηλαστικά, οι οικογένειες POP2, CCR4, PARN και ANGEL έχουν επεκταθεί χάρη σε διπλασιασμό γονιδίων (Πίνακας 1). Πίνακας 1: Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες. Ανήκουν σε µία από της δύο οµάδες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) υπέρ-οικογένεια. Κάποιες έχουν προβλεφθεί µέσο βιοπλυροφορικής[74]. Μέσω βιοπληροφορικής έχουν προβλεφθεί νέες αποαδενυλάσες όπως η Poly(A)-specific ribonuclease (PARN)-like domain containing 1 η οποία αποτελεί αντικείμενο της παρούσας 21

22 διπλωματικής εργασίας (PNLDC1) και η ANGEL1 [21, 22] (Πίνακας 1). Το γονίδιο pnldc1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο υποκινητής περιέχει CpG νησίδες και υπερμεθυλιώνεται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου και περιφερικά κύτταρα αίματος [23]. Τουλάχιστον ένα ορθόλογο από κάθε οικογένεια διαθέτει δράση νουκλεάσης και το μοτίβο νουκλεάσης είναι συντηρημένο (Πίνακας 1). Σε ορισμένες περιπτώσεις η δράση αποαδενυλάσης επιδείχθηκε χρησιμοποιώντας in vitro και in vivo τεχνικές. Η ταυτοποίηση της ANGEL και της 2 PDE είναι μεμονωμένη. Η ανθρώπινη ANGEL έχει βρεθεί σε σύμπλοκο αποαδενυλίωσης [19] και διατηρεί τα κατάλοιπα του ενεργού κέντρου, ενώ η Ngl2, μια ορθόλογη της ANGEL στον μύκητα, είναι μία εξωνουκλεάση [24]. Η ανθρώπινη 2 PDE μπορεί να διασπά το poly(a) όταν το 5 φωσφορικό κάθε αδενοσίνης είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με το 2 ή 3 υδροξύλιο. Ωστόσο ο μοναδικός βιολογικός ρόλος της είναι η αποικοδόμηση του 2-5 oligo(a). Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να ταυτοποιηθούν όλες οι δραστικές αποαδενυλάσες και να διευκρινιστεί ο βιολογικός τους ρόλος. εν είναι ακόμη πλήρως κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Είναι πιθανόν ειδικές αποαδενυλάσες να στοχεύουν σε διακριτές ομάδες mrna με αποτέλεσμα να ελέγχεται κάθε ομάδα από την δράση ενός ενζύμου. Από την άλλη διάφορες αποαδενυλάσες μπορούν να δρουν στο ίδιο mrna με διακριτές αλλά αλληλοεπικαλυπτόμενες δράσεις. Στο μύκητα η PAN2 αποαδενυλιώνει νεοσυντιθέμενα μόρια mrna μέσα στον πυρήνα [25] (Εικόνα 6). Παρολ αυτά αν ακολουθήσουμε το mrna στο κυτταρόπλασμα θα δούμε ότι η Ccr4 είναι η επικρατούσα αποαδενυλάση [26]. Σε κύτταρα θηλαστικών, η PAN2 αφαιρεί την μισή ουρά, οπότε μέλη της POP2 και CCR4 αποικοδομούν την υπόλοιπη [27]. 4.2.Σύμπλοκα αποαδενυλασών Οι αποαδενυλάσες συνήθως σχηματίζουν σύμπλοκα. Οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στα σύμπλοκα αυτά μπορεί να επηρεάζουν την δραστικότητα των αποαδενυλασών. Για παράδειγμα, η αποαδενυλάση PAN2 προσδένεται στην PAN3 η οποία με την σειρά της αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη PABP 4 (Εικόνα 7). Η PABP ρυθμίζει την δράση του συμπλόκου PAN2 PAN3 προσελκύοντας το στην poly(a) ουρά. Κάποιες πολυαδενυλάσες σχηματίζουν ομο- ή ετεροδιμερή (Εικόνα 7). Σε κάποιες περιπτώσεις ο ομοδιμερισμός είναι απαραίτητος για την ενεργότητα της [24]. Η Ccr4 και η Pop2 στο S. cerevisiae σχηματίζουν ετεροδιμερή [28]. Επίσης ο ετεροδιμερισμός επεκτείνει το ρεπερτόριο των αποαδενυλασών στα θηλαστικά. Εφτά διακριτά σύμπλοκα μεταξύ των αποαδενυλασών έχουν καταγραφεί 22

23 [22, 29]. ιάφορα ετεροδιμερή μπορεί να έχουν διαφορετική ενζυμική ή ρυθμιστική ικανότητα. Σε αυτή την κατηγορία ανήκει η CNOT8 η οποία είναι μέλος της POP2 οικογένειας και έχει την ικανότητα να προσδένεται στην PUF ρυθμιστική πρωτεΐνη περισσότερο από ότι προσδένεται η CNOT7, ένα άλλο μέλος της POP2 οικογένειας [30]. Ανώτερα σύμπλοκα όσον αφορά το επίπεδο οργάνωσης προσθέτουν επιπλέον λειτουργίες και ρυθμιστική δυνατότητα. Υπάρχουν ειδικά ετεροδιμερή αποτελούμενα από την CCR4 και την POP2 πρωτεΐνη σε διάφορα είδη, συνδέονται με πρωτεΐνες NOT για να σχηματίσουν μεγάλα συμπλέγματα πολλαπλών υπομονάδων [22, 28]. Το σύμπλοκο CCR4 POP2 NOT [31] εμφανίζεται σε διαφορετικές μορφές με μοριακά βάρη να κυμαίνονται από 0,65 έως 2 MDa [28]. Οι πρωτεΐνες NOT μπορούν να δρουν ως συνδέτες. Η NOT4 της D. melanogaster συνδέει το σύμπλοκο αποαδενυλίωσης σε μία 3 UTR ρυθμιστική πρωτεΐνη. Μεταξύ ετεροδιμερών και υψηλού επιπέδου πολυπλοκότητας συμπλόκων στα οποία μπορούν να προσδένονται διαφορετικά, το ρεπερτόριο των αποαδενυλασών και του βιολογικού τους ρόλου είναι αρκετά εκτενές. 4.3.Βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών Οι αποαδενυλάσες έχουν διάφορες βιολογικές λειτουργίες όπως έχει δειχθεί από πειράματα γενετικής και RNA παρεμβολής (Πίνακας 1). Μερικά από τα ένζυμα αυτά είναι είναι απαραίτητα για την βιωσιμότητα των οργανισμών, ενώ μεταλλάγματα των ενζύμων αυτών επιφέρουν συγκεκριμένο φαινότυπο. Στα μετάζωα, τα φυτά και τους μύκητες διατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας των αποαδενυλασών επιφέρει ένα εύρος περίεργων φαινοτύπων (Πίνακας 1), ενώ για την βιωσιμότητα του ζυμομύκητα καμία αποαδενυλάση δεν είναι απαραίτητη. Παρόλο που η αποαδενυλίωση δεν αναστέλλεται με μεταλλάξεις στα γονίδια pan2 ή ccr4, μπλοκάρεται σε διπλά μεταλλάγματα pan2 και ccr4. Τα διπλά μεταλλάγματα είναι βιώσιμα γεγονός που υποδεικνύει ότι άλλα μονοπάτια αποικοδόμησης του mrna συμπληρώνουν την αποαδενυλίωση μολονότι ο ρυθμός είναι πολύ πιο αργός [32]. Ειδικές αποαδενυλάσες είναι απαραίτητες για συγκεκριμένες βιολογικές διαδικασίες, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ρύθμιση των επιπέδων mrna είναι σημαντική για τις διαδικασίες αυτές. ιάφορες αποαδενυλάσες όπως η PARN του A. thaliana και Xenopus laevis, η CCR4 της D. melanogaster και η CCF-1 του C. elegans., είναι κρίσιμες στην εμβρυογένεση [33, 34, 35, 36, 37]. Άλλες είναι απαραίτητες για την γονιμότητα. Cnot7- knockout ποντίκια παρόλο που είναι βιώσιμα χωρίς σωματικά ελαττώματα εμφανίζουν ελαττωματική σπερματογένεση και κατ επέκταση τα αρσενικά είναι στείρα [38, 39]. Η 23

24 CCR4 από την D. melanogaster και η CCF-1 από τον C. elegans παίζουν σημαντικό ρόλο στη γαμετογένεση τόσο ώστε μεταλλάγματα τους να επιφέρουν στειρότητα [34, 35]. Επιπροσθέτως, οι αποαδενυλάσες παίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία. Τα Cnot7- knockout ποντίκια έχουν αυξημένη μάζα οστών [40]. ιατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας της Nocturnin του ποντικού προκαλεί ελαττωματικό έλεγχο μεταβολισμού προσφέροντας αντίσταση σε παχυσαρκία προκαλούμενη από την δίαιτα. Πράγματι τα ποντίκια αυτά παίρνουν πιο δύσκολα βάρος παρόλο που συμπεριφέρονται και τρέφονται φυσιολογικά [41]. Οι αποαδενυλάσες ελέγχουν την ανάπτυξη ακόμη και σε επίπεδο κυττάρου. Μεταλλάγματα της D. melanogaster Ccr4 προκαλούν ελαττωματικό κυτταρικό κύκλο, όπως επίσης και μεταλλάγματα pop2 και ccr4 στον ζυμομύκητα [28]. Σε κυτταρικές σειρές, αποσιώπηση της pop2 επιφέρει διαταραχή στον έλεγχο της κυτταρικής μάζας. Στα θηλαστικά υπερ-έκφραση της Cnot7 ή της Caf1Z ή μείωση έκφρασης της Cnot6L, προκαλεί μειωμένη κυτταρική αύξηση [29, 42]. Αυτά τα παράξενα ευρήματα παρέχουν μία πρώτη ματιά στον ρόλο των αποαδενυλασών. Έως τώρα είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς άμεσες ή έμμεσες επιπτώσεις. Για παράδειγμα ο φαινότυπος που προκαλείται παρεμβάλλοντας το γονίδιο της Nocturnin μπορεί να οφείλεται σε διατάραξη πολλών mrna ή μόνο αυτών που εμπλέκονται στον μεταβολισμό. Η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μορίων mrna στόχων των οποίων η απορρύθμιση είναι υπεύθυνη για τους φαινοτύπους που περιγράφτηκαν προηγουμένως κρίνεται απαραίτητη. 4.4.Ρύθμιση της αποαδενυλίωσης Η ρύθμιση της δράσης των αποαδενυλασών είναι αναγκαία, καθώς μη φυσιολογική αποαδενυλίωση επιφέρει γενική απορρύθμιση. Σταθερά και μεταφραζόμενα mrna πρέπει να προστατεύονται από την αφαίρεση της poly(a) ουράς, ενώ μη σταθερά ή προβληματικά mrna πρέπει να αποαδενυλιώνονται και να αποικοδομούνται [43, 44]. Ταχεία αποαδενυλίωση συγκεκριμένων στόχων ξεχωρίζει σημαντικά από την φυσιολογική αποαδενυλίωση. Έτσι οι αποαδενυλάσες πρέπει να ρυθμίζονται γενικά αλλά και ειδικά σύμφωνα με τον στόχο (Εικόνα 8). Οι αποαδενυλάσες και οι ρυθμιστές τους εκφράζονται σε δεδομένη χρονική στιγμή και τόπο όταν μπορεί να υπάρχει και η ρύθμιση τους. Για παράδειγμα η έκφραση της Nocturnin είναι ρυθμική, πιθανόν μέσου ημερονυκτίου ρυθμού [45]. 24

25 Άλλες αποαδενυλάσες, όπως μέλη της POP2 και CCR4 οικογένειας εκφράζονται ευρέως και σταθερά [46]. Ένας δεύτερος μηχανισμός για γενική ρύθμιση της αποαδενυλίωσης είναι η αναστολή της ενζυμικής δράσης (Εικόνα 8). Ειδικά στρεσογόνα, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οξειδωτικά, οσμωτική πίεση ή θερμικό στρες, έλλειψη γλυκόζης, αναστέλλουν την αποαδενυλίωση, ενώ μελέτες επι της ανθρώπινης PARN δείχνουν ότι αναστέλλεται από νουκλεοτίδια και συνθετικά τους ανάλογα. [47, 48, 49, 50]. Η αποαδενυλίωση επηρεάζεται από δύο τοπολογικά διακριτές μορφές ελέγχου: α) πυρηνική κυτταροπλασματική και β) εντοπισμός σε κοκκία. ιάφορες αποαδενυλάσες κινούνται παλινδρομικά από τον πυρήνα στον κυτταρόπλασμα [22, 27] (Πίνακας 1). Αλλαγές στην διαμερισματοποίηση επιφέρουν δραματικά αποτελέσματα. Στα αμφίβια, αποσύνθεση του πυρήνα κατά την μείωση απελευθερώνει την PARN στο κυτταρόπλασμα όπου και αποαδενυλιώνει μητρικά mrna [33]. ιάφορες αποαδενυλάσες εντοπίζονται σε ενδοκυτταρικά κοκκία (Πίνακας 1). Τα γαμετοκύτταρα, τα νευρωνικά κοκκία και τα σωμάτια P (P bodies) περιέχουν mrna μόρια σε καταστολή τα οποία μπορούν να ενεργοποιηθούν [51]. Ο συνεντοπισμός των ενζύμων με τα υποστρώματα μπορεί να διεγείρει την αποαδενυλίωση αλλά αυτό δεν έχει αποδειχθεί πλήρως. Από την άλλη η αποαδενυλίωση δεν φαίνεται να περιορίζεται στα κοκκία γιατί οι ίδιες αποαδενυλάσες έχουν βρεθεί και στο κυτταρόπλασμα [52]. Εικόνα 7: Οι αποαδενυλάσες ρυθµίζονται γενικά αλλά και ειδικά σύµφωνα µε τον στόχο[74]. Η αποαδενυλίωση μπορεί να επηρεάζεται από χαρακτηριστικά του mrna. Η 5 καλύπτρα διεγείρει την ενεργότητα και την διαρκή εξωνουκλεοτιδική δράση δηλαδή την συνεχή αποαδενυλίωση από την PARN, ενώ δεν έχει επίδραση στην δράση άλλων αποαδενυλασών (Πίνακας 1). Αυτή η ιδιαίτερη ιδιότητα της PARN οφείλεται στην ικανότητα πρόσδεσης του ενζύμου αυτού στην 5 καλύπτρα του mrna μέσω μια ειδικής 25

26 περιοχής πρόσδεσης [25]. Σε κάποια mrna η poly(a) ουρά μπορεί να προστατευθεί από τις αποαδενυλάσες μέσω ζευγαρώματος βάσεων. Για παράδειγμα το πυρηνικό RNA της PAN στο σάρκωμα Kaposi,προκαλούμενο από ερπιτοϊό, αποτρέπει την αποαδενυλίωση του με ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ της poly(a) ουράς και μίας περιοχης πλούσιας σε ουριδίνη [52]. Η U-rich περιοχή Edc1 mrna του Saccharomyces cerevisiae λειτουργεί με τον ίδιο τρόπο[53]. 4.5.Επαγωγή της αποαδενυλίωσης από ρυθμιστικές πρωτεΐνες. Η ρύθμιση ειδικών mrna οφείλεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες που συχνά βρίσκονται στο 3 UTR και προάγουν την αποαδενυλίωση. Στις αλληλουχίες αυτές προσδένονται παράγοντες που στρατολογούν αποαδενυλάσες και διεγείρουν την αποαδενυλίωση (Εικόνα 3). ιάφορες RNA προσδενόμενες πρωτεΐνες (CUG-BP, PUF και CPEB), στρατολογούν τις αποαδενυλάσες αλληλεπιδρώντας άμεσα με αυτές[54, 55]. (Πίνακας 2) Ακόμα και η PABP μπορεί να ενεργοποιήσει την αποαδενυλίωση έλκοντας το σύμπλοκο PAN2 PAN3 στο mrna. Στα θηλαστικά η PABP μπορεί να στρατολογήσει σύμπλοκα μελών των οικογενειών POP2 CCR4 μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που συσχετίζονται με TOB πρωτεΐνες [55]. Πίνακας 2: Παράγοντες που στρατολογούν αποαδενυλάσες και διεγείρουν την αποαδενυλίωση[74]. 26

27 Η συνδυαστική δράση των ρυθμιστών επεκτείνει την πολυπλοκότητα των διαδικασιών αποαδενυλίωσης. Πολλαπλοί καταστολείς είτε πρωτεΐνες είτε mirnas, συχνά προσδένονται στο ίδιο mrna 3 UTR. Για παράδειγμα οι κατασταλτικές πρωτεΐνες του ζυμομύκητα Puf4 και Puf5 προσδένονται στο 3 UTR του HO mrna και κάθε πρωτεΐνη επιστρατεύει τα σύμπλοκα Ccr4 Pop2 για να επιταχυνθεί η αποαδενυλίωση [56]. Επιπλέον σύμπλοκα που προσδένονται στο 3 -UTR μπορούν να προσελκύσουν αποαδενυλάσες μέσω διαφορετικών υπομονάδων. Στην D. melanogaster οι πρωτεΐνες Pumilio και Nanos προσδένονται στο hunchback mrna και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Το σύμπλοκο Pumilio Nanοs με την σειρά του προσελκύει το σύμπλοκο CCR4 POP2 NOT με αλληλεπιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν και οι δύο υπομονάδες. Η Pumilio προσδένεται στην POP2, ενώ η Nanos προσδένεται στην NOT4 [57]. Έλεγχος της αποαδενυλίωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με τροποποίηση της πρόσδεση του ρυθμιστή ενός mrna ή της αποαδενυλάσης (Εικόνα 3). Η φωσφορυλίωση της RNA προσδενόμενης πρωτεΐνης KSRP από το p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) μονοπάτι αναστέλλει την προσδεση της στο RNA και εμποδίζει την ρύθμιση της αποαδενυλίωσης του mrna στόχου κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης κυττάρων ποντικού σε μυοκύτταρα [56]. Παρομοίως η πρωτεΐνη της D. melanogaster Oskar έχει προταθεί ότι αναστέλλει την πρόσδεση του καταστολέα της μετάφρασης Smaug στο mrna στόχο μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, που οδηγεί στην ενεργοποίηση του mrna του nanos γονιδίου κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης [59] (Εικόνα 8). Άλλο ένα σημείο ελέγχου είναι η αλληλεπίδραση ρυθμιστή αποαδενυλάσης. Η Pbp1 του ζυμομύκητα προσδένεται στην PABP και αναστέλλει την δραστικότητα της Pan2 Pan3 πιθανόν εμποδίζοντας την πρόσδεση [59]. 4.6.Παράγοντες που διεγείρουν ή αναστέλλουν την αποαδενυλίωση Το υπόστρωμα των αποαδενυλασών, η poly(a) ουρά του mrna είναι καλυμμένη με μόρια PABP που εμποδίζουν την πρόσβαση σε αυτήν(εικόνα 7), π.χ. η PABP του ζυμομύκητα αναστέλλει την δραστικότητα της απομονωμένης Ccr4n [32]. Στα θηλαστικά η PABP αναστέλλει την PARN [59]. Στο X. Laevis, η epab, μια ομόλογη της PABP επίσης αναστέλλει την αποαδενυλίωση του mrna [60]. Η ρυθμιζόμενη αποδέσμευση της PABP από την poly(a) του mrna ή η αλληλεπίδραση της PABP με μία αποαδενυλάση μπορεί να διεγείρει την αποαδενυλίωση [62]. Στον άνθρωπο υπάρχουν τουλάχιστον 6 μορφές της PABP, ενώ υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που επίσης προσδένονται στη poly(a) ουρά (όπως η NAB2), για τις οποίες δεν είναι γνωστό εάν επηρεάζουν την αποαδενυλίωση. Οι 27

28 ρυθμιστές είναι δυνατόν να μπλοκάρουν την αποαδενυλίωση με το να σταθεροποιούν σύμπλοκα PABP mrna. Το α-cp σύμπλοκο των RNA προσδενόμενων πρωτεϊνών σταθεροποιεί το mrna της α-globin με το να προσδένεται στην PABP. Συγρόνως άλλες πρωτεΐνες προσδέτες μπορούν να επηρεάζουν την αποαδενυλίωση. Η CBP80, μία υπομονάδα του πυρηνικού συμπλόκου πρόσδεσης στο 5 κάλυμμα προσδένεται και ανταγωνίζεται την δράση της PARN, πιθανόν περιορίζοντας την δράση της σε νεοσυντιθέμενα pre-mrnas [63]. Επιπλέον ρυθμιστικές πρωτεΐνες μπορούν να δρουν μέσω της PABP για να διεγείρουν την αποαδενυλίωση του mrna (Εικόνα 8). Πρωτεΐνες συσχετιζόμενες με ελικάση όπως η RHAU μπορούν να διεγείρουν την αποαδενυλίωση αντικαθιστώντας την PABP από την poly(a) ουρά [62]. Η TOB των θηλαστικών διεγείρει την αποαδενυλίωση με το να στρατολογεί μέλη της CCR4 POP2 οικογένειας μέσω αλληλεπιδράσεων με την C-τελική περιοχή (non-rna-binding) της PABP. Η TOB λειτουργεί ως γέφυρα συνδέοντας την PABP με σύμπλοκα αποαδενυλίωσης [65, 55]. Εικόνα 8: Τα συµπλοκα αποαδενυλίωσης µπορεί να είναι πολυλειτουργικά ανάλογα µε τον ρυθµιστή που στρατολογούνται[74]. 4.7.Αντισταθμιστική πολυαδενυλίωση Επαναπολυαδενυλίωση μπορεί να αντισταθμίζει την αποαδενυλίωση (Εικόνα 6). Κυτταροπλασματικές poly(a) πολυμεράσες της GLD2 οικογένειας ενεργοποιούν κατασταλμένα μόρια mrnas [54]. Στο X. laevis oocytes, η RNA-binding protein CPEB προσδένεται στο mrna της κυκλίνης B1 και αλληλεπιδρά ταυτόχρονα με την πολυμεράση GLD2 και την PARN [66, 54] (Πίνακας 2). Τα δύο αυτά ένζυμα είναι ανενεργά μέχρι την μείωση. Κατά την διάρκεια της μείωσης η φωσφορυλίωση της CPEB προκαλεί 28

29 αποδέσμευση της PARN επιτρέποντας την πολυαδενυλίωση να λάβει χώρα και να ενεργοποιήσει το mrna [54]. Αυτός ο τρόπος ελέγχου είναι κοινός όταν κατασταλμένα μόρια mrnas χρειάζεται να αποθηκευθούν και να κινητοποιηθούν σε διαφορετικό στάδιο όπως συμβαίνει στην σύναψη. 4.8.Έλεγχος πολλαπλής λειτουργίας Σύμπλοκα αποαδενυλίωσης που στρατολογούνται από ειδικούς ρυθμιστές μπορεί να είναι πολυλειτουργικά. Τα σύμπλοκα αυτά περιέχουν συστατικά που μειώνουν την μετάφραση του mrna και προάγουν την αποικοδόμηση του mrna, μαζί με τα ένζυμα αποαδενυλίωσης (Εικόνα 9). Η πολυλειτουργικότητα έχει δύο σημαντικές επιπτώσεις. Πρώτον, η αποαδενυλίωση δεν είναι επαρκής για ταχεία αποικοδόμηση του mrna εάν, για το συγκεκριμένο mrna, υπάρχουν άλλα καθοριστικά στάδια όπως η απομάκρυνση της καλύπτρας [67]. εύτερον η πολυλειτουργικότητα παρέχει ευκαιρίες για τον έλεγχο της αποαδενυλίωσης, της μετάφρασης και της ανακύκλωσης είτε ανεξάρτητα είτε μαζί ανάλογα με την φύση του συμπλόκου (Εικόνα 9) (Πίνακας 2) Πολλοί ρυθμιστές (όπως PUF, CPEB, KSRP, Smaug, TTP και mirnas) στρατολογούν ειδικές αποαδενυλάσες και συμπαράγοντές τους, που είτε αναστέλλουν την μετάφραση (όπως Dhh1, Maskin, CUP and 4EHP), είτε προάγουν την απομάκρυνση της καλύπτρας (όπως η (DCP1 και DCP2) είτε αποικοδομούν ταχεία το mrna (όπως το εξώσωμα και η εξωριβονουκλεάση -1 (XRN1) (Εικόνα 4) (Πίνακας 2). Στρατολόγηση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ελικάση όπως η Dhh1 (και οι ορθόλογες της) [30] και η RHAU62, μπορεί να διευκολύνουν την καταστολή ή την αποικοδόμηση αναδιαμορφώνοντας τα σύμπλοκα mrna πρωτεΐνης. Η αναδιαμόρφωση μπορεί να εκτοπίζει παράγοντες από το mrna συμπεριλαμβάνοντας παράγοντες μετάφρασης και ρύθμισης. Από την άλλη μπορεί να επιτρέψει σε άλλους παράγοντες να αποκτήσουν πρόσβαση στο mrna, όπως καταβολικά ένζυμα. Ακόμα και μία μεμονωμένη αποαδενυλάση μπορεί να είναι πολυλειτουργική. Η PARN προσδένεται στην 5 καλύπτρα και διεγείρεται από την πρόσδεση αυτή [25]. Όταν στρατολογείται σε ένα mrna, η PARN πιθανόν ανταγωνίζεται τον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 4Ε eif4e ο οποίος προσδένεται επίσης στην 5 καλύπτρα με αποτέλεσμα η PARN να μπορεί ταυτόχρονα να καταλύει την αποαδενυλίωση και να αναστέλλει την μετάφραση κάτι που έρχεται σε συμφωνία με πειράματα ανταγωνισμού της πρόσδεσης στο mrnas [68]. Παρομοίως, η αλληλεπίδραση 5 -καλύπτρα μπορεί να εγγυηθεί ότι μόνο μη μεταφραζόμενα μόρια mrna που δεν ταυτίζονται με τον παράγοντα eif4e αποτελούν στόχο για την PARN. 29

30 Τα σύμπλοκα CCR4 POP2 NOT φαίνεται να είναι επίσης πολυλειτουργικά, κατέχουν πρωτεϊνικές υπομονάδες που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο, στην μεταγραφή και στην μεταγωγή σήματος [28], και πιθανόν ενσωματώνουν την διεργασία της αποικοδόμησης του mrna στις διαδικασίες αυτές. Με το να προσελκύουν ένα μοναδικό σύμπλοκο μερικοί ρυθμιστές καθορίζουν πολλές δραστηριότητες. Στο ζυμομύκητα το σύμπλοκο Ccr4 Pop2 Not complex έρχεται σε επαφή με το ένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας και την Dhh1 [28]. Αυτό το σύμπλοκο είναι πολυλειτουργικό αφού καταλύει την αποαδενυλίωση, την αφαίρεση της καλύπτρας την αναδιαμόρφωση και την καταστολή της μετάφρασης. Άλλοι ρυθμιστές όπως οι PUF πρωτεΐνες στρατολογούν πολυλειτουργικά σύμπλοκα με μία απλή αλληλεπίδραση με την Pop2 υπομονάδα καταστέλλοντας την μετάφραση και προάγοντας την αποικοδόμηση του mrna [30, 56]. Σε άλλες περιπτώσεις, ένας ρυθμιστής που προσδένεται στο RNA μπορεί και ενεργοποιεί διάφορες δράσεις μέσω διαφορετικών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Σε αυτές τις περιπτώσεις η πρωτεΐνη οργανώνει την συναρμολόγηση ειδικών πολυλειτουργικών συμπλόκων στο mrna (εικόνα 4). Τέλος με συνδυαστική δράση διαφόρων ρυθμιστών μπορεί να προσελκύεται ένα πολυλειτουργικό σύμπλοκο μοναδικό για ένα συγκεκριμένο mrna, το οποίο καθοδηγείται από μια ειδική αλληλουχία στο 3 -UTR του mrna και από ειδικούς ρυθμιστές που την αναγνωρίζουν (Πίνακας 2). 5.Τα mirnas επιδρούν στις poly(a) ουρές Τα mirnas δρουν με ποικίλο τρόπο πάνω στα μόρια mrna. Μπορούν να καταστείλουν την μετάφραση ενός mrna, να διεγείρουν την αποικοδόμηση του, και να προκαλέσουν αποαδενυλίωση [69]. Τα mirnas αλληλεπιδρούν με την Argonaute πρωτεΐνη για να σχηματίσουν τα RNA-induced silencing complexes (RISCs) [66]. Αυτά τα σύμπλοκα διεγείρουν την αποαδενυλίωση του mrna μέσω του CCR4 POP2 NOT συμπλόκου, καταστέλλουν την μετάφραση μέσω ενός μηχανισμού αλληλεπίδρασης Argonaute 5 - καλύπτρα και προάγουν την αφαίρεση της καλύπτρας του mrna μέσω του συμπλόκου αφαίρεσης της καλύπτρας DCP1 DCP2 [69, 70] (Πίνακας 2). Επιπλέον συστατικά του RISC σχετίζονται με ελικάση RCK (p54), μία ορθόλογη της Dhh1 που απαιτείται για την καταστολή μέσω mirna [69] (Πίνακας 2). Πρόσφατη μελέτη αναδεικνύει τον μοναδικό ρόλο των αποαδενυλασών και των poly(α) ουρών στην γονιδιακή αποσιώπηση με mirna όπου υποστηρίζεται η άποψη ότι όλοι οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αποσιώπηση ακόμα και αυτοί που δεν ξεκινούν με την αποαδενυλίωση απαιτούν την παρουσία poly(α) 30

31 με σύμπλοκο αποαδενυλάσης [72] Η ετερογένεια των πολυλειτουργικών συμπλόκων μπορεί να εξηγήσει γιατί ένας μοναδικός ρυθμιστής, ή μία οικογένεια ρυθμιστών μπορεί άλλοτε να καταστέλλει την μετάφραση mrna και άλλοτε να προάγει την αποικοδόμηση του mrna. Στο ζυμομύκητα οι πρωτεΐνες Puf4 και Puf5 στρατολογούν το σύμπλοκο Ccr4 Pop2 Not στους mrna στόχους αλλά η Puf5 καταστέλλει την μετάφραση του mrna ανεξάρτητα από την αποαδενυλίωση, ενώ η καταστολή από την Puf4 στηρίζεται στην αποαδενυλίωση [56]. Οι διαφορές πιθανόν οφείλονται στην σύσταση ή την τροποποίηση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης. Η 3 UTR του mrna καθορίζει το ποια σύμπλοκα αποαδενυλίωσηςθα επιδρούν πάνω σε αυτό. Η παρουσία εκατοντάδων RNA προσδενόμενων πρωτεϊνών και mirnas στο ανθρώπινο γονιδίωμα υποδεικνύει ότι η ρύθμιση σε επίπεδο mrna είναι πιο διαδεδομένη από ότι ήταν γνωστό παλαιότερα. Η πολυμορφία και το πλήθος των mrna αποαδενυλασών και των συμπλόκων τους, παρέχουν δυναμικές και ευέλικτες δυνατότητες στον έλεγχο του mrna. Η στρατολόγηση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης σε συγκεκριμένα mrna με RNA προσδενόμενους ρυθμιστές είναι ένα σημαντικό σημείο ελέγχου. Είναι όμως απαραίτητο πλέον να διευθετηθούν διάφορα σημαντικά θέματα. Η ταυτότητα, η δράση και η δομή όλων των αποαδενυλασών πρέπει να μελετηθεί. Λειτουργικές δοκιμές συνεχίζονται ώστε να ταυτοποιηθεί ο βιολογικός τους ρόλος, ωστόσο πρέπει επίσης να αποκαλυφθούν και οι συγκεκριμένοι mrna-στόχοι. Η σύσταση των συμπλοκών αποαδενυλίωσης και των συμπλόκων καταστολής του mrna που τα επιστρατεύουν είναι σημαντική και τα αίτια της ετερογένειάς τους αποτελούν σημαντικά ερώτηματα. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός ελέγχου σε επίπεδο mrna πρέπει να γνωστοποιηθούν οι αποαδενυλάσες (και τα σύμπλοκα τους), ποιοι RNA προσδενόμενοι ρυθμιστές τις προσελκύουν και οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις που εμπλέκονται. 6.Αποαδενυλίωση και καρκίνος Μελέτες δείχνουν ότι αυξημένη αποικοδόμηση ογκοκατασταλτικών mrna μπορεί να προκαλέσει καρκίνο, ενώ αυξημένη ανακύκλωση του mrna απαιτείται σε ταχέως διαιρούμενα κύτταρα [74]. Μεγάλο ποσοστό των μελετών επικεντρώνονται σε παράγοντες σταθεροποίησης του mrna. Η μείωση των mrna σταθεροποιητών μπορεί να προκαλέσει μείωση της έκφρασης ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Από την άλλη υπερλειτουργία mirna που στοχεύουν ογκοκατασταλτικά γονίδια μπορεί επίσης να προκαλέσει καρκίνο. Πειράματα γενετικής και RNAi έχουν επιδείξει ένα ευρύ πεδίο βιολογικών λειτουργιών 31

32 όπως στην γονιμότητα και κυτταρική ανάπτυξη [74]. Λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον ρόλο των ενζύμων αυτών στο καρκίνο. Η αποαδενυλάση CCR4b του συμπλόκου CCR4b NOT επάγει την κυτταρική αύξηση σε σειρές ινοβλαστών ως πρώτο-ογκογονίδιο [29]. Σε φυσιολογικές συνθήκες το ένζυμο αυτό ρυθμίζει τα επίπεδα του p27kip1 mrna, ενός ογκοκατασταλτικού που αναστέλλει κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες και προάγει τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον όταν από τα κύτταρα λείπει το ένζυμο αυτό τα επίπεδα του p27kip1 αυξάνονται και αναστέλλεται η ανάπτυξη των κυττάρων. Η CCR4b αναστέλλεται in vitro από την Tob πρωτεΐνη η οποία αναστέλλει των πολλαπλασιασμό [75]. Ωστόσο δεν υπάρχει καμία μελέτη με αλλαγή των επιπέδων της CCR4b σε όγκους, ενώ δεν υπάρχουν μελέτες που να σχετίζουν μία πλεονάζουσα δράση του ενζύμου με τα επίπεδα ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκινικές σειρές. Η PARN από την άλλη δρα ογκοκατασταλτικά με το να στοχεύει τα mrna των αυξητικών παραγόντων IL-8 και VEGF. Μεταλλάγματα της RNA προσδενόμενης πρωτεΐνης TTP όπου δεν μπορεί πλέων να στρατολογήσει την PARN έχουν βρεθεί σε μεταστατικά γλοιοκύτταρα [76, 77]. Επίσης η PARN και το σύμπλοκο εξωσώματος στρατολογούνται από τις KSRP και DHAU με αποτέλεσμα μειώνουν τα επίπεδα c-jun και upa, τα οποία αυξάνονται στον καρκίνο [78, 79]. Μια άλλη μελέτη εστιάζει στην αλληλεπίδραση της PARN με την CUG-BP η οποία την στρατολογεί για να αποσταθεροποιήσουν τα c-fos και TNF-alpha mrnas [80]. 32

33 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Η ποικιλότητα των αποαδενυλασών και των συμπλόκων που σχηματίζουν παρέχουν δυναμικές και ευέλικτες δυνατότητες έλεγχου των μορίων RNA, από την επιτήρηση της βιογένεσης τους μέχρι την ρύθμιση της ποσότητας τους και της δράσης τους. Στρατολόγηση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης σε συγκεκριμένα μόρια mrna θεωρείται πλέον σημαντικό σημείο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Για τον λόγο αυτό, η ταυτότητα, η δράση και η δομή όλων των αποαδενυλασών πρέπει να μελετηθεί εκτενώς. Η σύσταση των συμπλόκων αποαδενυλίωσης και των συμπλόκων καταστολής των μορίων mrna που τα στρατολογούν είναι σημαντική και ο λόγος της ετερογένειας τους αποτελεί σημαντικό ερώτημα. Για να προσδιοριστούν οι μηχανισμοί ελέγχου πρέπει να γίνει γνωστό το ποιες αποαδενυλάσες (και τα σύμπλοκα τους), ποιοι RNA-προσδενόμενοι ρυθμιστές τις στρατολογούν και ποιες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις είναι σημαντικές. Η διερεύνηση των μηχανισμών αυτών θα μας βοηθήσει στην κατανόηση της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής. Αυτό μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση συγκεκριμένων φαρμακευτικών στόχων που να αντιπροσωπεύουν απόλυτα ένα κυτταρικό τύπο ή μία κυτταρική λειτουργία αντίθετα από τούς κλασσικούς στόχους που συνήθως εμπλέκονται σε μηχανισμούς απαραίτητους για την βιωσιμότητα ή την φυσιολογία όλων των κυττάρων. Το πεδίο αυτό είναι σε αρκετά πρώϊμο στάδιο και αρχικά θα πρέπει να μελετηθούν όλα τα ένζυμα που εμπλέκονται. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή γίνεται μελέτη επί του μη χαρακτηρισμένου γονιδίου pnldc1 το οποίο είναι παράλογο του γονιδίου που κωδικοποιεί την ανθρώπινη PARN, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και πιθανόν παράγει δύο μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος ένα εκ των οποίων φαίνεται να διαθέτει ένα πεπτιδικό σήμα (βιοπληροφορική ανάλυση της βάσης δεδομένων UNIPROT). Ανάλυση της αλληλουχίας και της πιθανής δομής συγκριτικά με την PARN δείχνει πως η υποθετική πρωτεΐνη PNLDC1 διατηρεί την δράση αποαδενυλάσης. Το γονίδιο κλωνοποιήθηκε με σκοπό τον βιοχημικό χαρακτηρισμό της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Λόγω της ύπαρξης νησίδων CpG στον υποκινητή του γονιδίου και της μεθυλίωσης του, χορηγήθηκε ο απομεθυλιωτικός παράγοντας 5-Aza-Deoxycytidine σε κυτταρικές σειρές HaCAT και HEK 293 T για να ελεγχθεί αν το γονίδιο αυτό ρυθμίζεται με μεθυλίωση. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποσιώπησης του γονιδίου pan2 σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών με σκοπό την μελέτη της επίδρασης της έλλειψης της αποαδενυλάσης αυτής στηv έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που εμπλέκονται σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Οι CNOT7 και PARN ανήκουν στην ίδια οικογένεια αποαδενυλασών DEDD, συμβάλλοντας στην αποαδενυλίωση του mrna. Η NOCTURNIN είναι αποαδενυλάση διαφορετικής κατηγορίας (EEP) από τις δύο προηγούμενες (CNOT7, PARN) και υπόκειται 33

34 σε κιρκάδιο έλεγχο. Ο παράγοντας CBP20 αποτελεί συστατικό του πυρηνικού συμπλόκου πρόσδεσης καλύμματος Ο παράγοντας eif4e προσδένεται στο 5 άκρο του mrna ελέγχοντας την μετάφραση. Ο μεταγραφικός παράγοντας MYC επάγει την έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη, ενώ λειτουργεί και αντι-αποπτωτικά Ο ρόλος της αποαδενυλάσης PAN2 δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος ενώ είναι γνωστό ότι ευθύνεται για την απομάκρυνση του τελικού τμήματος της poly(a) ουράς. 34

35 35

36 ΥΛΙΚΑ 1.Χημικά Acetic Acid (glacial) Acrylamide 2X Agar Agarose Ammonium acetate Ammonium chloride Ammonium persulfate Ammonium sulfate Ampicillin (Na + Salt) 5-Aza-Deoxycytidine Boric acid Bovine Serum Albumin (BSA) Bradford reagent Χ-Gal Bromophenol blue 2-Butanol Chloramphenicol Coomassie brilliant blue R250 Coomassie brilliant blue G250 Deoxynucleotides (dntps) Diethylpyrocarbinol (DEPC) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Ditheiothreitol (DTT) DNA MW MARKERS Ethanol Ethylendiaminetetra-acetic acid (EDTA) FBS MERCK SERVA SERVA BIORAD MERCK MERCK SERVA MERCK SERVA SIGMA MERCK SIGMA SIGMA SIGMA SIGMA MERCK SERVA MERCK MERCK BIOLINE SIGMA SERVA SERVA BIOLINE MERCK SERVA BIOSERA 36

37 Formaldehyde 37% Formamide, deionized Gel Red Nucleic Acid Gel Stain Glycerol ( Glycine Hydrochloride 37% Imidazole Isopropanol Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG) Kanamycin A monosulfate Lipofectamine Magnesium chloride, hexahydrate Magnesium sulfate, heptahydrate β Mercaptoethanol Methanol MEM w/ Earle's Salts w/ stable Glutamine N-N methylen bis acrylamide Nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Agarose Penicillin-Streptomycin Solution 100X Peptone Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Polyethylene glycol (MW 40000) Ponceau S Potassium chloride Potassium dihydrogen phosphate di Potassium hydrogen phosphate Ribonucleotides triphosphates ROX Low MERCK SIGMA BIOTIUM SERVA SERVA MERCK ALDRICH MERCK SERVA SIGMA Invitrogen MERCK MERCK SERVA MERCK BIOSERA SERVA QIAGEN BIOSERA SERVA SERVA SERVA MERCK MERCK MERCK MERCK MERCK SERVA PROMEGA KAPABIOSYSTEMS 37

38 Sodium chloride Sodium dodecyl sulfate Sodium di-hydrogen phosphate, monohydrate di Sodium hydrogen phosphate MERCK SDS MERCK MERCK N, N, N, N Tetramethylethylendiamine SERVA Tris hydroxylmethylaminomethane Triton X-100 Trysure reagent Tween 20 Urea Xylene cyanol Yeast extract SERVA MERCK BIOLINE APPLICHEM SERVA SERVA SERVA 2.Ένζυμα: BamH1 DNase I EcoRI KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix(2x) Lysozyme NdeI RNasin T4 DNA Ligase TNK T4 Nucleotide Kinase TAKARA TAKARA TAKARA KAPABIOSYSTEMS SIGMA TAKARA PROMEGA FERMENTAS TAKARA 3.Κιτ: ChemiLucent Western blot detection system Nucleospin Plasmid DNA Mini Prep Nucleospin Extract II Nucleospin RNA II StrataClone PCR Cloning Kit KAPA SYBR Green One-Step qrt-pcr Kit AMERSHAM MACHEREY NAGEL MACHEREY NAGEL MACHEREY NAGEL STRATAGENE KAPABIOSYSTEMS 38

39 4.Βακτηριακά στελέχη: DH5α [γονότυπος: F-φ80lacΖ Μ15 (lacζυ Α-argF) U169 deor reca1 enda1 hsdr17(rk-, mk+) phoa supe44 thi-1 gyra96 rela1 λ-] ΒL21 (DE3) {γονότυπος: E. coli B F- dcm ompt hsds(rb- mb-) gal λ (DE3)} BL21 (DE3) Rosetta [γονότυπος: E. coli F- ompt hsdsb(rb-, mb-) gal dcm prare2 (Camr) BL21 (DE3) Codon Plus [γονότυπος: E. coli B F ompt hsds(rb, mb ) dcm+ Tetr gal λ(de3) enda Hte (argu iley leuw Camr)] Strataclone TM Solopack Competent Cells : Tα συγκεκριμένα κύτταρα παρέχονται από το Strataclone PCR Cloning Kit της Stratagene και διαθέτουν την ικανότητα έκφρασης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία απαιτείται για την κυκλοποίηση των γραμμικών μορίων DNA που παράγονται κατά τη διάρκεια του καταλυόμενου από την τοποϊσομεράση Ι ligation. Επίσης, τα κύτταρα αυτά υποστηρίζουν την επιλογή βάσει των μπλε και άσπρων αποικιών (blue/white screening) όταν μετασχηματισθούν με το πλασμίδιο psc-a, το οποίο παρέχεται από το ίδιο kit και εξασφαλίζουν μετασχηματισμό υψηλής απόδοσης. 5.Πλασμιδιακοί φορείς psc-a: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 3.5 kb που χρησιμοποιείται για τη κλωνοποίηση γονιδίων. H διαδικασία της κλωνοποίησης με το συγκεκριμένο φορέα εκμεταλλεύεται τις συνδυασμένες δράσεις της τοποϊσομεράσης Ι από το ιό Vaccinia και της ρεκομπινάσης Cre από τον βακτηριοφάγο P1. In vivo, η τοποϊσομεράση Ι συμμετέχει στην αντιγραφή του DNA χαλαρώνοντας και επανασυνδέοντας τις έλικες του DNA. Ειδικότερα, η τοποϊσομεράση Ι κόβει τη φωσφοδιεστερική ραχοκοκαλιά μιας αλυσίδας DNA ακριβώς μετά την αλληλουχία 5-CCCTT δημιουργώντας μια ενδιάμεση ένωση DNA-ενζύμου, η οποία συντηρεί την ενέργεια δεσμού που πρόκειται να χρειαστεί για την επανελίκωση του κομμένου DNA πίσω στη σωστή έλικα. Από τη στιγμή που δημιουργηθεί το ενδιάμεσο αυτό, η αντίδραση επανελίκωσης μπορεί επίσης να συμβεί με ένα ετερόλογο τμήμα DNA. Η Cre καταλύει τον ανασυνδιασμό μεταξύ δύο loxp αλληλουχιών αναγνώρισης. Το μείγμα φορέων που παρέχεται με το PCR cloning kit της Stratagene περιέχει βραχίονες DNA δύο ειδών, καθένας από τους οποίους στο ένα άκρο του φέρει μια τοποϊσομεράση Ι και στο άλλο μια περιοχή αναγνώρισης loxp. Τα φορτισμένα με την τοποϊσομεράση άκρα διαθέτουν μια προεξοχή τροποποιημένης ουριδίνης ( U*). Με αυτόν τον τρόπο τα ενισχυμένα με Taq πολυμεράση προϊόντα της PCR, τα οποία φέρουν 3-Α 39

40 προεξοχές μπορούν να ενωθούν αποτελεσματικά με τους παραπάνω βραχίονες μέσω του σχηματισμού δεσμών Α- U*, ακολουθούμενου από την σύνδεση των αλυσίδων DNA με τη βοήθεια της τοποϊσομεράσης Ι (Εικόνα 11). Εικόνα 9: Σύνοψη της µεθόδου στην οποία στηρίζεται ο µετασχηµατισµός µε τη βοήθεια του Strataclone PCR cloning kit. Το γραμμικό μόριο DNA που προκύπτει στη συνέχεια, μετασχηματίζει επιδεκτικά κύτταρα που έχουν την ικανότητα σύνθεσης της ρεκομπινάσης Cre, η οποία με τη σειρά της ανασυνδιάζει τις περιοχές loxp στα άκρα του γραμμικού μορίου. Έτσι, σχηματίζεται ο κυκλικός φορέας psc-a που έχει την ικανότητα ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο παρουσία αμπικιλλίνης και περιέχει το οπερόνιο της λακτόζης (lacz). Το συγκεκριμένο οπερόνιο παίζει ρόλο στον έλεγχο της επιτυχίας της κλωνοποίησης με βάση την εμφάνιση μπλε ή άσπρου χρώματος των αποικιών (blue/white screening). Ο φορέας έχει επεξεργαστεί κατάλληλα έτσι ώστε να είναι κομμένος εντός του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης. Oι αποικίες που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο ή το πλασμίδιο δεν έχει ενσωματώσει το επιθυμητό γονίδιο, παρουσιάζουν μπλε χρώμα, καθώς ο φορέας επανακυκλοποιείται, εκφράζεται το lacz και επομένως διασπάται η λακτόζη. Ο μηχανισμός αυτός, λοιπόν, είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για την κλωνοποίηση γονιδίων σε βακτηριακούς φορείς και μάλιστα σε συνδυασμό με την ανάπτυξη των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με το κατάλληλο αντιβιοτικό, καθιστά αρκετά αξιόπιστη και ακριβή την διαδικασία επιλογής των αποικιών που έχουν προσλάβει τον φορέα με το επιθυμητό ένθετο. 40

41 Πλασμιδιακοί φορείς pet-15b, pet-20b(+), pet-33b(+) και pet29(a-c) (NOVAGEN ) Πρόκειται για πλασμιδιακούς φορείς μεγέθους που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης. Μετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυμεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού. Με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων είναι δυνατή η εισαγωγή του επιθυμητού γονιδίου, όπως είναι στη συγκεκριμένη περίπτωση το γονίδιο pnldc1 στο εσωτερικό του polylinker και στη συνέχεια, η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου αυτού μετά από την πρόσδεση της Τ7 RNA πολυμεράσης στον προαγωγέα της. Προστίθενται έξι τριάδες νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν έξι ιστιδίνες στην αρχή η στο τέλος της αμινοξικής αλληλουχίας. Για να προστεθεί η αλληλουχία στο τέλος όπως στην περίπτωση του pet- 20b θα πρέπει να απαλειφθεί το κωδικόνιο λήξης της μεταγραφής του pnldc1. Η μεταγραφή σταματά από ένα κωδικόνιο λήξης αμέσως μετά τα νουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τις έξι ιστιδίνες 6.Short-Hairpin RNAs (shrnas) Για την αποσιώπηση της PAN2 χρησιμοποιήθηκαν πέντε διαφορετικά shrnas (Πίνακας 4) από την Sigma κλωνοποιημένα στο πλασμιδιακό φορέα plko.1-puro (Εικόνα 12). Tα shrnas και τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου φορέα παρέχουν ένα ισχυρό μοριακό εργαλείο μακροπρόθεσμης, σταθερής αποσιώπησης του επιθυμητού γονιδίου, μέσω του συστήματος του RNAi καθώς και τη δυνατότητα αναγέννησης του πλασμιδίου μετά το μετασχηματισμό βακτηρίων με αυτό. CCGGCCTGCCTTCTTGCGCTTCATTCTCGAGAATGAAGCGCAAGAAGGCAGGTTTTT CCGGGCTTCCTTTCTCCATTCGCATCTCGAGATGCGAATGGAGAAAGGAAGCTTTTT CCGGCAGTGATGATATTCGGCAGATCTCGAGATCTGCCGAATATCATCACTGTTTTT CCGGCCTCTCCCTTTACTGTTCTATCTCGAGATAGAACAGTAAAGGGAGAGGTTTTT CCGGGCTGGAGGACTTTGACTTCAACTCGAGTTGAAGTCAAAGTCCTCCAGCTTTTT Πίνακας 3: Αλληλουχίες που επιλέχθηκαν για την αποσιώπηση της PAN2 41

42 Εικόνα 10: Ο χάρτης του πλασµιδιακού φορέα plko.1- puro της Sigma Ο plko.1-puro περιέχει γονίδια ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη και την πουρομυκίνη για δυνατότητα επιλογής βακτηριακών και ευκαρυωτικών κυττάρων αντιστοίχως, που έλαβαν επιτυχώς το πλασμίδιο. Ο μηχανισμός δράσης των shrnas έγκειται στην in vivo μεταγραφή της κλωνοποιημένης στο φορέα αλληλουχίας του shrna ενδοκυτταρικά και η παραγωγή μικρών δίκλωνων μορίων RNA που φέρουν μια δευτεροταγή δομή φουρκέτας. Στη συνέχεια αυτά τα δίκλωνα μόρια επεξεργάζονται από τη Dicer και παράγουν μια ομάδα από sirnas ειδικά για το ένα mrna-στόχο 7.Εκκινητές (primers) Εκκινητές για αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο: Οι εκκινητές αυτοί είναι σχεδιασμένοι να ενισχύουν ειδικά ένα τμήμα ενός γονιδίου και σχεδιάζονται σε περιοχές παρεμβαλλόμενες από ιντρόνια. Γονίδιο Μήκος προϊόντος Αλληλουχία H2A FWD H2A REV 255bp CGGTAAGGCTGGAAAGGACT TGCAAGTGACGAGGGGTAAT PARN FWD PARN REV 211bp CAGCAGAAACATGCCAAAGA CCAAGAGTCTGGGGAAAACA 42

43 CBP20 FWD CBP20 REV 175bp ACGCCATGCGGTACATAAAT TGTGCCAGTTTTCCATAGCC MYC FWD MYC REV 274bp CAGCGACTCTGAGGAGGAAC TCGGTTGTTGCTGATCTGTC eif4e FWD eif4e REV 256bp CAGGAGGTTGCTAACCCAGA CTCCCCGTTTGTTTTTCTCA PAPOLA FWD PAPOLA REV 216bp TCGGGCGCCATGTTAGGACG CCCTGTGTTGTAACTGGAAAC CNOT7 FWD CNOT7 REV 419bp GTCCTCTGTGAAGGGGTCAA GAC TGCTTG TTGGCT TC TC PABPC FWD PABPC REV 500bp ATGGCAGCTATCCCACAGAC GTAGGGTGCATGGCTTGAAT PNLDC1 FWD PNLDC1 REV 236bp GACCCCTCCCAGAAAGCTAC GGGGCACTTTGTCTCAACAT Πίνακας 4: Εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης σε πραγµατικό χρόνο. Για την ενίσχυση του γονιδίου Pnldc1_1, από cdna κλώνο από βιβλιοθήκη cdna ανθρώπινη, χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές (primers) Pnldc1 forward Nde I primer και Pnldc1 Reverse BamH I primer(πίνακας 5). Εκκινητής Αλληλουχία 5'-3' Τm Pnldc1_1 forward Nde I GCATATG TTCTGCACCCGAGGACTG 63 Pnldc1 Reverse BamH I GGATCCTCAGGTACCAGATCTTCCAAGG 63 Πίνακας 5: Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για την ενίσχυση του γονιδίου Pnldc1, από cdna κλώνο. Τα χρωµατισµένα νουκλεοτίδια αντιστοιχούν στις επιθυµητές θέσεις κοπής από τα περιοριστικά ένζυµα NdeI (Forward primer) και BamH1 (Reverse primer). 43

44 8.Θρεπτικά μέσα Θρεπτικά υλικά για την καλλιέργεια βακτηρίων Υγρό θρεπτικό μέσο(lb Broth) 0,5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0,5% v/w NaCl, ph 7,2 Στερεό θρεπτικό μέσο (LB Agar) 0,5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0,5% v/w NaCl, 1,5% agar, ph 7,2 SOC (υγρό θρεπτικό μέσο για μετασχηματισμό βακτηρίων) 0,5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl,10 mm MgCl2, 10 mm MgSO4, 20mM glucose Για την καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Πλήρης θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών: DMEM high glucose stable glutamine, 5-10 % fetal bovine serum (FBS), 1x penicillin-streptomycin ιάλυμα ψύξης: FBS, 10% DMSO 9. ιαλύματα ιαλύματα για ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων ΤΑΕ (50x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης : Tris base 24,2% v/w, Οξικό οξύ 5,71% w/w, EDTA 0,05M, ph 8,6 Loading buffer (6x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων : Bromophenol Blue 0,09%, Xylene Cyanol 0,09%, Γλυκερόλη 60%, EDTA 60mM ιαλύματα για απομόνωση πρωτεΐνης ιάλυμα λύσης: (50 mm NaH 2 PO 4 ph 7.4, 0.3 M KCl, 0.1% Triton X-100, 10% glycerol, 2mM mercaptoethanol and 5 mm imidazole, PMSF 0,1 mm, lysozyme). Τα υλικά Triton X-100, mercapto-ethanol, lysozyme στο διάλυμα λύσης τα προσθέτουμε πριν διαλύσουμε τα κύτταρα. ιάλυμα έκπλυσης: (50 mm NaH 2 PO 4 ph 7.4, 0.3 M KCl, 10% glycerol and 10 mm imidazole). 44

45 ιάλυμα έκλουσης: (50 mm NaH 2 PO 4 ph 7.4, 0.3 M KCl, 10% glycerol and 200 mm Imidazole). ιαλύματα για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 2x Sample Buffer: 90 mm Tris HCl ph 6.8, 20% γλυκερόλη, 2% SDS, 0.02% bromophenol blue, 0.1 M DTT. Running buffer(10x). Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: Tris base 1,5 %, Γλυκίνη 7,2% v/w, SDS 0,5%, ph 8,3 ιαλύματα στοκ ιαλύματα για πήκτωμα ακρυλαμιδίου Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 8,8 1,5M Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 6,8 0,5M SDS 10% v/w Ακρυλαμίδιο 30% v/w acrilimide / bis-acrilimide (29/1) σε ddh20 Ανάλογα με την συσκευή και την περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου που θα χρειαστούμε θα αναζητήσουμε τους πίνακες για την αναλογία των διαλυμάτων στοκ που θα πρέπει να αναμείξουμε και προσθέτουμε στο τέλος τους καταλύτες APS 10% και TEMED. ιαλύματα για βαφή του gel ιάλυμα χρώσης: 1gr/L Coomassie Brilliant Blue, 48% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. ιάλυμα αποχρωματισμού: 45% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ ιαλύματα για την μέτρηση της ενεργότητα αποαδενυλίωσης με κυανό του μεθυλενιου διάλυμα αντίδρασης (1.5mM MgCl2, 100 mm KCl, 20 mm HEPES-KOH ph mm EDTA, 0.25 mm DTT και 10% γλυκερόλη) methylene blue buffer ( % methylene blue 0,1Μ MOPS-ΚΟΗ ph 7,5 2mM EDTA) στοκ 100μg/ml poly(a) στερεό poly(a) διαλύεται σε διάλυμα αντίδρασης για συγκέντρωση 100μg/ml poly(a) 45

46 ιαλύματα για αποτύπωση κατά Western Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς: 25 mm Tris, 150 mm γλυκίνη, 20% μεθανόλη, ph 8.3. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS: 10 mm Tris HCl ph 7.5, 150 mm NaCl. ιάλυμα δέσμευσης: TBS, 3% BSA. ιάλυμα TBS-Tween/Triton: 20 mm Tris-HCl ph 7.5, 500 mm NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20, 0.2% (v/v) Triton X

47 ΜΕΘΟ ΟΙ 1.Ανάλυση in silico του γονιδίου pnldc1 Το γονίδιο pnldc1 είναι παράλογο του γονιδίου parn. Όλες οι διαθέσιμες πληροφορίες βρίσκονται στο Με το πρόγραμμα bioedit και τον αλγόριθμο CLUSTAL W έγινε η ομοπαράθεση με το γονίδιο parn από την οποία μπορούμε να βγάλουμε συμπεράσματα για την υποθετική πρωτεΐνη. Η πρόβλεψη της δομής έγινε με λογισμικό swissmodel στο Ως πρότυπο μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η κρυσταλλική δομή της Mouse PARN (3d45A). Ανάλυση της προβλεπόμενης δομής έγινε με το λογισμικό UCSF Chimera. 2.Κλωνοποίηση του γονιδίου pnldc1 2.1.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Η PCR χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του γονιδίου pnldc1_1 από cdna κλώνο από ανθρώπινη βιβλιοθήκη. Αρχικά προστίθενται ο cdna κλώνος, το ρυθμιστικό διάλυμα της πολυμεράσης, η οποία στην προκειμένη περίπτωση είναι η DNA πολυμεράση, τα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια (dntps), οι εκκινητές (primers) και Η 2 Ο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι Human Pnldc1_1 Protein NdeI Forward primer και Human Pnldc1_1 Protein BamHI Reverse primer. Έτσι, μετά το πέρας της αντίδρασης ενίσχυσης των επιθυμητών γονιδίων, προκύπτουν προϊόντα που στα άκρα τους φέρουν θέσεις κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο μετουσίωσης σε θερμοκρασία 95 ο C για 4 λεπτά. Μετά την πάροδο αυτού του χρονικού διαστήματος προστίθεται με προσοχή η πολυμεράση και το πρόγραμμα συνεχίζεται. Ακολουθούν 25 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ο C για 30 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για την σύνδεση των εκκινητών στους 56 ο C για 45 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 ο C για 1,5 λεπτά. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία υβριδισμού 72 ο C για 10 λεπτά όπου προστίθεται επιπλέον 0.5 μl Taq πολυμεράση, προκειμένου στα προϊόντα του πολυμερισμού να προστεθoυν 3 Α άκρα 47

48 Αντιδραστήρια Όγκος Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης (5x) 10 µl Premixed dntps (2,5 mm) 5 µl Pnldc1 forward Nde I primer (100pmol/µl) 0.5 µl Pnldc1 forward Nde I primer (100pmol/µl) 0.5 µl cdna κλώνος (1:10) 0.7 µl DNA πολυµεράση (Phusion) (2U/µl) 0.5 µl Πίνακας 5: Τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για την παρασκευή µείγµατος για PCR Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή μειγμάτων τελικού όγκου 50μl φαίνονται στον (Πίνακας 6). 2.2.Απομόνωση τμημάτων DNA Για το διαχωρισμό τμημάτων DNA και τον προσδιορισμό του μεγέθους του καθενός χρησιμοποιείται η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης. Χρησιμοποιείται πηκτή αγαρόζης 1%, η οποία παρασκευάζεται με την προσθήκη 0,40g αγαρόζης, αντίστοιχα, σε 40ml ΤΑΕ buffer 1x. Στη συνέχεια, θερμαίνεται το διάλυμα μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης και να γίνει διαυγές. Αφού κρυώσει ακολουθεί προσθήκη 3μl Gel Red, ήπια ανάδευση και στη συνέχεια το διάλυμα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και αφήνεται να πήξει. Προετοιμάζονται τα δείγματα και οι μάρτυρες του μοριακού βάρους που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν με την προσθήκη σε αυτά loading buffer 6x. Η απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (DNA extraction from agarose gels) έγινε με βάση το πρωτόκολλο του kit NucleoSpin Extract II της MACHEREY-NAGEL Εξαγωγή του τμήματος DNA- ιάλυση της πηκτής: Αρχικά εξάγεται από την πηκτή αγαρόζης η ζώνη με το τμήμα του DNA που επιθυμούμε να απομονώσουμε με την βοήθεια ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Η εξαγωγή πραγματοποιείται με προσοχή ώστε να ελαχιστοποιηθεί όσο το δυνατόν ο περιττός όγκος της πηκτής. Το κομμάτι αυτό διαλύεται σε buffer NT σε αναλογία 200μl buffer για κάθε 100mg πηκτής αγαρόζης (για πηκτή αγαρόζης μέχρι και 2%). Η διάλυση επιτυγχάνεται με θέρμανση της πηκτής στους 50 C για 5-10 λεπτά με ανάδευση κάθε 2-3 λεπτά. έσμευση του DNA- Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Το δείγμα φορτώνεται σε στήλη, η οποία τοποθετείται σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2mL. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g, απομακρύνεται το έκλουσμα και επανατοποθετείται η στήλη στο συλλεκτικό σωλήνα. 48

49 Ακολούθως, προστίθενται ακόμη 600μl NT3 buffer, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης- Έκλουση του DNA Τα δείγμα φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer NT3. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Ακολούθως, η στήλη μεταφέρεται σε νέο σωλήνα (Recovery Tube) και προστίθενται 50μl του Elution Buffer NE. Ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό με σκοπό την αύξηση της απόδοσης της έκλουσης του DNA. Τέλος, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g. Το εκλουόμενο DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. 2.3.Σύνδεση τμημάτων DNA Επωάζεται γραμμικός φορέας παρουσία των τμημάτων, που επιθυμούμε να συνδέσουμε, σε αναλογία φορέα προς τμήμα DNA 1:3, με την προσθήκη 1 Unit Τ4 DNA λιγάσης (1u/μl). Επιπλέον, είναι απαραίτητη η προσθήκη στο διάλυμα του ειδικού ρυθμιστικού διαλύματος της λιγάσης το οποίο κατασκευάζεται από την ίδια εταιρεία. Το διάλυμα επωάζεται για 12-14h στους 16 ο C στην περίπτωση που χρησιμοποιείται ο φορέας pet-20b. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθεί ο πλασμιδιακός φορέας psc-a, προστίθενται με την ακόλουθη σειρά τα εξής συστατικά: 3 μl Strataclone Cloning Buffer 2 μl PCR product (5-50ng) 1 μl Strataclone Vector Mix Ακολούθως, πραγματοποιείται επώαση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. 2.4.Mεταφορά πλασμιδιακού DNA σε κύτταρα E. coli με ηλεκτροδιάτρηση Σε 50μl ηλεκτροεπιδεκτικών κυττάρων γίνεται προσθήκη 1-2μl του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA και επώαση στον πάγο για 1 λεπτό. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρονται σε κυβέττα 0.2cm (Biorad Gene Pulser ) και πραγματοποιείται ηλεκτρικό shock των κυττάρων ( pulse ) στο micropulser στο πρόγραμμα Ec2 (Biorad 49

50 MicroPulser TM ). Έπειτα το μίγμα DNA-κυττάρων αφαιρείται από την κυβέττα και μεταφέρεται σε 1ml SOC medium. Ακολουθεί επώαση για 1,5 ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση (160 rpm). Τέλος, επιστρώνονται μl της μετασχηματισμένης καλλιέργειας σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό μέσο LB agar το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό, ανάλογα με τα γονίδια ανθεκτικότητας που διαθέτει το εκάστοτε πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για το μετασχηματισμό (π.χ. για pet-20b αμπικιλλίνη). Επίσης, σε περίπτωση που το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται διαθέτει το οπερόνιο της λακτόζης (π.χ. psc-a), είναι απαραίτητη η προσθήκη 20μl X-gal (2%) πριν την επίστρωση των κυττάρων, για να είναι δυνατή, στη συνέχεια, η επιλογή των λευκών αποικιών που θα περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο (blue/white screening). Τέλος, πραγματοποιείται επώαση των τρυβλίων στους 37 ο C για h. 2.5.Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα Οι θετικές αποικίες ενοφθαλμίζονται σε 3mL LB broth που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό. Ακολουθεί επώαση των καλλιεργειών για 12-14h στους 37 o C υπό ανάδευση (210 rpm). Η ακόλουθη διαδικασία πραγματοποιείται με βάση το πρωτόκολλο απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E. coli του kit NucleoSpin Plasmid της MACHEREY-NAGEL. Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων: Μεταφέρονται 1,5mL από την καλλιέργεια E. coli που αναπτύχθηκε σε ένα σωλήνα και φυγοκεντρούνται για 30s στις x g. Απομακρύνεται το υπερκείμενο και επαναλαμβάνεται αυτό το βήμα. Λύση των κυττάρων: Προστίθενται 250μl buffer A1 και επαναδιαλύεται το ίζημα με τη βοήθεια πιπέτας και έντονη ανάδευση στο vortex. Ακολουθεί προσθήκη 250μl buffer A2 και ανάμειξη αναποδογυρίζοντας ήπια μερικές φορές χωρίς τη χρήση του vortex. Το δείγμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 λεπτά. Ακολούθως προστίθενται 300μl buffer A3 και πραγματοποιείται ήπια ανάδευση αναποδογυρίζοντας μερικές φορές (6-8) αποφεύγοντας τη χρήση του vortex. Φυγοκέντρηση για 5-10 λεπτά στις x g σε θερμοκρασία δωματίου. έσμευση του DNA: Τοποθετείται η στήλη σε ένα σωλήνα συλογής (collecting tube) των 2ml στην οποία φορτώνεται το υπερκείμενο που έχει προκύψει από τη φυγοκέντρηση του προηγούμενου 50

51 βήματος. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g και απομάκρυνση του εκλούσματος. Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης: Επανατοποθετείται η στήλη στο σωλήνα συλογής και προστίθενται 600μl buffer A4 (με αιθανόλη). Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης - Έκλουση του DNA: Επανατοποθετείται η στήλη στο σωλήνα συλογής και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στις x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer Α4. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Τοποθετείται η στήλη σε νέο σωλήνα και προστίθενται 50μl buffer AE ή ddh 2 O. Στη συνέχεια, επωάζεται το δείγμα για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g. Το εκλουόμενο πλασμιδικό DNA φυλάσσεται στους -20 ο C. 2.6.Υποκλωνοποίηση σε φορέα έκφρασης και μετασχηματισμός δεκτικών ΒL21(DE3) Codon plus, BL21(DE3) και BL21(DE3)Rosetta Η ενζυμική πέψη με τη χρήση ενζύμων περιορισμού έχει σκοπό την υδρόλυση των φωσφοδιεστερικών δεσμών του DNA. Πλασμιδιακό DNA επωάζεται με το ένζυμο σε αναλογία 2 Units (ενζυμικές μονάδες)/μg DNA, παρουσία του κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο προτείνεται από την κατασκευαστική εταιρεία. Η ενζυμική μονάδα (Unit) ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 1 μg DNA από βακτηριοφάγο σε μια ώρα, στους 37 ο C. Η αντίδραση διαρκεί περίπου 2-3 ώρες στους 37 ο C. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα NdeI (10u/μl) και BamHI (10u/μl) για την υποκλωνοποίηση σε pet15(b) και pet33(b) ενώ για την υποκλωνοποίηση σε pet20(b) ακολούθησε πρώτα υποκλωνοποίηση με τα ένζυμα περιορισμού NdeI και KpnI σε pet29(c) και ακολούθως από αυτό με τα ένζυμα NdeI και XhoI για υποκλωνοποίηση σε pet20(b) και pet28(b). Η κάθε μια αντίδραση περιέχει τα εξής: Ρυθμιστικό διάλυμα 10x NdeI 10U/μL 4 μl 1 μl 51

52 Ενζυμο2 10U/μL Πλασμίδιο με ή χωρίς ένθετο ddh 2 O sterile μέχρι τελικού όγκου 1 μl 10 μl 20 μl Ακολουθεί επώαση για 2 hrs στους 37 o C. Τα προϊόντα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης για τον έλεγχο της αντίδρασης και τον διαχωρισμό των προϊόντων. Οι ζώνες που αντιστοιχούν στο γραμμικό πλασμίδιο pet και στο ένθετο pnldc1 με κολλώδη άκρα απομονώνονται όπως περιγράφηκε και χρησιμοποιούνται σε αντίδραση συνένωσης για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου pet/pnldc1. Η Τ4 DNA λιγάση καταλύει τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ 3 -ΟΗ και 5 -Ρ άκρων. Το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει τα εξής: pnldc1 20 ng/μl pet 40 ng/μl T4 DNA Ligase (350 U/μL) 10x T4 DNA Ligase Buffer ddh2o 8μL 4μL 1μL 2μL 6μL Ακολουθεί επώαση στους 16 C για 16 hrs. Τα προϊόντα της αντίδρασης συνένωσης χρησιμοποιούνται για μετασχηματισμό δεκτικών DH5a και το ανασυνδυασμένο pet/pnldc1 απομονώνεται όπως περιγράφηκε. 50 ng πλασμιδίου pet/pnldc1 χρησιμοποιούνται για το μετασχηματισμό δεκτικών BL21(DE3)Codon plus, BL21(DE3) και BL21(DE3)Rosetta, Τα δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)Codon plus περιέχουν επιπλέον αντίγραφα trna γονιδίων που αναγνωρίζουν τα κωδίκια της αργινίνης AGA και AGG, της ισολευκίνης AUA και τέλος της λευκίνης CUA. Η έλλειψη αυτών των κωδικίων αποτελεί τον πιο συχνό περιορισμό της μετάφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών σε στελέχη E. coli. 3.Έκφραση ανασυνδυασμένης PNLDC1_ οκιμή έκφρασης Σε 5ml LB Broth με αντιβιοτικό σε τελική συγκέντρωση 0.1mg/ml, ενοφθαλμίζονται κύτταρα BL21(DE3)Codon plus, BL21(DE3) και BL21(DE3)Rosetta, που περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο και επωάζονται για 12-14h στους 37 Ο C υπό ανάδευση (210 rpm). 52

53 Ακολουθεί μεταφορά 2,5 ml της Ο/Ν καλλιέργειας σε 2x50ml από φρέσκο θρεπτικό μέσο LB broth με αμπικιλλίνη. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 600nm (OD600) και επώαση στους 37 Ο C υπό ανάδευση μέχρι το OD600 να φτάσει περίπου το 0,6 που αντιστοιχεί στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Προσθέτουμε 0,1-1mM IPTG (0,1M) (Isopropyl Thio Galactosyl). Το IPTG δρα ως επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης της οποίας ο προαγωγέας στο πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση του γονιδίου Pnldc1_1, βρίσκεται μπροστά από τον polylinker. Η έκφραση του γονιδίου αυτού στα κύτταρα του E. coli αναστέλλεται από τον καταστολέα LacIQ. Το IPTG δεσμεύει και απομακρύνει τον καταστολέα από το DNA επιτρέποντας έτσι την έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η οποία με τη σειρά της θα αναγνωρίσει τον προαγωγέα της στο πλασμίδιο και θα μεταγράψει τα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτόν, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι το γονίδιο Pnldc1_1. Μετά την προσθήκη του IPTG συνεχίζεται η επώαση της καλλιέργειας σε θερμοκρασία Ο C μέχρι το OD600 να φτάσει περίπου το 1,2. Τέλος, φυγοκεντρούνται οι καλλιέργειες στις 4000 rpm για 15 min στους 4 ο C, αφαιρείται το υπερκείμενο και το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 Ο C. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορεί να συντίθεται σε διαλυτή μορφή, ενώ σε πολλές περιπτώσεις τα παραγόμενα μόρια συσσωματώνονται και σχηματίζουν αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια (inclusion bodies). Ο σχηματισμός των έγκλειστων σωματίων επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως η φύση του πρωτεϊνικού μορίου, το είδος του βακτηριακού στελέχους και του πλασμιδίου έκφρασης του συστήματος, και κυρίως, από τις συνθήκες καλλιέργειας και επαγωγής της έκφρασης του ετερόλογου γονιδίου. Ομογενοποίηση κυττάρων Πριν την ομογενοποίηση το ίζημα των κυττάρων επωάζεται στον πάγο μέχρι να ξεπαγώσει. Στη συνέχεια αναδιαλύεται σε 3-5 ml διαλύματος λύσης/gr νωπού βάρους κυττάρων. Το διάλυμα λύσης περιέχει από 2 έως 10 mm ιμιδαζόλιο, το οποίο ανταγωνίζεται κατάλοιπα ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη, προκαλώντας έτσι μείωση της μη ειδικής πρόσδεσης πρωτεϊνών με ιστιδίνες κατά τη χρωματογραφία. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml, ώστε να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων και ακολουθεί επώαση στο πάγο για 30 min και ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε συσκευή υπερήχων με 10 χτυπήματα (bursts) σε ισχύ W, διάρκειας 30 sec το καθένα, στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 60 min στους 4 o C. Το υπερκείμενο αποτελεί το εκχύλισμα των διαλυτών πρωτεϊνών. Το ίζημα αποτελείται από, 53

54 μεμβράνες, βακτηριακά τοιχώματα, DNA και αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια. 3.2.Ανίχνευση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου και ανάλυση κατά western Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν φορτωθούν στην πηκτή περιλαμβάνει την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος Loading Dye (2x) και τη θέρμανση των δειγμάτων στους 98 ο C, για 5 λεπτά. Τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Το ανώτερο μέρος του πηκτώματος (πήκτωμα πακεταρίσματος, stacking gel) είναι περιεκτικότητας 4% σε ακρυλαμίδιο και έχει ph 6.8. Η περιεκτικότητα του κατώτερου μέρους του πηκτώματος (πήκτωμα διαχωρισμού, separating gel) εξαρτάται από το εύρος μοριακών βαρών των πρωτεϊνών για το οποίο το πήκτωμα επιθυμούμε να έχει την μέγιστη διαχωριστική ικανότητα, ενώ το ph είναι 8.8. Για τον βέλτιστο διαχωρισμό πρωτεϊνών με μοριακά βάρη από 20 έως 90 kda το διαχωριστικό πήκτωμα πρέπει να είναι 10 %, ενώ για εύρος 10 έως 20 kda η περιεκτικότητα πρέπει να είναι 16 %. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 7 cm x 9 cm x 1 mm και η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 120V για 2 hrs. Χρώση με Coomassie Brilliant Blue Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης αφαιρούμε το πήκτωμα διαχωρισμού και το φέρουμε σε διάλυμα χρώσης (staining solution) Coomassie Brilliant Blue. Το διάλυμα θερμαίνεται ελαφρώς για 10 min και στη συνέχεια το πήκτωμα κατεργάζεται με διάλυμα αποχρωματισμού 1 h υπό ανάδευση για την εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών. Ανάλυση κατά western Με αυτή τη μεθοδολογία οι πρωτεΐνες μεταφέρονται με ηλεκτρομεταφορά από το πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε μεμβράνη πολυβινυλιδένιου φθορίου (PVDF). Μετά από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, όπως περιγράφηκε, το πήκτωμα διαχωρισμού ξεπλένεται από την περίσσεια SDS με ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Κόβουμε τη μεμβράνη PVDF στις διαστάσεις του πηκτώματος διαχωρισμού και την καθιστούμε υδρόφιλη, εμβαπτίζοντάς την για 2 sec σε απόλυτη μεθανόλη. Τοποθετούμε με τη σειρά 3 κομμάτια χαρτιού Whatman 3ΜΜ, το πήκτωμα, τη μεμβράνη PVDF και 3 κομμάτια χαρτί Whatman (όλα εμποτισμένα με διάλυμα μεταφοράς) χωρίς να εγκλωβιστούν φυσαλίδες αέρα. Ακολούθως, τοποθετούμε το «σάντουιτς» στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς με την μεμβράνη προς την άνοδο. Η ηλεκτρομεταφορά 54

55 πραγματοποιείται στα 100 V για 1 h στους 4 C. Μετά το πέρας, η μεμβράνη επωάζεται σε διάλυμα δέσμευσης των μη ειδικών θέσεων της μεμβράνης στους 4 C για τουλάχιστον 1 h. Η μεμβράνη μετά το τέλος της δέσμευσης εκπλένεται με διάλυμα TBS-Tween/Triton δύο φορές από 10 min και με διάλυμα TBS για 10 min. Ακολουθεί επώαση με Υπεροξειδάση συζευγμένη με Νi που προσδένεται στην ουρά ιστιδινών, αραιωμένο 1/1000 σε διάλυμα δέσμευσης, για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Το τελικό ξέπλυμα γίνεται με διάλυμα TBS- Tween/Triton, 4 φορές από 10 min. H μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα ανίχνευσης υπεροξειδάσης (Chemicon) για 1.5 min και στη συνέχεια εκτίθεται σε φιλμ. 3.3.Καθαρισμός διαλυτής PNLDC1 με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου Αφού επιβεβαιωθεί η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, σειρά έχει ο καθαρισμός της σε στήλη συγγενείας Ni-NTA. Τα κατάλοιπα των έξι συνεχόμενων ιστιδινών αλληλεπιδρούν μέσω των ιμιδαζολικών δακτυλίων με το νικέλιο του χρωματογραφικού υλικού με εξαιρετικά μεγάλη συγγένεια που φτάνει αυτήν του ενζύμουυποστρώματος ή τη συγγένεια αντιγόνου-αντισώματος. Η αλληλεπίδραση παραμένει ισχυρή στα διάφορα στάδια έκπλυσης της στήλης, και παύει σε χαμηλό ph ( ) ή σε υψηλές συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου ( mm). Το τελευταίο ανταγωνίζεται την ουρά ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη. Με την εξασθένιση της αλληλεπίδρασης των ιστιδινών με το νικέλιο, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούεται μέχρι και 95%, απαλλαγμένη από άλλες πρωτεΐνες του εκχυλίσματος. Αφού καθοριστεί η διάρκεια της επαγωγής και η θερμοκρασία, επάγουμε την έκφραση του ανασυνδυασμένου γονιδίου σε καλλιέργεια όγκου 1-2 L. Στο εκχύλισμα προστίθεται 6 ml εναιωρήματος Ni-NTA αγαρόζη (περιέχει υλικό για 3 ml πακεταρισμένης στήλης) και το μίγμα τίθεται υπό ελαφρά ανακίνηση στους 4 C για 1.5 h, ώστε να προσδεθεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο χρωματογραφικό υλικό. Ακολούθως το εναιώρημα πακετάρεται σε στήλη με τη ροή που προκαλείται από την δύναμη της βαρύτητας. Το διάλυμα που διέρχεται της στήλης συλλέγεται (flow-through). Η στήλη εκπλένεται με >30 ml διαλύματος έκπλυσης και στη συνέχεια με διάλυμα βαθμίδωσης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου ( mm) συνολικού όγκου 9 ml, όπου η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούεται στα 250 mm ιμιδαζολίου. Το αποτέλεσμα της διαδικασίας πιστοποιείται με SDS/PAGE. Τα δείγματα καθαρής πρωτεΐνης διαπιδύονται σε διάλυμα TRIS-HCI και φυλάσσονται στους -20 C. 55

56 4. Μέτρηση της δραστικότητας αποαδενυλίωσης με κυανό του μεθυλενίου 4.1.Αρχή της μεθόδου Το κυανό του μεθυλενίου προσδένεται στο πολυμερές poly(a) με αποτέλεσμα να μειώνεται η συγκέντρωση του μέσα στο διάλυμα. Έτσι αυξάνεται η οπτική απορρόφηση στα 662nm όσο μειώνεται η συγκέντρωση του poly(a) [81]. Στην αρχή αυτή και με βάση την πρότυπη καμπύλη γίνεται η μέτρηση της συγκέντρωσης σε μία αντίδραση των 100 μl με πρόσθεση 900 μl διαλύματος κυανό του μεθυλενίου. Το διάλυμα κυανό του μεθυλενίου περιέχει EDTA σε συγκέντρωση 2mM το οποίο δεσμεύει τα ιόντα μαγνησίου. Τα ιόντα μαγνησίου είναι απαραίτητα για την λειτουργία του ενζύμου και έτσι το EDTA σταματάει την αντίδραση. 4.2.Κατασκευή πρότυπης καμπύλης poly(a) Τα δείγματα ετοιμάστηκαν σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα Όταν προστέθηκε το διάλυμα κυανό του μεθυλενίου τα δείγματα επωάστηκαν για 15 και η φωτομέτρηση έγινε στα 662 nm. το φωτόμετρο μηδενίζεται με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση κάθε φορά και μετράται το τυφλό. Έτσι η πρότυπη καμπύλη αντιπροσωπεύει την διαφορά απορροφήσεων. Από την πρότυπη καμπύλη προκύπτει η εξίσωση από την οποία μπορούμε να υπολογίζουμε την ποσότητα του poly(a)που υδρολύεται κατά τις ενζυμικές αντιδράσεις. Τελική συγκέντρωση 0 (Τ) poly(a)100μg/ml (μl) ιάλυμα αντίδρασης (μl) ιάλυμα κυανό του Μεθυλενίου Α Χρονοκαμπύλη ενζυμικής δράσης Για την μέτρηση της ενεργότητας παρασκευάζεται το συνολικό μίγμα σε μεγάλη ποσότητα και από αυτό μεταφέρονται κατευθείαν (χρόνο μηδέν) και σε τακτά χρονικά διαστήματα 100μL από την αντίδραση σε 900 μl διαλύματος κυανό του μεθυλενίου. Από της στιγμή που αναμιχθεί με το διάλυμα κυανό του μεθυλενίου ακολουθεί επώαση του 56

57 μίγματος για 15 λεπτά στους 30 O C πριν την φωτομέτρηση. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με το μίγμα της αντίδρασης σε χρόνο μηδέν με διάλυμα κυανό του μεθυλενίου. Η τιμή της απορρόφησης, των δειγμάτων που αντιστοιχούν σε χρόνους αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογη της ποσότητας poly(α) που απoπολυμερίστηκε. 5. ιατήρηση και καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών 5.1.Απόψυξη κυττάρων Ένα δοχείο κατάψυξης κυττάρων που περιέχει 10 7 περίπου κύτταρα μεταφέρεται παγωμένο κατευθείαν σε υδατολουτρο στους 37 o C μέχρι να τηχθει όλο το θρεπτικό υλικό που περιέχει τα κύτταρα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15 ml falcon με 5 ml PBS και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5 λεπτα. Με τον τρόπο αυτόν τα κύτταρα ξεπλένονται από το DMSO. Αφαιρείται το υπερκείμενο, τα κύτταρα αναδιαλύονται σε θρεπτικό μέσο και μεταφέρονται σε φλάσκα 75 cm 2 (Τ75 flask) ή σε τρυβλίο ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες σε τελικό όγκο θρεπτικό 13 ml. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό και συμπληρώνεται με φρέσκο θρεπτικό μέσο κυτταροκαλλιεργειών. 5.2.Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα καλύψουν 100% την επιφάνεια της φλάσκας πριν αρχίσουν και δημιουργούν διπλοστοιβάδες πρέπει να αποκολληθούν, να αραιωθούν και να στρωθούν στη φλάσκα σε ποσότητα τέτοια να καλύπτει το 10-20% της επιφάνειας (αραίωση 1/10-1/5). Για κύτταρα τα οποία προσκολλούνται ισχυρά στο πλαστικό μέσο εξωκυττάριων γλυκοπρωτεϊνών είναι απαραίτητη η επεξεργασία με θρυψίνη. Για να δράσει η θρυψίνη πρέπει να ξεπλυθούν τα κύτταρα δύο φορές με PBS για να απομακρυνθεί κάθε ίχνος θρεπτικού. Προστίθεται διάλυμα θρυψίνης 1x τοσο ωστε να καλυφθεί όλη η επιφάνεια της φλάσκας (2-3ml). Ακολουθεί επώαση στους 37 μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα (αποκτούν στρογγυλή μορφή όταν τα παρατηρήσουμε στο ανάστροφο μικροσκόπιο). Για τα HaCaT απαιτείται επώαση 8-10 λεπτών. Προστίθεται φρέσκο θρεπτικό μέσο το οποίο απενεργοποιεί την θρυψίνη και τα κύτταρα αποκολλώνται με ελαφρό πιπετάρισμα. Τα κύτταρα ΗΕΚ 293 Τ αποκολλώνται χωρίς θρυψίνη μετά από επώαση με 10 ml PBS στους 37 για 10 λεπτά και ισχυρό χτύπημα της φλάσκας στο πλάι με το χέρι. Από αυτό το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρουμε το 1/5-1/10 σε νέα φλάσκα σε τελικό όγκο 13 ml πλήρης θρεπτικού. 57

58 5.3.Πάγωμα κυττάρων Όταν τα κύτταρα καλύπτουν το 70% της επιφάνειας αποκολλώνται και αναδιαλύονται. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15 ml falcon και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5 λεπτα. Αφαιρείται το υπερκείμενο και αναδιαλύονται σε 1ml διάλυμα ψύξης 6.Αποσιώπηση Pan2 με shrna MISSION shrna clones(sigma). Είναι πλασμίδια σχεδιασμένα για γονιδιακή αποσιώπηση σε κύτταρα θηλαστικών. Eπιλέχθηκαν 5 shrna για την PAN2. Ο πλασμιδιακος φορέας (plko.1<-puro) επιτρέπει την παροδική η μόνιμη διαμόλυνση μέσω αντίστασης στην πουρομυκίνη ιαμόλυνση κυττάρων θηλαστικών με χρήση λιποσωμάτων (Lipofection) Σε κάθε πηγάδι ενός 6-well plate προσθέτουμε το 1/12 από τα κύτταρα μίας πλήρης Τ75 flask έτσι ώστε να έχουμε πληρότητα περίπου 90-95% την επόμενη μέρα σε κάθε πηγάδι μετά από επώαση στους 37 o C. Η πληρότητα αυτή ενδείκνυται για τη διαμόλυνση. Για τη διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε λιποφεκταμίνη, ένα πολυκατιονικό συνθετικό λιπίδιο αναμειγμένο με φωσφατιδυλο-αιθανολαμίνη. Το αντιδραστήριο αυτό συνδυαζόμενο με DNA, σχηματίζει λιποσώματα που συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων-στόχων και αποχύνουν το περιεχόμενο DNA στο εσωτερικό του κυττάρου (στην περίπτωσή μας μιλάμε για πλασμίδια που φέρουν shrnas). Μεταβολές των χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων DNA και λιποφεκταμίνης είναι απαραίτητες για την βελτιστοποίηση της διαμόλυνσης. Επίσης, είναι αναγκαία στα πειράματα αποσιώπησης και η ύπαρξη control κυττάρων τα οποία και δεν θα υποστούν διαμόλυνση, καθώς και control κυττάρων τα οποία διαμολύνονται με άδειο πλασμιδιακό φορέα που φέρει απλά ένα γονίδιο επιλογής. Για το σχηματισμό των λιποσωμάτων ετοιμάζουμε δύο μίγματα σύμφωνα με τους εξής κανόνες: α. Ο λόγος γdna/λ χρησιμοποιούμενης Λιποφεκταμίνης=1/2 β. 50λ ΜΕΜ/ γ DNA (για προετοιμασία του DNA mix) γ. 50λ ΜΕΜ/2 λ Λιποφεκταμίνης (για την προετοιμασία του Lipo mix). δ. 0,5 γ DNA απαιτείται για τη διαμόλυνση των κυττάρων κάθε πηγαδιού ενός 6-well plate (στην συκεκριμένη εργασία ως DNA λαμβάνουμε μείγμα πλασμιδίων που φέρουν και τα 5 είδη shrnas έναντι της PAN2 που χρησιμοποιήθηκαν). 58

59 Παρασκευή του μίγματος διαμόλυνσης: Αναμιγνύουμε τα DNA mix και Lipo mix και τα αφήνουμε να επωαστούν για 5-20 min σε θερμοκρασία δωματίου. Παράλληλα απομακρύνουμε από κάθε well το θρεπτικό υλικό με αναρρόφηση και ξεπλένουμε τα κύτταρα με κρύο και αποστειρωμένο PBS 1Χ τρεις φορές. Πριν την προσθήκη του μίγματος διαμόλυνσης προσθέτουμε θρεπτικό υλικό χωρίς αντιβιοτικάαντιμυκωτικά και χωρίς ορό (FBS) σε κάθε well (2ml/well).Μετά το πέρας του χρόνου επώασης του μίγματος διαμόλυνσης, μοιράζουμε το τελευταίο στα κύτταρα που προορίζονται για διαμόλυνση και αφήνουμε το 6-well plate να επωαστεί στους 37 o C. Tην επόμενη μέρα απομακρύνουμε το θρεπτικό υλικό από τα διαμολυσμένα κύτταρα και το αντικαθιστούμε με ΜΕΜ 10% FBS, 1% Αntibiotic-Antimycotic το οποίο περιέχει επιπλέον και το αντιβιοτικό επιλογής (στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε πουρομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 1-10μg/mL θρεπτικού υλικού). Τα κύτταρα λύονται 72 ώρες μετά την διαμόλυνση και απομονώνεται το ολικό RNA 7.Χορήγηση 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης σε κυτταρικές σειρές Ο απομεθυλιωτικός παράγοντας 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνη, ως νουκλεοσιδικό ανάλογο ενσωματώνεται στο DNA κατά την αντιγραφή, παγιδεύοντας τις μεθυλοτρανσφεράσες DNMT αναστέλλoντας τη μεθυλίωση του DNA. Καλλιέργειες κυττάρων σε 10 cm τρυβλίο με αρχική πληρότητα 20-30% αναπτύσσονται τρεις μέρες σε πλήρη θρεπτικό υλικό παρουσία η απουσία 100μΜ 5-αζα-2'-δεοξυκυτιδίνης καθε μέρα γίνεται αλλαγή με φρέσκο υλικό το οποίο περιέχει 100μΜ του φαρμάκου. Την τρίτη μέρα τα κύτταρα πλένονται με 10ml PBS και απομονώνεται το ολικό RNA 8.Απομόνωση ολικού RNA από κυτταρικές σειρές Με όξινο φαινολικό διάλυμα θειοκυανικής γουανιδίνης: H διαδικασία αυτή είναι βασισμένη στην μέθοδο των Chomczynski και Sacchi στην οποία χρησιμοποιείται για ομογενοποίηση κυττάρων ή ιστού και εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων όξινο φαινολικό διάλυμα θειοκυανικής γουανιδίνης. Σε κάθε τρυβλίο κυτταροκαλιέργειων που έχει πλυθεί με PBS προστίθενται 2ml Trysure και τα κύτταρα αποκολλώνται και ομογενοποιούνται με ειδική ξύστρα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 2 για κάθε τρυβλίο eppendorf αφού αναδιαλύουμε πιπετάροντας μερικές φορές. Μετα απο 5 λεπτά προστίθεται 0,2ml /ml χλωροφόρμιο και το μείγμα ανακινείται έντονα για 15 δευτερόλεπτα. Ακολουθεί επώαση 3 59

60 λεπτών και τα δείγματα φυγοκεντρούνται για 15 λεπτα σε g. Η υδατική φάση που περιέχει το ολικό RNA μεταφέρεται σε νέο epentorf (στην μέση φάση που βρίσκεται το DNA ως λευκό στρώμα), προστίθεται 0,5ml ισοπροπανόλη και ανακινείται έντονα. Μέτα από 10 λεπτά φυγοκεντρούνται 10 λεπτα σε g στους 4 O C. Απομακρύνεται το υπερκείμενο και το ίζημα ξεπλένεται με 1 ml 70% αιθανόλη με φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε g. Απομακρίνεται η αιθανόλη και το ίζημα ξηραίνεται μέσα στον κλίβανο καθέτου νηματικής ροής όπου επικρατούν στείρες συνθήκες. Το ίζημα αναδιαλύεται με 50 μl Η 2 Ο ελεύθερο ριβονουκλεασών (RNase-free ή DEPC-treated water) Τα δείγματα φωτομετρούνται στα 260 και 280 nm και υπολογίζεται ο λόγος 260/280. Εάν ο λόγος είναι μικρότερος από 1.8 τότε τα δείγματα κατεργάζονται με Dnase. Με κιτ απομόνωσης ολικού RNA: Αρχικά περίπου 30 mg από κάθε δείγμα ομογενοποιούνται με την προσθήκη 350 μl διαλύματος RA1 παρουσία 3.5 μl β- μερκαπτοαιθανόλης. Το ομογενοποίημα τοποθετείται σε ειδικές στήλες οι οποίες επιτρέπουν το φιλτράρισμα του δείγματος μετά από φυγοκέντρηση στις x g για 1 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το διηθημένο μίγμα μεταφέρεται σε νέους αποστειρωμένους σωλήνες eppendorf, στο οποίο προστίθενται ml αιθανόλης 70%. Ακολουθεί δέσμευση του ολικού RNA σε μικρές στήλες χρωματογραφίας και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 8000 x g για 30 sec σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί απομάκρυνση τυχόν αλάτων με ειδικό διάλυμα (Membrane Desalting Buffer, MDB) και επώαση του δείγματος παρουσία DNAασης Ι, για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το βήμα αυτό εξασφαλίζει την ελάχιστη δυνατή επιμόλυνση του δείγματός μας με γονιδιωματικό DNA, γεγονός το οποίο θα επηρέαζε την τελική ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR. Aκολουθούν σταδιακές φυγοκεντρήσεις του δείγματος, κατά τις οποίες απομακρύνονται τα υποπροϊόντα της πέψης με την DNAάση Ι. Τέλος, ακολουθεί έκλουση του ολικού RNA του δείγματος με Η 2 Ο ελεύθερο ριβονουκλεασών (RNase-free ή DEPC-treated water). Κάθε δείγμα RNA που απομονώνεται ελέγχεται για τυχαία υδρόλυση μετά από ανάλυση τόσο σε πηκτή αγαρόζης 0,8% όσο και σε πηκτή αγαρόζης 1,2% παρουσία φορμαλδεϋδης και φυλάσσεται στους -80 C. 9.Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο Η Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο είναι μία από τις πιο διαδεδομένες μεθόδους προσδιορισμού γονιδιακής έκφρασης. Είναι μία ιδιαίτερα ευαίσθητη και εξειδικευμένη τεχνική καθώς μπορεί να ανιχνεύσει ακόμα και ένα αντίγραφο 60

61 ενός μεταγράφου ή ακόμα να ανιχνεύσει διαφορετικής έντασης έκφραση μεταξύ δύο δειγμάτων σε ποσοστό έως και 23%. Μπορεί να διεξαχθεί σε ένα βήμα (one step reaction), όπου η όλη διαδικασία από τη σύνθεση του cdna μέχρι την αντίδραση πολυμεράσης συμβαίνει στον ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα ή σε δύο βήματα (two-steps) όπου η αντίστροφη μεταγραφή και η ενίσχυση του παραγόμενου cdna πραγματοποιούνται σε διαφορετικούς δοκιμαστικούς σωλήνες. Η one step Real time PCR θεωρείται ότι μειώνει την πειραματική απόκλιση γιατί οι ενζυμικές αντιδράσεις συμβαίνουν στο ίδιο δοκιμαστικό σωλήνα. Ωστόσο αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί μία αρχική RNA μήτρα η οποία είναι επιρρεπής σε αποικοδόμηση. Η Real Time PCR επιτρέπει τη μέτρηση της ποσότητας των προϊόντων και κατ επέκταση την παρακολούθηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού ενός μορίου-στόχου σε όλη τη διάρκεια της PCR. Ύστερα από μια αρχική φάση κατά την οποία δεν είναι ανιχνεύσιμο το προϊόν της PCR λόγω του ότι βρίσκεται σε πολύ μικρή ποσότητα, ακολουθεί μία εκθετική φάση κατά την οποία η ποσότητα του προϊόντος σχεδόν διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο. Αν υπάρχουν περισσότερα μόρια-στόχοι αρχικά στο δοκιμαστικό σωλήνα, θα χρειαστούν και λιγότεροι κύκλοι για να ξεκινήσει η εκθετική φάση. Συγκρίνοντας τον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για την έλευση της εκθετικής φάσης σε διαφορετικές αντιδράσεις, μπορούμε να προσδιορίσουμε την αρχική ποσότητα των μορίων που χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρα στις αντιδράσεις. Υπάρχουν αρκετές διαφορετικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό του προϊόντος της PCR που υπάρχει στο τέλος κάθε κύκλου, αλλά όλες βασίζονται στην ανίχνευση μιας φθορίζουσας ετικέτας (tag), η οποία συνδέεται σε κάθε μόριο που συντίθεται. Οι πρώτες ετικέτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το βρωμιούχο αιθίδιο και το SYBR Green I. Και τα δύο εισχωρούν στις αύλακες του δίκλωνου DNA.Στην παρούσα πειραματική διαδικασία εφαρμόσαμε την ποσοτική one-step RT-PCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο της KAPABIOSYSTEMS ''KAPA SYBR Green One-Step qrt-pcr Kit'' προκειμένου να ελέγξουμε τα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (genes of interest,goi) σε κύτταρα στα οποία εισήχθησαν αντι-pan2 shrnas η επωάστηκαν με φάρμακο (treated) και σε κύτταρα τα οποία δεν υπέστησαν κατεργασία (calibrator). Ως χρωστική αναφοράς (Reference dye) χρησιμοποιήθηκε η ROX Low. Ως εσωτερικό πρότυπο (normalizer) για την κανονικοποίηση του σήματος των ειδικών προϊόντων ορίστηκε το ιδιοσυστατικό είτε το γονίδιο της ιστόνης 2Α είτε γονίδιο της ακτίνης. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε ολικό RNA απομονωμένο από τα εξεταζόμενα δείγματα. Η συσκευή Stratagene Mx3000P QPCR System μαζί με το λογισμικό της χρησημοποιήθηκε στα πειράματα. 61

62 62

63 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1.Ανάλυση in silico του γονιδιου pnldc1 Το γονίδιο pnldc1 παρουσιάζει ομολογία με το γονιδιο parn. Όλες οι διαθέσιμες πληροφορίες βρίσκονται στο Με τον αλγόριθμο CLUSTAL W έγινε η ομοπαράθεση της πρωτεΐνης PNLDC1_1(PNDC1) με την πρωτεΐνη PARN. Η πρωτεΐνη PARN είναι πλήρως χαρακτηρισμένη και από κρυσταλογραφικές μελέτες και μέσω μεταλλάξεων αντικατάστασης έχουν βρεθεί τα κρίσιμα στον καταλυτικό μηχανισμό αμινοξέα. Στην εικόνα 11 φαίνεται η ομοπαράθεση με τον αλγόριθμο CLUSTAL W. Τα αμινοξικά κατάλοιπα που σχηματίζουν το ενεργό κέντρο υπάρχουν και στην υποθετική πρωτεΐνη PNLDC1_1. Εικόνα 11.Οµοπαράθεση PARN µε PNLDC1 µε τον αλγόριθµο CLUSTAL W όπου φαίνονται κυκλωµένα µε κόκκινο τα κρίσιµα αµινοξικά κατάλοιπα που υπάρχουν και στις δύο πρωτεΐνες Η πρόβλεψη της δομής έγινε με λογισμικό swissmodel στο Ως πρότυπο μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η κρυσταλλική δομή της Mouse PARN. Ανάλυση της προβλεπόμενης δομές έγινε με το λογισμικό UCSF Chimera. Στην προβλεπόμενη δομή σχηματίζεται το ενεργό κέντρο όπως και στην PARN με τα καταλυτικά αμινοξικά κατάλοιπα να έρχονται σε παρόμοια μεταξύ τους θέση στο χώρο (εικόνα 12). Σύμφωνα με τα δεδομένα αυτά η PNDC1 διατηρεί την δράση αποαδενυλάσης. 63

64 Εικόνα 12 Υποθετική δοµή µε βάση την οµολογία µε την ορθόλογη πρωτεΐνη PARN A: Ενεργό κέντρο κρυσταλικής δοµής PARN Β: Ενεργό κέντρο υποθετικής δοµής της PNDC1. Η ανάλυση και ο χρωµατισµός έγιναν µε το προγραµµα UCSF Chimera ενώ η δοµή αναπτύχθηκε µε λογισµικό swissmodel 2.Κλωνοποίηση του γονιδιου pnldc1_1 και εισαγωγή του σε φορέα έκφρασης Για την ενίσχυση του γονιδίου Pnldc1_1, πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε cdna κλώνος από cdna βιβλιοθήκη ανθρώπινου εγκεφάλου και πνεύμονα. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl και εφαρμόστηκε θερμοκρασία υβριδισμού 56 ο C. Χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές, με αποτέλεσμα να προκύψουν προϊόντα ενίσχυσης τα οποία θα διαθέτουν στα άκρα τους τις αλληλουχίες που αναγνωρίζουν τα περιοριστικά ένζυμα NdeI (5 άκρο) και BamH I (3 άκρο). Μετά την ολοκλήρωση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης έγινε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων ενίσχυσης σε πήκτωμα αγαρόζης (1%). Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης έγιναν ορατά σε υπεριώδη ακτινοβολία (Εικόνα 13), ενώ πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους των τμημάτων DNA με βάση τον μάρτυρα μοριακού βάρους (ladder 1kb). Η εικόνα της ηλεκτοφόρησης έδειξε την ενίσχυση του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) του γονιδίου Pnldc1_1 το οποίο αντιστοιχεί στην ευδιάκριτη ζώνη των ~1500 bp, το οποίο συμπίπτει με το μήκος του υπο μελέτη γονιδίου (1596 bp). Εικόνα 13 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 1 %. ιαδροµή 1: DNA µάρτυρας ιαδροµή 2: PCR προϊόν. 64

65 Ακολούθησε καθαρισμός και απομόνωση από το πήκτωμα αγαρόζης, των ενισχυμένων τμημάτων DNA που αντιστοιχούν στις επιθυμητές ζώνες με τη χρήση εξειδικευμένου κιτ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο τελικός όγκος έκλουσης του DNA ήταν τα 50 μl. Στη συνέχεια τα προϊόντα που εξήχθησαν από την πηκτή, χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση της ενσωμάτωσης του γονιδίου στον πλασμιδιακό φορέα psc-a. Η σύνδεση του ενισχυμένου προϊόντος PCR με τον φορέα, βασίστηκε στη μέθοδο του TA cloning, καθώς τα γονίδια διέθεταν μετά το τέλος της PCR, 3 προεξοχές δεοξυαδενοσίνης (dα), λόγω της δράσης της Taq πολυμεράσης που προστέθηκε κατά το τελευταίο βήμα υβριδισμού της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Επιπλέον ο πλασμιδιακός φορέας psc-a είναι κατασκευασμένος με τέτοιο τρόπο έτσι ώστε να διαθέτει προεξοχή τροποποιημένης ουριδίνης (du*). Η αντίδραση σύνδεσης των συμπληρωματικών αυτών άκρων πραγματοποιήθηκε για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας ήταν η δημιουργία ενός ανασυνδιασμένου psc-a-pnldc1_1 πλασμιδισκού φορέα, προς μετασχηματισμό κατάλληλων βακτηριακών κυττάρων. Το επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας περιλάμβανε τη μεταφορά των προϊόντων της αντίδρασης σύνδεσης σε στελέχη E. coli. Για την ανάπτυξη των μετασχηματισμένων κυττάρων πραγματοποιήθηκε επώαση στους 37 ο C σε τριβλία LB άγαρ με το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (100mg/ml) σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. Εφόσον το πλασμίδιο psc-a προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη, οι αποικίες που θα αναπτυχθούν παρουσία αυτού του αντιβιοτικού θα είναι αποκλειστικά εκείνες που έχουν προσλάβει το επιθυμητό πλασμίδιο. Επίσης, είναι απαραίτητη η προσθήκη X-gal στα τριβλία, καθώς ο συγκεκριμένος πλασμιδιακός φορέας διαθέτει το οπερόνιο lacz με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η επιλογή των λευκών αποικιών που έχουν προσλάβει το επιθυμητό πλασμίδιο, έναντι των μπλε αποικιών (blue/white screening). Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA από τις επιλεγμένες λευκές αποικίες σε μικρή κλίμακα (minipreps) και έλεγχος του απομονωμένου πλασμιδιακού DNA με χρήση των περιοριστικών ενζύμων NdeI και BamHI. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε διπλή αντίδραση πέψης (δηλαδή με ταυτόχρονη παρουσία και δράση των περιοριστικών ενζύμων NdeI και BamHI) διάρκειας 2-3 ωρών στους 37 ο C. Η αντίδραση αυτή εξασφαλίζει την ταυτόχρονη αποκοπή του 5 και 3 άκρου του ενθέματος από τον πλασμιδιακό φορέα και την χρησιμοποίησή του σε περαιτέρω διαδικασίες. Μετά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης και έκθεση της πηκτής σε υπεριώδη ακτινοβολία, προέκυψε μία ζώνη μεγέθους περίπου 3,5 kb που αντιστοιχεί στον 65

66 πλασμιδιακό φορέα psc-a και μία ζώνη μεγέθους περίπου 1500 bp, που αντιστοιχεί στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου pnldc1_1 (Εικόνα 16). Το αποτέλεσμα αυτό αναμένεται λόγω της ακρίβειας της διαδικασίας. Ακολούθησε φύλαξη των μετασχηματισμένων κυττάρων παρουσία 50% γλυκερόλης (σε αναλογία 700 μl κύτταρα και 300 μl γλυκερόλη) και αποθήκευσή τους στους -80 ο C. Τα ενθέματα των φορέων των μετασχηματισμένων κυττάρων στάλθηκαν για αλληλούχηση. Τα αποτελέσματα της αλληλούχησης αναλύθηκαν με τη διαδικασία της ομοπαράθεσης με τη χρήση ειδικού λογισμικού (αλγόριθμος clustal W), η οποία έδειξε 100% ομοιότητα με την αλληλουχία του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου Pnldc1_1. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι το ένθεμα που ενισχύθηκε δε φέρει καμία τυχαία μετάλλαξη. Στη συνέχεια, έγινε πέψη του πλασμιδιακού φορέα pet-15b, όπως και του φορέα psc-a από το θετικό ως προς το ένθεμα κλώνο με τα ένζυμα περιορισμού NdeI και BamHI. Ακολούθησε επώαση των δειγμάτων για 2 ώρες στους 37 ο C και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων, η οποία επιβεβαίωσε την ορθότητα της αντίδρασης πέψης. Παρατηρήθηκε μία ζώνη μεγέθους περίπου 5,7 kb, η οποία αντιστοιχεί στον φορέα pet-15b (γραμμοποιημένο), όπως επίσης και δυο ευδιάκριτες ζώνες των 3,7 kb και 1500 bp περίπου που αντιστοιχούν στον φορέα psc-a και στο γονίδιο Pnldc1_1 αντίστοιχα (Εικόνα 14). Η αλληλούχηση εξασφαλίζει ότι και την ορθότητα του τελικού προϊόντος της γονιδιακής έκφρασης που είναι η πρωτεΐνη Pnldc1_1. Εικόνα 14: Αποτέλεσµα της ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της πέψης του πλασµιδιακού φορέα pet-20b και του φορέα psc-a του θετικού ως προς το ένθεµα κλώνου, µε τα περιοριστικά ένζυµα NdeI και BamHI. ιαδροµή 1: DNA µάρτυρας, διαδροµή 2: προϊόν πέψης ανασυνδιασµένου p-sca, διαδροµή 3: προϊόν πέψης pet-15b. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε εξαγωγή της ζώνης μεγέθους ~1500 bp που αντιστοιχεί στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου pnldc1_1, καθώς και εξαγωγή της ζώνης μεγέθους 5,7 kb που αντιστοιχεί στον γραμμοποιημένο πλασμιδιακό φορέα pet-15b από το πήκτωμα αγαρόζης της Eικόνας 16. Ακολούθησε αντίδραση σύνδεσης (ligation) ανάμεσα στα δύο τμήματα που απομονώθηκαν από τα πηκτώματα αγαρόζης, μέσω της δράσης T4 DNA λιγάσης. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στους 16 ο C Ο/Ν, ενώ η 66

67 σύνδεση των δύο τμημάτων επετεύχθη μέσω των κολλωδών άκρων τους που προέκυψαν από την πέψη με κοινά περιοριστικά ένζυμα (NdeI, BamHI). Αποτέλεσμα της αντίδρασης αυτής ήταν η δημιουργία ανασυνδιασμένου φορέα έκφρασης pet-15b-pnldc1_1. Aκολούθησε η μεταφορά του προϊόντος της αντίδρασης σύνδεσης σε επιδεκτικά κύτταρα E. coli BL21 (DE3) Rosetta, με τη διαδικασία του μετασχηματισμού. Η ανάπτυξη των μετασχηματισμένων κυττάρων έγινε στους 37 ο C σε τριβλία με στερεό θρεπτικό μέσο (LB άγαρ) παρουσία αντιβιοτικού στη συγκέντρωση που ήδη αναφέρθηκε. Ο πλασμιδιακός φορέας pet-15b δεν διαθέτει το οπερόνιο lacz με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η επιλογή των κλώνων που έχουν προσλάβει το πλασμίδιο με το επιθυμητό ένθετο, με βάση το χρώμα τους. Για τον λόγο αυτό δεν ήταν δυνατός ο έλεγχος παρουσία X-gal. Έτσι, πραγματοποιήθηκε έλεγχος των αποικιών που αναπτύχθηκαν στο τριβλίο με τη διαδικασία της colony PCR. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl και εφαρμόστηκε θερμοκρασία υβριδισμού 56 ο C. Χρησιμοποιήθηκαν, όπως προαναφέρθηκε, οι εκκινητές Human Pnldc1_1 NdeI Forward primer και Human Pnldc1_1 BamHI Reverse primer. Έγινε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης (1%). Η εικόνα της ηλεκτροφόρησης έδειξε ότι όλες οι αποικίες ήταν θετικές ως προς το ένθεμα, διότι φαίνεται μετά την αντίδραση να έχουν ως μοναδικό προϊόν ενίσχυσης μία ζώνη μεγέθους 1500 bp περίπου που αντιστοιχεί στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου Pnldc1_1 (Εικόνα 15) με την ίδια διαδικασία έγινε υποκλωνοποίηση σε πλασμιδιακούς φορείς pet-33b,. pet-29c, pet-20b pet-28b Εικόνα 15: Αποτέλεσµα της ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της colony PCR. ιαδροµή 1: DNA µάρτυρας, διαδροµή 2,3,4: PCR προϊόν. 3. οκιμή έκφρασης ανασυνδιασμένης PNLDC1_1 Kύτταρα E. coli BL21(DE3)Codon plus, BL21(DE3)Rosetta BL21 και BL21(DE3) που περίεχουν το πλασμίδιο pet15(b) Pnldc1_1. καλιεργήθηκαν σε 50ml Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις IPTG (επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης) για την επαγωγή της έκφρασης (0.5mM και 1mM) σε θερμοκρασία δωματίου και στους 37 o C αντίστοιχα. (Εικόνα 23). 67

68 Εικόνα 16: ιαδροµή 1: Μάρτυρας. ιαδροµές 2, 3 και 4: Επαγωγή BL21(DE3), BL21(DE3)Rosetta και BL21(DE3) Codon plus µε 0,5 mm IPTG στους 25 o C. ιαδροµές 5, 6 και 7 Επαγωγή BL21(DE3), BL21(DE3)Rosetta και BL21(DE3) Codon plus µε 1 mm IPTG στους 37 o C ιαδροµές 8, 9 και 10 Αδιάλυτο κλάσµα επαγωγής BL21(DE3), BL21(DE3)Rosetta και BL21(DE3) Codon plus µε 0,5 mm IPTG στους 25 o C. Σε όλες τις συνθήκες επαγωγής και σε όλα τα κύτταρα η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εντοπίζεται στο αδιάλυτο κλάσμα Ανάλυση κατά western με υπεροξειδάση συζευγμένη με Ni ++ Στην παρακάτω εικόνα φαινεται η ανάλυση κατά western όπου στο τελευταίο πηγαδάκι ηλεκτροφορήθηκε μικρή ποσότητα απο το ίζημα της λύσης των επαγώμενων κυττάρων και επιδεικνύει το γεγονός ότι το μεγαλύτερο ποσοστό της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης βρίσκεται σε αδιάλυτη μορφή. Εικόνα 17: ιαδροµή 1: Μάρτυρας. ιαδροµές 2, 3 και 4: Επαγωγή BL21(DE3), BL21(DE3)Rosetta και BL21(DE3) Codon plus µε 0,5 mm IPTG στους 25 o C. ιαδροµές 5, 6 και 7 Επαγωγή BL21(DE3), BL21(DE3)Rosetta και BL21(DE3) Codon plus µε 1 mm IPTG στους 37 o C ιαδροµή 8: Αδιάλυτο κλάσµα επαγωγής BL21(DE3) 4.Καθαρισμός ανασυνδυασμένης PNLDC1_1 με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου Το γονιδιο υποκλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακο φορέα pet33(b) ο οποίος επιτρέπει χαμιλότερα επίπεδα έκφρασης και δοκιμάστηκαν διάφορες συνθήκες για την έκφραση διαλυτής πρωτεΐνης. Μετά από 16 ώρες επαγωγής δύο λίτρων καλλιέργειας Codon + pet33(b) pnldc1 με 0,1mM IPTG στους 25 ο C η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη απομονώθηκε 68

69 με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου. Στην εικόνα 20 φαίνεται η ανάλυση των σταδίων της χρωματογραφίας με SDS PAGE Εικόνα 18: Στάδια χρωµατογραφίας συγγενείας ακινητοποιηµένου νικελίου για την αποµόνωση ανασυνδυασµένης PNLDC1_1 από Codon + pet33(b) pnldc1 με 0,1mM. IPTG στους 25 ο C. Το γονίδιο υποκλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pet28(b) ο οποίος κωδικοποιεί και στην αρχή αλλά και στο τέλος της αλληλουχίας εξαπεπτίδια ιστιδίνης με αποτέλεσμα η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη να προσδένεται ισχυρότερα στην στήλη νικελίου. Μετά από 16 ώρες επαγωγής δύο λίτρων καλλιέργειας Codon + pet28(b) pnldc1 με 0,5mM IPTG στους 25 ο C η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου. Στην εικίονα 21 φαινονται η ανάλυση των σταδίων της χρωματογραφίας με SDS PAGE Εικόνα 19: Στάδια χρωµατογραφίας συγγενείας ακινητοποιηµένου νικελίου για την αποµόνωση ανασυνδυασµένης PNLDC1_1 από Codon + pet20(b) pnldc1 με 0,1mM. IPTG στους 25 ο C. 5. Μέτρηση της δραστικότητας της PNLDC1_1 με κυανό του μεθυλενίου Στις παρακάτω γραφικές παραστάσεις παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης της ανασυνδυασμένης PNLDC1_1. Πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων poly(a) για να βρεθεί η σταθερά Km και η μέγιστη ταχύτητα του ενζύμου Vmax. Το poly(a) προστέθηκε σε συγκεντρώσεις 0,1-1,2 μm. Λόγω της μικρής διαλυτότητας της πρωτεΐνης και κατακρήμνιση της σε κάθε προσπάθεια συμπύκνωσης σε 69

70 κάθε αντίδραση προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,01-0,05 μm. Η μέγιστη ταχύτητα είναι τα 2.2 nm/min ενώ η σταθερά Km από το διάγραμμα διπλού ανάστροφου Lineweaver-Burk υπολογίζεται στα 77 nm poly(a).η kcat υπολογίσθηκε 1.75 * 10-3 sec -1. Εικόνα 20 A. Καµπύλη ενζυµικής κινητικής κατά Michaelis Menten B. ιάγραµµα Lineweaver- Burk 6.Επίδραση της αποσιώπησης της αποαδενυλάσης PAN2 στην έκφραση σημαντικών γονιδίων Στις 96 ώρες μετά την διαμόλυνση με πλασμίδια που φέρουν shrnas έναντι της PAN2 απομονώθηκε ολικό RNA. Η έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην βιολογία του κυττάρου μετρήθηκε με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-REAL TIME PCR) στην συσκευή MxPro Χρησιμοποιήθηκε το κιτ ''KAPA SYBR Green One-Step qrt-pcr Kit. Για calibrator κύτταρα διαμολύνθηκαν με πλασμίδια που δεν φέρουν shrnas. Για κανονικοποίηση του σήματος επιλέχθηκε το γονίδιο της ιστόνης 2Α. Με Western επιβεβαιώθηκε η αποσιώπηση (Εικόνα 22 Α). Για κάθε ζεύγος εκκινητών έγιναν τρεις αντιδράσεις. Το λογισμικό της συσκευής υπολογίζει την μεταβολή της έκφρασης των γονιδίων στα κύτταρα στα οποία έγινε η αποσιώπηση. Στην εικόνα 23 φαίνονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα της αποσιώπησης. Η έκφραση των γονιδίων Papola, cpb20 και Myc μειώνεται σημαντικά. 70

71 Α Β 1,2 1 Σχετική Εκφραση 0,8 0,6 0,4 0,2 0 PARN CNOT7 NOCTURNIN EIF4E PAPOLA CBP20 MYC Γονίδιο Εικόνα 21 Α. Επιβεβαίωση απωσιώπησης της PAN 2 µε western. B. Σχετική έκφραση σηµαντικών γονιδίων µετα από απωσιώπηση της αποαδενυλάσης PAN2 Τα προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5 % για να επιβεβαιωθεί η ειδική ενίσχυση τμήματος των επιθυμητών γονιδίων. Εικόνα 22 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 1.5 % των προϊόντων αλυσιδωτής αντίδραση πολυµεράσης σε πραγµατικό χρόνο. 7.Επίδραση του απομεθυλίοτικού παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine στην έκφραση των γονιδίων pnldc1, parn, cnot7 O υποκινητής του γονιδίου pnldc1 υπερμεθυλιώνεται. Για να ελεγχθεί αν η έκφραση του γονιδίου αυξάνεται με απομεθυλίωση, κυτταρικές σειρές HaCaT και HEK293 T επωάστηκαν με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine. Απομονώθηκε 71

72 ολικό RNA και πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο. Με απομεθυλίωση του DNA επάγεται η έκφραση του γονιδίου pnldc1 ενώ δεν επηρεάζεται η έκφραση του ορθόλογου γονιδίου parn και της αποαδενυλάσης cnot7. Στην εικόνα 25 παρουσιάζονται οι μέσες τιμές από τα αποτελέσματα στις δύο κυτταρικές σειρές όπου φαίνεται η σχετική έκφραση των γονιδίων σε σειρές που δεν επωάστηκαν ή επωάστηκαν με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-Aza- Deoxycytidine. Για κανονικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές για το γονίδιο της ακτίνης % Εκφραση pnldc1 parn cnot7 Γονίδιο αποαδενυλάσης untreaded treated Εικόνα 25 Σχετική έκφραση των γονιδίων σε σειρές στις οποίες χορηγήθηκε ή δεν χορηγήθηκε ο αποµεθυλιωτικός παράγοντα 5 -Aza-Deoxycytidine Τα προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5 % για να επιβεβαιωθεί η ειδική ενίσχυση τμήματος των επιθυμητών γονιδίων. Εικόνα 26 Ηλεκτροφόρηση σε πύκτωµα αγαρόζης 1.5 % των προϊόντων αλυσιδωτής αντίδραση πολυµεράσης σε πραγµατικό χρόνο. ιαδροµές 1,10 Μάρτυρες. ιαδροµές 2,4,6,8: Από µη επεξεργασµένα κύτταρα µε εκκινήτες ακτήνης, pnldc1, parn και cnot7 αντίστοιχα. ιαδροµές 3,5,7,9: Από επεξεργασµένα µε φάρµακο κύτταρα µε εκκινητές ακτήνης, pnldc1, parn, και cnot7 αντίστοιχα 72

73 Οι ζώνες που παρουσιάζονται είναι στο αναμενόμενο μέγεθος υποδηλώνοντας την ειδικότητα των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν. Στην εικόνα 28 φαίνονται ενδεικτικά τα αποτελέσματα από την κυτταρική σειρά HaCaT. Η διαφορά στην έκφραση του γονιδίου pnldc1 σε κύτταρα στα οποία δεν χορηγήθηκε ή χορηγήθηκε φάρμακο φαίνεται και από την ένταση των ζωνών (διαδρομές 4,5 αντίστοιχα). Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η γραφική παράσταση όπου απεικονίζεται η ενίσχυση κατά την διάρκεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για κάθε αντίδραση. Η μεταβολή της έκφρασης της PNLDC1 φαίνεται στην γραφική παράσταση. Εικόνα 29: Γραφική παράσταση απεικόνησης της ενίσχυσης κατά την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης σε πραγµατικό χρόνο Το σημείο στο οποίο ξεκινάει η εκθετική αύξηση είναι αντιπροσωπευτικό της αρχικής ποσότητας του υποστρώματος ενώ το κατώφλι στο οποίο γίνεται η μέτρηση ορίζεται από το λογισμικό (έγχρωμες γραμμές). Οι καμπύλες που αφορούν το γονίδιο κανονικοποίησης του σήματος (ακτίνη) και των άλλων δύο αποαδενυλασών περνάνε από το κατώφλι σε παραπλήσιο σημείο υποδεικνύοντας την παρόμοια έκφρασή τους στα κύτταρα που επωάστηκαν με τον απομεθυλιωτικό παράγοντα. 73

74 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μέχρι πρόσφατα υπήρχε η πεποίθηση ότι το κυριότερο σημείο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης αφορά το στάδιο της μεταγραφής. Αρχικές μελέτες σε βακτήρια και ιούς υποδείκνυαν έναν κυρίαρχο ρόλο της συγκρότησης της μεταγραφικής μηχανής στην γονιδιακή έκφραση και κατ επέκταση στην βιολογία του κυττάρου. Πρόσφατες μελέτες όμως έχουν αλλάξει αυτά τα δεδομένα αναδεικνύοντας την δυναμικότητα της συμμετοχής των μορίων RNA σε μηχανισμούς γονιδιακής έκφρασης, απαραίτητους για τις κυτταρικές λειτουργίες των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών. Το RNA επιστρέφει δυναμικά στην εξέλιξη (μάτισμα, RNA παρεμβολή κτλ) επιτρέποντας την ανάπτυξη αυτών των σύνθετων μηχανισμών. Η αποικοδόμηση του mrna υπό φυσιολογικές συνθήκες συνήθως ξεκινάει από την βράχυνση της poly(a) ουράς. Η αποαδενυλίωση είναι συνήθως το στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και της αποσιώπησης του mrna καθιστώντας την το σημαντικότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Οι αποαδενυλάσες είναι εξωριβονουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg 2+ που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3 5, παράγοντας 5 -AMP. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή γίνεται μελέτη επί της PAN2 και του μη χαρακτηρισμένου γονιδίου pnldc1. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποσιώπησης της αποαδενυλάσης PAN2. Στις 96 ώρες μετά την διαμόλυνση με πλασμίδια που φέρουν shrnas έναντι της PAN2 απομονώθηκε ολικό RNA. Η έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην βιολογία του κυττάρου μετρήθηκε με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο. Οι CNOT7 και PARN ανήκουν στην ίδια οικογένεια αποαδενυλασών DEDD, συμβάλλοντας στην αποαδενυλίωση του mrna. Η NOCTURNIN είναι αποαδενυλάση διαφορετικής κατηγορίας (EEP) από τις δύο προηγούμενες (CNOT7, PARN) και υπόκειται σε κιρκάδιο έλεγχο. Ο παράγοντας CBP20 αποτελεί συστατικό του πυρηνικού συμπλόκου πρόσδεσης της καλύπτρας. Ο παράγοντας eif4e προσδένεται στο 5 άκρο του mrna ελέγχοντας την μετάφραση. Ο μεταγραφικός παράγοβτας MYC επάγει την έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη, ενώ λειτουργεί και αντι-αποπτωτικά. Η έκφραση των PAPOLA CBP20 και MYC μειώνεται σημαντικά (Εικόνα 22). Είναι γνωστό ότι οι πρωτεΐνες αυτές εμπλέκονται στην μεταγραφή και ωρίμανση του mrna. Η PAN2 ξεκινάει την διαδικασία της αποαδενυλίωσης και άλλες αποαδενυλάσες συνεχίζουν την διαδικασία αυτή. Εάν αυτό είναι γενικό, τότε έλλειψη της PAN2 θα επιφέρει γενικά προβληματική αποαδενυλίωση και αποικοδόμηση του mrna με αποτέλεσμα να μειώνεται η ανακύκλωση του και κατ επέκταση η μεταγραφή νέων mrna. Το γεγονός αυτό μπορεί να μειώνει την απαίτηση για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην μεταγραφή και ωρίμανση νέων mrna. Η poly(a) 74

75 polymerase A (PAPOLA) και η CBP20 συμμετέχουν άμεσα στις διαδικασίες ωρίμανσης του mrna. Η πρωτεΐνη MYC εμπλέκεται στην μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με τoν κυτταρικό κύκλο. Θα μπορούσε να επηρεάζεται καθώς δεν υπάρχει χώρος για νέα mrna αλλά και επειδή σε ένα προβληματικό κύτταρο όσον αφορά στην ανακύκλωση του mrna γενικά θα επιβραδύνονται και θα καταστέλλονται οι μηχανισμοί κυτταρικού κύκλου. Ένας άλλος μηχανισμός θα μπορούσε να είναι ο εξής. Εάν στόχος της PAN2 είναι μία πρωτεΐνη που ρυθμίζει αρνητικά της διαδικασίες της μεταγραφής και του κυτταρικού κύκλου τότε αποσιώπηση της PAN2 και κατ επέκταση αύξηση της πρωτεΐνης αυτής θα επηρεάζει αρνητικά τις διαδικασίες αυτές. Το γονίδιο pnldc1 το οποίο είναι παράλογο του γονιδίου parn, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και πιθανόν παράγει δύο μετάγραφα μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Ανάλυση της αλληλουχίας και της πιθανής δομής συγκριτικά με την PARN δείχνει πως η υποθετική πρωτεΐνη PNLDC1 διατηρεί την δράση αποαδενυλάσης. Η ισομορφή 1 κλωνοποιήθηκε σε φορείς υπερέκφρασης και η ανασυδυασμένη πρωτεΐνη καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου. Από τις εικόνες της απομόνωσης φαίνεται πως η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στο έγκλειστα σωμάτια ενώ ελάχιστη διαλυτή πρωτεΐνη μπορεί να απομονωθεί από μεγάλες καλλιέργειες. Προκαταρτικά πειράματα αποαδενυλίωσης με κυανό του μεθυλενίου δείχνουν ότι η πρωτεΐνη PNLDC1 διαθέτει την δράση αποαδενυλάσης. Λόγω της μικρής διαλυτότητας της πρωτεΐνης και κατακρήμνιση της σε κάθε προσπάθεια συμπύκνωσης σε κάθε αντίδραση προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,1-0,5 μm. Η συγκέντρωση αυτή είναι μικρή για ένζυμο που δεν έχουν βρεθεί οι βέλτιστες συνθήκες. Παρόλο αυτά είναι απαραίτητη η βελτιστοποίηση των συνθηκών για την απομόνωση μεγάλης ποσότητας καθαρής πρωτεΐνης για κινητική ανάλυση και μελέτες αποαδενυλίωσης με ραδιενεργό υπόστρωμα. Σύγκριση της αλληλουχίας με την PARN στο πρόγραμμα BioEdit και ανάλυση της υδροφοβικότητας με αλγόριθμο των Kyte και Doolittle [82] δείχνει ότι η πρωτεΐνη PNLDC1 αντίθετα από την PARN διαθέτει υδρόφοβες περιοχές στην αρχή και στο τέλος της αλληλουχίας, ενώ στην υπόλοιπη αλληλουχία παρουσιάζει παρόμοιο προφίλ υδροφοβικότητας. 75

76 Εικόνα 29: Ανάλυση υδροφοβικότητα των πρωτεϊνών PNLDC1 και PARN Σύμφωνα με αλγόριθμους πρόβλεψης στον διαδικτυακό τόπο η πρωτεΐνη PNLDC1 διαθέτει ένα πεπτιδικό σήμα στην αμινο-τελική περιοχή (αμινοξέα 1-18) και ένα διαμεμβρανικό τμήμα στην καρβοξυ-τελική περιοχή (αμινοξέα ). Τα χαρακτηριστικά αυτά δεν εντοπίζονται στην ορθόλογη πρωτεΐνη PARN (Εικόνα 30). Εικόνα 30 Προβλεψη παραμέτρων της αλληλουχίας της πρωτεΐνης PNLDC1. Φαίνεται να διαθέτει ένα πετιδικό σήμα στο αμινο-τελικό άκρο και ένα διαμεμβρανικό τμήμα στο καρβοξυ-τελικό ακρο 76

77 Το πεπτιδικό σήμα πιθανόν αποκόπτεται από την πρωτεΐνη μέσω μεταφραστικών τροποποιήσεων στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Στα αμινοξέα 1-18 συμπεριλαμβάνεται το D18 που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταλυτικό μηχανισμό σύμφωνα με την ομοπαράθεση με την PARN. Με τον αλγόριθμο πρόβλεψης πεπτιδικών σημάτων Signal-3L φαίνεται ότι τα αμινοξέα 1-15 αποτελούν πεπτιδικό σήμα. Εικόνα 30. Προβλεψη πεπτιδικού σήµατος βάση του αλγόριθµου Signal-3L Στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη τα παραπάνω χαρακτηριστικά ενδέχεται να επηρεάζουν αρνητικά τη διαλυτότητα της. Το πεπτιδικό σήμα είναι υδρόφοβο και δεν αποκόπτεται στο προκαρυωτικό κύτταρο ενώ λόγω της πιθανής διαμεμβρανικής περιοχής η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη θα παρασύρεται με τις μεμβράνες και τα βακτηριακά τοιχώματα κατά την διαδικασία της απομόνωσης γεγονός που συμβαδίζει με τα αποτελέσματα μας. Παρόλες τις δυσκολίες που επιφέρουν τα χαρακτηριστικά αυτά στις πειραματικές διαδικασίες, είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος καθώς δεν απαντώνται στην PARN και στις άλλες αποαδενυλάσες. Άλλο ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της πρωτεΐνης PNLDC1 προκύπτει από τα πειράματα χορήγησης του απομεθυλιωτικού παράγοντα 5-Aza-Deoxycytidine σε κυτταρικές σειρές HaCAT και HEK 293 T. Η μεθυλίωση του DNA αποτελεί μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Το γονίδιο pnldc1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο υποκινητής περιέχει CpG νησίδες που μεθυλιώνονται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου και περιφερικά κύτταρα αίματος [20]. Η μεθυλίωση του DNA προκαλεί γονιδιακή σίγηση είτε λόγω παρεμπόδισης της πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων, είτε λόγω προσέλκυσης καταστολέων (repressors) της μεταγραφής μέσω πρόσδεσης των πρωτεϊνών MBD (Methyl-CpG-binding domain proteins) Mε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο δείξαμε ότι η έκφραση της PNLDC1 αυξάνεται 4 φορές μετά από χορήγηση του φαρμάκου. Το γεγονός ότι μία πρωτεΐνη που ενδεχομένως εμπλέκεται στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης με το να αποικοδομεί mrna, ρυθμίζεται επιγενετικά μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή υποδεικνύει 77